ปจจัยท่ีมีผลตอการชักนําแคลลัส การเจริญของยอด และการออกดอก

ของกุหลาบพันธุมายวาเลนไทนในหลอดทดลอง Factors Influencing Callus Induction, Growth of Propagated Shoots and

In Vitro Flowering of My Valentine Rose

ศิรินธร คงประพฤติ Sirinthorn Kongpraphrut

วิทยานิพนธนี้เปนสวนหนึ่งของการศึกษาตามหลกัสูตรปริญญา วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต สาขาวิชาพืชศาสตร

มหาวิทยาลัยสงขลานครินทร A Thesis Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of

Master of Science in Plant Science Prince of Songkla University

2551 ลิขสิทธิ์ของมหาวิทยาลัยสงขลานครินทร (1)

ชื่อวิทยานิพนธ ปจจัยที่มีผลตอการชักนําแคลลัส การเจริญของยอด และการออกดอกของกุหลาบพันธุมายวาเลนไทนในหลอดทดลอง

ผูเขียน นางสาวศิรินธร คงประพฤติ สาขาวิชา พืชศาสตร อาจารยท่ีปรึกษาวิทยานิพนธหลัก คณะกรรมการสอบ ………………………............................. .………………………….ประธานกรรมการ (รองศาสตราจารย ดร.สมปอง เตชะโต) (รองศาสตราจารย ดร.ธีระ เอกสมทราเมษฐ) ……………………………………กรรมการ อาจารยท่ีปรึกษาวิทยานิพนธรวม (รองศาสตราจารย ดร.สมปอง เตชะโต) …………………………......................... ……………………………………กรรมการ (รองศาสตราจารย ดร.สายัณห สดุด)ี (รองศาสตราจารย ดร.สายัณห สดุด)ี ……………………………………กรรมการ (ผูชวยศาสตราจารย ดร.พจมาลย สุรนิลพงศ)

บัณฑิตวิทยาลัย มหาวิทยาลัยสงขลานครินทร อนุมัติใหนับวิทยานิพนธฉบับนี้ เปนสวนหนึ่งของการศึกษา ตามหลักสูตรปริญญาวิทยาศาสตรมหาบัณฑิต สาขาวิชาพืชศาสตร ………………………………….…………. (รองศาสตราจารย ดร.เกริกชัย ทองหน)ู คณบดีบัณฑิตวิทยาลัย

(2)

(3)

ชื่อวิทยานิพนธ ปจจัยที่มีผลตอการชักนําแคลลัส การเจริญของยอด และการออกดอกของกุหลาบพันธุมายวาเลนไทนในหลอดทดลอง

ผูเขียน นางสาวศิรินธร คงประพฤติ สาขาวิชา พืชศาสตร ปการศึกษา 2551

บทคัดยอ

การชักนําแคลลัสจากชิ้นสวนใบออนของกุหลาบพันธุมายวาเลนไทนในหลอดทดลอง โดยใชสูตรอาหารและสารควบคุมการเจริญเติบโตตาง ๆ พบวา ช้ินสวนใบที่วางเล้ียงบนอาหารสูตร MS เติม TDZ ความเขมขน 1.5 มิลลิกรัมตอลิตร รวมกับ NAA ความเขมขน 0.1 มิลลิกรัมตอลิตร ชักนําแคลลัสไดสูงสุด 100 เปอรเซ็นต และแคลลัสมีลักษณะเปน compact

สําหรับการศึกษาผลของสูตรอาหาร ความเขมขนของเบนซิลอะดินีน (BA) ซูโครสและความเขมแสงตอการเจริญของยอดและการออกดอกของกุหลาบพันธุมายวาเลนไทน รวมกับการศึกษาผลของจํานวนครั้งในการยายเล้ียงตอการพัฒนาการของดอก พบวา อาหารสูตร MS เติม BA ความเขมขน 0.5 มิลลิกรัมตอลิตร สงเสริมการสรางยอดรวมและดอกสูงสุด 2.91 ยอดตอช้ินสวน และ 5 ดอก ตามลําดับ BA ความเขมขน 0.3 และ 0.5 มิลลิกรัมตอลิตร ใหเปอรเซ็นตการเกิดดอกสูงสุด 55.55 เปอรเซ็นต หลังวางเลี้ยงเปนเวลา 9 สัปดาห และจากการศึกษาขางตนยังพบวา อาหารสูตรดังกลาวที่ปราศจากสารควบคุมการเจริญเติบโตสามารถชักนํารากไดดีที่สุด คือ 37.63 เปอรเซ็นต โดยมีรากเฉลี่ย 2.83 รากตอช้ินสวน ซูโครสเขมขน 3.5 เปอรเซ็นต ในอาหารสูตร MS รวมกับการใหแสง 50.70 ไมโครโมลตอตารางเมตรตอวินาที ใหเปอรเซ็นตการสรางยอด และจํานวนยอดเฉลี่ยสูงสุด คือ 84 เปอรเซ็นต และ 2.32 ยอดตอช้ินสวน ตามลําดับ นอกจากนี้การยายเลี้ยงทุกเดือนเปนจํานวน 6 คร้ัง ในอาหารสูตร MS เติม BA ความเขมขน 0.2 มิลลิกรัมตอลิตร ใหการเกิดดอกสูงสุด 95.08 เปอรเซ็นต ซ่ึงมีทั้งดอกปกติและผิดปกติ จํานวน 42 และ 74 ดอก ตามลําดับ โดยดอกปกติมีสีชมพูถึงแดง สวนดอกผิดปกติมีความแปรปรวนของสีดอกตั้งแตสีแดง ชมพู ขาวเขียว และขาวเหลือง ซ่ึงดอกผิดปกตินี้พบหลายลักษณะ คือ มีสีเขียวคลายใบบริเวณกลางดอก ดอกบวมฉ่ําน้ํา ดอกมีลักษณะเหี่ยวกอนถึงระยะดอกบาน และบางดอกมีเกสรตัวผูเพียงอยางเดียว

(4)

Thesis Title Factors Influencing of Callus Induction, Growth of Propagated Shoots and In Vitro Flowering of My Valentine Rose

Auther Miss Sirinthorn Kongpraphrut Major Program Plant Science Academic Year 2008

Abstract

Young leaves from in vitro shoots of My Valentine rose were cultured on different culture media supplemented with various kinds and concentrations of plant growth regulators for callus induction. The highest percentage of callus formation was observed on MS medium supplemented with 1.5 mgl-1 TDZ and 0.1 mgl-1 NAA at 100% and promoted compact callus.

The effects of concentration of BA, sucrose and light intensity for growth shoots and in vitro flowering of My Valentine rose were investigated, and also the effect of number of subcultures on flower differentiation was studied. The results revealed that MS medium supplemented with 0.5 mgl-1 BA gave the highest number of shoots and flowers at 2.91 shoots/ responding explant and 5 floral buds, respectively. MS medium supplemented with 0.3 and 0.5 mgl-1 BA showed the highest percentage of in vitro flowering at 55.55% after 9 weeks of culture. Growth-regulator-free MS medium gave the best rooting at 37.63% and 2.83 roots/responding shoot. Sucrose at a concentration of 3.5% in MS medium under illumination of 50.70 µmolm-2s-1 yielded the highest percentage of multiple shoot formational at 84% and 2.32 shoots/responding explant. Six monthly subcultures gave the highest percentage of flowering at 95.08%, although this includes both normal and abnormal flowers (normal flowers were pink to red in color whereas abnormal ones had a variety of floral colors from red, pink, and greenish-white to yellowish-white. The greatest number of normal (42) and abnormal flowers (74) were obtained on 0.2 mgl-1 BA containing MS medium. Other abnormal characters of flowers were green, hyperhydrict flowers and some had a stamen only.

(5)

กิตติกรรมประกาศ

ผูเขียนขอกราบขอบพระคุณ รองศาสตราจารย ดร. สมปอง เตชะโต ประธานกรรมการที่ปรึกษาวิทยานพินธเปนอยางสงู ที่กรุณาใหความรู คําแนะนําสั่งสอนทั้งในดานการเรียน การวิจยั ตลอดจนการนําเสนอผลงานวจิัย การเขียนวิทยานิพนธจนเสร็จสมบูรณ ขอกราบขอบพระคุณ รองศาสตราจารย ดร. สายัณห สดุดี กรรมการที่ปรึกษาวทิยานิพนธ รองศาสตราจารย ดร. ธีระ เอกสมทราเมษฐ ประธานกรรมการสอบวิทยานพินธ และผูชวยศาสตราจารย ดร.พจมาลย สุรนิลพงศ กรรมการสอบวิทยานิพนธ ที่กรุณาใหคําแนะนํา ตรวจสอบแกไขวิทยานิพนธ

ขอกราบขอบพระคุณคณาจารยประจําภาควิชาพืชศาสตร คณะทรัพยากรธรรมชาติ และคณาจารยทุกทานที่เคยใหการอบรม ส่ังสอน รวมทั้งเจาหนาที่ประจําภาควิชาพืชศาสตรทุกทานที่ใหการชวยเหลือจนสําเร็จการศึกษา

ขอขอบพระคุณ บัณฑิตวทิยาลัย มหาวิทยาลัยสงขลานครินทร ที่กรุณาใหทุนอุดหนนุในการทําวิทยานิพนธ

ขอขอบพระคุณ คุณนพรัตน ถวิลเวทนิ และศนูยสงเสริมและพัฒนาอาชีพการเกษตร จังหวัดตรัง (พันธุพืชเพาะเลี้ยง) ที่อนุเคราะหตนกุหลาบพนัธุมายวาเลนไทนสําหรับการทําวิจัยในครั้งนี้

ขอขอบพระคุณ บิดา-มารดา คุณเจริญ-คุณวิชุตา คงประพฤติ ดวยความเคารพอยางสูง นองสาวที่นารัก คุณอุบลรัตน คงประพฤติ รวมทั้งคุณ ศุภวิทย ใจงาม และครอบครัว ที่กรุณาใหความชวยเหลือในทกุ ๆ ดาน ใหความรัก ความเอาใจใส ความเขาใจ และเปนกําลังใจที่สําคัญยิ่งเสมอมา

ขอขอบคุณ พี่ ๆ เพื่อน ๆ นอง ๆ ที่เรียนรวมกันมา และทุกคนในหองปฏิบัติการเทคโนโลยีชีวภาพของพืชปลูก ที่คอยใหการชวยเหลือและเปนกําลังใจที่ดีตลอดมา

ศิรินธร คงประพฤติ

(6)

สารบัญ หนา บทคัดยอ (3) Abstract (4) กิตติกรรมประกาศ (5) สารบัญ (6) รายการตาราง (7) รายการภาพประกอบ (8) ลักษณะคํายอและตัวยอ (10) บทที่ 1 บทนํา 1

บทนําตนเรื่อง 1 ตรวจเอกสาร 3 วัตถุประสงค 11

2 วัสดุ อุปกรณ และวิธีการวิจัย 12 วัสดุ อุปกรณ 12 วิธีการวิจยั 14

3 ผล 17 4 วิจารณ 40 5 สรุป 50 เอกสารอางอิง 51 ภาคผนวก 60 ประวัติผูเขียน 62

(7)

รายการตาราง

ตารางที่ หนา 1 ผลของชนิดและความเขมขนของสารควบคุมการเจริญเตบิโตตอการชักนําแคลลัสจาก

การเพาะเลีย้งชิ้นสวนใบบนอาหารสูตร MS เปนเวลา 4 สัปดาห 18 2 ผลของสูตรอาหารและสารควบคุมการเจรญิเติบโตตอการชักนําแคลลัสหลังจาก

เพาะเลี้ยงชิน้สวนใบเปนเวลา 3 สัปดาห 21 3 ผลของอาหารสูตร MS เติม TDZ ความเขมขน 1.5 มิลลิกรัมตอลิตร รวมกับ NAA

ความเขมขนตาง ๆ ตอการชักนําแคลลัสโดยวางเลี้ยงชิ้นสวนใบบนอาหารสูตร MS เปนเวลา 4 สัปดาห 25

4 ผลของสูตรอาหารสังเคราะห และระดับความเขมขนของสารควบคุมการเจริญเติบโตตอการเกิดยอดรวมเฉลี่ย และการเกดิดอกของกุหลาบพนัธุมายวาเลนไทนภายในระยะเวลา 9 สัปดาห 30

5 สูตรอาหารสังเคราะห และระดับความเขมขนของสารควบคุมการเจริญเติบโตตอการเกิดรากของกหุลาบสายพันธุมายวาเลนไทน หลังเพาะเลี้ยงเปนเวลา 6 สัปดาห 32

6 ผลของน้ําตาลซูโครส และความเขมแสง ตอการสรางยอดและดอกของกุหลาบพันธุมายวาเลนไทน ภายในระยะเวลา 5 สัปดาห 34

7 ผลของจํานวนครั้งของการยายเลี้ยงตอการเกิดดอกของกุหลาบพันธุมายวาเลนไทนในอาหารสูตร MS เติม BA ความเขมขน 0.2 มิลลิกรัมตอลิตร 36

(8)

รายการภาพประกอบ

ภาพที ่ หนา 1 ตนพันธุกหุลาบพันธุมายวาเลนไทนที่เล้ียงบนอาหารสูตร MS ที่ปราศจากสาร

ควบคุมการเจริญเติบโต เปนเวลา 7 เดือน 12 2 Friable callus และ compact callus จากการเพาะเลี้ยงชิ้นสวนใบบนอาหารสูตร

MS เติมสารควบคุมการเจริญเติบโตชนิดตาง ๆ เปนเวลา 4 สัปดาห 19 3 แคลลัสที่ชักนําไดจากการเพาะเลี้ยงใบออนของกุหลาบพันธุมายวาเลนไทนบน

อาหารสูตร MS ที่เติมสารควบคุมการเจริญเติบโตตาง ๆ หลังวางเลี้ยงเปนเวลา 3 สัปดาห 22

4 แคลลัสที่ชักนําไดจากการเพาะเลี้ยงใบออนของกุหลาบพันธุมายวาเลนไทนบนอาหารสูตร ½MS ที่เติมสารควบคุมการเจริญเติบโตตาง ๆ หลังวางเลี้ยงเปนเวลา 3 สัปดาห 23

5 เปอรเซ็นตการชักนําแคลลัสจากการวางเลี้ยงชิ้นสวนใบของกุหลาบพันธุมายวาเลนไทนบนอาหารสูตร MS เติม TDZ ความเขมขน 1.5 มิลลิกรัมตอลิตร รวมกับ NAA ความเขมขนตาง ๆ (0 0.05 0.1 0.15 และ 0.2 มิลลิกรัมตอลิตร) หลังวางเล้ียงเปนเวลา 4 สัปดาห 24

6 ปริมาณแคลลัสจากการวางเลี้ยงชิ้นสวนใบของกุหลาบพันธุมายวาเลนไทนบนอาหารสูตร MS เติม TDZ ความเขมขน 1.5 มิลลิกรัมตอลิตร รวมกับ NAA ความเขมขนตาง ๆ (0 0.05 0.1 0.15 และ 0.2 มิลลิกรัมตอลิตร) หลังวางเลีย้งเปนเวลา 4 สัปดาห 26

7 ลักษณะ compact callus ที่เกิดจากการเพาะเลี้ยงชิ้นสวนใบออนของกุหลาบพันธุ มายวาเลนไทน เปนเวลา 4 สัปดาห บนอาหารสูตร MS เติม TDZ ความเขมขน 1.5 มิลลิกรัมตอลิตร รวมกับ NAA ความเขมขนตาง ๆ 27

8 การสรางยอดของกุหลาบพนัธุมายวาเลนไทนบนอาหารสังเคราะหสูตร MS เติม BA ความเขมขนระดับตาง ๆ หลังการวางเลี้ยงชิ้นสวนเปนเวลา 9 สัปดาห 29

9 การสรางดอกของกุหลาบพันธุมายวาเลนไทนบนอาหารสังเคราะหสูตร MS เติม BA ความเขมขนระดับตาง ๆ หลังการวางเลี้ยงชิ้นสวนเปนเวลา 9 สัปดาห 31

(9)

รายการภาพประกอบ (ตอ)

ภาพที ่ หนา 10 การสรางรากของกุหลาบพันธุมายวาเลนไทนบนอาหารสังเคราะหสูตร MS

ปราศจาก สารควบคุมการเจริญเติบโต หลังวางเลี้ยงชิ้นสวนเปนเวลา 6 สัปดาห 33 11 ผลของจํานวนครั้งของการยายเลี้ยงยอดในอาหารสูตร MS เติม BA ความเขมขน

0.2 มิลลิกรัมตอลิตร ตอจํานวนดอกปกตแิละผิดปกติของกุหลาบพันธุ มายวาเลนไทน 35

12 ผลของจํานวนครั้งของการยายเลี้ยงยอดในอาหารสูตร MS เติม BA ความเขมขน 0.2 มิลลิกรัมตอลิตร ตอเปอรเซ็นตการเกิดดอกปกติ และผิดปกติของกหุลาบพันธุ มายวาเลนไทน 37

13 ดอกที่มีลักษณะเปนปกติ ซ่ึงเกิดจากการยายเล้ียงแตละครั้ง จํานวน 6 คร้ัง ในอาหารสังเคราะหสูตร MS เติม BA ความเขมขน 0.2 มิลลิกรัมตอลิตร 38

14 ดอกที่มีลักษณะผิดปกติ ซ่ึงเกิดจากการยายเลี้ยงครั้งที่ 4 5 และ 6 ในอาหารสูตร MS เติม BA ความเขมขน 0.2 มิลลิกรัมตอลิตร 39

(10)

ลักษณะคํายอและตัวยอ

มก/ล = มิลลิกรัมตอลิตร BA = Benzyladenine B5 = Gamborg medium C = Compact callus CRD = Completely randomized design C/N ratio = อัตราสวนของสารประกอบคารโบไฮเดรต และไนโตรเจน DMRT = Duncan’s multiple range test 2,4-D = 2,4-Dichlorophenoxy acetice acid F = Friable callus GA3 = Gibberellic acid HID = High intensity discharge lamp IAA = Indole-acetic acid IBA = indole-3-butyric acid LS = Linsmaier and Skoog medium MS = Murashige and Skoog medium ½ MS = Half Murashige and Skoog medium NAA = α-Naphthalene acetic acid pCPA = p-chlorophenoxyacetic acid SH = Schenk and Hildebrandt medium TDZ = Thidiazuron {1-phenyl-3-(1,2,3-thaidiazol-5-yl)urea} TU = Thiourea 2,4,5-T = 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid

1

บทที่ 1

บทนํา

บทนําตนเรื่อง

กุหลาบ (Rosa hybrida) เปนไมดอกที่มีความสําคัญ มีการปลูกเปนการคาทั่วโลก (วุฒิชัย, 2548; เศรษฐพงศ, 2543) โดยจัดอยูในสกุล Rosa ประกอบดวย 120 ชนิด (โสระยา, 2544) และมีลูกผสมนับหมื่นสายพันธุ มีถ่ินกําเนิดในทวีปเอเชียเปนสวนใหญ (สุปราณี, 2541; โสระยา, 2544) ปจจุบันมีการจัดจําแนกประเภทของกุหลาบที่มีมูลคาทางเศรษฐกิจ ไดแก กุหลาบตัดดอก (Hybrid Tea) กุหลาบพวง (Floribunda) กุหลาบแกรนดิฟลอรา (Grandiflora) กุหลาบหนู (Miniature) และกุหลาบเลื้อย (Climber) (สุปราณี, 2541; โสระยา, 2544; สุธานิธ์ิ, 2539) โดยกุหลาบพันธุมายวาเลนไทน (My Valentine rose) เปนลูกผสมระหวางพันธุลิตเติลชีฟ (Little Chief) กับพันธุลิตเติลเคิรท (Little Curt) จัดอยูในกลุมของกุหลาบหนู มีขนาดเล็กหรือแคระโดยธรรมชาติ ลักษณะทั่วไปของกุหลาบพันธุมายวาเลนไทน คือ เปนไมทรงพุมเตี้ย มีความสูง 0.50-0.75 เมตร ใบมีขนาดเล็ก ดอกบานมีเสนผาศูนยกลาง 2.20 เซนติเมตร กลีบดอกซอนแนนมี 40 - 60 กลีบ กลีบดอกเล็กมีสีแดงคลายกํามะหยี่ กล่ินหอมออน ๆ ลักษณะพิเศษของกุหลาบพันธุนี้ คือ ดอกออกเปนชอ แข็งแรงและทนทานตอโรคราน้ําคาง กุหลาบไดถูกนํามาใชประโยชนหลายดาน เชน อุตสาหกรรมไมตัดดอก การผลิตน้ําหอม น้ํามันหอมระเหย เครื่องสําอาง เปนตน จึงเปนที่สนใจของหลายประเทศทั่วโลก โดยมีการดําเนินงานขยายพันธุและสนับสนุนใหเกษตรกรปลูกมาเปนเวลานาน มีการซื้อขายเปนอันดับหนึ่งในตลาดประมูลอัลสเลีย ประเทศเนเธอรแลนด ซ่ึงเปนตลาดประมูลไมดอกที่ใหญที่สุดของโลก เมื่อพ.ศ. 2542 มีการซื้อขายประมาณ 1,672 ลานดอก และมียอดขายสูงสุดในประเทศตาง ๆ เมื่อเปรียบเทียบกับไมดอกชนิดอื่น ๆ โดยประเทศที่ผลิตกุหลาบรายใหญของโลก ไดแก อิตาลี เนเธอรแลนด สเปน สหรัฐอเมริกา เปนตน และเปนไมดอกที่มีความสําคัญเปนอันดับ 2 ในสหรัฐอเมริกา (โสระยา, 2544) ในสภาวะปจจุบันพบวามีความกาวหนาในการพัฒนาการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อไมดอก โดยเฉพาะดานอุตสาหกรรมไมดอกไมประดับทั้งในภูมิภาคเอเชียและยุโรป ซ่ึงมีการขยายตัวเพิ่มขึ้นอยางรวดเร็ว เชน ประเทศไตหวันมีการนําเขาดอกกุหลาบมูลคารวมในป 2546 เทากับ 67,687 เหรียญสหรัฐฯ โดยนําเขาจากประเทศไทยเปนอันดับ 4

2

ดวยมูลคา 10,392 เหรียญสหรัฐฯ (สํานักงานสงเสริมการคาในตางประเทศ ณ กรุงมะนิลา, 2547) และในป 2003 ประเทศอิตาลีซ่ึงเปนแหลงผลิตกุหลาบรายใหญของโลกไดนําเขากุหลาบจากประเทศไทย รอยละ 0.08 ถึงแมวาจะยังมีการนําเขาจากประเทศไทยนอยอยู แตนี่เปนสญัญาณบอกถึงความตองการกุหลาบที่เพิ่มสูงขึ้นและตอเนื่อง (สํานักงานสงเสริมการคาในตางประเทศ ณ เมืองมิลาน, 2547) ดวยเหตุผลดังกลาวสงผลใหเกิดการขยายพันธุกุหลาบอยางรวดเร็วเพื่อตอบสนองความตองการทั้งทางคุณภาพและปริมาณ หรือเพื่อการศึกษาวิจัย รวมถึงการเพิ่มมูลคาสินคาอีกดวย การนําเทคโนโลยีการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อมาใชจึงเปนวิธีการหนึ่งที่สามารถใชขยายพันธุ รวมถึงการปรับปรุงพันธุไดอยางรวดเร็ว ซ่ึงตองมีการควบคุมปจจัยตาง ๆ ที่สําคัญ ไดแก สูตรอาหาร สารควบคุมการเจริญเติบโต รวมทั้งสภาพแวดลอม (ประภัสสร, 2548) จึงสามารถชักนําแคลลัส ยอด และดอกของกุหลาบได โดยสามารถขยายพันธุไดคร้ังละปริมาณมากในระยะเวลาอันสั้น เนื่องจากช้ินสวนเพียงชิ้นเดียวสามารถชักนําเปนแคลลัส ยอด หรือดอกไดจํานวนมาก สงผลใหชักนําเปนพืชตนใหมไดปริมาณมากเชนกัน อีกทั้งผลผลิตที่ไดยังมีความสม่ําเสมอ ดังรายงานการชักนําแคลลัส ยอดและดอกของกุหลาบหลาย ๆ พันธุ เชน กุหลาบพันธุ Improved Blaze (Hasegawa, 1979) Rosa persica x xanthina (Tweddle et al., 1984) Duftwolke และ Iseta (Sauer et al., 1985) Samantha (He et al., 1996) Crimson Glory (Syamal and Singh, 1996) The Fairy (Sahoo and Debata, 1997) Baronesse (Carelli and Echeverrigaray, 2002) และ Rosa indica (Soomro et al., 2003) ซ่ึงการชักนําแคลลัส ยอด และดอกกุหลาบโดยสวนใหญใชสารควบคุมการเจริญเติบโตมากกวา 1 ชนิด หรือการควบคุมสภาวะแวดลอมตาง ๆ เพื่อใหกุหลาบเกิดการสรางแคลลัส ยอดและดอกไดสูงสุด (Wang et al., 2002; Saritha and Naidu, 2007) และเนื่องจากกุหลาบพันธุมายวาเลนไทนที่ใชในการศึกษานี้ ยังไมมีรายงานการศึกษาเกี่ยวกับปจจัยเบื้องตนในการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อมากอนจึงยังขาดขอมูลพื้นฐานที่จําเปนอยูมาก ประกอบกับมีปริมาณนอย ดังนั้นจึงไดทําการศึกษาถึงปจจัยเบื้องตนตาง ๆ ที่มีผลตอการชักนําแคลลัส การสรางยอด และการชักนําดอกของกุหลาบพันธุนี้ เพื่อนําไปประยุกตใชในการขยายพันธุ ปรับปรุงพันธุ เชน การใชเทคโนโลยีโปรโตพลาสต การสรางมูลคาผลผลิต รวมถึงใชเปนพื้นฐานในการศึกษาวิจัย หรือใชเปนขอมูลอางอิงตอไป

3

การตรวจเอกสาร 1. การชักนําแคลลัส

แคลลัส หมายถึง เซลลที่อยูรวมกันเปนกลุม โดยยังไมมีการเปลี่ยนแปลงไปเปน

อวัยวะหรือเนื้อเยื่อชนิดตาง ๆ แคลลัสประกอบดวยเซลลพาเรนคิมา (parenchyma) เพียงอยางเดียว มีขนาดตาง ๆ รูปรางไมแนนอน สวนใหญใชการเพาะเลี้ยงแคลลัสเพื่อการขยายพันธุ การผลิตพืชพันธุทนทานหรือตานทาน การชักนําแคลลัสในกุหลาบตองอาศัยปจจัยทั้งภายนอก ไดแก สูตรอาหาร สารควบคุมการเจริญเติบโต ตลอดทั้งปจจัยภายในตนพืชเอง ไดแก อายุ และความพรอม ลักษณะทางพันธุกรรม และฮอรโมนภายในพืชเอง ซ่ึงขึ้นอยูกับชนิดหรือสายพันธุของพืช นอกจากนี้ยังขึ้นอยูกับวัตถุประสงคในการศึกษาดวย (อัมพา และคณะ, 2546) เชน การผลิตสารแอนโธไซยานินผานแคลลัสของกุหลาบมอญ โดยการวางเลี้ยงแคลลัสบนอาหารสูตร Linsmaier and Skoog (LS) ที่เติม dicamba ความเขมขน 1 มิลลิกรัมตอลิตร รวมกับ Benzyladenine (BA) ความเขมขน 0.5 มิลลิกรัมตอลิตร (อัญจนา, 2547) การชักนําแคลลัสในพืชกลุมกุหลาบนั้นสูตรอาหาร สารควบคุมการเจริญเติบโต รวมทั้งชิ้นสวนพืชมีความสําคัญอยางมาก ซ่ึงผลของปจจัย ตาง ๆ เหลานี้ไดมีรายงานดังตอไปนี้

การชักนําแคลลัสกุหลาบสามารถทําไดโดยการเพาะเลี้ยงชิ้นสวนตาง ๆ เชน ใบ (Khui and Sink, 1982; Noriega and Sondahl, 1991; Hsia and Korban, 1996; Kintzios et al., 1996; Dohm et al., 2001; Soomro et al., 2003) ลําตน (Ishioka and Tanimoto, 1990) ปลายราก (Noriega and Sondahl, 1991) กลีบดอก (Murali et al., 1996) สําหรับสูตรอาหารที่ใชชักนําแคลลัสของกุหลาบมีหลายสูตรดวยกัน ซ่ึงแตละสูตรมีสวนประกอบและปริมาณของสารที่เปนองคประกอบแตกตางกันไป ทั้งนี้ขึ้นอยูกับชนิด และพันธุของกุหลาบ และวัตถุประสงคในการใช โดยทั่วไปอาหารทุกสูตรมีองคประกอบของอาหาร 5 สวน ดังนี้ สารอินทรีย สารอนินทรีย น้ําตาล สารควบคุมการเจริญเติบโต และสารประกอบเชิงซอน (สมปอง, 2539 อางโดย ปรัชพรรณ, 2550) ชนิดของอาหารเพาะเลี้ยงมีความสําคัญอยางมากตอการชักนําแคลลัส ดังนั้นจึงตองเลือกสูตรอาหารใหเหมาะสม มีรายงานการชักนําแคลลัสของกุหลาบในอาหารสูตรสังเคราะหที่แตกตางกัน ดังนี้ อาหารสูตร Murashige and Skoog (MS) (Khui and Sink, 1982; Arene et al., 1993; Li and 2002; Dohm et al., 2001; Lloyd et al., 1988; Ishioka and Tanimoto,1990; Hsia and Korban, 1996; Soomro et al., 2003; Kintzios et al.,1996) อาหารสูตร Half Murashige and Skoog (½ MS) (Hsia and Korban, 1996) อาหารสูตร Schenk and Hildebrandt (SH) (Khui and Sink, 1982; Theo et at.,

4

1996; Kamo,2004) อาหารสูตร Gamborg (B5) (Noriega and Sondahl, 1991) นอกจากนี้ยังมีการศึกษาเกี่ยวกับการชักนํา Somatic embryogenesis โดยใชอาหารสูตร MS (Kaur et al., 2006; Estabrooks et al., 2007) สําหรับสารควบคุมการเจริญเติบโตของพืชเปนสารกลุมใหญ เปนสารอินทรียที่ไมจํากัดวาพืชจะสรางขึ้นเองหรือมนุษยสังเคราะหขึ้น มีการใชในปริมาณเพียงเล็กนอยก็สามารถกระตุน ยับยั้ง หรือเปลี่ยนแปลงสภาพทางสรีรวิทยาของพืชได นอกจากนี้ยังมีสารหลายชนิดที่มีผลตอการเจริญเติบโตของพืช แตสารเหลานี้อาจไมใชสารควบคุมการเจริญเติบโตก็ได โดยทั่วไปสารควบคุมการเจริญเติบโตของพืชตองเปนสารอินทรีย ซ่ึงประกอบดวยคารบอน ไฮโดรเจน และออกซิเจนเปนหลัก ธาตุอาหารของพืช เชน น้ําตาล กรดอะมิโน และไขมัน ถึงแมวาเปนสารอินทรียและมีผลตอการเจริญเติบโตของพืช แตก็ไมไดจัดเปนสารควบคุมการเจริญเติบโต เนื่องจากสารเหลานี้เปนอาหารของพืชโดยตรง สวนธาตุอาหารตาง ๆ เชน ไนโตรเจน ฟอสฟอรัส เปนวัตถุดิบในการสรางอาหาร และไมจัดเปนสารอินทรีย จึงไมจัดเปนสารควบคุมการเจริญเติบโตเชนกัน (พีรเดช, 2542 อางโดย ปรัชพรรณ, 2550) สําหรับการชักนําแคลลัสกุหลาบไดมีรายงานการใชสารควบคุมการเจริญเติบโต 2 กลุมรวมกันระหวางออกซิน เชน dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) naphthaleneacetic acid (NAA) indole-3-butyric acid (IBA) p-chlorophenoxyacetic acid (pCPA) และไซโตไคนิน เชน Thidiazuron (TDZ) BA Kinetin สวนชนิดที่ใชนั้นแตกตางกันออกไปขึ้นกับชนิดและพันธุของกุหลาบ Khui และ Sink (1982) รายงานวา 2,4-D ความเขมขน 2 มิลลิกรัมตอลิตร รวมกับ Kinetin ความเขมขน 0.25 มิลลิกรัมตอลิตร และ casein hydrolysate ความเขมขน 2 กรัมตอลิตร หรือ 2,4-D ความเขมขน 5 มิลลิกรัมตอลิตร รวมกับ pCPA ความเขมขน 2 กรัมตอลิตร และ Kinetin ความเขมขน 0.1 มิลลิกรัมตอลิตร สามารถชักนําแคลลัสในกุหลาบพันธุ Tropicana และ Rosa manetti Hort. ไดสูงสุดหลังวางเลี้ยงเปนเวลา 3 สัปดาห Noriega และ Sondahl (1991) ใช 2,4-D ความเขมขน 2 มิลลิกรัมตอลิตร รวมกับ Zeatin ความเขมขน 1.5 มิลลิกรัมตอลิตร ชักนําแคลลัสใน R. hybrida Arene และคณะ (1993) ชักนําแคลลัสของกุหลาบพันธุ Meirutral ดวย 2,4-D ความเขมขน 4.5 ไมโครโมลาร รวมกับ BA ความเขมขน 2.2 ไมโครโมลาร ในกุหลาบพันธุ Moneyway พบวา การใช 2,4-D ความเขมขน 50 ไมโครโมลาร สามารถชักนําแคลลัสไดดี (Theo et at., 1996 ) Li และคณะ (2002) รายงานการชักนําแคลลัสในกุหลาบ R. chinensis cv. Red Sunblaze R. hybrida cv. Carefree Beauty และ R. hybrida cv. Grand Gala โดยใช 2,4-D ความเขมขน 11.3 หรือ 45.2 ไมโครโมลาร ในกุหลาบพันธุ Heckenzauber และ Pariser Charme ชักนําแคลลัสไดโดยวางเลี้ยงบนอาหารสูตรที่เติม 2,4-D หรือ NAA เปนเวลา 4 สัปดาห และยายเลี้ยงลงอาหารสูตร MS เติม Zeatine และ TDZ เพื่อชักนําใหเกิด

5

embryogenic callus และเพิ่มปริมาณโดยใช NAA รวมกับ Zeatine และ Gibberellic acid (GA3) (Dohm et al., 2001) Kamo (2004) รายงานวาการใช 2,4-D ความเขมขน 13.6 ไมโครโมลาร หรือ Dicamba ความเขมขน 18.1 ไมโครโมลาร รวมกับ Kinetin ความเขมขน 0.46 ไมโครโมลาร สามารถชักนําแคลลัสในกุหลาบพันธุ Kadinal ได ตอมา Bao และ Gao (2005) ศึกษาในกุหลาบพันธุ Samantha พบวา สามารถชักนําแคลลัสไดโดยใช 2,4-D ความเขมขน 7-10 มิลลิกรัมตอลิตร ในชวงแรกของการเพาะเลี้ยง จากนั้นเพิ่มปริมาณแคลลัสโดยการยายลงอาหารเติม TDZ ความเขมขน 1.5 มิลลิกรัมตอลิตร รวมกับ NAA ความเขมขน 0.01 มิลลิกรัมตอลิตร และ GA3 ความเขมขน 0.1 มิลลิกรัมตอลิตร Lloyd และคณะ (1988) ศึกษาการชักนําแคลลัสใน R. persica x xanthina โดยใช BA ความเขมขน 1-2 มิลลิกรัมตอลิตร รวมกับ NAA ความเขมขน 0.1-0.3 มิลลิกรัมตอลิตร Ishioka และ Tanimoto (1990) รายงานวา NAA เขมขน 10 ไมโครโมลาร สามารถชักนําแคลลัสของกุหลาบพันธุ Bulgarian หรือ กุหลาบมอญได หลังเพาะเลี้ยงเปนเวลา 6 สัปดาห สําหรับกุหลาบหนูพันธุ Baby Katie สามารถชักนําแคลลัสได 73 และ 67 เปอรเซ็นต ในอาหารสูตรที่เติม NAA ความเขมขน 11 และ 27 ไมโครโมลาร ตามลําดับ ซ่ึงสูงกวากุหลาบตัดดอกพันธุ Carefree Beauty และกุหลาบหนูพันธุ Red Sunblaze (Hsia and Korban, 1996) Soomro และคณะ (2003) ชักนําแคลลัสของ R. indica ดวย IBA เขมขน 0.6 หรือ 0.8 มิลลิกรัมตอลิตร รวมกับ NAA เขมขน 0.1 มิลลิกรัมตอลิตร Murali และคณะ (1996) ใช BA เขมขน 0.5-2 มิลลิกรัมตอลิตร รวมกับ Kinetin ความเขมขน 0.5-2 มิลลิกรัมตอลิตร และ Dicamba เขมขน 0.5-1 มิลลิกรัมตอลิตร เพาะเลี้ยงเปนเวลา 4-5 สัปดาห สามารถชักนําแคลลัสกุหลาบได Kintzios และคณะ (1996) ไดรายงานวาสามารถชักนําแคลลัสกุหลาบพันธุ Soraya Baccara Mercedes และ Ronto ได 100 เปอรเซ็นต โดยการใช pCPA เขมขน 53.5 ไมโครโมลาร รวมกับ Kinetin เขมขน 4.6 ไมโครโมลาร

นอกจากนี้ยังมรีายงานการชกันํา Somatic embryogenesis ใน R. bourboniana Desp โดยใช 2,4-D ความเขมขน 15 ไมโครโมลาร พบวา สามารถชักนํา Somatic embryogenesis ไดสูงสุด หลังวางเลี้ยงเปนเวลา 8 สัปดาห (Kaur et al., 2006) Estabrooks และคณะ (2007) รายงานวา กหุลาบพันธุ Livin Easy สามารถชักนํา Somatic embryogenesis ได โดยใช 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid (2,4,5-T) ความเขมขน 10 หรือ 25 ไมโครโมลาร

6

2. การชักนํายอดและดอกในหลอดทดลอง

การเจริญทางลําตนและการเกิดดอกของกุหลาบตองอาศัยกระบวนการตาง ๆ ทางสรีรวิทยาที่สลับซับซอน โดยมีปจจัยทั้งทางดานสภาพแวดลอมภายนอก ตลอดทั้งเกิดจากอิทธิพลภายในตนพืชเองเขามาเกี่ยวของในการเปลี่ยนแปลงเนื้อเยื่อเจริญจากการเจริญทางลําตนไปเปนระยะเจริญพันธุ (ออกดอก) ซ่ึงปจจัยเหลานั้น ไดแก อายุ ความพรอมของตนพืช ลักษณะทางพันธุกรรม และฮอรโมนภายใน สวนปจจัยภายนอก เชน แสง สารควบคุมการเจริญเติบโต และธาตุอาหาร เชน อัตราสวนของสารประกอบคารโบไฮเดรต และไนโตรเจน (C/N ratio) ในตนพืชหากปริมาณของคารโบไฮเดรตสูง และมีปริมาณของไนโตรเจนปานกลาง พืชจะออกดอกได แตถามีปริมาณของไนโตรเจนสูงกวาปริมาณของคารโบไฮเดรต พืชจะมีการเจริญทางกิ่ง ใบ เทานั้น ซ่ึงปจจัยตาง ๆ เหลานี้จะชวยสงเสริมใหพืชสรางตาดอกจนกระทั่งพัฒนาเปนดอกที่สมบูรณ (ลิลล่ี, 2546) โดยประโยชนของการชักนําดอกในหลอดทดลองนั้นมีหลายประการ ดังนี้

การปรับปรุงพันธุพืช: โดยทั่วไปพืชจะออกดอกได เมื่อพืชมีความพรอม คือ อายุ อาหาร และสภาพแวดลอม เชน กุหลาบพันธุมายวาเลนไทน จะออกดอกในชวงฤดูใบไมผลิถึงฤดูหนาว และเนื่องจากกุหลาบมีชวงการเจริญเติบโตติดตอกันเปนระยะเวลานานมากกวา 6 เดือน ดังนั้นตองใชเวลานานในการปรับปรุงพันธุ เพราะถาทําการปลูกทดสอบในแปลงปลูกตองใชเวลานับปในการเพาะเมล็ด อนุบาลตนกลา และการดูแลรักษาตนกลาจนกวาจะออกดอกได การนําเทคโนโลยีการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อเขามาชวยจึงสามารถรนระยะเวลาในการปรับปรุงพันธุไดมาก โดยชักนําการสรางดอกในระยะเวลาอันสั้นโดยการดัดแปลงสูตรอาหาร และสารควบคุมการเจริญเติบโตใหเหมาะสม จากนั้นก็สามารถที่จะทําการผสมพันธุในหลอดทดลองไดเลย เมล็ดก็สามารถที่จะเพาะในสภาพปลอดเชื้อทําใหขยายพันธุพืชพันธุใหม ๆ ไดจํานวนมากในระยะเวลาอันส้ัน

การจําแนกพันธุพืช: หากตองการทราบวาพืชที่พบเห็นมานั้นเปนพันธุไมชนิดอะไรหรือมีช่ือเรียกวาอยางไร ตองใชวิธีวิเคราะหและการจําแนกชนิดพันธุพืชนั้นโดยใชหลักวิชาพฤกษศาสตรสาขาอนุกรมวิธานพืช (Plant taxonomy) เปนหลักใหญ ซ่ึงการวิเคราะห คือการพิสูจนชนิดพืช ตองใชลักษณะทางสัณฐานของลําตน ใบ ดอก ผล ตลอดจนเมล็ด ในกรณีของสองลักษณะแรกนั้นมักไมพบปญหาเรื่องระยะเวลา แตพืชจํานวนมากที่มีลักษณะทางสัณฐานของใบและลําตนที่เหมือนกัน จึงไมสามารถใชลักษณะดังกลาวจําแนก หรือ แยกความแตกตางของสายพันธุไดดังนั้นลักษณะที่สาม คือลักษณะทางสัณฐานของดอกเปนตัวชวยได แตปญหาประการหนึ่งที่พบในพืชดอกบางชนิด เชนกลวยไม พืชยืนตน ที่สรางดอกชา และใชเวลานาน ดังนั้นหากตองรอจนพืช

7

ออกดอกแลวจึงแยกความแตกตางทําใหเสียเวลา การเรงวงจรการสรางดอกในหลอดทดลองชวยใหการวินิจฉัยสายพันธุพืชเปนไปอยางรวดเร็วและมีประสิทธิภาพ เชนกลวยไมเหลืองจันทบูรที่พบวามีสองสายพันธุ คือสายพันธุดอกเหลืองลวน และสายพันธุที่มีสีแดงเขมแตม หากตองแยกดวยลักษณะทางลําตน และใบไมสามารถทําได ตองปลูกอยางนอย 1 ป จึงแยกความแตกตางโดยใชดอกได ดังนั้นหากชักนําการสรางดอกในหลอดทดลองเพียงเวลา 1-2 เดือนก็ทราบไดวาตนไหนเปนสายพันธุใด

สรางมูลคาเพิ่มใหผลิตภัณฑ: เนื่องจากปจจุบันงานวิจัยดานเทคโนโลยีชีวภาพสามารถสรางรายไดทางเศรษฐกิจไดนั้น หลาย ๆ หนวยงานทั้งภาครัฐและภาคธุรกิจไดทําการปรับปรุงพันธุพืชมาอยางตอเนื่อง โดยการคัดเลือกพันธุแปลกหรือพันธุทนทานตอโรค ซ่ึงกุหลาบสายพันธุมายวาเลนไทนมีคุณสมบัติเดนกวาสายพันธุอ่ืน ๆ คือมีความทนทานตอโรคราน้ําคาง ซ่ึงเปนสาเหตุหลักของการตายของตนกุหลาบ หรือการผลิตดอกกุหลาบที่ไมไดมาตรฐาน ดอกมีกล่ินหอม สามารถนํามาใชเปนวัตถุดิบในอุตสาหกรรมน้ําหอม น้ํามันหอมระเหย ใชเปนสวนประกอบในการผลิตเครื่องสําอาง รวมทั้งผลิตภัณฑดานความงามเพิ่มสูงขึ้น ดังนั้นการชักนําดอกในหลอดทดลองจึงสามารถเพิ่มมูลคาของผลิตภัณฑได โดยปจจุบันมีการจําหนายตนไมในขวดแกว สรางรายไดตั้งแต 20-5,000 บาท ขึ้นอยูกับภาชนะที่ใสและสายพันธุไมดวย (บดินทร และศิริโรจน, 2549 อางโดย ปรัชพรรณ, 2550)

2.1 การชักนํายอดในหลอดทดลอง

ดังที่กลาวขางตนวา การเจรญิของพืชตองอาศัยกระบวนการตาง ๆ ทางสรีรวิทยาที่สลับซับซอน โดยมีปจจัยทัง้ทางดานสภาพแวดลอมภายนอก ตลอดทั้งเกิดจากอิทธิพลภายในตนพืชเองตอการสรางยอดรวม สําหรับพืชกลุมกุหลาบมีรายงานการชักนํายอดในหลอดทดลองโดยใชสารควบคุมเพียงชนดิเดยีว Kim และคณะ (2003) พบวา สามารถชักนํายอดของกุหลาบไดโดยใช BA ความเขมขน 2 มิลลิกรัมตอลิตร Kumar และคณะ(2001) รายงานวา การใช TDZ เพยีงอยางเดยีว ความเขมขน 0.22-0.55 มิลลิกรัมตอลิตร สามารถชักนํายอดในกุหลาบไดเชนกัน แตจากรายงานการศกึษาโดยสวนใหญ พบวา การชักนํายอดในกุหลาบตองใชสารควบคุมการเจริญเติบโตมากกวา 1 ชนดิ Khui และ Sink (1982a, 1982b) ศึกษาเปรียบเทียบการชักนํายอดในกุหลาบ 4 พันธุ คือ Tropicana Bridal Pink Rosa damascana และ Rosa canina โดยวางเลี้ยงชิ้นสวนขอบนอาหารสูตร MS เติม BA ความเขมขน 1-2 มิลลิกรัมตอลิตร รวมกับ NAA ความเขมขน 0.05-0.15 มิลลิกรัมตอลิตร พบวา กหุลาบพันธุ Tropicana และ Bridal Pink มีการสรางยอดรวมสูงที่สุด

8

Hasegawa (1979) ศึกษาในกุหลาบพันธุ Improved Blaze โดยวางเลี้ยงขอบนอาหารสูตร MS เติม BA ความเขมขน 3 มิลลิกรัมตอลิตร รวมกับ Indole-acetic acid (IAA) ความเขมขน 0.3 มิลลิกรัมตอลิตร พบวา ชักนํายอดไดสูงสุด ในการศกึษาการชักนํายอดของกหุลาบตอ ๆ มานั้น มีรายงานการใชสารควบคุมการเจริญเติบโตชนิด และความเขมขนตาง ๆ เชน การใช BA ความเขมขน 0.05-10 มิลลิกรัมตอลิตร รวมกับ IAA ความเขมขน 0.02-1 มิลลิกรัมตอลิตร (Hasegawa, 1980; Martin et al., 1981) หรือรวมกับ NAA ความเขมขน 0.005-0.5 มิลลิกรัมตอลิตร (Skirvin and Chu, 1979; Tweddle et al., 1984; Sauer et al., 1985; Carelli and Echeverrigaray, 2002) หรือรวมกับ Indole-3-butyric acid (IBA) ความเขมขน 0.01-0.1 มิลลิกรัมตอลิตร (Compos et al., 1990; รงรอง, 2542; He et at., 1996; Soomro et al., 2003) และยังมีการใช GA3 ความเขมขน 0.01-0.25 รวมดวย (Davies, 1980; Sahoo and Debata, 1997; Singh and Syamal, 1999; Syamal and Singh, 1996)

สําหรับพืชชนดิอื่น ๆ ไดมีรายงานการชกันํายอดในกลวยไมโดยการใช BA เพียงอยางเดยีว ความเขมขน 4.4-44 ไมโครโมลาร (Chamber et al., 1991; Duan and Yazawa, 1995; Ramanayake et al., 2001; Ling and Keng, 2006; Sim et al., 2007) หรือใชรวมกบั NAA ความเขมขน 0.5 มิลลิกรัมตอลิตร (ปรัชพรรณ, 2550) Franklin และคณะ (2000) ชักนํายอดของ Green pea จากการเพาะเลีย้งชิ้นสวนใบเลี้ยง และปลายยอดบนอาหารสูตร MS เติม BA ความเขมขน 2 มิลลิกรัมตอลิตร รวมกับวิตามินบี 5 พบวา ชักนํายอดได 32 และ 7 เปอรเซ็นต ตามลําดับ Zhang (2007) ศึกษาใน Perilla โดยวางเลี้ยงใบเลี้ยงและสวนลําตนใตใบเลี้ยง บนอาหารสูตร MS เติม BA รวมกับ IAA อยางละ 0.5 มิลลิกรัมตอลิตร พบวา สามารถชักนํายอดรวมได Britto และคณะ (2003) ศึกษาใน Ceropegia bulbosa Roxb. Var. bulbosa โดยเพาะเลี้ยงชิ้นสวนขอบนอาหารสูตร B5 เติม BA ความเขมขน 3 มิลลิกรัมตอลิตร รวมกับ NAA ความเขมขน 0.05 มิลลิกรัมตอลิตร พบวา สามารถชักนํายอดรวมไดสูงสุด 12 ยอดตอช้ินสวน Ling และคณะ (2003) เปรียบเทียบผลของสารควบคุมการเจริญเตบิโตและซูโครสตอการชักนํายอดของไผ (Bambusa edulis) พบวา การเพาะเลี้ยงยอดบนอาหารสูตร MS เติม TDZ ความเขมขน 0.5 ไมโครโมลาร รวมกับซูโครส 3 เปอรเซ็นต สามารถชักนํายอดได 3.92 เปอรเซ็นต Data และคณะ (2005) ชักนํายอดในเบญจมาศ 4 พันธุ พบวา เมื่อเพาะเลี้ยงปลายยอดบนอาหารสูตร MS เติม NAA ความเขมขน 0.5 มิลลิกรัมตอลิตร เบญจมาศพันธุ Puja มีการสรางยอดรวมไดสูงสดุ 85 เปอรเซ็นต สวนอาหารสูตร MS เติม TDZ ความเขมขน 2 มิลิกรัมตอลิตร ชักนํายอดรวมของเบญจมาศพันธุ Sunil ไดสูงสุด 75 เปอรเซ็นต นอกจากนี้ยังมรีายงานการชกันํายอดโดยใช Adenine sulfate ความเขมขน 1 มิลลิกรัมตอลิตร รวมกับ BA ความเขมขน 4 มิลลิกรัมตอลิตร และ IAA ความเขมขน 1 มิลลิกรัมตอลิตร ใน Pentanema indicum (Sivanesan and Jeang., 2007)

9

นอกจากนี้สูตรอาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อยังเปนอีกปจจยัทีส่งเสริมการสรางยอดในหลอดทดลอง โดยสวนใหญแลวกหุลาบเกือบทุกสายพันธุสามารถเพิ่มยอดไดสูงสุดเมื่อเพาะเลีย้งในอาหารสังเคราะหสูตร MS (รงรอง, 2542; Compos et al., 1998; Kim et al., 2001; Soomro et al., 2003) 2.2 การชักนําดอกในหลอดทดลอง

การสรางดอกของพืชไดรับอิทธิพลทั้งจากปจจัยภายในและภายนอก คือ พืชตองมีการเจริญเติบโตทางลําตนถึงชวงอายุที่เหมาะสมจึงมีการสรางดอก อายุพืชมีความสัมพันธกับขนาดของตนพืช ซ่ึงเกี่ยวของกับปริมาณอาหารในพืชโดยตรง คารโบไฮเดรตที่ไดจากการสังเคราะหดวยแสงและสะสมในพืชซ่ึงมีผลตอการสรางดอก Bressan และคณะ (1982) ศึกษาในกุหลาบพันธุ Improved Blaze และ Gold Glow โดยการวางเลี้ยงชิ้นสวนขอบนอาหารสูตร MS เติม BA ความเขมขน 1 มิลลิกรัมตอลิตร รวมกับ IAA ความเขมขน 0.3 มิลลิกรัมตอลิตร สามารถชักนําดอกไดดีที่สุด Franklin และคณะ (2000) เพาะเลี้ยงยอดของ green pea บนอาหารสูตร MS ซ่ึงเติมซูโครสความเขมขนที่แตกตางกันตั้งแต 0-6 เปอรเซ็นต รวมกับ IBA ความเขมขน 0.5 มิลลิกรัมตอลิตร และ GA3 ความเขมขน 1 มิลลิกรัมตอลิตร พบวา อาหารสูตรที่เติมซูโครส 3 เปอรเซ็นต ใหดอกสูงสุด 4.2 ดอก โดยยอดอายุ 84 วัน ใหการเกิดดอกสูงสุด 100 เปอรเซ็นต และยังพบวา การเลือกใชยอดที่มีอายุ 28 วัน สงผลใหตนพืชมีการยืดยาวมากที่สุด 13.5 เซนติเมตร นอกจากนี้สภาพแวดลอมยังมีอิทธิพลตอการเกิดดอก และการพัฒนาของดอก ดังจะเห็นไดวาพืชบางชนิดสามารถออกดอกไดทุกฤดู แตมีพืชอีกหลายชนิดตองผานสภาพแวดลอมที่เฉพาะ เชน การมีชวงแสงที่เหมาะสม เนื่องจากแสงเปนแหลงพลังงานที่สําคัญในกระบวนการสรางอาหารของพืช โดยทั่วไปพืชสวนใหญ ตองการความเขมของแสงสูงในการออกดอก โดยมีผลตอการสะสมปริมาณสารอาหารในพืช และกระตุนการสรางตาดอก สําหรับกุหลาบในสภาพธรรมชาตินั้นตองการแสงอยางนอย 6 ช่ัวโมง (เศรษฐพงศ, 2543; โสระยา, 2544) จากผลการศึกษาของ Hamner และ Bonner (1985) อางโดยลิลล่ี (2546) พบวา ความเขมแสงระดับต่ํา ๆ ก็สามารถชักนําการออกดอกได แตโดยทั่วไปการเจริญทางลําตนและคุณภาพดอกของกุหลาบเพิ่มขึ้นเมื่อไดรับแสงเพิ่มขึ้น (เศรษฐพงศ, 2543; ลิลล่ี, 2546) โดยจากการศึกษาของ Boodley (1981) อางโดยลิลล่ี (2546) พบวา ในฤดูหนาวซึ่งความเขมแสงลดลง สงผลใหอัตราการเจริญของตนกุหลาบชาลง แตเมื่อมีการใหแสงกับกุหลาบโดยใช High intensity discharge (HID) lamp ความเขมแสง 1,200-1,500 ฟุตเทียน นาน 9 ช่ัวโมง ปรากฏวา สามารถปรับปรุงการเจริญ และการออกดอกไดเมื่อ

10

เทียบกับการปลูกปกติ โดยมีปริมาณผลผลิตเพิ่มขึ้น 100 เปอรเซ็นต นอกจากนี้การไดรับธาตุอาหารในปริมาณที่เหมาะสมก็มีผลตอการออกดอกพืช เพราะการออกดอกของพืชขึ้นอยูกับอัตราสวนของไนโตรเจนและคารโบไฮเดรตในตนพืช ถาปริมาณไนโตรเจนสูง สงเสริมการสรางใบ และกิ่ง หรือการเจริญทางลําตน ทําใหการสรางดอกของพืชเกิดยาก หรือชา ในขณะที่ปริมาณคารโบไฮเดรตหรือสารประกอบคารบอนในพืชซ่ึงสูง หรือในสภาพที่พืชไดรับฟอสฟอรัสและโพแทสเซียมสูง มีผลตอการกระตุนการสรางดอกของพืช โสระยา (2544) รายงานวา ฟอสฟอรัสชวยใหกุหลาบมีการสรางดอก ติดเมล็ด และมีการเจริญของรากที่ดี โพแทสเซียมชวยใหกุหลาบมีความแข็งแรงขึ้น จากการศึกษาของ McDonald ป ค.ศ. 1995 อางโดยโสระยา (2544) พบวา การปลูกกุหลาบในโรงเรือนตองการระดับธาตุอาหารไนโตรเจน 170 ppm (part per million) ฟอสฟอรัส 34 ppm โพแทสเซียม 150 ppm แคลเซียม 120 ppm แมกนีเซียม 12 ppm Woodson และ Boodley (1982) อางโดย โสระยา (2544) ศึกษาถึงผลของไนโตรเจนในรูปของ ไนเตรทหรือแอมโมเนียม และโพแทสเซียมตอการเจริญและการออกดอกของกุหลาบ Forever Yours โดยการใหโพแทสเซียมความเขมขนต่ํา 1 มิลลิกรัมตอลิตร ทําใหการเจริญและผลผลิต ดอกถูกจํากัด Kraus และ Kraybill (1918) อางโดยสัมฤทธิ์ (2544) พบวา สัดสวนของคารบอนตอไนโตรเจน เปนตัวกําหนดการออกดอกของพืช Chandler (1958) อางโดยสมบุญ (2544) รายงานวาเนื้อเยื่อกุหลาบที่มีคาความสัมพันธระหวางปริมาณคารบอนตอไนโตรเจนสูงสงเสริมการสรางดอก สวนเนื้อเยื่อที่มีคาคารบอนตอไนโตรเจนต่ํา สงเสริมการสรางใบ และกิ่งกาน

สําหรับพืชอ่ืน ๆ นั้น ไดมีรายงานไว เชน การศึกษาผลของซูโครสตอการสรางดอกของ Brassica napus พบวา อาหารสูตร MS เติมซูโครสความเขมขน 3 เปอรเซ็นต รวมกับการลดความเขมขนของไนโตรเจนลง 1 ใน 5 สวน และเพิ่มความเขมขนของฟอสเฟสเปน 2 เทา ใหผลดีที่สุด โดยซูโครส 3 เปอรเซ็นต ใหดอกปกติ 40 เปอรเซ็นต ดอกผิดปกติ 20 เปอรเซ็นต สวนที่ความเขมขน 4 เปอรเซ็นต ใหดอกปกติ 30 เปอรเซ็นต และดอกผิดปกติ 40 เปอรเซ็นต หลังเพาะเลี้ยงเปนเวลา 6 สัปดาห (Koh and Loh, 2000) Dewir และคณะ (2007) รายงานการศึกษาเปรียบเทียบผลของซูโครสและ GA3 ตอการเกิดดอกของ Spathiphyllum พบวา อาหารสูตร MS เติมซูโครส 6 เปอรเซ็นต รวมกับ GA3 ความเขมขน 10 มิลลิกรัมตอลิตร ชักนําดอกไดสูงสุด 85 เปอรเซ็นต เมื่อเพาะเลี้ยงเปนเวลา 3 เดือน

11

วัตถุประสงค

1. ศึกษาผลของสูตรอาหารและสารควบคุมการเจริญเติบโตที่เหมาะสมตอการชักนําแคลลัสในกุหลาบพันธุมายวาเลนไทน

2. ศึกษาผลของสูตรอาหาร สารควบคุมการเจริญเติบโต ซูโครส และความเขมแสง ตอการชักนํายอดและดอกในหลอดทดลอง รวมถึงศึกษาผลของจํานวนครั้งในการยายเลี้ยงตอการพัฒนาการของดอกกุหลาบพันธุมายวาเลนไทน

12

บทที่ 2

วัสดุ อุปกรณและวิธีการวิจัย

วัสดุอุปกรณ

1.วัสดุ

1.1 วัสดุพืช

การศึกษานีใ้ชช้ินสวนใบออนและขอของกุหลาบพันธุมายวาเลนไทน ที่เพาะเลี้ยงบนอาหารสูตร MS ที่ปราศจากสารควบคุมการเจริญเตบิโต น้ําตาลซูโครสเขมขน 3 เปอรเซ็นต ภายใตการใหแสงนาน 14 ช่ัวโมงตอวัน ที่ความเขมแสง 25.35 ไมโครโมลตอตารางเมตรตอวินาที อุณหภูมิ 26 + 4 องศาเซลเซียส ยายเลี้ยงทกุ 1 เดือน เปนเวลานาน 7 เดอืน (ภาพที่ 1)

ภาพที่ 1 ตนกุหลาบพันธุมายวาเลนไทนที่เล้ียงบนอาหารสูตร MS ที่ปราศจากสารควบคุมการเจริญเติบโต เปนเวลา 7 เดือน

13

1.2 สารเคมีท่ีใชในการทดลอง

- สารเคมีที่ใชเตรียมธาตุอาหารหลัก และธาตุอาหารรองของอาหารสูตร MS ½ MS และ LS (รายละเอียดของสูตรอาหารแสดงในตารางภาคผนวก)

- น้ําตาลซูโครส - สารควบคุมการเจริญเติบโต คือ 2,4-D BA NAA และ TDZ - วุนตรานางเงือก - สารละลายปรับความเปนกรด-ดาง (pH) คือ HCl หรือ KOH

2. อุปกรณการทดลอง

2.1 เคร่ืองมือ และอุปกรณท่ีใชในการเตรียมอาหาร

- เครื่องปรับความเปนกรด-ดาง (pH meter) - เครื่องคนสารละลายพรอมแทงแมเหล็ก - เครื่องชั่งทศนิยม 2 และ 4 ตําแหนง - หมอนึ่งความดันไอ - ตูอบแหงและอบฆาเชื้อ - ตูอบไมโครเวฟ - เครื่องแกวที่ใชในการทดลอง ประกอบดวย ฟลาสก ไปเปต กระบอกตวง ขวด

ปรับปริมาตร บีกเกอร ขวดเพาะเลี้ยง - ไมโครไปเปต พรอมทิปนึ่งฆาเชื้อ - ตูเย็นและตูแชแข็ง

2.2 เคร่ืองมือ และอุปกรณท่ีใชในการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ

- ตูยายเลี้ยงเนื้อเยื่อ - ปากคีบ - ดามมีดและใบมีดผาตัด

14

- กระดาษชําระ - แอลกอฮอล 70 และ 95 เปอรเซ็นต - จานเพาะเลี้ยงขนาด 10 เซนติเมตร

2.3 เคร่ืองมือ และอุปกรณท่ีใชในการวางเลี้ยงเนื้อเยื่อ

- เครื่องวัดความเขมแสง - ช้ันวางเลี้ยง

วิธีการวิจัย 1. การศึกษาปจจัยท่ีมีผลตอการชักนําแคลลัสของกุหลาบพันธุมายวาเลนไทน

1.1 ศึกษาผลของ 2,4-D และ TDZ ตอการชักนําแคลลัสของกุหลาบพันธุมายวาเลนไทน

นําชิ้นสวนใบออนของกุหลาบพันธุมายวาเลนไทนอาย ุ 7 เดือน ซ่ึงอยูในหลอดทดลองมาสรางบาดแผล 2 แผลตอใบ เพาะเลี้ยงบนอาหารสูตร MS ซ่ึงเติมสารควบคุมการเจริญเติบโตตาง ๆ ไดแก 2,4-D จํานวน 3 ระดับ คือ 0.2 0.5 และ 1 มิลลิกรัมตอลิตร และ TDZ จํานวน 3 ระดบั คือ 0.5 1 และ 1.5 มิลลิกรัมตอลิตร จากนั้นวางเลีย้งในที่มืด ที่อุณหภูมิ 26 + 4 องศาเซลเซียส บันทึกขอมูลการเกิดแคลลัสหลังการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อทุก ๆ สัปดาห เปนเวลา 4 สัปดาห โดยขอมูลที่บันทึก คือ จํานวนชิน้สวนที่เกิดแคลลัส เปอรเซ็นตการเกิดแคลลัส ปริมาณ ลักษณะและสขีองแคลลัส ในแตละสิ่งทดลอง (Treatment) เปรียบเทียบกันโดยใชแผนการทดลองแบบสุมอยางสมบูรณ (Completely randomized design: CRD) และเปรียบเทยีบคาเฉลี่ยโดยวิธี Duncan’s Multiple Range Test (DMRT) แตละสิ่งทดลอง มี 4 ซํ้า ๆ ละ 25 ช้ินสวน

1.2 ศึกษาผลของสูตรอาหารและสารควบคุมการเจริญเติบโตตอการชักนําแคลลัสของกุหลาบ

พันธุมายวาเลนไทน นําชิ้นสวนใบออนเพาะเลีย้งบนอาหารสูตร MS และ ½ MS เติมสารควบคุมการเจริญเติบโตที่แตกตางกัน คอื BA 2,4-D และ TDZ ความเขมขน 0.5 1 และ 1.5 มลิลิกรัมตอลิตร ตามลําดับ รวมกับ NAA ความเขมขน 0.01 และ 0.05 มิลลิกรัมตอลิตร วางเลี้ยงในที่มืด อุณหภูมิ

15

26 + 4 องศาเซลเซียส บันทึกขอมูลการเกิดแคลลัสหลังการเพาะเลีย้งเนื้อเยื่อทุก ๆ สัปดาห โดยขอมูลที่บันทึก คือ จํานวนชิ้นสวนที่เกิดแคลลัส เปอรเซ็นตการเกดิแคลลัส ปริมาณ ลักษณะและสีของแคลลัส ในแตละสิ่งทดลองเปรียบเทียบกันโดยใชแผนการทดลองแบบสุมอยางสมบูรณ และเปรียบเทียบคาเฉลี่ยโดยวิธี DMRT แตละสิ่งทดลองมี 4 ซํ้า ๆ ละ 25 ช้ินสวน

จากนั้นยายชิ้นสวนใบไปเพาะเลี้ยงบนอาหารสูตรที่ดีที่สุดที่ไดจากการศึกษาที่ 1.1 และ 1.2 เพื่อศึกษาผลของ NAA จึงไดดดัแปลงสูตรอาหารดังกลาวโดยการเติม NAA ระดับความเขมขนตาง ๆ วางเลี้ยงในที่มืด อุณหภูม ิ 26 + 4 องศาเซลเซียส บันทึกขอมูลเชนเดียวกับขางตน ใชแผนการทดลองและเปรียบเทียบคาเฉลี่ยโดยวิธีเดยีวกบัขางตนเชนกนั

2. การศึกษาปจจัยท่ีมีผลตอการชักนํายอด และดอกของกุหลาบพันธุมายวาเลนไทนในหลอด

ทดลอง

2.1 ศึกษาผลของสูตรอาหารสังเคราะห และ BA ตอการสรางยอดรวมและการสรางดอก นําสวนขอของตนกุหลาบพันธุมายวาเลนไทนที่ไดจากการเพาะเลี้ยงบนอาหารสูตร MS ปราศจากสารควบคุมการเจริญเติบโต อายุ 2 เดือน ความยาว 2 ขอ มาวางเลี้ยงบนอาหารสูตร LS และ MS เติม BA ความเขมขน 0 0.1 0.2 0.3 0.4 และ 0.5 มิลลิกรัมตอลิตร ตามลําดับ ภายใตการใหแสงนาน 14 ช่ัวโมงตอวัน ที่ความเขมแสง 25.35 ไมโครโมลตอตารางเมตรตอวินาที อุณหภูมิ 26 + 4 องศาเซลเซียส หลังเพาะเลี้ยงเปนเวลา 1 สัปดาห บันทึกผลจํานวนยอดรวม จํานวนตาดอก จํานวนดอก ทุก ๆ สัปดาห เปนเวลา 9 สัปดาห ในแตละสิ่งทดลองเปรียบเทียบกันโดยใชแผนการทดลองแบบสุมอยางสมบูรณ และเปรียบเทียบคาเฉลี่ยโดยวิธี DMRT

2.2 ศึกษาผลของน้ําตาลและความเขมแสงตอการสรางยอดรวมและการสรางดอก

นําชิ้นสวนขอของกุหลาบพนัธุมายวาเลนไทนอาย ุ6 เดอืน ความยาว 2 ขอตอหนึ่งช้ินสวน เพาะเลี้ยงบนอาหารสูตร MS ที่ปราศจากสารควบคุมการเจริญเติบโต เติมน้ําตาลซูโครส 4 ระดับ คือ 3 3.5 4 และ 4.5 เปอรเซ็นต โดยแตละความเขมขนวางเลี้ยงภายใตการใหแสง 25.35 และ 50.70 ไมโครโมลตอตารางเมตรตอวนิาที อุณหภมูิ 26+4 องศาเซลเซียส หลังเพาะเลี้ยงเปนเวลา 5 สัปดาห บันทกึผลจํานวนยอดรวม จํานวนตาดอก จํานวนดอก ในแตละสิ่งทดลองเปรียบเทียบกนัโดยใชแผนกการทดลองแบบสุมอยางสมบูรณหลายปจจัย และเปรยีบเทียบคาเฉลี่ยโดยวิธี DMRT

16

2.3 ศึกษาผลของจาํนวนครัง้การยายเลี้ยงตอการสรางดอก

นําตนกุหลาบพันธุมายวาเลนไทนที่ไดจากการเพาะเลี้ยงบนอาหารสูตร LS และ MS ที่เติม BA ความเขมขน 0.2 มิลลิกรัมตอลิตร มาเพาะเลี้ยงบนอาหารสูตร MS ที่ปราศจากสารควบคุมการเจริญเติบโต เปนเวลา 4 สัปดาห จากนั้นนํามาเพาะเลี้ยงบนอาหารสูตร MS เติม BA ความเขมขน 0.2 มิลลิกรัมตอลิตร เปนเวลา 4 สัปดาห ภายใตการใหแสงนาน 14 ช่ัวโมงตอวัน ที่ความเขมแสง 25.35 ไมโครโมลตอตารางเมตรตอวินาที อุณหภูมิ 26 + 4 องศาเซลเซียส บันทึกการออกดอก แลวยายลงอาหารสูตร MS ที่ปราศจากสารควบคุมการเจริญเติบโต เปนเวลา 4 สัปดาห จากนั้นนํามาเพาะเลี้ยงบนอาหารสูตร MS เติม BA ความเขมขน 0.2 มิลลิกรัมตอลิตร เปนเวลา 4 สัปดาห ภายใตสภาวะแวดลอมเชนเดิม บันทึกการออกดอก ทําซ้ําเชนเดิมจํานวน 6 คร้ัง ในแตละครั้งที่ยายเลี้ยงตรวจสอบการออกดอกเปรียบเทียบกันโดยใชแผนการทดลองแบบสุมอยางสมบูรณและเปรียบเทียบคาเฉลี่ยโดยวิธี DMRT

17

บทที่ 3

ผล

1. การศึกษาปจจัยท่ีมีผลตอการชักนําแคลลัสของกุหลาบพันธุมายวาเลนไทน

1.1 ศึกษาผลของ 2,4-D และ TDZ ตอการชักนําแคลลัสของกุหลาบพันธุมายวาเลนไทน จากการศึกษาเปรียบเทียบสารควบคุมการเจริญเติบโต คือ 2,4-D และ TDZ ซ่ึงเติมในอาหารสูตร MS พบวา ช้ินสวนใบทีเ่พาะเลี้ยงบนอาหารสูตรนี้เตมิ TDZ สงเสริมใหมีการสรางแคลลัสกอนอาหารสูตรที่เติม 2,4-D โดย TDZ ความเขมขน 1.5 มิลลิกรัมตอลิตร ใหเปอรเซ็นตการสรางแคลลัสสูงสุด 64 เปอรเซ็นต แตกตางอยางมีนยัสําคัญทางสถิติ (p<0.05) หลังวางเลี้ยงเปนเวลา 4 สัปดาห รองลงมา คือ TDZ ความเขมขน 1 มิลลิกรัมตอลิตร ใหเปอรเซ็นตการสรางแคลลัส 56 เปอรเซ็นต (ตารางที่ 1) แคลลัสที่ไดมีลักษณะเปนแบบ friable และ compact มีสีขาวถึงสีเหลือง (ภาพที่ 2 ฉ-ช) ในขณะที่แคลลัสโดยสวนใหญมีสีขาว (ภาพที่ 2 ข-จ) ซ่ึงการชักนาํแคลลัสโดยใช TDZ นี้ ใหเปอรเซ็นตการสรางสูงกวา 2,4-D ถึง 4 เทาเปนอยางนอย สวนสูตรอาหารที่ไมมีการเติมสารควบคุมการเจริญเติบโตนั้นไมสามารถชักนําแคลลัสได (ภาพที่ 2 ก)

18

ตารางที่ 1 ผลของชนิดและความเขมขนของสารควบคุมการเจริญเติบโตตอการชักนําแคลลัสจากการเพาะเลี้ยงชิ้นสวนใบบนอาหารสูตร MS เปนเวลา 4 สัปดาห

ทรีตเมนต จํานวนใบที่สรางแคลลัส

การสรางแคลลัส (%)

ปริมาณแคลลัส

สีแคลลัส ลักษณะแคลลัส

Hormone-free MS 0 0b - - - 0.2 mg/l 2,4-D 2 8b + W F 0.5 mg/l 2,4-D 1 4b + W F 1 mg/l 2,4-D 3 12b +++ W F C 0.5 mg/l TDZ 8 32ab + W F C

1 mg/l TDZ 14 56a ++ W Y F C

1.5 mg/l TDZ 16 64a +++ W Y F C

F-test * C.V. (%) 9.87

* แตกตางทางสถิติอยางมีนัยสําคัญ (P ≤ 0.05) คาเฉลี่ยที่กํากบัดวยตัวอักษรที่ตางกันมีความแตกตางทางสถิติเมื่อเปรียบเทียบดวยวิธี DMRT - = ไมมีการสรางแคลลัส + = สรางแคลลัสนอยกวา 25 เปอรเซ็นตของชิ้นสวนใบ ++ = สรางแคลลัส 26- 75 เปอรเซ็นตของชิ้นสวนใบ +++ = สรางแคลลัสมากกวา 75 เปอรเซ็นตของชิ้นสวนใบ W = White W Y = White Yellow F = Friable callus C = Compact callus

19

ภาพที่ 2 Friable callus และ compact callus จากการเพาะเลี้ยงชิ้นสวนใบบนอาหารสูตร MS เติม

สารควบคุมการเจริญเติบโตชนิดตาง ๆ เปนเวลา 4 สัปดาห (บาร = 1 เซนติเมตร) (ก) MS free (ข) MS + 0.2 mg/l 2,4-D (ค) MS + 0.5 mg/l 2,4-D (ง) MS + 1 mg/l 2,4-D (จ) MS + 0.5 mg/l TDZ (ฉ) MS + 1 mg/l TDZ (ช) MS + 1.5 mg/l TDZ

ข ก

ค ง

จ ฉ

ช

20

1.2 ศึกษาผลของสูตรอาหารและสารควบคุมการเจริญเติบโตตอการชักนําแคลลัสของกุหลาบพันธุมายวาเลนไทน

หลังจากเพาะเลี้ยงชิ้นสวนใบออนของกุหลาบพันธุมายวาเลนไทนบนอาหารสูตร MS และ ½ MS เติมสารควบคุมการเจริญเติบโตที่เหมือนกัน เปนเวลา 3 สัปดาห พบวา อาหารสูตร MS สงเสริมการสรางแคลลัสไดดีกวาอาหารสูตร ½ MS โดยใหเปอรเซ็นตการสรางแคลลัสเฉลี่ย 40 เปอรเซ็นต ในขณะที่อาหารสูตร ½ MS ใหเปอรเซ็นตการสรางแคลลัสเฉลี่ยเพียง 18 เปอรเซ็นต (ตารางที่ 2) จากการศึกษาผลของสารควบคุมการเจริญเติบโต 2 ชนิด พบวา TDZ รวมกับ NAA ใหการสรางแคลลัสสูงสุด อยูในชวง 36-84 เปอรเซ็นต บนอาหารสูตร MS และ 8-56 เปอรเซ็นต บนอาหารสูตร ½ MS แตกตางอยางมีนัยสําคัญทางสถิติ (p<0.05) กับสารควบคุมการเจริญเติบโตชนิดและความเขมขนอื่น ๆ หลังเพาะเลีย้งเปนเวลา 3 สัปดาห รองลงมาคือ การใช BA รวมกับ NAA ใหการสรางแคลลัส 32-44 เปอรเซ็นต บนอาหารสูตร MS และ 8-12 เปอรเซ็นต บนอาหารสูตร ½ MS และเมื่อใช 2,4-D รวมกับ NAA พบวา มกีารสรางแคลลัสต่ําสุด 12-32 เปอรเซ็นต บนอาหารสูตร MS และ 4-20 เปอรเซ็นต บนอาหารสูตร ½ MS (ตารางที่ 2) สําหรับแคลลัสที่ชักนําไดจากการใช BA รวมกับ NAA พบวา แคลลัสมีลักษณะเปน friable สีขาว และมีปริมาณนอย ทั้งบนอาหารสูตร MS (ภาพที่ 3 ก-ข ) และอาหารสูตร ½ MS (ภาพที ่4 ก-ข) การใช 2,4-D รวมกับ NAA ใหแคลลัสลักษณะเปน compact สีขาว ปริมาณนอยเชนเดียวกับการใช BA รวมกับ NAA ทั้งสองสูตรอาหาร (ภาพที่ 3 ค-ง (อาหารสูตร MS) และภาพที่ 4 ค-ง (อาหารสูตร ½ MS)) การใช TDZ รวมกับ NAA ใหแคลลัสทั้งสองลักษณะ คือ friable และ compact สีขาวถึงสีเหลืองทั้งบนอาหารสูตร MS (ภาพที่ 3 จ-ฉ) และ ½ MS (ภาพที ่4 จ-ฉ) มีปริมาณแคลลัสสูงสุดเมื่อเปรียบเทยีบกับการเติม BA รวมกับ NAA และ 2,4-D รวมกับ NAA

21

ตารางที่ 2 ผลของสูตรอาหารและสารควบคุมการเจริญเติบโตตอการชักนําแคลลัสหลังจาก เพาะเลี้ยงชิ้นสวนใบเปนเวลา 3 สัปดาห สารควบคุมการเจริญเติบโต

(มก/ล) สูตรอาหาร

BA 2,4-D TDZ NAA

จํานวนใบที่สรางแคลลัส

การสรางแคลลัส

(%)

ปริมาณแคลลัส

สี ลักษณะแคลลัส

MS 0.5 - - 0.01 11 44bc + W F 0.5 - - 0.05 8 32bc + W F - 1 - 0.01 8 32bc + W Y C - 1 - 0.05 3 12d + W Y C - - 1.5 0.01 9 36bc + W F C - - 1.5 0.05 21 84a ++ W F C

เฉลี่ย 40

½ MS 0.5 - - 0.01 2 8d + W F 0.5 - - 0.05 3 12d + W F - 1 - 0.01 5 20cd + W Y C - 1 - 0.05 1 4d + W Y C - - 1.5 0.01 2 8d + W F C - - 1.5 0.05 14 56ab + W F C

เฉลี่ย 18 F-test *

C.V.(%) 6.81 * แตกตางทางสถิติอยางมีนัยสําคัญ (P ≤ 0.05) คาเฉลี่ยที่กํากับดวยตัวอักษรที่ตางกันมีความแตกตางทางสถิติเมื่อเปรียบเทียบดวยวิธี DMRT + = สรางแคลลัสนอยกวา 25 เปอรเซ็นตของชิ้นสวนใบ ++ = สรางแคลลัส 26- 75 เปอรเซ็นตของชิ้นสวนใบ +++ = สรางแคลลัสมากกวา 75 เปอรเซ็นตของชิ้นสวนใบ W = White W Y = White Yellow F = Friable callus C = Compact callus

22

ภาพที่ 3 แคลลัสที่ชักนําไดจากการเพาะเลี้ยงใบออนของกุหลาบพันธุมายวาเลนไทนบนอาหารสูตร MS ที่เติมสารควบคุมการเจริญเติบโตตาง ๆ หลังวางเลี้ยงเปนเวลา 3 สัปดาห (ก) BA เขมขน 0.5 มิลลิกรัมตอลิตร รวมกับ NAA เขมขน 0.01 มิลลิกรัมตอลิตร (ข) BA เขมขน 0.5 มิลลิกรัมตอลิตร รวมกับ NAA เขมขน 0.05 มิลลิกรัมตอลิตร (ค) 2,4-D เขมขน 1 มิลลิกรัมตอลิตร รวมกับ NAA เขมขน 0.01 มิลลิกรัมตอลิตร (ง) 2,4-D เขมขน 1 มิลลิกรัมตอลิตร รวมกับ NAA เขมขน 0.05 มิลลิกรัมตอลิตร (จ) TDZ เขมขน 1.5 มิลลิกรัมตอลิตร รวมกับ NAA เขมขน 0.01 มิลลิกรัมตอลิตร (ฉ) TDZ เขมขน 1.5 มิลลิกรัมตอลิตร รวมกับ NAA เขมขน 0.05 มิลลิกรัมตอลิตร

ข ก

ค ง

จ ฉ

23

ภาพที่ 4 แคลลัสที่ชักนําไดจากการเพาะเลี้ยงใบออนของกุหลาบพันธุมายวาเลนไทนบนอาหารสูตร ½MS ที่เติมสารควบคุมการเจริญเติบโตตาง ๆ หลังวางเลี้ยงเปนเวลา 3 สัปดาห (ก) BA เขมขน 0.5 มิลลิกรัมตอลิตร รวมกับ NAA เขมขน 0.01 มิลลิกรัมตอลิตร (ข) BA เขมขน 0.5 มิลลิกรัมตอลิตร รวมกับ NAA เขมขน 0.05 มิลลิกรัมตอลิตร (ค) 2,4-D เขมขน 1 มิลลิกรัมตอลิตร รวมกับ NAA เขมขน 0.01 มิลลิกรัมตอลิตร (ง) 2,4-D เขมขน 1 มิลลิกรัมตอลิตร รวมกับ NAA เขมขน 0.05 มิลลิกรัมตอลิตร (จ) TDZ เขมขน 1.5 มิลลิกรัมตอลิตร รวมกับ NAA เขมขน 0.01 มิลลิกรัมตอลิตร (ฉ) TDZ เขมขน 1.5 มิลลิกรัมตอลิตร รวมกับ NAA เขมขน 0.05 มิลลิกรัมตอลิตร

ข ก

ค ง

จ ฉ

24

จากการศึกษานี้การใช TDZ และ NAA ที่เติมในอาหารสูตร MS ใหผลดีที่สุด จึงไดทดสอบความเขมขนของ NAA ตอการชักนําแคลลัสอีกครั้ง พบวา เมื่อเพาะเลีย้งชิ้นสวนใบออนของกุหลาบพนัธุมายวาเลนไทนเปนเวลานานขึ้น ในทกุทรีตเมนตใหการสรางแคลลัสสูงขึ้น และสูงสุดภายในเวลา 3 สัปดาห โดยเฉพาะการเติม NAA ความเขมขน 0.1 และ 0.15 มิลลิกรัมตอลิตร รวมกับ TDZ ความเขมขน 1.5 มิลลิกรัมตอลิตร ชักนําแคลลัสไดสูงสุด 100 เปอรเซ็นต แตกตางจากความเขมขนอื่น ๆ อยางมีนัยสําคัญ (p<0.05) (ภาพที ่5 และตารางที่ 3)

0

20

40

60

80

100

120

0 0.05 0.1 0.15 0.2ความเขมขนของ NAA (มก/ล)

การสร

างแคล

ลัส (%

)

NAA (mg/l) สัปดาหท่ี 1 สัปดาหท่ี 2 สัปดาหท่ี 3 สัปดาหท่ี 4

ภาพที่ 5 เปอรเซ็นตการชักนําแคลลัสจากการวางเลี้ยงชิ้นสวนใบของกุหลาบพันธุมายวาเลนไทนบนอาหารสูตร MS เติม TDZ ความเขมขน 1.5 มิลลิกรัมตอลิตร รวมกับ NAA ความเขมขนตาง ๆ (0 0.05 0.1 0.15 และ 0.2 มิลลิกรัมตอลิตร) หลังวางเลี้ยงเปนเวลา 4 สัปดาห (แตละทรีตเมนตเพาะเลี้ยง 150 ใบ)

25

ตารางที่ 3 ผลของอาหารสูตร MS เติม TDZ ความเขมขน 1.5 มิลลิกรัมตอลิตร รวมกับ NAA ความเขมขนตาง ๆ ตอการชักนําแคลลัสโดยวางเลี้ยงชิ้นสวนใบบนอาหารสูตร MS เปนเวลา 4 สัปดาห

NAA (มก/ล)

จํานวนใบที่สรางแคลลัส

เปอรเซ็นตการสรางแคลลัส

ปริมาณแคลลัส สีแคลลัส ลักษณะแคลลัส

0 145 99.67a + W Y C 0.05 85 50.67c + W Y C

0.1 150 100.00a +++ W Y C

0.15 150 100.00a ++ W Y C

0.2 114 76.00b ++ W Y C

F-test * C.V. (%) 17.9

* แตกตางทางสถิติอยางมีนัยสําคัญ (P ≤ 0.05) คาเฉลี่ยที่กํากับดวยตัวอักษรที่ตางกันมีความแตกตางทางสถิติเมื่อเปรียบเทียบดวยวิธี DMRT - = ไมมีการสรางแคลลัส + = สรางแคลลัสนอยกวา 25 เปอรเซ็นตของชิ้นสวนใบ ++ = สรางแคลลัส 26- 75 เปอรเซ็นตของชิ้นสวนใบ +++ = สรางแคลลัสมากกวา 75 เปอรเซ็นตของชิ้นสวนใบ W Y = White Yellow C = Compact callus

อยางไรก็ตามปริมาณแคลลัสที่ไดจากการเติม NAA ความเขมขน 0.1 มิลลิกรัมตอลิตร รวมกับ TDZ ความเขมขน 1.5 มิลลิกรัมตอลิตร มีสูงกวาการเตมิ NAA ความเขมขน 0.15 มิลลิกรัมตอลิตร รวมกับ TDZ ความเขมขน 1.5 มิลลิกรัมตอลิตร (ภาพที่ 6) แคลลัสที่ชักนําไดจากทุกทรีตเมนตมีลักษณะเปน compact สีขาวถึงสีเหลือง (ภาพที่ 7)

26

ภาพที่ 6 ปริมาณแคลลัสจากการวางเลี้ยงชิ้นสวนใบของกุหลาบพันธุมายวาเลนไทนบนอาหารสูตร MS เติม TDZ ความเขมขน 1.5 มิลลิกรัมตอลิตร รวมกับ NAA ความเขมขน ตาง ๆ (0 0.05 0.1 0.15 และ 0.2 มิลลิกรัมตอลิตร) หลังวางเลี้ยงเปนเวลา 4 สัปดาห (บาร = 1 เซนติเมตร) (แตละทรีตเมนตเพาะเลี้ยง 150 ใบ)

(ก) NAA ความเขมขน 0 มิลลิกรัมตอลิตร (ข) NAA ความเขมขน 0.05 มิลลิกรัมตอลิตร (ค) NAA ความเขมขน 0.1 มิลลิกรัมตอลิตร (ง) NAA ความเขมขน 0.15 มิลลิกรัมตอลิตร (จ) NAA ความเขมขน 0.2 มิลลิกรัมตอลิตร

ข ก

ค ง

จ

27

ภาพที่ 7 ลักษณะ compact callus ที่เกิดจากการเพาะเลี้ยงชิ้นสวนใบออนของกุหลาบพันธุ มายวาเลนไทน เปนเวลา 4 สัปดาห บนอาหารสูตร MS เติม TDZ ความเขมขน 1.5 มิลลิกรัมตอลิตร รวมกับ NAA ความเขมขนตาง ๆ (บาร = 1 เซนติเมตร) (แตละทรีตเมนตเพาะเลี้ยง 150 ใบ)

(ก) NAA ความเขมขน 0 มิลลิกรัมตอลิตร (ข) NAA ความเขมขน 0.05 มิลลิกรัมตอลิตร (ค) NAA ความเขมขน 0.1 มิลลิกรัมตอลิตร (ง) NAA ความเขมขน 0.15 มิลลิกรัมตอลิตร (จ) NAA ความเขมขน 0.2 มิลลิกรัมตอลิตร

ข ก

ค ง

จ

28

2. การศึกษาปจจัยท่ีมีผลตอการชักนํายอดและดอกของกุหลาบพันธุมายวาเลนไทนในหลอดทดลอง

2.1 ศึกษาผลของสูตรอาหารสังเคราะหและ BA ตอการสรางยอดรวมและการสรางดอก

จากการศึกษาเปรียบเทียบสูตรอาหาร MS และ LS เติม BA ความเขมขนระดับ ตาง ๆ พบวา อาหารสังเคราะหสูตร LS ทุกระดับความเขมขนของ BA ไมสามารถชักนํายอดรวมได โดยช้ินสวนขอที่เพาะเลี้ยงมกีารสรางยอดเพียงยอดเดยีว (ภาพที ่ 8 ก-ฉ) เชนเดยีวกับอาหารสูตร MS ปราศจากสารควบคุมการเจริญเติบโต (ภาพที ่ 8 ช) ในขณะที่อาหารสูตร MS เติม BA ทุกระดับความเขมขน ชักนํายอดไดมากกวา 1 ยอด หลังเพาะเลี้ยงเปนเวลา 9 สัปดาห (ภาพที่ 8 ซ-ฒ) โดยอาหารสูตร MS เติม BA ความเขมขน 0.5 มิลลิกรัมตอลิตร สงเสริมการสรางยอดรวมเฉลี่ยและดอกสูงสุด 2.21 ยอดตอช้ินสวน และ 5 ดอก ตามลําดับ (ตารางที่ 4)

อาหารสูตร MS เติม BA ความเขมขน 0.3 และ 0.5 มิลลิกรัมตอลิตร ใหเปอรเซ็นตการเกิดดอกสูงสุด 55.55 เปอรเซ็นต หลังเพาะเลี้ยงเปนเวลา 9 สัปดาห แตกตางจากความเขมขนอ่ืน ๆ อยางมีนัยสําคัญยิ่ง (p<0.01) (ตารางที่ 4) ซ่ึงมีการสรางดอกในสัปดาหที่ 5 หลังการเพาะเลี้ยง ทั้งดอกปกติและผิดปกติ โดยดอกปกติมีสีชมพูถึงสีแดง สวนดอกผิดปกติมีความแปรปรวนของสีดอกตั้งแตสีแดง ชมพู ขาวเขียว และขาวเหลือง ซ่ึงดอกผิดปกตินี้พบหลายลักษณะ คือ มีสีเขียวคลายใบบริเวณกลางดอก ดอกมีขนาดเล็กกวาปกติมาก และบางดอกไมมีเกสร (ภาพท่ี 9) สวนชิ้นสวนที่เพาะเลี้ยงบนอาหารสังเคราะหสูตร LS ไมพบการสรางดอกเลย

29

ภาพที่ 8 การสรางยอดของกุหลาบพันธุมายวาเลนไทนบนอาหารสังเคราะหสูตร MS เติม BA ความเขมขนระดับตาง ๆ หลังการวางเลี้ยงชิ้นสวนเปนเวลา 9 สัปดาห (บาร = 1เซนติเมตร)

(ก) LS free (ข) LS + 0.1 mg/l (ค) LS + 0.2 mg/l (ง) LS + 0.3 mg/l (จ) LS + 0.4 mg/l (ฉ) LS + 0.5mg/l (ช) MS free (ซ) MS + 0.1 mg/l (ญ) MS + 0.2 mg/l (ฌ) MS + 0.3 mg/l (ฑ) MS + 0.4 mg/l (ฒ) MS + 0.5mg/l

ข ก ค

ง จ ฉ

ช ซ ญ

ฌ ฑ ฒ

30

ตารางที่ 4 ผลของสูตรอาหารสังเคราะห และระดับความเขมขนของสารควบคุมการเจริญเติบโตตอการเกิดยอดรวมเฉลี่ย และการเกิดดอกของกุหลาบพันธุมายวาเลนไทน ภายในระยะเวลา 9 สัปดาห

จํานวนดอกบาน ดอกปกต ิ

ดอกผิดปกต ิสูตรอาหาร

BA (มก/ล)

จํานวนยอดรวมเฉลี่ย

จํานวนดอก

ทั้งหมด

จํานวนดอกที่ยังไมบาน R P

R G

P G

WG

WY

เกิดดอก (%)

LS 0 0.44e 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.1 1.19cd 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.2 1.16cd 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.3 1.40bcd 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.4 1.41bcd 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.5 1.60abcd 0 0 0 0 0 0 0 0 0

MS 0 0.98de 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.1 1.29cd 2 1 0 1 0 0 0 0 50 0.2 2.13a 4 2 0 2 0 0 0 0 40 0.3 1.67abc 5 3 0 0 1 1 0 0 55.55 0.4 1.97ab 3 1 0 0 0 0 1 0 25 0.5 2.21a 5 5 0 0 0 0 0 0 55.55

F-test ** - - - - - - - - C.V. (%) 43.76

- ไมวิเคราะห ** แตกตางอยางมีนัยสําคัญทางสถิติ (p<0.01) คาเฉลี่ยที่กํากบัดวยอักษรทีต่างกันในสดมภเดยีวกันมีความแตกตางอยางมีนัยสําคัญทางสถิติเมื่อเปรียบเทียบดวยวิธี DMRT R = Red color flower P = Pink color flower R G = Red with green color flower P G = Pink with green color flower W G = White with green color flower W Y = White with yellow color flower

31

ภาพท่ี 9 การสรางดอกของกุหลาบพันธุมายวาเลนไทนบนอาหารสังเคราะหสูตร MS เติม BA

ความเขมขนระดับตาง ๆ หลังการวางเลี้ยงชิ้นสวนเปนเวลา 9 สัปดาห (บาร = 1เซนติเมตร) (ก - ค) MS + 0.1 mg/l (ง - ฉ) MS + 0.2 mg/l (ช - ญ) MS + 0.3 mg/l (ฌ) MS + 0.4 mg/l (ฒ) MS + 0.5mg/l

ง

ญ

ฌ ฒ

จ ฉ

ช ซ

ก ข ค

32

นอกจากนี้ยังพบวา หลังเพาะเลี้ยงชิ้นสวนขอบนอาหารสูตร MS ปราศจากสารควบคุมการเจริญเติบโต เปนเวลา 6 สัปดาห สามารถชักนํารากไดอีกดวย โดยสามารถสรางรากไดสูงสุด 37.63 เปอรเซ็นต มีรากเฉลี่ย 2.83 รากตอช้ินสวน แตกตางจากความเขมขนอื่น ๆ อยางมีนัยสําคัญยิ่ง (p<0.01) (ตารางที่ 5) โดยรากมีสีขาวในสัปดาหที่ 1-2 และคอย ๆ เปลี่ยนเปนสีดําและมีความยาวเพิ่มขึ้นเมื่อเพาะเลี้ยงเปนเวลานานขึ้น (ภาพที่ 10) ตารางที่ 5 สูตรอาหารสังเคราะห และระดับความเขมขนของสารควบคุมการเจริญเติบโตตอการ

เกิดรากของกุหลาบพันธุมายวาเลนไทน หลังเพาะเลี้ยงเปนเวลา 6 สัปดาห

สูตรอาหาร BA (มก/ล) เกิดราก (%) จํานวนรากเฉลี่ย

(ราก/ช้ินสวน) LS 0 0 0b

0.1 0 0b 0.2 0 0b 0.3 0 0b 0.4 0 0b 0.5 0 0b

MS 0 37.63 2.83a 0.1 3.35 0.23b 0.2 0 0b 0.3 2.29 0.02b 0.4 0 0 b 0.5 0 0 b

F-test - ** C.V. (%) - 8.89

- ไมวิเคราะห ** แตกตางอยางมีนัยสําคัญทางสถิติ (p<0.01) คาเฉลี่ยที่กํากบัดวยอักษรทีต่างกันในสดมภเดยีวกันมีความแตกตางอยางมีนัยสําคัญทางสถิติเมื่อเปรียบเทียบดวย วิธี DMRT

33

ภาพที่ 10 การสรางรากของกุหลาบพันธุมายวาเลนไทนบนอาหารสังเคราะหสูตร MS ปราศจาก

สารควบคุมการเจริญเติบโต หลังวางเลี้ยงชิ้นสวนเปนเวลา 6 สัปดาห (บาร = 1 เซนติเมตร)

2.2 ศึกษาผลของน้ําตาลและความเขมแสงตอการสรางยอดรวมและการสรางดอก

ความเขมขนของน้ําตาลซูโครสและความเขมแสงมีอิทธิพลรวมกันในการสรางยอดและดอก การเพาะเลี้ยงชิ้นสวนขอบนอาหารสูตร MS เติมซูโครส 3.5 เปอรเซ็นต ภายใตการใหแสง 50.70 ไมโครโมลตอตารางเมตรตอวินาที ใหเปอรเซ็นตการสรางยอดรวมเฉลี่ยสูงสุด 84 เปอรเซ็นต จํานวนยอดเฉลี่ยที่สราง 2.32 ยอดตอช้ินสวน แตกตางจากความเขมขนอื่น ๆ อยาง มีนัยสําคัญยิ่ง (p<0.01) และเมื่อความเขมขนของซูโครสเพิ่มขึ้น สงผลใหเปอรเซ็นตการสรางยอดรวมและจํานวนยอดลดลง อยางไรก็ตามในทุกสิ่งทดลองไมสามารถชักนําดอกได (ตารางที่ 6)

34

ตารางที่ 6 ผลของน้ําตาลซูโครส และความเขมแสง ตอการสรางยอดและดอกของกุหลาบพันธุ มายวาเลนไทน ภายในระยะเวลา 5 สัปดาห

ซูโครส (%)

ความเขมแสง (ไมโครโมลตอตารางเมตร

ตอวินาที)

การสราง ยอดรวม

(%)

จํานวนยอดเฉลี่ย (ยอด/ช้ินสวน)

เกิดดอก (%)

3 25.35 54+5.300 d 1.29+0.550 c 0 3 50.70 67+5.000 cd 1.55+0.593 bc 0

3.5 25.35 47+5.300 d 1.90+0.803 ab 0 3.5 50.70 84+3.800 a 2.32+0.808 a 0 4 25.35 70+4.900 bcd 2.08+1.552 ab 0 4 50.70 72+4.700 bcd 1.24+0.511 c 0

4.5 25.35 73+4.700 bc 1.59+0.979 bc 0 4.5 50.70 56+5.500 cd 2.03+0.875 ab 0

F-test ** ** - C.V. (%) 35.75 46.62

- ไมวิเคราะห ** แตกตางอยางมีนัยสําคัญทางสถิติ (p<0.01) คาเฉลี่ยที่กํากบัดวยอักษรทีต่างกันในสดมภเดยีวกันมีความแตกตางอยางมีนัยสําคัญทางสถิติเมื่อเปรียบเทียบดวย วิธี DMRT

2.3 ศึกษาผลของจาํนวนครัง้การยายเลี้ยงตอการสรางดอก

เมื่อพิจารณาถึงจํานวนครั้งการยายเลี้ยงตอการสรางดอกของกุหลาบพันธุ มายวาเลนไทน บนอาหารสูตร MS เติม BA ความเขมขน 0.2 มิลลิกรัมตอลิตร สลับกับอาหารสูตร MS ทุก ๆ เดือน เปนเวลา 12 เดือน พบวา จํานวนครั้งการยายเลี้ยงสงผลตอการสรางดอก โดยดอกเร่ิมปรากฏใหเห็นตั้งแตการยายเลี้ยงครั้งแรกจํานวน 12 ดอก การยายเลี้ยงครั้งที่ 2 เกิดดอกจํานวน 20 ดอก การยายเลี้ยงครั้งที่ 3 มีจํานวน 17 ดอก ซ่ึงการยายเลี้ยงเพียง 3 คร้ัง ไมชักนําใหเกิดดอกผิดปกติ (ภาพที่ 11) จากนั้นจํานวนดอกคอย ๆ เพิ่มขึ้นเมื่อจํานวนครั้งการยายเล้ียงเพิ่มขึ้น และมีจํานวนดอกสูงสุด 116 ดอก เมื่อยายเลี้ยงครั้งที่ 6 (ตารางที่ 7)

35

0

20

40

60

80

1 2 3 4 5 6จํานวนครั้งการยายเลี้ยง

จํานวน

ดอก (

ดอก)

จํานวนดอกปกติ จํานวนดอกผิดปกติ ภาพที่ 11 ผลของจํานวนครั้งของการยายเล้ียงยอดในอาหารสูตร MS เติม BA ความเขมขน 0.2

มิลลิกรัมตอลิตร ตอจํานวนดอกปกตแิละผิดปกติของกหุลาบพันธุมายวาเลนไทน (ยายเล้ียงเดือนละครั้งเปนเวลา 12 เดือน)

สําหรับเปอรเซ็นตการเกิดดอก พบวาเปนไปในทิศทางเดียวกับจาํนวนดอก คือ จํานวนครั้งการยายเลี้ยงทีเ่พิม่ขึ้นสงผลใหเปอรเซ็นตการเกิดดอกเพิ่มสงูขึ้น โดยการยายเลี้ยงครั้งที่ 1 ใหเปอรเซ็นตการเกิดดอกต่ําสุด 6.67 เปอรเซ็นต การยายเลี้ยงครั้งที่ 2 ใหเปอรเซ็นตการเกิดดอก11.11 เปอรเซ็นต การยายเลี้ยงครั้งที่ 3 ใหเปอรเซ็นตการเกิดดอก 14.17 เปอรเซ็นต การยายเลี้ยงคร้ังที่ 4 ใหเปอรเซ็นตการเกดิดอก 59.17 เปอรเซ็นต การยายเล้ียงครั้งที่ 5 ใหเปอรเซ็นตการเกิดดอก 80 เปอรเซ็นต และการยายเลี้ยงครัง้ที่ 6 ใหเปอรเซ็นตการเกดิดอกสูงสุด 95.08 เปอรเซ็นต (ตารางที่ 7)

36

ตารางที่ 7 ผลของจํานวนครั้งของการยายเล้ียงตอการเกิดดอกของกุหลาบพันธุมายวาเลนไทนในอาหารสูตร MS เติม BA ความเขมขน 0.2 มิลลิกรัมตอลิตร

จํานวนดอกปกต ิ

จํานวนดอกไมปกต ิคร้ังที่ ยายเลี้ยง

เกิดดอก (%)

จํานวนดอกทั้งหมดที่สราง R P

รวม R G P G W G W Y

รวม

1 6.67e 12 5 7 12 0 0 0 0 0 2 11.11de 20 5 15 20 0 0 0 0 0 3 14.17d 17 0 17 17 0 0 0 0 0 4 59.17c 71 8 45 53 0 18 0 0 18 5 80.00b 100 3 71 74 0 26 0 0 26 6 95.08a 116 4 38 42 0 37 15 22 74

F-test ** - - - - - - C.V. (%) 15.87

- ไมวิเคราะห ** แตกตางอยางมีนัยสําคัญทางสถิติ (p<0.01) คาเฉลี่ยที่กํากบัดวยอักษรทีต่างกันในสดมภเดยีวกันมีความแตกตางอยางมีนัยสําคัญทางสถิติเมื่อเปรียบเทียบดวย วิธี DMRT R = Red P = Pink R G = Red with green P G = Pink with green W G = White with green W Y = White with yellow

ในขณะที่ดอกผิดปกตินั้นเริ่มปรากฏขึ้นหลังจากยายเลี้ยงครั้งที่ 3 เปนตนไป โดยการยายเล้ียงครั้งที่ 4 ใหจํานวนดอกผิดปกติ 18 ดอก คิดเปน 25.35 เปอรเซ็นต และเพิ่มขึ้นสูงสุด 60.79 เปอรเซ็นต จํานวน 74 ดอก ในการยายเลี้ยงครั้งที่ 6 ในขณะที่ดอกปกติมีเปอรเซ็นตลดลงเมื่อจํานวนครั้งในการยายเล้ียงมากขึ้น (ภาพที่ 12)

37

020406080

100120

1 2 3 4 5 6จํานวนครั้งการยายเล้ียง

เปอรเซ

น็ตการ

เกดิดอก (

%)

ดอกปกติ ดอกผิดปกติ

ภาพท่ี 12 ผลของจํานวนครั้งของการยายเลี้ยงยอดในอาหารสูตร MS เติม BA ความเขมขน 0.2 มิลลิกรัมตอลิตร ตอเปอรเซ็นตการเกิดดอกปกติ และผิดปกติของกุหลาบพันธุ มายวาเลนไทน (ยายเลี้ยงเดือนละครั้งเปนเวลา 12 เดือน)

หลังจากการยายเลี้ยงครั้งที่ 6 ซ่ึงใชระยะเวลารวมทั้งหมด 12 เดือน พบดอกปกติที่ปรากฏมีสีชมพูถึงสีแดง (ภาพที่ 13) ในขณะทีด่อกผิดปกติมีการกระจายตัวของสีดอก ตั้งแต สีแดง ชมพู ขาวเขยีว ถึง ขาวเหลือง โดยดอกผิดปกตินี้พบหลายลักษณะ คือ ดอกมีลักษณะสีเขียวคลายใบบริเวณกลางดอก ดอกมีลักษณะอวบฉ่ําน้าํ บางดอกมีเฉพาะเกสรตวัผู และดอกมีลักษณะเหีย่วกอนถึงระยะดอกบาน (ภาพที่ 14)

38

ภาพท่ี 13 ดอกที่มีลักษณะเปนปกติ ซ่ึงเกิดจากการยายเลี้ยงแตละครั้ง จํานวน 6 คร้ัง ในอาหาร

สังเคราะหสูตร MS เติม BA ความเขมขน 0.2 มิลลิกรัมตอลิตร (บาร = 1 เซนติเมตร)

39

ภาพที่ 14 ดอกที่มีลักษณะผิดปกติ ซ่ึงเกิดจากการยายเลี้ยงครั้งที่ 4 5 และ 6 ในอาหารสูตร MS

เติม BA ความเขมขน 0.2 มิลลิกรัมตอลิตร (บาร = 1 เซนติเมตร) (ก-ข) ดอกสีขาวเขียว (ค-ง) ดอกสีขาวเหลือง (จ-ช) ดอกมีสีเขียวคลายใบบริเวณกลางดอก (ซ) ดอกอวบฉ่ําน้ํา (ญ) ดอกมีเฉพาะเกสรตัวผู (ฌ - ฑ) ดอกเหี่ยวกอนถึงระยะดอกบาน (ฒ) ดอกไมปกติ

ข ก ค

ง จ ฉ

ช ซ ญ

ฌ ฑ ฒ

40

บทที่ 4

วิจารณ

1. การศึกษาปจจัยท่ีมีผลตอการชักนําแคลลัสของกุหลาบพันธุมายวาเลนไทน สูตรอาหารและสารควบคุมการเจริญเติบโตมีผลตอการชักนําแคลลัสจากชิ้นสวน

ใบของกุหลาบพันธุมายวาเลนไทน โดยจากการศึกษาเปรียบเทียบการใชสารควบคุมการเจริญ เติบโตเพียงอยางเดียว ระหวางกลุมออกซินและไซโตไคนิน พบวา การวางเลี้ยงชิ้นสวนใบบนอาหารสูตร MS เติม TDZ ความเขมขน 1.5 มิลลิกรัมตอลิตร ใหเปอรเซ็นตการสรางแคลลัสสูงที่สุด สอดคลองกับ Canli (2003) ซ่ึงศึกษาใน R. multiflora โดยเพาะเลี้ยงชิ้นสวนใบบนอาหารสูตร MS เติม TDZ ความเขมขน 1.8 2.7 และ 3.6 ไมโครโมลาร พบวา สามารถชักนําแคลลัสไดสูงสุด Preece (1987) พบวา TDZ ความเขมขน 0.05-5 ไมโครโมลาร มีความเหมาะสมตอการชักนําแคลลัสจากตน Juglan มากที่สุด เนื่องจาก TDZ เปนสารควบคุมการเจริญเติบโตที่ชวยลดการเกิดสารประกอบฟนอล สงเสริมการเพิ่มปริมาณแคลลัส (Te-chato et al., 1995) โดยหนาที่หลักของไซโตไคนิน คือ ชวยเรงการขยายตัวของเซลล จากการศึกษาการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อยาสูบ พบวา ไซโตไคนินสามารถขยายขนาดของแวคิวโอลในเซลล ทําใหเซลลขยายใหญขึ้นได และพบวาไซโตไคนินสงเสริมการขยายตัวของเซลลในสวนที่ตัดจากแผนใบและใบเลี้ยงซึ่งปกติจะไมมีการขยายตัว ใหมีการขยายตัวขึ้นได (สมบุญ, 2544) โดยทั่วไปไซโตไคนินมีการเคลื่อนยายนอย แตมีคุณสมบัติสําคัญในการดึงสารอาหารตาง ๆ มายังแหลงที่มีไซโตไคนินสะสมอยู (พีรเดช, 2532) ในขณะที่มีงานวิจัยจํานวนมากรายงานวา การใชสารควบคุมการเจริญเติบโตกลุมออกซินใหผลดีกวาไซโตไคนิน เชน การชักนําแคลลัสในกุหลาบหลายสายพันธุ พบวา 2,4-D มีความสามารถในการชักนําแคลลัสไดดีกวาสารควบคุมการเจริญเติบโตชนิดอื่น (Khui et al.,1982; Noriega and Sondahl, 1991; Arene et al., 1993; Theo et at., 1996; Li et al., 2002; Dohm, 2001; Kamo, 2004; Bao and Gao,2005) สําหรับพืชชนิดอื่นไดมีรายงานไวเชนกันวา การใช 2,4-D ใหผลดีในการชักนําแคลลัส เชน Hoque and Mansfield (2004) เพาะเลี้ยงชิ้นสวนรากของขาวสายพันธุอินดิคา บนอาหารสูตร MS เติม 2,4-D ความเขมขน 2 มิลลิกรัมตอลิตร สามารถชักนําแคลลัสไดสูงสุด และยังมีรายงานการใชออกซินชนิดอื่น ๆ เชน Page และ Visser (1989) รายงานวา การใช NAA ความเขมขน 50 ไมโครโมลาร ในพืช Geraldton Wax (Chamelaucium uncinatum

41

Schauer) สงเสริมการสรางแคลลัสที่บริเวณฐานของขอไดดี Hsia และ Korban (1996) รายงานวา การเพาะเลี้ยงชิ้นสวนใบของกุหลาบหนูพันธุ Baby Katie บนอาหารสูตร MS เติม NAA ความเขมขน 11 และ 27 ไมโครโมลาร เพาะเลี้ยงนาน 6 สัปดาห สามารถชักนําแคลลัสไดสูงสุด ความแตกตางหรือการตอบสนองตอสารควบคุมการเจริญเติบโตที่แตกตางกันเปนผลมาจากชนิดหรือสายพันธุพืช ปริมาณสารควบคุมการเจริญเติบโตที่พืชสรางขึ้นเองในปริมาณที่ตางกัน สงผลใหเมื่อเติมสารควบคุมการเจริญเติบโตชนิดและความเขมขนเดียวกัน การตอบสนองของพืชแตละชนิดจึงแตกตางกัน ลัดดาวัลย (2544) รายงานการชักนําแคลลัสจากใบออนของมังคุด มะพูด มะดัน และชะมวง ซ่ึงทั้งหมดเปนพืชในสกุล Garcinia วงศ Guttiferae พบวามีการตอบสนองตอสารควบคุมการเจริญเติบโตที่แตกตางกัน โดยมังคุดชักนําแคลลัสไดดีเมื่อเติม BA และ TDZ มะพูดใหแคลลัสสูงสุดเมื่อใช BA รวมกับ 2,4-D ชะมวงใหแคลลัสสูงสุดเมื่อเพาะเลี้ยงบนอาหารสูตรที่เติม BA รวมกับ NAA ในขณะที่มะดันใหแคลลัสสูงสุดเมื่อใช 2,4-D รวมกับ thiourea (TU) จากการศึกษาการชักนําแคลลัสของกุหลาบพันธุมายวาเลนไทนคร้ังนี้ใชสารควบคุมการเจริญเติบโตเพียงสองชนิดซึ่งเปนสารคนละกลุม อีกทั้งระดับความเขมขนที่ใชในการศึกษาอาจจะยังไมเหมาะสม จึงเปนไปไดที่ทําใหชักนําแคลลัสไดนอย ดังนั้นในการศึกษาตอไปควรมีการเพิ่มชนิดของสารควบคุมการเจริญเติบโตในแตละกลุม เนื่องจากพืชอาจตอบสนองตอสารควบคุมการเจริญเติบโตชนิดอื่นไดดีกวา รวมทั้งควรเพิ่มระดับของความเขมขนใหสูงขึ้น เพื่อใหเหมาะสมตอการชักนําแคลลัสไดสูงสุด

นอกจากนี้ยังพบวา การใชสารควบคุมการเจริญเติบโตกลุมไซโตไคนินรวมกับสารในกลุมออกซินที่มีคุณสมบัติในการกระตุนใหเซลลเกิดการยืดตัว จึงเปนการเพิ่มประสิทธิภาพใหแกไซโตไคนิน โดยการใช NAA เขมขน 0.1 มิลลิกรัมตอลิตร รวมกับ TDZ ความเขมขน 1.5 มิลลิกรัมตอลิตรชักนําแคสลัสไดสูงขึ้น เนื่องจาก NAA เปนสารควบคุมการเจริญเติบโตที่มีความสําคัญในกระบวนการเจริญเติบโต และการพัฒนาการของเซลลพืช มีหนาที่สงเสริมการแบงเซลล การเติบโต ทําใหพืชมีการสรางแคลลัสไดสูงขึ้น สอดคลองกับการศึกษาของ Nontaswatsri และ Fukai (2005) ซ่ึงรายงานวาสามารถชักนําแคลลัสจากใบเลี้ยงของผีเสื้อ Dianthus hybrida Teslstar Scarlet ได เมื่อเพาะเลี้ยงบนอาหารสูตร MS เติม TDZ ความเขมขน 1 มิลลิกรัมตอลิตร รวมกับ NAA ความเขมขน 0.1 มิลลิกรัมตอลิตร จิตเกษม และคณะ (2545) ใช TDZ รวมกับ NAA ชักนําแคลลัสไดสูงสุดในบัวหลวงพันธุบุณฑริก แคลลัสที่ไดมีสีเขียวใส ฉ่ําน้ํา เกาะกันอยางหลวม ๆ อยางไรก็ตามความเขมขนที่เหมาะสมตอการชักนําแคลลัสยอมแตกตางกัน ซ่ึงตางจากการศึกษาในครั้งนี้ที่แคลลัสมีสีขาว เหลือง เกาะกันแนน แคลลัสที่เพาะเลี้ยงไดมีลักษณะรูปรางและสีแตกตางกันออกไป ทั้งนี้อาจเนื่องมาจากแคลลัสสรางรงควัตถุที่แตกตางกัน เชนแคลลัสที่มีสีเขียว

42

เนื่องจากมีการสรางคลอโรฟลล แคลลัสสีเหลืองสรางแคโรทีนอยด และฟลาโวทีนอยด สวนแคลลัสสีมวงสรางแอนโทไซยานิน เปนตน ปริมาณและชนิดของรงควัตถุเหลานี้ขึ้นอยูกับชนิดของพืช ธาตุอาหาร และปจจัยสภาพแวดลอมของการเพาะเลี้ยง จึงสงผลใหแคลลัสของพืชแตละชนิดหรือสายพันธุมีความแตกตางกัน นอกจากนี้ยังมีรายงานการใชออกซินและไซโตไคนินชนิดอื่น ๆ ไวดวยเชนกัน เชน Rout และคณะ (1991) รายงานวาในกุหลาบพันธุ Landora สามารถชักนําแคลลัสไดดีเมื่อวางเลี้ยงชิ้นสวนใบบนอาหารสูตร ½ MS เติม BA ความเขมขน 2.2 ไมโครโมลาร รวมกับ NAA ความเขมขน 5.4 ไมโครโมลาร เปนเวลา 4 สัปดาห ในทํานองเดียวกับ Prakash และคณะ (1999) ที่สามารถชักนําแคลลัสในตนหนาแมว (Hybanthus enneaspermus L.) ไดสูง เมื่อใช NAA ความเขมขน 2.6 ไมโครโมลาร รวมกับ BA ความเขมขน 2.2 ไมโครโมลาร แคลลัสที่ไดมีสีเขียวออน เกาะกันแนน สอดคลองกับการศึกษาในพืช Boxthorn (Lycium chinense Mill.) ที่สามารถชักนําแคลลัสไดโดยการวางเลี้ยงชิ้นสวนใบในอาหารที่มี NAA ความเขมขน 2.69 ไมโครโมลาร รวมกับ BA ความเขมขน 0.89 ไมโครโมลาร (Kim et al., 2001) Murali และคณะ (1996) รายงานวาการวางเลี้ยงชิ้นสวนกลีบดอกบนอาหารสูตร MS เติม BA ความเขมขน 0.5-2 มิลลิกรัมตอลิตร รวมกับ Kinetin ความเขมขน 0.5-2 มิลลิกรัมตอลิตร รวมกับ Dicamba ความเขมขน 0.5-1 มิลลิกรัมตอลิตร สามารถชักนําแคลลัสได Chang และคณะ (2000) ใชช้ินสวนดอกออนของลิลล่ี (Lilium speciosum Thumb.var. gloriosoides Baker) เพาะเลี้ยงบนอาหารสูตร MS เติม 2,4-D ความเขมขน 3 มิลลิกรัมตอลิตร รวมกับ BA ความเขมขน 0.25 มิลลิกรัมตอลิตร Leupin และคณะ (2000) เพาะเล้ียงชิ้นสวนใบหญาแฝก Vetiveria zizanioides บนอาหารสูตร MS เติม 2,4-D ความเขมขน 2.26 ไมโครโมลาร รวมกับ BA ความเขมขน 2.22 ไมโครโมลาร นอกจากนี้ยังมีรายงานการชักนําแคลลัสโดยใชออกซินรวมกัน 2 ชนิด เชน Soomro และคณะ (2003) ที่สามารถชักนําแคลลัสของ R. indica โดยการเพาะเลี้ยงชิ้นสวนใบบนอาหารสูตร MS เติม IBA ความเขมขน 0.6 หรือ 0.8 มิลลิกรัมตอลิตร รวมกับ NAA ความเขมขน 0.1 มิลลิกรัมตอลิตร ซ่ึงโดยปกติการชักนําชิ้นสวนพืชใหเกิดแคลลัสนั้น ระดับของสารควบคุมการเจริญเติบโตของพืชกลุมไซโตไคนินและกลุมออกซินตองมีความสัมพันธกัน หากระดับไซโตไคนินสูง ออกซินต่ํา มีสวนสําคัญในการชักนําใหเกิดตน ในทางตรงกันขามหากระดับของออกซินสูง ไซโตไคนินต่ํา มีผลในการชักนําใหเกิดราก และหากระดับของไซโตไคนินและออกซินใกลเคียงกันจะสงเสริมใหเกิดแคลลัส ทั้งนี้ปริมาณและสัดสวนที่เหมาะสมตอการเกิดแคลลัสจะขึ้นอยูกับชนิดและชิ้นสวนของพืชดวย (รงรอง, 2542) จากการศึกษานี้ พบวา ตองใชสารควบคุมการเจริญเติบโตกลุมออกซินในปริมาณสูง แสดงวากุหลาบพันธุมายวาเลนไทนนี้อาจมีการสรางสารควบคุมกลุมไซโตไคนินขึ้นภายในชิ้นสวนพืชเองในปริมาณสูง และจากการศึกษาครั้งนี้การใช TDZ ความเขมขน 1.5 มิลลิกรัม

43

ตอลิตร รวมกับ NAA ความเขมขน 0.1 มิลลิกรัมตอลิตร สามารถชักนําแคลลัสไดสูงสุด 100 เปอรเซ็นต แตหากพิจารณาถึงการพัฒนาเปนพืชตนใหมนั้น แคลลัสที่ไดไมมีการพัฒนาตอไปหลังจากวางเลี้ยงบนอาหารสูตรเดิมเปนเวลา 2 สัปดาห ดังนั้นในการศึกษาตอไปควรมีการเพิ่มชนิดและระดับของความเขมขนของสารควบคุมการเจริญเติบโตที่สูงขึ้น เพื่อใหไดแคลลัสปริมาณสูง อีกทั้งสามารถพัฒนาเปนพืชตนใหมไดตอไป

สําหรับการศึกษาผลของสูตรอาหารตอการสรางแคลลัสของกุหลาบพันธุ มายวาเลนไทนในการศึกษานี้ พบวา อาหารสูตร MS ใหผลดีกวาอาหารสูตร LS อยางมาก กลาวคือ หลังจากเพาะเลี้ยงชิ้นสวนใบเปนเวลา 2-4 สัปดาห ช้ินสวนที่เพาะเลี้ยงบนอาหารสูตร LS มีการสรางแคลลัสนอยมาก ๆ และช้ินสวนใบเริ่มเปล่ียนสีจากสีเขียวเปนสีเหลืองและสีคอย ๆ กลายเปนสีน้ําตาลเมื่อเวลานานขึ้น และไมมีการสรางแคลลัสเพิ่มขึ้น (ไมแสดงขอมูล) และ เมื่อเปรียบเทียบระหวางอาหารสูตร MS และ ½ MS พบวา อาหารสูตร MS ใหการสรางแคลลัสดีกวา ½MS เมื่อเปรียบเทียบโดยการเติมสารควบคุมการเจริญเติบโตที่เหมือนกัน สอดคลองกับการศึกษาของ Hsia และ Korban (1996) ซ่ึงรายงานวา การเพาะเลี้ยงชิ้นสวนใบของกุหลาบหนูพันธุ Baby Katie บนอาหารสูตร MS สามารถชักนําแคลลัสไดดีกวาอาหารสูตร ½MS เมื่อเติมสารควบคุมการเจริญเติบโตชนิดและความเขมขนเดียวกัน หลังการเพาะเลี้ยงเปนเวลา 6 สัปดาห สอดคลองกับการศึกษาโดยสวนใหญที่พบวาอาหารสูตร MS ใหผลดีตอการชักนําแคลลัสของกุหลาบ (Khui et al.,1982; Lloyd et al., 1988; Ishioka and Tanimoto,1990; Arene et al., 1993; Hsia and Korban, 1996; Kintzios et al., 1996; Murali et al., 1996; Li et al., 2002; Dohm, 2001; Soomro et al., 2003; Kamo, 2004; Bao and Gao,2005; Kaur et al., 2006; Estabrooks et al., 2007) ในขณะที่ Rout และคณะ (1991) รายงานการชักนําแคลลัสจากชิ้นสวนใบของกุหลาบพันธุ Landora วา อาหารสูตร ½ MS ที่เติมสารควบคุมการเจริญเติบโตเชนเดียวกับอาหารสูตร MS ใหการสรางแคลลัสไดดีกวาอาหารสูตร MS

ซ่ึงผลจากการศึกษาจะเห็นไดวาสูตรอาหารและสารควบคุมการเจริญเติบโตมีผลตอการชักนําแคลลัสและลักษณะของแคลลัส ดังนั้นจึงควรมีการศึกษาในเรื่องชนิดของสูตรอาหารและสารควบคุมการเจริญเติบโตอ่ืน ๆ เพิ่มขึ้นอีก และอาจมีการเพิ่มความเขมขนของสารควบคุมการเจริญเติบโตที่ใชในการศึกษา ตลอดจนชนิดของชิ้นสวนเริ่มตนตอไป

44

2. การศึกษาปจจัยท่ีมีผลตอการชักนํายอดและดอกของกุหลาบพันธุมายวาเลนไทนในหลอดทดลอง

จากการศึกษาปจจัยตาง ๆ ที่มีผลตอการเจริญของยอดและการออกดอกของ

กุหลาบพันธุมายวาเลนไทนในหลอดทดลอง พบวา ระดับซูโครสและความเขมแสงมีผลตอการสรางยอดของกุหลาบสายพันธุนี้ โดยความเขมแสงสูง (50.70 ไมโครโมลตอตารางเมตรตอวินาที) ชักนํายอดไดดีกวาระดับต่ํา และซูโครสความเขมขน 3.5 เปอรเซ็นต สามารถชักนํายอดไดดีที่สุด เนื่องจากซูโครสเปนคารโบไฮเดรตซึ่งเปนแหลงของคารบอน มีผลโดยตรงตอกระบวนการสังเคราะหดวยแสง สอดคลองกับอัมพา และคณะ (2541) ซ่ึงรายงานวาอาหารสูตร MS เติมซูโครสชักนํายอดไดดีกวาการไมเติมซูโครส สําหรับการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชสวนใหญนิยมใชน้ําตาลซูโครส (Wilson et al., 1996) น้ําตาลชนิดนี้พบมากในพืชช้ันสูง ทั้งนี้เพราะในธรรมชาติพืชเก็บสะสมพลังงานในรูปของน้ําตาลซูโครสเปนสวนใหญ (สมปอง, 2539) เชนเดียวกับ Neto และ Otoni (2003) รายงานวาน้ําตาลซูโครสมีความเหมาะสมที่สุดในการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชทั่วไป เพราะน้ําตาลซูโครสใหคาออสโมติกโพเทนเชี่ยลที่ต่ํากวาน้ําตาลชนิดอื่น ๆ และมีความเหมาะสมในการเพาะเลี้ยง เมื่อเปรียบเทียบในระดับความเขมขนเดียวกัน นอกจากนี้ยังสามารถรักษาระดับความเปนกรดดางไดใกลเคียงกับคาเปนกรดและดางกอนและหลังนึ่งฆาเชื้ออาหาร เมื่อเปรียบเทียบกับน้ําตาลชนิดอื่น ๆ ประกอบกับน้ําตาลซูโครสสามารถหาซื้อไดงายในทองตลาด และมีราคาถูก เหมาะสมที่จะนํามาใชในการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช โดยเฉพาะในการขยายพันธุพืชเพื่อการคาไดเปนอยางดี แตการใชซูโครสใหไดผลดีนั้น ตองพิจารณาถึงชนิดของพืช และความเขมขนที่เหมาะสมดวย เพ็ญจันทร (2546) ศึกษาผลของชนิดและความเขมขนของน้ําตาลตอการเจริญของยอดรวมจากการเพาะเลี้ยงเมล็ดมังคุด โดยใชน้ําตาล 7 ชนิด และใชความเขมขน 5 ระดับ คือ 3 4 5 6 และ 7 เปอรเซ็นต พบวา การเพาะเลี้ยงเมล็ดมังคุดบนอาหารเติมซูโครสความเขมขน 3 เปอรเซ็นต ใหจํานวนยอดรวมสูงสุด 15.72 ยอดตอเมล็ด

แมวาโดยปกติแลวการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชในอาหารสังเคราะหจะไมตองการแสงมากนัก แตแสงก็ยังมีความจําเปนตอกระบวนการเปลี่ยนแปลงพัฒนาทางดานสัณฐานที่ถูกควบคุมดวยพันธุกรรม ซ่ึงแสงที่ใหกับพืชในสภาพเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อควรพิจารณาดานความเขมของแสง ชวงแสง และคุณภาพของแสง ความตองการแสงของเนื้อเยื่อพืชที่เล้ียงในหลอดทดลองตางจากการปลูกเลี้ยงในสภาพธรรมชาติ พืชที่เล้ียงในหลอดทดลองยังไมมีการสังเคราะหดวยแสง เพราะไดรับคารโบไฮเดรตอยางเพียงพอจากน้ําตาลซึ่งเติมในอาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ อยางไรก็ตาม แสงยังมีความจําเปนในการควบคุมใหพืชเจริญเติบโตเปนปกติ เชน การสรางยอด การชักนําใหเกิด

45

ราก การสรางตนใหมจากแคลลัส เปนตน การใหแสงที่มีความเขมสูงระดับเดียวกับการปลูกเลี้ยงพืชในสภาพธรรมชาติอาจทําใหเนื้อเยื่อพืชตายได โดยความเขมของแสงมีผลตอการเจริญของเนื้อเยื่อในหลอดทดลองมากกวาดานชวงแสง ถาหากพืชไดรับความเขมของแสงสูงเทาในแปลงปลูกจะเปนอันตรายเนื่องจากพืชไดรับอุณหภูมิสูงมากเกินไป ควรเลี้ยงภายใตแสงประมาณ 1,000-4,000 ลักซ การที่พืชตองการความเขมแสงต่ํากวาในธรรมชาติ สันนิษฐานวาการสังเคราะหดวยแสงในสภาพหลอดแกวถูกจํากัดดวยปริมาณของคารบอนไดออกไซดที่ต่ํามาก โดยทั่ว ๆ ไปความตองการความเขมแสงของพืชข้ึนอยูกับชนิดของพืชดวย เชน เยอบีรา และไมดอกลมลุกหลายชนิด ตองการความเขมแสงอยางต่ําประมาณ 3,000 ลักซ หากความเขมแสงสูงเกินไปสงผลใหเกิดการยับยั้งการเจริญเติบโตของพืชได (พงศยุทธ, 2550) Zhang และ Leung (2002) รายงานวา การเพาะเลี้ยงชิ้นสวนขอของ Gentiana triflora บนอาหารสูตร WPM เติมซูโครสความเขมขน 3 เปอรเซ็นต รวมกับสารควบคุมการเจริญเติบโต วางเลี้ยงภายใตความเขมแสง 60 ไมโครโมลตอตารางเมตรตอวินาที นาน 12 สัปดาห สามารถชักนํายอดไดสูงสุด 70 เปอรเซ็นต

สําหรับการศึกษาผลของสารควบคุมการเจริญเติบโตตอการชักนํายอดของกุหลาบสายพันธุมายวาเลนไทนคร้ังนี้ พบวา การเติม BA เพียงอยางเดียวสามารถชักนํายอดของกุหลาบสายพันธุนี้ไดดี เนื่องจาก BA เปนสารควบคุมการเจริญเติบโตกลุมไซโตไคนิน มีผลตอการเจริญเติบโตของพืช คือ สงเสริมการแบงเซลล เรงการขยายตัวของเซลล (สมบุญ, 2544) สงเสริมการสรางและการเจริญของตา การเพิ่มไซโตไคนินใหกับตาขาง ทําใหเกิดการสรางใบได ทั้งนี้เพราะตาขางชวยดึงอาหารมาจากสวนอื่น ๆ และยังสงเสริมการสรางโปรตีน โดยไซโตไคนินสามารถดึงสารและกรดอะมิโนชนิดตาง ๆ เขาใกลตัว และยังควบคุมการเปดปดของปากใบ (สมบุญ, 2544) ชะลอกระบวนการเสื่อมสลายตัวของคลอโรฟลล (นิตย, 2541; นพดล, 2537) โดยเฉพาะ BA ที่สามารถชะลอการแกของพืชได นอกจากนี้ยังสงเสริมการพัฒนาของ คลอโรพลาสตและการสังเคราะหคลอโรฟลล สวนของพืชที่มีไซโตไคนินจะสามารถดึงเอาอาหารมาจากสวนอื่น ๆ ได และยังชวยใหใบที่เปลี่ยนเปนสีเหลืองสามารถสังเคราะหคลอโรฟลลขึ้นไดอีก ทําใหสวนของพืชที่ไดรับสารไซโตไคนินมีอายุไดนาน (สมบุญ, 2544) โดยสวนใหญพบวา การชักนํายอดตองใชสารควบคุมการเจริญเติบโตมากกวา 1 ชนิด เชน Carelli and Echeverrigaray (2002) รายงานวา สามารถชักนํายอดของกุหลาบพันธุ Baronesse ไดโดยใชอาหารสูตร MS เติม BA ความเขมขน 3 มิลลิกรัมตอลิตร รวมกับ NAA ความเขมขน 0.5 มิลลิกรัมตอลิตร สอดคลองกับ ปรัชพรรณ (2550) พบวา อาหารสังเคราะหสูตร MS เติม BA ความเขมขน 4 มิลลิกรัมตอลิตร รวมกับ NAA ความเขมขน 0.5 มิลลิกรัมตอลิตร สามารถชักนํายอดรวมเฉลี่ยของกลวยไมเหลืองจันทบูรไดสูงสุด 4.44 ยอดตอช้ินสวน หลังจากเพาะเลี้ยงเปนเวลา 3 เดือน

46

จากการศึกษาผลของสูตรอาหารเพาะเลี้ยงตอการชักนํายอดนั้น พบวา อาหารสูตร MS ชักนํายอดไดดีกวาอาหารสูตร LS เนื่องจากธาตุอาหารหลักของ MS มีโพแทสเซียมฟอสเฟต ซ่ึงทําหนาที่ เกี่ยวกับการทํางานดานสรีรวิทยาของพืช เปนธาตุที่จําเปนในการสังเคราะหคารโบไฮเดรต การเคลื่อนยายแปงและน้ําตาลในพืช อีกทั้งยังมีสารอินทรียที่เปน coenzymes ในปฏิกิริยาออกซิเดชัน ไดแก Nicotinic acid Pyridoxin-HCl และ Glycine ซ่ึงทําหนาที่ในกระบวนการเมแทบอลิซึมของกรดอะมิโน สงผลตอการแบงเซลลของเนื้อเยื่อเจริญ และการพัฒนาการของนิวเซลลาเซลลไปเปนตนออน หรือยอด (สมปอง, 2539) ดังนั้นชิ้นสวนที่เพาะเลี้ยงในอาหารสูตร MS จึงมีการสรางยอดไดสูงกวาอาหารสูตร LS สอดคลองกับงานวิจัยของ Soomro และคณะ (2003) ซ่ึงทดลองในกุหลาบ R. indica สามารถชักนําใหเกิดการสรางยอดไดสูงสุดเมื่อเพาะเลี้ยงในอาหารสูตร MS โดยสวนใหญแลวกุหลาบเกือบทุกสายพันธุสามารถเพิ่มยอดไดสูงสุดเมื่อเพาะเลี้ยงในอาหารสังเคราะหสูตร MS (รงรอง และคณะ, 2542; Compos et al., 1998; Kim et al., 2001) เชนเดียวกับปรัชพรรณ (2550) ซ่ึงศึกษาเปรียบเทียบผลของสูตรอาหารตอการสรางยอดรวมของกลวยไมเหลืองจันทบูร พบวา อาหารสังเคราะหสูตร MS สามารถชักนํายอดรวมเฉลี่ยสูงกวาอาหารสูตร VW

สําหรับการชักนําดอกนั้น โดยทั่วไปการออกดอกของพืชข้ึนอยูกับอัตราสวนของไนโตรเจนและคารโบไฮเดรตในตนพืช ถาปริมาณไนโตรเจนสูง สงเสริมการสรางใบ และกิ่ง หรือการเจริญทางลําตน ทําใหการสรางดอกของพืชเกิดยากหรือชา ในขณะที่ปริมาณคารโบไฮเดรตหรือสารประกอบคารบอนในพืชสูง หรือในสภาพที่พืชไดรับฟอสฟอรัสและโพแทสเซียมสูง กระตุนการสรางดอกของพืช โสระยา (2544) รายงานวา ฟอสฟอรัสชวยใหกุหลาบมีการสรางดอก ติดเมล็ด และมีการเจริญของรากที่ดี โพแทสเซียมชวยใหกุหลาบมีความแข็งแรงขึ้น จากการศึกษาของ McDonald ป ค.ศ. 1995 อางโดย โสระยา (2544) พบวา การปลูกกุหลาบในโรงเรือนตองการระดับธาตุอาหารไนโตรเจน 170 part per million (ppm) ฟอสฟอรัส 34 ppm โพแทสเซียม 150 ppm แคลเซียม 120 ppm และแมกนีเซียม 12 ppm Kraus และ Kraybill (1918) อางโดยสัมฤทธิ์ (2544) พบวา สัดสวนของคารบอนตอไนโตรเจนเปนตัวกําหนดการออกดอกของพืช และจากการศึกษาของ Chandler (1958) อางโดย สมบุญ (2538) รายงานวา เนื้อเยื่อกุหลาบที่มีคาความสัมพันธระหวางปริมาณคารบอนตอไนโตรเจนสูง สงเสริมการสรางดอก สวนเนื้อเยื่อที่มีคาคารบอนตอไนโตรเจนต่ํา สงเสริมการสรางใบ และกิ่งกาน จากการศึกษาครั้งนี้ พบวา ระดับซูโครสและความเขมแสงที่ใชศึกษาไมสามารถชักนําดอกในกุหลาบพันธุมายวาเลนไทนนี้ได เนื่องจากระดับซูโครสอาจไมเหมาะสม ทําใหคา C/N ภายในชิ้นสวนพืชไมเหมาะสมตอการสรางดอก ในขณะที่ Jumin และ Ahmad (1999) รายงานวา การเพาะเลี้ยงชิ้นสวนยอดของดอกแกว

47

(Murraya paniculata) บนอาหารสูตร MT (Milk-Tween) เติมซูโครสความเขมขน 5 เปอรเซ็นต รวมกับสารควบคุมการเจริญเติบโต พบวา สามารถชักนําดอกได 95 เปอรเซ็นต Koh และ Loh (2000) ศึกษาการชักนําดอกใน Brassica napus โดยเพาะเลี้ยงยอดบนอาหารสูตร MS เติมซูโครส 3 เปอรเซ็นต ลดไนโตรเจนลงแตเพิ่มฟอสเฟตเปน 2 เทา พบวา ชักนําดอกได 40 เปอรเซ็นต นอกจากนี้ Hamner และ Bonner (1985) อางโดยลิลล่ี (2546) รายงานวาความเขมแสงระดับต่ําก็สามารถชักนําดอกได แตโดยทั่วไปการเจริญทางลําตนและคุณภาพดอกกุหลาบเพิ่มขึ้นเมื่อไดรับแสงเพิ่มขึ้น โดยมีผลตอการสะสมปริมาณสารอาหารในพืช และกระตุนการสรางตาดอก (เศรษฐพงศ, 2543) สอดคลองกับ Boodley (1981) อางโดยลิลล่ี (2546) พบวาการใหแสง 1,200-1,500 ฟุต-เทียน นาน 9 ช่ัวโมง สามารถปรับปรุงการเจริญและการออกดอกได 100 เปอรเซ็นต

นอกจากซูโครสและความเขมแสงแลว พบวา BA ยังเปนตัวสงเสรมิใหเกิดการสรางดอกดวย จากการศึกษาครั้งนี้ พบวา อาหารสูตร MS เติม BA เพียงอยางเดียว สามารถชักนําดอกไดในทกุระดับความเขมขน เนื่องจาก BA สงเสริมการแบงเซลลของพืช ทําใหพืชเขาสูระยะเจริญเติบโตเร็วขึ้น รวมทั้งชวยปรับสมดุลของ C/N ดวย นอกจากนีก้ารใช BA รวมกับสารควบคุมการเจริญเติบโตอ่ืน ๆ เชน Kintzios และคณะ (1999) ชักนําดอกใน Chamomilla recutita L. โดยใชอาหารสูตร MS เติม BA ความเขมขน 8.87 ไมโครโมลลาร รวมกับ NAA ความเขมขน 1.07 ไมโครโมลลาร ปรัชพรรณ (2550) รายงานวา การใช BA ความเขมขน 2 มิลลิกรัมตอลิตร รวมกบั NAA ความเขมขน 0.5 มลิลิกรัมตอลิตร สามารถชักนําดอกของกลวยไมเหลืองจนัทบูรไดสูงสุด 46.67 เปอรเซ็นต ในขณะที่ Wang และคณะ (2002) รายงานวา TDZ ความเขมขน 0.5 มิลลิกรัมตอลิตร สามารถชักนําดอกของกุหลาบไดสูงสุด 49.1 เปอรเซ็นต ดังนั้นชนิดของไซโตไคนินและความเขมขนที่เหมาะสม รวมทั้งชนิดของพชืมีการตอบสนองตอการออกดอกรวมกัน

สําหรับผลของสูตรอาหาร LS และ MS ตอการสรางดอกนั้น พบวา อาหารสูตร MS ชักนําดอกได สวนอาหารสูตร LS ไมสามารถชักนําดอกไดเลย เนื่องจากอาหารสูตร MS เปนอาหารเพาะเลีย้งเนื้อเยื่อที่มปีริมาณไนโตเจนสูง เหมาะแกการสรางดอกของพืช ซ่ึงเปนไปตามสัดสวน C/N อีกทั้งยังมอีงคประกอบของสูตรอาหารที่แตกตางกนั คือ อาหารสูตร LS ไมมี โพแทสเซียมฟอสเฟต Nicotinic acid Pyridoxin-HCl และ Glycine ซ่ึงมีคุณสมบัติดังที่ไดกลาวมาแลวในขางตน จึงสงผลใหตนกหุลาบที่เพาะเลี้ยงบนอาหารสูตรนี้ไมสามารถชักนําดอกไดเลย สอดคลองกับ Woodson และ Boodley (1982) อางโดย โสระยา (2544) ซ่ึงศึกษาถึงผลของไนโตรเจนในรูปของไนเตรทหรือแอมโมเนียม และโพแทสเซียมตอการเจริญและการออกดอกของกุหลาบพันธุ Forever Yours โดยการใหโพแทสเซียมความเขมขนต่ํา 1 มิลลิกรัมตอลิตร ทําใหการ

48

เจริญและผลผลิตดอกถูกจํากดั เชนเดยีวกับการชักนําดอกของกุหลาบพันธุมายวาเลนไทนที่ศึกษาในครั้งนี้ การเพาะเลี้ยงบนอาหารสูตร LS ทีซ่ึงไมมีโพแทสเซียมฟอสเฟตสงผลใหการสรางดอกถูกจํากัด

จํานวนครั้งของการยายเล้ียงมีผลตอลักษณะบางประการที่เปลี่ยนแปลงไป ซ่ึงในการศึกษาครั้งนี้พบวา การยายเลี้ยงครั้งที่ 6 มีเปอรเซ็นตการเกิดดอกสงูสุด และมีการกระจายตัวของสีดอก ตั้งแต แดง ชมพู เหลืองเขียว ถึง เหลืองขาว รวมทั้งมีดอกปกติ และผิดปกติสูงสุด โดยพบดอกผิดปกตหิลายลักษณะ ประกอบดวย ดอกมีลักษณะสีเขียวคลายใบบริเวณกลางดอก ดอกบวมฉ่ําน้ํา ดอกเหีย่วกอนถึงระยะดอกบาน และบางดอกมีเฉพาะเกสร ในทาํนองเดียวกับอรอุมา (2550) ซ่ึงเพาะเลี้ยงปลายยอดกลวยน้ําวาบนอาหารสูตร MS เติม BA ความเขมขน 5 มิลลิกรัมตอลิตรหรือน้ํามะพราว 15 เปอรเซ็นต หรือทั้ง 2 ชนิดรวมกัน พบวา การยายเลี้ยงครั้งที่ 3 ปรากฏลักษณะผิดปกติ 6 ลักษณะ คือ ใบซีด ใบดาบ ลําตนยืดยาว หนอ ปม และใบเปนเสนมวนงอ เชนเดียวกบั Michael และคณะ (2006) รายงานวา หลังการยายเลี้ยงครั้งที่ 4 พบความแปรปรวนของตนกลวย Zelig จํานวน 3 เปอรเซ็นต เนื่องจากสารควบคุมการเจริญเติบโตกลุมไซโตไคนินสามารถชักนําการเจริญไดเปนอยางด ี จึงสงเสริมใหพืชมีการเจริญเตบิโตไดดีในชวงแรก แตเมื่อเพาะเลี้ยงเปนระยะเวลานานขึ้น สงผลใหพชืดูดน้ํา ธาตุอาหาร และสารควบคุมการเจริญเติบโตมากจนมากเกินไป สงเสริมใหพืชมีการแบงเซลลผิดปกติได (เพ็ญจันทร, 2546; สมปอง, 2539) สอดคลองกับ สมปอง และวนัทนา (2531) พบวา การใช BA ที่ระดับความเขมขนสูง สงผลใหเกิดตนกลาของมังคุดขนาดเล็กกวา 0.5 เซนติเมตร จํานวนมากและลักษณะแคระแกร็นจับกันเปนกลุมกอน ซ่ึงในการศึกษาคร้ังนี้ไดยายเลีย้งตนกหุลาบจากอาหารสูตร MS เติม BA ความเขมขน 2 มิลลิกรัมตอลิตร สูอาหารสูตรเดิมแตปราศจากสารควบคุมการเจริญเติบโต สลับกัน เพื่อปองกันการเกิดลักษณะผิดปกติของพืช ดังที่ไดกลาวมาแลวในขางตน สอดคลองกับเพ็ญจนัทร (2546) ซ่ึงรายงานวา การใช BA ความเขมขน 5 มลิลิกรัมตอลิตร ในชวง 1 เดือนแรกของการเพาะเลีย้ง ไมพบลักษณะผิดปกติ แตหลังจากยายเลีย้งบนอาหารใหมสูตรเดิม จึงพบลักษณะผิดปกติขึ้น เนื่องจากพืชมกีารสะสม BA ในชวงแรกมากพออยูแลว เมื่อยายเลีย้งบนอาหารใหมสูตรเดิมอีกโดยไมลดความเขมขนของ BA ลง ทําใหสมดุลของสารควบคุมการเจรญิเติบโตเปลี่ยนไปไมเหมาะสมตอการเจริญเติบโตของพืช อยางไรก็ตามเมื่อยายเลี้ยงบนอาหารใหมที่ลดความเขมขนของ BA เปน 0.1 มิลลิกรัมตอลิตร พบลักษณะผิดปกติดังกลาวลดลง สอดคลองกับการรายงานของ Te-chato (1998) ซ่ึงพบวา เมื่อลดความเขมขนของ BA ลง ทําใหลักษณะผิดปกติของพืชลดลงดวย นอกจากนี้จํานวนครั้งในการยายเล้ียงยังสงผลตออายุและความพรอมของพืชดวย กลาวคือพืชตองมีการเจริญทางลําตนจนถึงชวงอายุที่เหมาะสมจึงมีการสรางดอก โดยอายุของพืชสัมพันธกับขนาดของตนพืชซ่ึงเกีย่วของกับปริมาณ

49

อาหารในพืชโดยตรง ดังนัน้จึงมีผลตอการสรางดอกของพืช สอดคลองกับ Franklin และคณะ (2000) ที่พบวายอดถั่วอายุ 84 วัน เกิดดอกสูงสุด 100 เปอรเซ็นต

จากการศึกษาครั้งนี้ยังพบวาอาหารสูตร MS ปราศจากสารควบคุมการเจริญเติบโตยังสามารถชักนํารากไดอีกดวย โดยชักนํารากไดสูงสุด 37.63 เปอรเซ็นต เฉลี่ย 2.83 รากตอตน ทําใหลดขั้นตอนในการเพาะเลีย้งเนื้อเยื่อลงได อีกทั้งยังเปนการลดตนทนุทั้งดานสารเคมี แรงงานอีกดวย ในขณะที่กุหลาบสายพันธุอ่ืน ๆ ตองใชสารควบคุมการเจริญเตบิโตในการชักนําราก เชน การชักนํารากของกุหลาบพันธุ Improved Blaze ดวยอาหารสูตร MS เติม IAA ความเขมขน 0.3 มิลลิกรัมตอลิตร (Hasegawa, 1979) Soomro และคณะ (2003) พบวา สามารถชักนํารากของ R. indica ไดสูงสุด 50 เปอรเซ็นต ดวยอาหารสูตร MS เติม IBA ความเขมขน 0.6 - 0.8 มิลลิกรัมตอลิตร รวมกับ NAA ความเขมขน 0.1 - 0.3 มิลลิกรัมตอลิตร หลังวางเลี้ยงเปนเวลา 12 สัปดาห

50

บทที่ 5

สรุป

อาหารสูตร MS เติม TDZ เพียงอยางเดียว ใหการสรางแคลลัสไดรวดเร็วกวาอาหารสูตร MS ที่เติม 2,4-D และเปอรเซ็นตการสรางแคลลัสสูงกวาดวย (อยางนอย 4 เทา) โดยสูตรอาหารและสารควบคุมการเจริญเติบโตที่เหมาะสมตอการชักนําแคลลัสจากชิ้นสวนใบออนของกุหลาบพันธุมายวาเลนไทน คือ อาหารสูตร MS เติม TDZ ความเขมขน 1.5 มิลลิกรัมตอลิตร รวมกับ NAA ความเขมขน 0.1 มิลลิกรัมตอลิตร ใหการสรางแคลลัสสูงสุด 100 เปอรเซ็นต ปริมาณแคลลัสที่ไดเพิ่มขึ้นในแตละสัปดาห โดยแคลลัสมีลักษณะเปน compact และเมื่อความเขมขนของ NAA เพิ่มขึ้นเปน 0.2 มิลลิกรัมตอลิตร สงผลใหการชักนําแคลลัสลดลง

การเพาะเลีย้งชิ้นสวนขอบนอาหารสูตร MS มีความเหมาะสมตอการชักนํายอดและดอกมากกวาอาหารสูตร LS เติม BA ความเขมขน 0.5 มิลลิกรัมตอลิตร สงเสริมการสรางยอดรวมและตาดอกสูงสุด 2.91 ยอด/ช้ินสวน และ 5 ตาดอก ตามลําดับ และยังพบวาอาหารสูตร MS ที่ปราศจากสารควบคุมการเจริญเติบโตสามารถชักนํารากไดสูงสุด 37.63 เปอรเซ็นต (2.83 รากตอยอด)

อาหารสูตร MS ที่เติมซูโครสความเขมขน 3.5 เปอรเซ็นต รวมกบัการใหแสง 50.70 ไมโครโมลตอตารางเมตรตอวินาที สงผลใหมีการสรางยอดรวมสูงสุด 84 เปอรเซ็นต จํานวนยอดเฉลี่ย 2.32 ยอดตอช้ินสวน แตไมสามารถชักนําดอกไดทุกระดับความเขมขน

จํานวนครั้งการยายเลี้ยงสงผลตอการสรางดอกของกุหลาบพันธุมายวาเลนไทน โดยดอกเริ่มปรากฏใหเห็นตั้งแตการยายเลี้ยงครั้งแรก แตมีเปอรเซ็นตนอย และเพิ่มสูงขึ้นเมื่อจํานวนครั้งการยายเล้ียงเพิ่มขึ้น โดยมีเปอรเซ็นตการเกิดดอกสูงสุด 95.08 เปอรเซ็นต จํานวน 116 ดอก หลังการยายเล้ียงครั้งที่ 6 สําหรับดอกผิดปกติเร่ิมปรากฏขึ้นหลังจากยายเล้ียงครั้งที่ 4 และเพิ่มขึ้นสูงสุด 60.79 เปอรเซ็นต จํานวน 74 ดอก หลังการยายเลี้ยงครั้งที่ 6 เชนกัน รวมทั้งเกิดการกระจายตัวของสีดอก ตั้งแต สีแดง ชมพู ขาวเขียว ถึง ขาวเหลือง ซ่ึงดอกผิดปกตินี้พบหลายลักษณะ คือ มีลักษณะสีเขียวคลายใบบริเวณกลางดอก ดอกมีลักษณะบวมฉ่ําน้ํา บางดอกมีเฉพาะเกสรตัวผู และดอกมีลักษณะเหี่ยวกอนถึงระยะดอกบาน

51

เอกสารอางอิง จิตเกษม เที่ยงจิตต, ภัควดี ภกัดีงาม และ สุเม อรัญนารถ. 2545. การชักนําใหเกิดแคลลัสในบัว

หลวงพันธุบณุฑริก. กรุงเทพฯ: ภาควิชาพืชสวน คณะเทคโนโลยีการเกษตร สถาบันเทคโนโลยีพระจอมเกลาเจาคุณทหาร ลาดกระบัง.

นพดล จรัสสัมฤทธิ์. 2537. ฮอรโมนพืชและสารควบคุมการเจริญเตบิโตของพืช. กรุงเทพฯ: โรงพิมพสหมิตรออฟเซท.

นิตย ศกนุรักษ. 2541. สรีรวิทยาของพืช. เชียงใหม: ภาควิชาพืชไร คณะผลิตกรรมการเกษตร มหาวิทยาลัยแมโจ.

ประภัสสร สูทกวาทิน. 2548. การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ. กรุงเทพฯ: งานวิจยัอุตสาหกรรมเทคโนโลยีชีวภาพ สถาบันวิจัยและพฒันา.

ปรัชพรรณ หนูจีน. 2550. ปจจัยที่มีผลตอการเจริญและการออกดอกของกลวยไมเหลืองจันทบูร (Dendrobium friedericksianum Rchb.f) ในหลอดทดลอง. วิทยานิพนธวิทยาศาสตรมหาบัณฑติ สาขาวิชาพืชศาสตร คณะทรัพยากรธรรมชาติ มหาวทิยาลัย สงขลานครินทร.

พงศยุทธ นวลบุญเรือง. 2550. การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพชื. ลําปาง: สถาบันวิจยัและฝกอบรมการเกษตรลําปาง สถาบันเทคโนโลยีราชมงคล.

พีรเดช ทองอําไพ. 2532. สารควบคุมการเจริญเติบโต. นครปฐม: ภาควิชาพืชสวน คณะเกษตร มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร วิทยาเขตกําแพงเสน.

เพ็ญจันทร เพชรสุด. 2546. อิทธิพลของวุน น้ําตาล และการสรางแผลตอการเจริญของยอดรวมจากการเพาะเลี้ยงเมล็ดมังคุดในหลอดทดลอง. วิทยานพินธวิทยาศาสตรมหาบัณฑิต สาขาวิชาพืชศาสตร คณะทรัพยากรธรรมชาติ มหาวิทยาลัยสงขลานครินทร.

รงรอง วิเศษสุวรรณ. 2542. เทคนินการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ. นครปฐม: งานเพาะเลี้ยงเนือ้เยื่อ ฝายปฏิบัติการวิจัย มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร กําแพงแสน.

ลัดดาวัลย มูสิกะปาละ. 2544. การชักนําแคลลัส การแยกโปรโตพลาสตจากใบพืชในสกุล Garcinia บางชนิด. วิทยานพินธวิทยาศาสตรมหาบัณฑิต สาขาวิชาพืชศาสตร คณะทรัพยากรธรรมชาติ มหาวิทยาลัยสงขลานครินทร.

ลิลล่ี กาวีตะ. 2546. การเปลี่ยนแปลงทางสัญฐาณและพฒันาการของพืช. กรุงเทพฯ: มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร.

52

วุฒิชัย ไขมกุ. 2548. การแยกและการเพาะเลี้ยงโปรโตพลาสตจากเซลลซัสเพนชันของกุหลาบมอญ (Rosa damascene Mill.). ปญหาพิเศษบัณฑิตศกึษา. สงขลา: ภาควิชาพืชศาสตร คณะทรัพยากรธรรมชาติ มหาวิทยาลัยสงขลานครินทร วิทยาเขตหาดใหญ.

เศรษพงศ เลขะวัฒนะ. 2543. การปลูกกุหลาบตัดดอก. กรมสงเสริมการเกษตร: KU Electronic Magazine 2: 1-3.

สมบุญ เตชะภญิญาวัฒน. 2544. สรีรวิทยาของพืช. กรุงเทพฯ: ภาควชิาพฤกษศาสตร คณะวิทยาศาสตร มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร.

สมปอง เตชะโต และ วนัทนา เองยอง. 2531. การขยายพันธุมังคุดจํานวนมากโดยวธีิการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ. ว. สงขลานครินทร 10: 7-11

สมปอง เตชะโต. 2539. บทปฏิบัติการชีวภาพพืชปลูก. สงขลา: ภาควิชาพืชศาสตร มหาวิทยาลัยสงขลานครินทร.

สัมฤทธิ์ เฟองจันทร. 2544. สรีรวิทยาการพัฒนาพืช. กรุงเทพฯ: หางหุนสวนจํากดั โรงพิมพคลังนานาวิทยา.

สุธานิธ์ิ ยุกตะนันทน. 2539. กุหลาบ: ราชินีดอกไม. กรุงเทพฯ: สําหนักพิมพบานและสวน. สุปราณี วนิชชานนท. 2541. ไมประดับ. กรุงเทพฯ: สํานักพิมพเพื่อนเกษตร. โสระยา รวมรังษี. 2544. สรีรวิทยาไมดอก. เชียงใหม: ภาควิชาพืชสวน คณะเกษตรศาสตร

มหาวิทยาลัยเชียงใหม. สํานักงานสงเสริมการคาในตางประเทศ ณ กรุงมะนิลา. 2547. ตลาดไมตัดดอกในไตหวนั.

กรมสงเสริมการสงออก กระทรวงพาณิชย. สํานักงานสงเสริมการคาในตางประเทศ ณ เมืองมิลาน. 2547. สถานการณตลาดไมตดัดอกและพันธุ

ไมในตลาดอิตาลี. กรมสงเสริมการสงออก กระทรวงพาณิชย. อรอุมา บุญมี. 2550. การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อกลวยน้ําวา [Musa (ABB group)] และความแปรปรวน

ทางพันธุกรรม. วิทยานิพนธวิทยาศาสตรมหาบัณฑติ สาขาวิชาพืชศาสตร คณะทรัพยากรธรรมชาติ มหาวิทยาลัยสงขลานครินทร.

อัญจนา จันทรปะทิว. 2547. การผลิตแอนโธไซยานินในการเพาะเลี้ยงแคลลัส และเซลลซัสเพนชัน ของกุหลาบมอญ (Rosa damascena Mill.) วิทยานิพนธวิทยาศาสตรมหาบัณฑิต สาขาวิชาพืชศาสตร มหาวิทยาลัยสงขลานครินทร.

อัมพา วองวิชชกร, ปริญญารัตน ภูศิริ และ วรนฐั ศรีพาเพลิน. 2546. การเพาะเลีย้งเนื้อเยื่อกับงานขยายพนัธุพืช. กรุงเทพฯ: กรมสงเสริมการเกษตร.

53

Arene, L., Pellegrino, C. and Gudin, S. 1993. A comparison of the somaclonal variation level of Rosa hybrida L. cv. Meirutral plants regenerated from callus or direct induction from different vegetative and embryonic tissues. Euphytica 71: 83-90.

Avramis, T., Hugard, J. and Jonard, R.L. 1982. Multiplication in vitro du Rosier porte-greffe Rosa indica major. Académie des sciences 294: 63-68.

Bao, M.Z. and Gao, L.P. 2005. Callus induction and plant regeneration of Rosa hybrida 'Samantha'. Acta Horticulturae Sinica 3: 534-536.

Barna. K.S. and Wakhlu, A.K. 1995. Effects of thidiazuron on micropropagation of rose. In Vitro Cellular and Development Biology Plant 31: 44-46.

Bressan, P.H., Kim, Y.J., Hyndman, S.E., Hasegawa, P.M. and Bressan, R.A. 1982. Factors affecting in vitro propagation of rose. Journal of the American Society for Horticultural Science 107: 979-990.

Britto, S.J., Natarajan, E. and Arockiasamy, D.I. 2003. In vitro flowering and shoot multiplication from nodal explants of Ceropegia bulbosa Roxb. Var. bubosa. Taiwania 48: 106-111.

Carelli, B.P. and Echeverrigaray, S. 2002. An improved system for the in vitro propagation of rose cultivars. Scientia Horticulturae 92: 69-74.

Canli, F. A. 2003. Effects of dark and TDZ on callus formation of rose leaf explants. Pakistan Journal of Biological Science 6: 1672-1674.

Chamber, S.M., Heuch, J.H.R. and Pirrie, A. 1991. Micropropagation and in vitro flowering of the bamboo Dendrocalamus hamiltonii Munro. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 27: 45-48.

Clemencia, N. and Maro, R.S. 1991. Somatic embryogenesis in hybrid tea roses. Biotechnology 9: 991-993.

Compos, P.S., Salome, M. and Pais, S. 1990. Mass propagation of the dwarf rose cultivar Rosamini. Scientia Horticulturae 43: 321-330.

Data, S.K., Misra, P. And Mandal, A.K.A. 2005. In vitro mutagensis-a quick method for establishment of solid mutant in Chrysanthemum. Current Science 88: 155-158.

Davies, D.R. 1980. Rapid propagation of roses in vitro. Scientia Horticulturae 13: 385-9.

54

Dewir, Y.H., Chakrabarty, D., Ali, B.M., Singh, N., Hahn, E.J. and Peak, K.Y. 2007. Influence of GA3, sucrose and solid medium bioreactor culture on in vitro flowering of Spathiphllum and association of glutathione metabolism. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 90: 225-235.

Dohm, A., Ludwig, C., Nehring, K. and Debener, T. 2001. Somatic embryogenesis in roses. Acta Hort. 547: 341-347

Duan, J.X. and Yazawa, S. 1995. Floral induction and develoment in Phalaenopsis in vitro. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 43: 71-74.

Ebrahim, M.K.H. and Ibrahim, I.A. 2000. Influence of medium solidification and pH value on in vitro propagation of Maranta leuconeura cv. Kerchoviana. Science Horticulturae 86: 211-221.

Estabrooks, T., Browne, R. and Dong, Z. 2007. 2,4,5-Trichlorophenoxyacetic acid promotes somatic embryogenesis in the rose cultivar ‘Livin’ Easy’ (Rosa sp.). Plant Cell Reports 26: 153-160.

Franklin, G., Pius, P.K. and Ignaimuthu, S. 2000. Factors effecting in vitro flowering and fruiting of green pea (Pisum sativum L.). Euphytica 115: 65-73.

Hasegawa, P.M. 1979. In vitro propagation of rose. Scientia Horticulturae 14: 610-612. Hasegawa, P.M. 1980. Factors affecting shoot and root initiation from cultured rose shoot tips.

Journal of the American Society for Horticultural Science 105: 216-220. He, S.L., Zhu, D.Y., Ren, N.H. and Lu, L. 1996. A study on tissue culture for micropropagation

of cut rose variety Samantha. Acta Agriculturae Boreali Sinica 11: 117-120. Hee, K.H. and Loh, C.S. 2007. Early in vitro flowering and seed production in culture in

Dendrobium Chao Praya Smile (Orchidaceae). Plant Cell Reports 26: 2055-2062. Hoque, Md.E. and Mansfield, J.W. 2004. Effect of genotype and explant age on callus induction

and subsequent plant regeneration from root-derived callus of Indica rice genotypes. Plant cell,Tissue and organ Culture 78: 217-223.

Hsia, C.N. and Korban, S.S. 1996. Organogenesis and somatic embryogenesis in callus culture of Rosa hybrida and Rosa chinensis minima. Plant Cell Tissue and Organ Culture 44: 1-6.

55

Ishioka, N. and Tanimoto, S. 1990. Plant regeneration from Bulgarian rose callus. Plant Cell Tissue and Organ Culture 22: 197-199.

Jumin, H.B. and Ahmad, M. 1999. High – frequency in vitro flowering of Murraya paniculata L. Jack. Plant Cell Reports 18: 764-768.

Kachonpadungkitti, Y., Romohatngoen, S., Hasegawa, K. and Hisajima, S. 2001. Efficient flower induction from cultured buckwheat (Fagopyrum esculentum L.) node segments in vitro. Plant Growth Regulation 35: 37-45.

Kadota, M., Imizu, K. and Hirano, T. 2001. Double-phase in vitro culture using sorbitol increases shoot proliferation and reduces hyperhydricity in Japanese pear. Scientia Horticulturae 89: 207-215.

Kamo, K., Jones, B., Bolar and Smith, F. 2004. Regeneration from long-term embryogenic callus of the Rosa hybrida cultivar Kardinal. In Vitro Cellular and Development Biology Plant 41: 32-36.

Kaur, N., Pati, P., Sharma, M. and Ahuja, P.S. 2006. Somatic embryogenesis from immature zygotic embryos of Rosa bourbonlana Desp In Vitro Cellular and Development Biology Plant 42: 124-127.

Khui, K.M. and Sink, K.C. 1982a. Micropropagation of new and old world rose species. Scientia Horticulturae 57: 315-319.

Khui, K.M. and Sink, K.C. 1982b. Rooting enhancement of Rosa hybrida for tissue culture propagation. Scientia Horticulturae 17: 371-376.

Khui, K.M. and Sink, K.C. 1982. Callus induction and culture of Rosa. Scientia Horticulturae 17: 361-370.

Kim, C.K., Chung, J.D., Jee, S.K. and Oh, J.Y. 2003. Somatic embryogenesis from in vitro grown leaf explants of Rosa hybrida L. Plant Biotechnol. 5: 161-164.

Kim, D. C., Chung, H. J., Min, B. H. and Yang, D. C. 2001. Plant regeneration from leaf and internode segment culture of Boxthorn (Lycium chinense Mill.). Korean Journal of Plant Tissue Culture 28: 329-333

Kintzios, S., Manos, C. and Makri, O. 1996. Somatic embryogenesis from mature leaves of rose (Rosa sp.). Plant Cell Reports 18: 467-472.

56

Kintzios, S. and Michaelakis, A. 1999. Induction of somatic embryogenesis and in vitro flowering from inflorescence of chamomile (Chamomilla recutita L.). Plant Cell Reports 18: 684-690.

Koh, W.L. and Loh, C.S. 2000. Direct somaic embryogenesis, plant regeneration and in vitro flowering in rapid-cycling Bassica napus. Plant Cell Reports 19: 1177-1183.

Kumar, A., Sood, A., Palni, U.T., Gupta, A.K. and Palni, L.M.S. 2001. Micropropagation of Rosa damascene Mill from mature bushes using thidiazuron. Journal of the American Society for Horticultural Science 76: 30-34.

Kuusiene, S. and Kandzezauskaite, M. 2001. The influence of genotype and explant for callus induction and proliferation of Rosa floribunda. Acta Hort. 560: 501-508.

Leupin, R.E., Leupin, M., Ehret, C., Erismann, K.H. and Witholt, B. 2000. Compact callus induction and plant regeneration of a non-flowering vetiver from Java. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 62: 115-123.

Li, X., Krasnyaski, S.F. and Korban, S.S. 2002. Somatic embryogenesis, secondary somatic embryogenesis and shoot organogenesis in Rosa. Plant Physiol. 159: 313-319.

Ling, C.S., Lin, C.C. and Chang, W.C. 2003. In vitro flowering of Bambosa edulis and subsequent plantlet survival. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 72: 71-78.

Ling, O.P. and Keng, C.L. 2006. In vitro plant regeneration, flowering and fruiting of Phyllanthus niruri L. (Euphorbiaceae). International Journal of Botany 2: 409-414.

Lloyd, D., Roberts, A.V. and Keith, C. 1988. The induction in vitro of adventitious shoots in Rosa. Euphytica 37: 31-36.

Mamiya, M. and Sakamoto, Y. 2000. Effect of sugar concentration and strength of basal medium on conversion of somatic embryos in Asparagus officinalis L. Scientia Horticulturae 84:15-26.

Martin, C., Carre, M. and Vernoy, R.L. 1981. Multiplication vegetative in vitro des vegetaux ligneux cultives: cas des rosiers. Académie des Sciences 293: 157-177.

Michael, W.B., Catherine, W.F. and Johannes, V.S. 2006. The effect of plant growth regulators on somaclonal variants to benzylaminopurine. Infomusa 15: 27-29.

57

Murail, S., Sreedhar, D. and Lokeswari, T.S. 1996. Regeneration through somatic embryogenesis from petal-derived calli of Rosa hybrida L. cv. Arizona (hybrid tea). Euphytica 91: 271-275.

Nadgauda, R.S., John, C.K. Parasharami, V.A., Joshi, M.S. and Mascarenhas, A.F. 1997. A comparison of in vitro with in vivo flowering in bamboo: Bambusa arundinacea. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 48: 181-188.

Neto,V.B.P. and Otoni, W.C. 2003. Carbon sources and their osmotic potential in plant tissue culture: does it matter?. Scientia Horticulturae 97: 193-202.

Nontaswatsri, C. and Fukai, S. 2005. Regenerative callus of Dianthus‘Telstar Scarlet’showing mixoploidy produce diploid plants. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 83: 351-355.

Page, M. Y. and Visser, H. J. 1989. In vitro propagation of Geraldton wax: initiation, proliferation and rooting. HortScience 24: 381-381.

Prakash, E., Khun, P. S., Reddy, P. S. and Rao, K. R. 1999. Regeneration of plant from seed derived callus of Hybanthus enneaspermus L. Muell., a rare ethnobotanical. Plant Cell Reports 18: 873-878.

Preece, J. E. 1987. The influence of thidiazuron on in vitro culture of woody plants. HortScience 22: 1071.

Ramanayake, S.M.S.D., Wanniarachchi, W.A.V.R. and Tennakoon, T.M.A. 2001. Axillary shoot proliferation and in vitro flowering in an adult giant Bamboo, Dendrocalamus giganteus Wall. Ex. Munro. In Vitro Cellular and Development Biology Plant 37: 667-671.

Rout, G.R., Debata, B.K. and Das, P. 1991. Somatic embryogenesis in callus cultures of Rosa hybrida L. cv. Landora. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 27: 65-69.

Sahoo, S. and Debata, B.K. 1997. A note on in vitro micropropagation and induction of flowering in the miniature rose “The Fairy”. Orissa Journal of Horticulture 25: 87-89.

Saritha, K.V. and Naidu, C.V. 2007. In vitro flowering of Withania somnifera Dunal.- antitumor medicinal plant.. Plant Science 172: 847 - 851.

Sauer, A., Walther, F. and Preil, W. 1985. Different suitability for in vitro propagation of rose cultivars. Gartenbauwissenschaft 50: 133 - 138.

58

Sim, G.E., Loh, C.S. and Goh, C.J. 2007. High frequency early in vitro flowering of Dendrobium Madam Thaong – In (orchidaceae). Plant Cell Reports: 26: 383 - 393.

Singh, S.K. and Syamal, M.M. 1999. Critical studies on the effect of growth regulators on in vivo shoot proliferation in Rosa_hybrida L. cv Sonia for micropropagation. Journal of Applied Horticulture 1: 91 - 93.

Sivanesan, I. and Jeang, B.R. 2007. Micropropagation and in vitro flowering in Pentanema indium Ling. Plant Biotechnology 24: 527 - 532.

Skirvin, R.M. and Chu, M.C. 1979. In vitro propagation of “Forever Yours” rose. Scientia Horticulturae 14: 608 - 610

Soomro, R., Yasmmin, S. and Aleem, R. 2003. In vitro propagation of Rosa indica. Pak. J. Biol. Sci., 6:826-830.

Syamal, M.M. and Singh, S.K. 1996. In vitro propagation of rose. Scientia Horticulturae 9: 57 - 62.

Tang, W. 2000. High - frequency plant regeneration via somatic embryogenesis and organogenesis and in vitro flowering of regenerated plantlet in Panax ginseng. Plant Cell Reports 19: 727 - 732.

Taylor, N.J., Light, M.E. and Staden, J.V. 2005. In vitro flowering of Kniphofia leucocephala: influence of cytokinins. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 80: 327 - 333.

Te-chato, S., M. Lim and P. Suranilpong. 1995. Types of medium and cytokinins in relation with purple leaf and callus formation of mangosteen. Songklanakarin J. Sci. Technol. 17:121-128.

Te-chato, S. 1998. Recent potential in the biotechnology of mangosteen I: Micropropagation. Songklanakarin J. Sci. Technol. 20: 275 - 284

Theo, P.M., Caroline, J.G., Charlotte, H.H. and Hans, J.M. 1996. Somatic embryogenesis and shoot regeneration from excised adventitious roots of the rootstock Rosa hybrida L. 'Moneyway'. Plant Cell Reports 15: 522-526.

Tweddle, D., Roberts, A.V. and Short, K.C. 1984. In vitro culture of roses. Académie des Sciences 7: 529 - 30.

Wang, G. Y., Yuan, M. F. and Hong, Y. 2002. In vitro flower induction in roses. In Vitro Cellular and Development Biology Plant 38: 513-518.

59

Wang, S., Tang, L. and Chen, F. 2001. In vitro flowering of bitter melon. Plant Cell Reports 20: 393 - 397.

Williams, R.R. and Taji, A.M. 1991. Effect of temperature, gel concentration and cytokinin on vitrification of Olearia microdisca (J.M. Black) in vitro shoot culture. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 26: 1 - 6.

Wilson, D. and Nayar, N.K. 1995. Effect of activated charcoal on in vitro rooting of cultured rose shoots. South Indian Horticulture 43: 32 - 4.

Wilson, D.P.M., Sullivan, J.A., Marsolasis, A.A., Tsujita, M.J. and Senaratna, T. 1996. Improvement of somatic embryogenesis in Zonal geranium. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 43: 207 - 213.

Zhang, T. 2007. In vitro flowering of Perilla fruteseens. In Vitro Cellular and Development Biology Plant 43: 91 - 94.

Zhang, Z. And Leung, D.W.M. 2000. A comparison of in vitro with in vivo flowering in Gentian. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 63: 223 - 226.

Zhang, Z. and Leung, D.W.M. 2002. Factors influencing the growth of micropropagated shoots and in vitro flowering of gentian. Plant Growth Regulation 7: 245 - 251.

60

ภาคผนวก

61

ตารางภาคผนวกที่ 1 องคประกอบของธาตุอาหารสูตร Half Murashige and Skoog (½ MS) Murashige and Skoog (MS) และ Linsmaier and Skoog (LS)

ปริมาณสาร (มิลลิกรัมตอลิตร) องคประกอบ ½ MS MS LS

ธาตุอาหารหลกั NH4NO3 825.00 1650.00 1650.00 KNO3 950.00 1900.00 1900.00 KH2PO4 85.00 170.00 - CaCl2.2H2O 220.00 440.00 440.00 MgSO4.7H2O 185.00 370.00 370.00 ธาตุอาหารรอง KI 0.415 0.83 0.83 H3BO3 3.1 6.20 6.20 MnSO4.H2O 8.45 16.90 16.90 ZnSO4.7H2O 5.3 10.60 10.60 CuSO4.5H2O 0.0125 0.025 0.025 Na2MoO4.2H2O 0.125 0.25 0.25 CoCl2.6H2O 0.0125 0.025 0.025 FeSO4.7H2O 13.9 27.80 27.80 Na2EDTA 18.65 37.30 37.30 สารอินทรีย Myo-inositol 50.00 100.00 100.00 Nicotinic acid 0.25 0.50 - Pyridoxine HCl 0.25 0.50 - Thiamine HCl 0.05 0.10 0.10 Glycine 1.00 2.00 - Sucrose (กรัม) 30.00 30.00 30.00 วุน (กรัม) 7.50 7.50 7.50 pH 5.7 5.7 5.7

62

ประวัติผูเขียน

ชื่อ สกุล นางสาวศิรินธร คงประพฤติ รหัสประจําตัวนักศึกษา 4910620055 วุฒิการศึกษา

วุฒิ ชื่อสถาบัน ปท่ีสําเร็จการศึกษา วิทยาศาสตรบณัฑิต (ผลิตกรรมชีวภาพ)

มหาวิทยาลัยสงขลานครินทร 2548