Expressão gênica dos receptores de estrógeno e ocitocina ... · T.1987 Veiga, Gisele Almeida...
Transcript of Expressão gênica dos receptores de estrógeno e ocitocina ... · T.1987 Veiga, Gisele Almeida...
Gisele Almeida Lima Veiga
Expressão gênica dos receptores de estrógeno e ocitocina no endométrio, miométrio e placenta
durante a gestação e parto em cadelas
São Paulo 2008
Gisele Almeida Lima Veiga
Expressão gênica dos receptores de estrógeno e ocitocina no endométrio, miométrio e placenta
durante a gestação e parto em cadelas
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Reprodução Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Medicina Veterinária Departamento:
Reprodução Animal
Área de concentração: Reprodução Animal
Orientador: Profa. Dra. Camila Infantosi Vannucchi
São Paulo 2008
Autorizo a reprodução parcial ou total desta obra, para fins acadêmicos, desde que citada a fonte.
DADOS INTERNACIONAIS DE CATALOGAÇÃO-NA-PUBLICAÇÃO
(Biblioteca Virginie Buff D’Ápice da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo)
T.1987 Veiga, Gisele Almeida Lima FMVZ Expressão gênica dos receptores de estrógeno e ocitocina no
endométrio, miométrio e placenta durante a gestação e parto em cadelas / Gisele Almeida Lima Veiga. – São Paulo : G. A. L. Veiga, 2008. 73 f. : il.
Dissertação (mestrado) - Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia. Departamento de Reprodução Animal, 2008.
Programa de Pós-Graduação: Reprodução Animal. Área de concentração: Reprodução Animal.
Orientador: Profa. Dra. Camila Infantosi Vannucchi.
1. Estrógeno. 2. Ocitocina. 3. Gestação. 4. Parto. 5. Cadelas. I. Título.
FOLHA DE AVALIAÇÃO Nome: VEIGA, Gisele Almeida Lima Título: Expressão gênica dos receptores de estrógeno e ocitocina no endométrio, miométrio e placenta durante a gestação e parto em cadelas
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Reprodução Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Medicina Veterinária
Data:____/____/____
Banca Examinadora
Prof. Dr. _____________________________ Instituição: ____________________
Assinatura: ___________________________ Julgamento: __________________
Prof. Dr. _____________________________ Instituição: ____________________
Assinatura: ___________________________ Julgamento: __________________
Prof. Dr. _____________________________ Instituição: ____________________
Assinatura: ___________________________ Julgamento: __________________
RESUMO
VEIGA, G. A. L. Expressão gênica dos receptores de estrógeno e ocitocina no endométrio, miométrio e placenta durante a gestação e parto em cadelas. [Expression of the canine estrogen and oxytocin receptor genes in the endometrium, myometrium and placenta during pregnancy and parturition]. 2008. 73 f. Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária) � Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2008. As diversas interações hormonais durante e gestação e parto na espécie canina são
parcialmente conhecidas. A resposta dos tecidos frente ao estímulo hormonal é
dependente da expressão gênica de seus receptores, bem como da concentração
local dos hormônios. Desta maneira, o presente estudo apresentou como objetivos:
caracterizar a expressão gênica dos receptores de estrógeno e ocitocina no
endométrio, miométrio e placenta, correlacionando com as concentrações séricas
dos respectivos hormônios durante a gestação e o parto. As cadelas gestantes
foram alocadas em 4 grupos de acordo com a idade gestacional: até 20 dias de
gestação (grupo 1, n=11), de 20 a 40 dias de gestação (grupo 2, n=12), de 40 a 60
dias de gestação (grupo 3, n=12) e em pródromos do parto (grupo 4, n=11). As
cadelas dos grupos 1, 2 e 3 foram submetidas à ovário-histerectomia e as cadelas
do grupo 4, à cesariana seguida da ovário-histerectomia. Amostras de endométrio,
miométrio e placenta foram colhidas, bem como amostras de sangue para obtenção
do soro sangüíneo. A extração do RNA total e a confecção do cDNA das amostras
foram realizadas a partir de kits comerciais. As reações da PCR em tempo-real
foram realizadas para os genes (RNAm) do receptor do estrógeno α (REα) e
receptor da ocitocina (OTR), utilizando o 18S e RPS5 como controles endógenos. As
dosagens hormonais foram realizadas por radioimunoensaio. A expressão gênica do
RNAmREα e RNAmOTR diferiram de acordo com o tecido e período gestacional. No
endométrio, a expressão do RNAmREα foi constante durante toda a gestação e
parto, enquanto que o RNAmOTR foi mais expresso no grupo 4. Em relação ao
miométrio, a expressão do RNAmREα foi maior nos grupos 2 e 4, já o RNAmOTR foi
mais expresso nos grupos 3 e 4. Na placenta, o RNAmREα apresentou maior
expressão nos grupos 1 e 2, e o RNAmOTR não sofreu mudanças durante a
gestação e o parto. As concentrações séricas de ocitocina mantiveram-se
constantes, enquanto os níveis estrogênicos aumentaram a partir de 40 dias de
gestação até o início do parto. Conclui-se que a expressão gênica dos REα e OTR
diferem de maneira temporal durante a gestação e o parto nos tecidos avaliados e
as concentrações séricas de ocitocina não interferem na expressão gênica de tais
receptores, enquanto os níveis de estrógeno elevam-se ao final da gestação, sendo
possível atribuir a tal perfil a diferente modulação dos REα e OTR nos tecidos
estudados.
Palavras-chave: Estrógeno. Ocitocina. Gestação. Parto. Cadelas.
ABSTRACT
VEIGA, G. A. L. Expression of the canine estrogen and oxytocin receptor genes in the endometrium, myometrium and placenta during pregnancy and parturition [Expressão gênica dos receptores de estrógeno e ocitocina no endométrio, miométrio e placenta durante a gestação e parto em cadelas]. 2008. 73 f. Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária) � Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2008.
Several hormone interactions during pregnancy and parturition in the canine species
are still unknown. Tissue response to hormonal stimulation is dependent on the
expression of its receptor gene, as well as of the local hormonal concentration.
Hence, the present study aimed to characterize the expression of the canine
estrogen and oxytocin receptor genes in the endometrium, myometrium and placenta
and its correlation with blood levels of the referred hormones during pregnancy and
parturition. Pregnant bitches were allocated into 4 groups according to the
gestational period: up to 20 days of pregnancy (Group 1, n=11), from 20 to 40 days
of pregnancy (Group 2, n=12), from 40 to 60 days of pregnancy (Group 3, n=12) and
in the early stage of labor (Group 4, n=11). Bitches from groups 1, 2 and 3 were
subjected to ovaryhisterectomy and bitches from group 4 were submitted to cesarian
section followed by ovaryhistectomy. Endometrium, myometrium and placenta
samples were colleted, as well as blood samples. Extraction of the total RNA and
cDNA synthesis were accomplished through commercial kits. The real-time PCR
reactions were performed for the estrogen-α (REα) and oxytocin (OTR) receptor
genes, using the 18S and RPS5 as control. Estrogen and oxytocin hormonal assays
were performed by radioimunoassay. The results of the mRNAREα and mRNAOTR
gene expression differed among gestational periods and tissues. In the endometrium,
RNAmREα expression was homogeneous during pregnancy and labor, whereas
group 4 presented a higher expression of RNAmOTR. In relation to the myometrium,
RNAmREα expression increased in groups 2 and 4, whilst RNAmOTR expression
was higher in groups 3 and 4. In the placenta, groups 1 and 2 presented the highest
RNAmREα expression and the RNAmOTR expression did not change during
pregnancy and parturition. Blood concentration of oxytocin remained constant, while
estrogen levels increased from 40 days of gestation to labor. In conclusion, the
expression of canine REα and OTR genes differed temporally during pregnancy and
parturition in the experimented tissues. Oxytocin blood levels did not influence the
receptor gene expression, whereas estrogen concentrations increased at the end of
the gestation, possible modulating REα and OTR expression in the canine
endometrium, myometrium and placenta.
Keywords: Estrogen. Oxytocin. Pregnancy. Parturition. Bitches.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ........................................................................................ 20
2 REVISÃO DE LITERATURA .................................................................. 24
3 MATERIAIS E MÉTODOS ...................................................................... 32
3.1 ANIMAIS E GRUPOS EXPERIMENTAIS ............................................... 32
3.2 COLHEITA DAS AMOSTRAS................................................................. 33
3.3 PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS.................................................. 34
3.3.1 Isolamento do RNA total................................................................... 34
3.3.1.1 Placenta....................................................................................... 34
3.3.1.2 Endométrio e miométrio............................................................ 34
3.3.2 Quantificação do RNA total............................................................ 35
3.3.3 Síntese do cDNA............................................................................ 35
3.3.4 Reação de amplificação por PCR em tempo real........................... 36
3.3.5 Dosagens hormonais...................................................................... 37
3.3.5.1 Dosagem de estrógeno............................................................. 37
3.3.5.2 Dosagem de ocitocina............................................................... 37
3.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA......................................................................... 38
4 RESULTADOS ........................................................................................ 41
4.1
ANÁLISE DAS VARIÂNCIAS DOS CONTROLES ENDÓGENOS NOS
DIFERENTES TECIDOS..........................................................................
42
4.2 ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA DO REα E OTR NA
PLACENTA..............................................................................................
43
4.3 ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA DO REα E OTR NO
ENDOMÉTRIO........................................................................................
46
4.4 ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA DO REα E OTR NO
MIOMÉTRIO...........................................
48
4.5 ANÁLISE DAS DOSAGENS HORMONAIS............................................ 52
4.5.1 Dosagem de estrógeno................................................................ 52
4.5.2 Dosagem de ocitocina.................................................................. 52
5 DISCUSSÃO ........................................................................................... 55
6 CONCLUSÃO ......................................................................................... 62
REFERÊNCIAS ....................................................................................... 64
LISTA DE FIGURAS
Figura 1-
Curva de amplificação e dissociação do controle endógeno 18S.................................................................................................
41
Figura 2-
Curva de amplificação e dissociação do controle endógeno RPS5..............................................................................................
41
Figura 3- Curva de amplificação e dissociação do RNAmREα..................................................................................... 42
Figura 4- Curva de amplificação e dissociação do RNAmOTR..................................................................................... 42
Figura 5-
Expressão gênica do RNAmREα em relação ao 18s na placenta nos grupos 1, 2, 3 e 4.....................................................................................................
44
Figura 6-
Expressão gênica do RNAmREα em relação ao RPS5 na placenta nos grupos 1, 2, 3 e 4.....................................................................................................
44
Figura 7-
Expressão gênica do RNAmOTR em relação ao 18s na placenta nos grupos 1, 2, 3 e 4.....................................................................................................
45
Figura 8-
Expressão gênica do RNAmOTR em relação ao RPS5 na placenta nos grupos 1, 2, 3 e 4....................................................................................................
45
Figura 9-
Expressão gênica do RNAmREα em relação ao 18s no endométrio nos grupos 1, 2, 3 e 4.....................................................................................................
46
Figura 10-
Expressão gênica do RNAmREα em relação ao RPS5 no endométrio nos grupos 1, 2, 3 e 4......................................................................................................
46
Figura 11-
Expressão gênica do RNAmOTR em relação ao 18s no endométrio nos grupos 1, 2, 3 e 4......................................................................................................
47
Figura 12-
Expressão gênica do RNAmOTR em relação ao RPS5 no endométrio nos grupos 1, 2, 3 e 4.....................................................................................................
47
Figura 13-
Expressão gênica do RNAmREα em relação ao 18s no miométrio nos grupos 1, 2, 3 e 4.....................................................................................................
48
Figura 14-
Expressão gênica do RNAmREα em relação ao RPS5 no miométrio nos grupos 1, 2, 3 e 4.....................................................................................................
48
Figura 15-
Expressão gênica do RNAmOTR em relação ao 18s no miométrio nos grupos 1, 2, 3 e 4......................................................................................................
49
Figura 16-
Expressão gênica do RNAmOTR em relação ao RPS5 no miométrio nos grupos 1, 2, 3 e 4......................................................................................................
49
Figura 17-
Expressão gênica do RNAmREα e RNAmOTR na placenta, endométrio e miométrio em relação ao grupo 1.....................................................................................................
50
Figura 18-
Expressão gênica do RNAmREα e RNAmOTR na placenta, endométrio e miométrio em relação ao grupo 2......................................................................................................
50
Figura 19-
Expressão gênica do RNAmREα e RNAmOTR na placenta, endométrio e miométrio em relação ao grupo 3.....................................................................................................
51
Figura 20- Expressão gênica do RNAmREα e RNAmOTR na placenta, endométrio e miométrio em relação ao grupo 4......................................................................................................
51
Figura 21- Concentrações séricas de estrógeno nos grupos 1, 2, 3 e 4...................................................................................................... 52
Figura 22- Concentrações séricas de ocitocina nos grupos 1, 2, 3 e 4...................................................................................................... 53
LISTA DE QUADROS
Quadro 1- Idade gestacional (dias) nos grupos experimentais 1, 2, 3 e 4...................................................................................................... 33
Quadro 2- Seqüência dos oligonucleotídeos iniciadores e suas temperaturas de anelamento...................................................... 36
LISTA DE TABELAS Tabela 1-
Variâncias apresentadas pelos controles endógenos 18S e RPS5 na análise de expressão gênica na placenta............................................................................................
43
Tabela 2-
Variâncias apresentadas pelos controles endógenos 18S e RPS5 na análise de expressão gênica no miométrio.........................................................................................
43
Tabela 3-
Variâncias apresentadas pelos controles endógenos 18S e RPS5 na análise de expressão gênica no endométrio......................................................................................
43
INTRODUÇÃOT – C – G – A – T – C – G – A – T - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - A – A – T – C – G – A
INTRODUÇÃO
T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � A � T � C � G � A
20
1 INTRODUÇÃO
A fisiologia e endocrinologia da gestação e parto nos animais domésticos
contêm eventos ainda desconhecidos, os quais estão se tornando passíveis de
reconhecimento com o emprego de novas técnicas de biologia molecular. Na
espécie canina, não se conhece detalhadamente as interações endócrinas e suas
conseqüentes alterações fisiológicas durante todo o período gestacional e no
momento do parto. A interação dos hormônios com seus receptores é responsável
por mudanças convergentes. Entretanto, a síntese e secreção, bem como a ação
hormonal não são plenamente conhecidas durante a gestação. A resposta do tecido-
alvo à ação de certos hormônios é determinada tanto pela presença de receptores
específicos quanto por sua concentração local. Nos últimos anos, poucos foram os
estudos concernentes à expressão gênica dos principais receptores hormonais
frente às mudanças uterinas que ocorrem durante a gestação e parto. Em relação à
espécie canina, não há até o momento pesquisas que elucidem tais mecanismos.
O período gestacional é caracterizado por altas concentrações de
progesterona, hormônio fundamental para a manutenção da gestação, por promover
o desenvolvimento endometrial, manter a integridade placentária, reduzir a atividade
miometrial e a sensibilidade à ocitocina, tornando o útero quiescente
(CONCANNON, 1986). Durante o curso da gestação, a produção de estrógeno
ocorre em vários tecidos e sua ação, em contraposição aos estímulos
progestacionais, contribui para o crescimento uterino necessário para o bem
sucedido desenvolvimento embrionário e fetal. A produção placentária de estrógeno,
em bovinos e mulheres gestantes, é precípua para a viabilidade fetal. Já em ovelhas,
a produção de estrógeno na placenta é induzida somente pelo cortisol fetal, como
estímulo para contração miometrial e liberação de prostaglandina no parto
(DOBSON et al., 1993; WOOD, 1999; KINDAHL, 2002). O receptor de estrógeno
(RE) e o RNAmRE estão presentes na musculatura lisa uterina e nas células ao
redor dos vasos sangüíneos do miométrio, indicando o envolvimento estrogênico na
contratilidade do miométrio e fluxo sangüíneo durante a gestação (WU et al., 1996a).
O principal evento endócrino durante o parto refere-se ao rápido aumento da
relação estrógeno/progesterona placentários. A queda dos níveis de progesterona e
INTRODUÇÃO
T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � A � T � C � G � A
21
o aumento de estrógeno são possivelmente as principais causas para o
descolamento de placenta, dilatação da cérvix e aumento da contratilidade uterina
(CONCANNON, 1986). O estrógeno estimula o parto por ampliar a expressão dos
genes responsáveis pela excitabilidade e contração miometrial, aumentando no
decorrer da gestação a sensibilidade uterina à ocitocina (FUCHS, 1983). Em
ovelhas, a atuação do estrógeno associada à queda da atividade progestacional ao
final da gestação é responsável por induzir a expressão dos receptores de ocitocina
(ROT) durante o trabalho de parto (LACHER et al., 1995). O controle do RNAmROT
no útero é mediado pelo REalfa (REα), este último, por sua vez, é regulado pela
queda da progesterona (MURATA et al., 2003). Além da importante expressão no
miométrio e glândula mamária, o ROT também está presente no endométrio,
placenta, ovário, testículos, epidídimo, ductos deferentes, timo, coração e rim, bem
como no tecido cerebral (KIMURA, 2003).
A ativação dos ROT nos tecidos alvos está na dependência das
concentrações locais de ocitocina. Por esse motivo, a ação da ocitocina circulante
nos receptores miometriais é controversa em humanos, pois as concentrações
séricas permanecem baixas durante toda a gestação e parto (MITCHELL et al.,
1998). Por outro lado, as concentrações plasmáticas de ocitocina elevam-se no
período que antecede o parto em primatas, demonstrando a ação endócrina e não
autócrina ou parácrina da ocitocina (HIRST et al., 1993).
Em suínos, os altos níveis séricos de estrógeno ao final da gestação
induzem a transcrição do RNAmROT no endométrio. Neste local, a ação da
ocitocina é responsável pela liberação de PGF2α, promovendo a luteólise pré-parto
(OPONOWICZ et al., 2006). A expressão do RNAmOTR no miométrio é
extremamente importante ao final da gestação em ratas, tornando-se máxima no
parto. A ligação da ocitocina ao seu receptor promove aumento do cálcio intracelular
e consequente contração miometrial. Já na placenta, a expressão do RNAmOTR
mantém-se baixa durante toda a gestação (CHAN et al., 1993).
O estudo da expressão gênica dos receptores hormonais bem como o
perfil endócrino nas diferentes fases da gestação e parto poderão esclarecer a razão
para diferentes respostas nos vários tecidos, frente ao estímulo hormonal. A partir
destes conhecimentos, será possível a aplicação terapêutica de determinados
hormônios em situações fisiológicas ou complicações durante a gestação e o parto.
INTRODUÇÃO
T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � A � T � C � G � A
22
Em face do exposto, os objetivos do presente estudo foram:
1) Determinar a expressão gênica dos receptores de estrógeno e ocitocina
no endométrio, miométrio e placenta durante a gestação e parto em
cadelas.
2) Determinar as concentrações séricas de estrógeno e ocitocina ao longo da
gestação e parto.
3) Correlacionar os níveis séricos de estrógeno e ocitocina com a expressão
de seus respectivos receptores locais.
REVISÃO DE LITERATURAT – C – G – A – T – C – G – A – T - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - A – A – T – C – G – A
REVISÃO DE LITERATURA
T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � A � T � C � G � A
24
2 REVISÃO DE LITERATURA
A gestação e o parto são eventos caracterizados por mudanças
hormonais que resultam no desenvolvimento bem sucedido e nascimento de um ou
mais membros de uma mesma espécie (CHALLIS; LYE, 1994). Neste particular
sentido, os hormônios esteróides (progesterona e estrógeno) desempenham
importante papel na manutenção da gestação e no início do trabalho de parto, por
meio da constante modulação da excitabilidade e contratilidade miometrial
(MESIANO et al., 2002).
A secreção pituitária de hormônios luteotróficos, como o hormônio
luteinizante (LH) e a prolactina, é responsável pela manutenção dos níveis elevados
de progesterona durante a gestação (CONCANNON, 1980). A progesterona
promove o desenvolvimento endometrial e a integridade placentária e previne o
parto por reduzir a atividade miometrial e a sensibilidade à ocitocina, desta maneira,
proporciona a quiescência miometrial (CONCANNON, 1986; MESIANO et al., 2002).
Em contrapartida, o rápido aumento da relação estrógeno/progesterona placentários
é o principal evento endócrino responsável pelo desencadeamento do parto, ou seja,
a queda dos níveis de progesterona e o aumento estrogênico são provavelmente as
maiores causas de descolamento placentário, dilatação da cérvix e aumento da
contratilidade uterina (CONCANNON, 1986).
O estrógeno livre circulante pode se apresentar sob a forma de várias
substâncias biologicamente ativas, tais como os hormônios 17β-estradiol, o sulfato
de estrona e estriol (KINDAHL, 2002). Estudos prévios demonstram que na espécie
bovina à segunda metade da gestação, a produção de estrógeno é essencialmente
placentária e, portanto, a dosagem estrogênica nesta fase pode refletir a função
placentária e, conseqüentemente, a viabilidade fetal (DOBSON et al., 1993;
KINDAHL, 2002). Em ovelhas, o cortisol fetal ao final da gestação induz a ativação
das enzimas 17α-hidroxilase e 17,20-liase placentárias, resultando no aumento dos
níveis de estrógeno e diminuição da progesterona. Os referidos eventos estimulam a
contração do miométrio, associada à secreção de prostaglandina no parto (WOOD,
1999). Na espécie humana, o estrógeno também é produzido na membrana fetal e
placenta e sua concentração aumenta no momento do parto (MITCHELL et al., 1984;
CHIBBAR et al., 1995). Todavia, na espécie canina, a concentração de estrógeno
REVISÃO DE LITERATURA
T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � A � T � C � G � A
25
aumenta lentamente durante a gestação, alcançando valores máximos de 20-30
ng/mL antes do parto, inferiores aos encontrados no final do proestro
(CONCANNON, 1975). O aumento na síntese de esteróides ovarianos é
provavelmente resultado do aumento na concentração de prolactina após 30 dias de
gestação (CONCANNON, 2001). A origem do estrógeno nas cadelas parece ser
particularmente ovariana, com menor dependência placentária. Portanto, a
mensuração deste hormônio à metade da gestação não exprime informação a
respeito da gestação e, por conseguinte, da viabilidade fetal (HOFFMANN et al.,
1994; CONCANNON; VERSTEGEN, 1999; ONCLIN et al., 2002). Desta maneira, a
ovariectomia em qualquer momento do período gestacional determina a reabsorção
embrionária ou abortamento (SOKOLOWISKY, 1974).
A distribuição dos receptores hormonais nos tecidos uterinos é crucial
para predizer sua provável ação local (AMSO et al., 1994). Os receptores de
estrógeno (RE) podem ser classificados em dois subtipos (α e β) e o grau de
expressão destes receptores pode determinar a intensidade da atividade estrogênica
(TELLERIA et al., 1998). Os REα e REβ são transcritos por diferentes genes e foram
caracterizados a partir do útero de mulheres gestantes e próstata de ratos,
respectivamente (GREENE et al., 1986; KUIPER et al., 1996). Os subtipos de RE
são expressos diferencialmente em vários tecidos uterinos durante a gestação e
parto, como no endométrio e miométrio, bem como nos folículos ovarianos e no
corpo lúteo de várias espécies (KUIPER et al., 1997; SAUNDERS et al., 1997;
TESSIER et al., 2000). Telleria et al. (1998) demonstraram que em ratas o
RNAmREα é expresso nos folículos ovarianos pequenos e em crescimento, porém
com sinalização mais abundante no corpo lúteo. A expressão do RNAmREβ no
corpo lúteo é semelhante durante toda a gestação, declinando no momento do parto;
enquanto a expressão do RNAmREα é baixa ao início da gestação, apresenta
expressão máxima à metade da gestação, reduzindo no momento do parto.
Segundo Wu et al. (1996a), tanto o RE quanto o RNAmRE estão
presentes na musculatura lisa do útero e em células ao redor dos vasos sangüíneos
do miométrio, o que indica o envolvimento do estrógeno na contratilidade do
miométrio e fluxo sangüíneo durante a gestação. O aumento do RNAmRE no
miométrio é decorrente da elevação do cortisol fetal ao final da gestação em
ovelhas, fato que caracteriza maior atividade do RE e, como conseqüência, aumento
da resposta do miométrio a este hormônio durante o trabalho de parto.
REVISÃO DE LITERATURA
T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � A � T � C � G � A
26
A expressão do RNAmREα é mediada por mecanismos distintos do
RNAmREβ nas diferentes espécies. A queda dos níveis de progesterona aumenta a
síntese, transcrição e expressão do RNAmREα, enquanto que a indução do
RNAmREβ depende de outros fatores ovarianos ou fatores feto-placentários
(MURATA et al., 2003). A progesterona atua suprimindo a expressão do RNAmREα
em vários tecidos de ratos. Entretanto, tal ação inibitória não foi evidenciada no
miométrio e endométrio de ovelhas (WU et al., 1996a). A expressão dos receptores
de estrógeno, progesterona e ocitocina no endométrio de ruminantes é alterada por
produtos embrionários, como o interferon-tau (SPENCER et al., 1995 a,b;
SPENCER; BAZER, 1996). A presença do embrião impede o aumento dos
receptores de estrógeno e ocitocina no útero e impede a liberação de prostaglandina
F2α (PGF2α) (WHATES; HANON, 1993). Até o momento, não existem relatos do
mecanismo de reconhecimento materno em cadelas como há nas demais espécies.
Portanto, a regulação hormonal com referência aos esteróides e ocitocina durante a
gestação é ainda propósito de pesquisa na endocrinologia canina.
Segundo Soloff (1975), o estrógeno atua diretamente sobre a expressão
de receptores de ocitocina (OTR) em ratas e coelhas não-gestantes. O REα é o
subtipo mais predominante no útero de ratas durante a gestação e parto e, desta
maneira, é o receptor envolvido diretamente no aumento do OTR (LARCHER et al.,
1995). Os níveis de RNAmREα aumentam gradualmente no útero durante a
gestação até o parto, no entanto, a máxima expressão do RNAmOTR ocorre no
momento do parto. O fato do REα ser o receptor predominante no útero durante a
gestação e ocorrer aumento concomitante do RNAmREα e RNAmOTR no parto,
sugere que o REα é o mediador da expressão do RNAmOTR no útero (MURATA et
al., 2003).
Durante o trabalho de parto, é preciso que o miométrio altere seu estado
quiescente para o estado contrátil. Esta transição é resultado do aumento de
estímulos contráteis e ausência de mecanismos que promovam relaxamento uterino,
o que requer a queda da atividade progestacional e ativação estrogênica (CHALLIS;
LYE, 1994). A função da progesterona no parto não está totalmente estabelecida,
entretanto, foi demonstrado que na placenta de mulheres gestantes, a progesterona
bloqueia o efeito estimulatório do estrógeno no RNAm da ocitocina (CHIBBAR et
al.,1995). Em humanos, também foi evidenciado que a resposta do miométrio à
REVISÃO DE LITERATURA
T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � A � T � C � G � A
27
progesterona diminui concomitantemente ao aumento coordenado na expressão do
REα (VEGETO et al., 1993; MESIANO et al., 2002).
O estrógeno e a progesterona são os mais importantes controladores da
síntese de ocitocina e aumento de seus receptores. A progesterona apresenta efeito
positivo na síntese da ocitocina, entretanto, regula negativamente o OTR. Por outro
lado, o estrógeno apresenta tanto efeito estimulatório para a síntese de ocitocina
como para o aumento da concentração do OTR (MITCHELL et al., 1998). O número
de OTR eleva-se durante a fase folicular do ciclo e diminui na fase lútea, refletindo o
efeito positivo e negativo do estrógeno e progesterona na síntese e degradação de
receptores, respectivamente (LESSEY, 1988; NOE, 1999). Do início à metade da
fase lútea, a progesterona atua nos receptores presentes no endométrio inibindo a
expressão do RE e suprimindo a formação do OTR (McCRACKEN et al., 1984).
Entretanto, a exposição contínua do endométrio à progesterona diminui
gradualmente a expressão do seu receptor (RP). Desta maneira, a progesterona
perde a habilidade de bloquear a formação do OTR e o endométrio torna-se sensível
aos efeitos do estrógeno (NOE, 1999). O aumento do estrógeno e do RE promove
tanto a formação do OTR quanto a liberação de PGF2α, culminando com a luteólise
(SPENCER et al., 1995b).
Até a última década, muitos pesquisadores consideravam a ocitocina
como um hormônio sintetizado no núcleo paraventricular e supra-óptico do
hipotálamo, transportado pelos axônios e armazenado nos grânulos secretórios da
hipófise posterior. Quando liberado na circulação, causa contração do miométrio
durante a gestação e descida do leite durante a lactação (MITCHELL et al., 1998).
Entretanto, a função da ocitocina no trabalho de parto não requer necessariamente o
aumento de sua concentração plasmática (WU et al., 1996b). Vários estudos
demonstram que a sensibilidade do miométrio à ocitocina aumenta durante o parto.
No entanto, este evento ocorre como resultado do aumento da concentração do
OTR e da concentração local deste hormônio (FUCHS, 1983; WU et al., 1996b). O
estudo da síntese de ocitocina em um sistema parácrino no útero gestante pode
esclarecer alguns dogmas a respeito da função da ocitocina no início do trabalho de
parto em humanos (MITCHELL et al., 1998).
A ocitocina é importante no estágio expulsivo do parto e no processo de
involução uterina. Os trabalhos relativos à espécie humana demonstram que a
concentração de ocitocina é baixa na mulher não gestante e mantém-se baixa
REVISÃO DE LITERATURA
T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � A � T � C � G � A
28
durante a gestação (MITCHELL et al., 1998). As mulheres com disfunção pituitária
aparentemente evoluem para parto normal, fato que sugere importantes
controvérsias em relação ao papel desempenhado pela ocitocina no parto (CHARD,
1989). Desta forma, propõe-se que a ocitocina local (uterina ou placentária) seja
iniciadora do parto, como resultado do aumento do RNAmOT na placenta humana
(CHIBBAR, 1993; MITCHELL, 1998).
Em várias espécies, a concentração de ocitocina no plasma materno é
maior durante o parto em relação ao período precedente (HIRST et al., 1993). A
redução na metabolização da ocitocina ao final da gestação pode ser em parte
responsável pelas altas concentrações observadas no parto (MITCHELL et al.,
1997). A atividade ocitocinase é uma forma comum de degradação da ocitocina, por
meio de enzimas que quebram as ligações entre os aminoácidos que formam a
molécula de ocitocina (BURBACH; LEBOUILLE, 1982). A atividade ocitocinase em
tecidos intra-uterinos em mulheres e ratas foi demonstrada anteriormente e tais
estudos sugerem que o catabolismo da ocitocina nestes locais reduz-se antes do
parto, resultando em significativo aumento da concentração local de ocitocina
(MITCHELL; WONG, 1996; MITCHELL et al., 1997). Em ratas, o declínio de
aproximadamente 25% na atividade ocitocinase ao final da gestação é responsável
pelo significativo aumento da ocitocina no útero neste período (MITCHELL et al.,
1998). A atividade de tais enzimas não foi evidenciada em cães, o que sugere que
outros fatores possam modificar a meia vida e o metabolismo da ocitocina durante o
parto nesta espécie (OLSSON et al., 2003).
A liberação da ocitocina é pulsátil, com amplitude de curta duração e meia
vida plasmática de poucos minutos (THORTON et al., 1990). Pesquisas demonstram
aumento na freqüência de pulsos da ocitocina até o começo do parto (DAWOOD et
al., 1978; OTSUKI et al., 1983; FUCHS et al., 1991). Em humanos e ratas, altas
concentrações de ocitocina plasmática correlacionam-se com altas concentrações
de estradiol. Por este motivo, o tratamento com estradiol em mulheres pode
aumentar a concentração de ocitocina plasmática (AMICO et al., 1981; YAMAGUCHI
et al., 1979).
Chann et al. (1993) postulam a existência de dois subtipos de receptores
de ocitocina no útero de ratas, os quais estão relacionados com a formação de
junções do tipo gap entre as células miometriais e com a liberação de prostaglandina
no endométrio e placenta. O aumento do RNAmOTR e do OTR foi demonstrado no
REVISÃO DE LITERATURA
T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � A � T � C � G � A
29
endométrio e miométrio de ovelhas durante o parto, sugerindo expressão
semelhante nestes tecidos (WU et al., 1996b). O OTR apresenta diferentes funções
no endométrio e miométrio, pois sua ativação promove a contração do miométrio por
elevação do cálcio intracelular e no endométrio resulta na liberação de PGF2α.
Portanto, a ocitocina pode estimular a contração do miométrio por dois mecanismos
paralelos. O primeiro envolve a ação direta do OTR nas células do miométrio,
resultando em mudança na concentração de cálcio intracelular e aumento da
contratilidade uterina (CHALLIS et al., 1994). O segundo mecanismo envolve a
estimulação indireta da contração uterina por meio da síntese de prostaglandina pelo
endométrio (FUCHS, 1983; RIEMER et al., 1986;). Por outro lado, em ratas, tal
homologia não foi observada, sendo o OTR expresso no miométrio, mas não no
endométrio (LARCHER et al., 1995). A expressão do RNAmOTR durante a luteólise
em porcas é mais acentuada no miométrio, em comparação com o início da
gestação (FRANCZAK et al., 2005; OPONOWICZ et al., 2006). Tais evidências
sugerem que o controle da expressão do OTR no útero de porcas dependente da
célula uterina (OPONOWICZ et al., 2006). A existência de dois subtipos de
receptores de ocitocina no útero é um fator importante a se levar em consideração
ao se optar por antagonistas de ocitocina como agentes tocolíticos no tratamento
clínico do parto prematuro. Para serem eficientes, os antagonistas da ocitocina
precisam bloquear a ação uterotônica e a liberadora de prostaglandina.
A ação exata da ocitocina durante o parto ainda permanece
desconhecida, pois estudos recentes demonstram a expressão gênica da ocitocina
também em tecidos periféricos (MITCHELL et al., 1997). A expressão do OTR foi
caracterizada não apenas no miométrio e glândula mamária, mas também no
endométrio, placenta, ovário, testículo, epidídimo, ductos deferentes, timo, coração e
rim, assim como no cérebro de diversas espécies animais (KIMURA, 1999; GIMPLE,
2001). Portanto, além da função endócrina da ocitocina no parto, sugere-se também
ação parácrina ou autócrina (MITCHELL et al., 1997). O primeiro relato da síntese de
ocitocina em tecidos periféricos foi realizado no corpo lúteo ovino, ao serem
observadas altas concentrações locais deste hormônio (WATHES et al., 1982). O
corpo lúteo e a hipófise armazenam e liberam ocitocina. Todavia, a presença de
OTR no corpo lúteo denota função autócrina (SERNIA et al., 1989). Chibbar et al.
(1993) demonstraram a presença do RNAm da ocitocina em tecidos intra-uterinos
em mulheres ao final da gestação: no âmnion e córion, mas principalmente na
REVISÃO DE LITERATURA
T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � A � T � C � G � A
30
placenta. O aumento do RNAmOTR e da ocitocina na placenta ao final da gestação
associado à proximidade anatômica com os tecidos alvos (endométrio e miométrio)
confirmam a hipótese de um sistema parácrino intra-uterino regulatório no momento
do parto (MITCHELL et al., 1998). A ativação do OTR na placenta induz a liberação
de PGF2α, promovendo contrações uterinas, relaxamento cervical e luteólise
(MITCHELL et al., 1998). No parto, a concentração do OTR no miométrio de ratas
aumenta abruptamente. Por outro lado, na placenta, as concentrações permanecem
baixas, indicando que o OTR no miométrio e na decídua são regulados por
mecanismos independentes (CHAN et al., 1993).
Durante a gestação, a concentração uterina do OTR aumenta de 6 a 80x
no momento de parto (FUCHS, 1983). Em humanos, a expressão do RNAmOTR no
miométrio aumenta em 100x com a idade gestacional de 32 semanas e 300x no
parto, comparando-se ao útero não gestante (KIMURA, 1996). Por outro lado, em
ratas, os níveis de RNAmOTR aumentam mais de 25x durante a gestação: 4,5x
durante os primeiros 21 dias de gestação, chegando a 6x entre o 21° dia e o início
do parto (LARCHER et al., 1995). Em ovelhas, o aumento no RNAmOTR é 3x maior
no corno gravídico, comparado ao não gravídico, sugerindo que a distensão uterina
ou outros fatores locais podem regular a concentração do OTR (WU et al., 1996b).
Em humanos, há descrição da síntese de ocitocina fetal ao final da
gestação, com ação reconhecida no início do trabalho de parto (CHARD, 1989). A
ocitocina atua no cérebro fetal como agente vasodilatador no endotélio de vasos
íntegros. Os episódios de baixa oxigenação no período perinatal levam à formação
de radicais peróxidos e, consequentemente, lesão no endotélio vascular. No
endotélio alterado, a ocitocina atua como agente vasoconstrictor, resultando em
isquemia e danos neurológicos (BARI et al., 1997). As ações cardiovasculares
maternas e fetais da ocitocina podem acarretar, em última análise, danos cerebrais
aos neonatos, fato que impõe cuidados extremos à utilização empírica da ocitocina
em partos distócicos.
MATERIAL E MÉTODOST – C – G – A – T – C – G – A – T - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - A – A – T – C – G – A
MATERIAIS E MÉTODOS
T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � A � T � C � G � A
32
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 ANIMAIS E GRUPOS EXPERIMENTAIS
Para o desenvolvimento deste estudo, foram selecionadas 46 cadelas
gestantes, com idade reprodutiva entre 1 e 6 anos, sem discriminação em relação à
raça, clinicamente saudáveis e sem histórico de alterações reprodutivas ou
obstétricas.
Os animais eram provenientes da rotina de atendimento em clínicas
veterinárias particulares. Apenas fêmeas para as quais os proprietários objetivaram
interromper a gestação indesejada foram inclusas neste estudo, respeitando as
normas de utilização de animais em experimentos, adotadas a partir da Comissão de
Bioética da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São
Paulo.
As cadelas foram alocadas em 4 grupos de acordo com a idade
gestacional, determinada por exame ultra-sonográfico, histórico reprodutivo e
mensuração do comprimento crown-rump fetal, segundo Evans (1993).
Grupo 1: fêmeas em fase inicial (0-20 dias) de gestação (n = 11);
Grupo 2: fêmeas com idade gestacional entre 20 e 40 dias (n = 12);
Grupo 3: fêmeas com idade gestacional superior a 40 dias (n = 12);
Grupo 4: fêmeas em fase preparatória ou pródromos do parto (n = 11).
A distribuição dos animais segundo o tempo gestacional nos diferentes
grupos experimentais está elencada no quadro 1.
MATERIAIS E MÉTODOS
T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � A � T � C � G � A
33
Cadelas GRUPO 1 GRUPO 2 GRUPO 3 GRUPO 4
1 17 24 42 Pródromos do parto
2 17 25 42 Pródromos do parto
3 18 25 42 Pródromos do Parto
4 18 30 47 Pródromos do parto
5 18 33 50 Pródromos do parto
6 19 35 50 Pródromos do parto
7 19 35 51 Pródromos do parto
8 19 35 54 Pródromos do parto
9 20 35 55 Pródromos do Parto
10 20 36 57 Pródromos do parto
11 20 37 60 Pródromos do parto
12 ---- 39 60 ----
Quadro 1 � Idade gestacional (dias) nos grupos experimentais 1, 2, 3 e 4
3.2 COLHEITA DAS AMOSTRAS
Para a análise da expressão gênica dos receptores de estrógeno e
ocitocina, foram colhidas amostras de endométrio, miométrio e placenta das fêmeas
dos grupos 1, 2 e 3 submetidas à interrupção da gestação por ovário-histerectomia.
As fêmeas do grupo 4 foram submetidas à operação cesariana seguida
imediatamente pela ovário-histerectomia. Após o procedimento cirúrgico, os
fragmentos de tecido foram transferidos para tubos com capacidade para 1 mL e
mantidos a -196°C até o processamento.
As amostras sangüíneas foram colhidas durante a intervenção cirúrgica,
por punção da veia jugular, após jejum alimentar de 12 horas. As amostras de
sangue total foram centrifugadas a 1500 xg por 10 minutos e o soro assim obtido foi
transferido para tubos plásticos resistentes ao congelamento. As amostras de soro
foram armazenadas em freezer a -20°C até o processamento.
MATERIAIS E MÉTODOS
T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � A � T � C � G � A
34
3.3 PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS
Os fragmentos de endométrio, miométrio e placenta foram destinados à análise da expressão gênica pela PCR em tempo real. Já o soro sangüíneo foi utilizado para as determinações de ocitocina e estrógeno.
3.3.1 Isolamento do RNA total
Foram utilizados dois métodos de extração de RNA, de acordo com o tipo de tecido:
3.3.1.1 Placenta
Para a extração do RNA total das placentas, foi utilizado o reagente TRIzol (Invitrogen®). Os fragmentos do tecido congelado foram macerados e a eles adicionado 1 mL do reagente TRIzol (isoticianato de guanidina + fenol). As amostras foram incubadas por 5 minutos, para em seguida ser adicionado 200 µL de clorofórmio. A mistura foi agitada vigorosamente por 15 segundos, incubada por 2 minutos a temperatura ambiente e centrifugada por 15 minutos a 4°C a 1200 xg. A fase aquosa foi transferida para um novo tubo e foram adicionados 500 µL de isopropanol. A mistura foi incubada por 10 minutos, centrifugada a 4°C a 1200 xg por 10 minutos e o sobrenadante foi removido por decantação. O sedimento foi, então, lavado com etanol a 70%, seco e ressuspendido em 40 µL de água DEPC.
3.3.1.2 Endométrio e miométrio
Para a extração do RNA total das amostras de endométrio e miométrio foi utilizado o sistema Illustra RNAspin Mini RNA Isolation (GE Healthcare ®), conforme
as instruções do fabricante. Os fragmentos dos tecidos congelados foram
MATERIAIS E MÉTODOS
T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � A � T � C � G � A
35
macerados e adicionou-se 350 µL de buffer RA1 e 3,5 µL de β-mercaptoetanol. A
mistura foi agitada vigorosamente em vórtex até a formação de uma solução homogênea e, em seguida, transferida para um filtro e centrifugada a 8000 xg
durante 30 segundos. Após o descarte do filtrado, adicionou-se 350 µL de
Membrane Desalting Buffer e centrifugado a 11000 xg por 1 minuto. O filtrado foi novamente descartado, para então ser adicionado 95 µL de uma mistura de DNAse, a qual foi incubada a temperatura ambiente durante 15 minutos. Após este período,
foram adicionados 200 µL de Buffer RA2 e, em seguida, a solução foi centrifugada a 11000 xg durante 1 minuto. O filtro foi colocado em um novo tubo coletor e foram adicionados 600 µL de Buffer RA3, procedendo-se nova centrifugação a 11000 xg
durante 1 minuto. Foram adicionados 250 µL de Buffer RA3 ao filtro e centrifugados durante 2 minutos a 11000 xg. O filtro foi transferido para um novo tubo coletor e então acrescentados 100 µL de água (livre de RNAses) e centrifugado a 11000 xg
durante 1 minuto.
3.3.2 Quantificação do RNA total
O RNA total foi quantificado após diluição em água (livre de RNAses) na proporção de 1:100, em aparelho de biofotometria Eppendorf® modelo Vi 1.35.
3.3.3 Síntese do cDNA
Após quantificação, 1 µg de RNA total foi utilizado para a síntese da
primeira fita de cDNA pela reação de transcrição reversa utilizando-se o sistema
SuperScriptTM II reverse transcriptase (Invitrogen®) na presença de oligo dT.
Inicialmente, o RNA total adicionado de 1 µL de oligo dT e água DEPC q.s.p 12 µL
foi exposto a 70°C durante 10 minutos em termociclador modelo PTC-100. Em
seguida a solução foi mantida a -20°C durante 1 minuto. Foram adicionados 2 µL de
First Strand Buffer, 2 µL de MgCl2 25mM, 1 µL de dNTP e 2 µL de 0,1 M DTT, para
então proceder a exposição a 42°C durante 5 minutos. Finalmente, foi adicionado
MATERIAIS E MÉTODOS
T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � A � T � C � G � A
36
1 µL da enzima Super script II e a reação foi mantida a 42°C por 50 minutos e 70°C
por 15 minutos. O cDNA obtido foi acondicionado a -20°C.
3.3.4 Reação de amplificação por PCR em tempo real
Os cDNAs foram submetidos à amplificação dos genes constitutivos 18S
e RPS5 (utilizados como controle endógeno), bem como ao OTR e REα com
oligonucleotídeos iniciadores desenhados a partir de seqüências anteriormente
depositadas no GenBank (www.ncbi.nml.nih.gov) (Quadro 2):
SEQUÊNCIA Oligonucleo-
tídeos FORWARD REVERSE
Tm (°C)
RPS5 5�TCACTGGTGARACCCCCT3� 5�CCTGATTCACACGGCGTAG3� 61
18S 5�TGGTTGATCCTGCCAGTAGCA3� 5�ATGAGCCATTCGCAGTTTCACT3� 60
REα 5�GGTCTTGGTGTTGGGTGTG3� 5�GGACATATTCCTCACGCTCC3� 59
OTR 5�GAACTTGTACAGCGCTTCCTC3� 5�GACAAAGGTGGATGAGTTGCTC3� 59
Quadro 2 � Seqüência dos oligonucleotídeos iniciadores e suas temperaturas de
anelamento
As reações de PCR em tempo real foram realizadas em equipamento
Eppendorf® Mastercycle Realplex utilizando o kit Platinum® SYBR Greener PCR
Master Mix (Invitrogen®). Todas as reações foram realizadas em 25 µL de volume
total e submetidas a 50°C durante 2 minutos, 95°C durante 10 minutos, seguida de
45 ciclos divididos em 15 segundos a 95°C e temperatura específica de anelamento
por 60 segundos (Quadro 2). Os experimentos foram realizados em duplicata.
Para o cálculo da expressão relativa dos genes alvo foi usada a fórmula
desenvolvida por Pfaffl (2006), descrita a seguir:
Eficiência relativa = (Ealvo) ∆Ct alvo (controle-amostra) / (Eendógeno) ∆Ct endógeno (controle�amostra)
MATERIAIS E MÉTODOS
T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � A � T � C � G � A
37
A eficiência das reações para os diferentes genes foi determinada pela
amplificação das amostras em diluições seriadas. Tais valores foram utilizados para
o cálculo da eficiência relativa (gene alvo/gene endógeno), considerando-se que:
Eficiência = 10 -1/slope
A eficiência calculada segundo a fórmula acima para as reações nos
distintos genes foram: 1,98 (18S), 2,05 (RPS5), 2,08 (REα) e 1,94 (OTR).
3.3.5 Dosagens hormonais
3.3.5.1 Dosagem do estrógeno
As amostras foram processadas utilizando o conjunto diagnóstico
comercial para dosagem de estradiol sérico da DSL-4400 (Diagnostic Systems
Laboratories, Webster, Texas, USA) por radioimunoensaio marcado com 125I,
desenvolvido para quantificação hormonal em soro humano; previamente validado
para a espécie canina. A sensibilidade da reação e os coeficientes de variação inter
e intra-ensaio foram 1,85 pg/ml (95%), 7,32% e 0,05%, respectivamente. O protocolo
utilizado seguiu o recomendado pelo fabricante e os padrões de qualidade
empregados estavam de acordo com o utilizado na rotina do Laboratório de
Dosagens Hormonais da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da
Universidade de São Paulo.
3.3.5.2 Dosagem de ocitocina
Para determinação hormonal, o volume de 1 mL do soro foi adicionado de
acetona e éter petroleum e as concentrações de ocitocina foram mensuradas pela
técnica de radioimunoensaio, conforme descrição de Elias et al. (1997). A
MATERIAIS E MÉTODOS
T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � A � T � C � G � A
38
sensibilidade da reação e os coeficientes de variação inter e intra-ensaio foram
0,9 pg/ml, 7,0% e 12,6%, respectivamente. Os padrões de qualidade empregados
estavam de acordo com o utilizado na rotina do Laboratório de Neuroendocrinologia
do Departamento de Fisiologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo.
3.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados foram analisados por meio do programa SAS System for
Windows (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA, 2000). Por meio do aplicativo Guided
Data Analisys, os dados foram testados quanto à normalidade dos resíduos e
homogeneidade das variâncias. Caso não obedecessem a estas premissas, foram
transformados em logaritmo na base 10 (Log10X) ou Raiz quadrada (RQ X). Para
descrição dos resultados, foram empregados os erros padrões e as médias (média ±
erro padrão da média) dos dados originais.
Neste experimento, as variáveis classificatórias utilizadas foram as fases
da gestação (grupos 1, 2, 3 e 4) e o gene em estudo nos tecidos. Neste caso, foi
avaliada a interação entre o tempo da gestação e a expressão do gene. As variáveis
REα/18S (miométrio) e REα/RPS5 (endométrio) obedeceram às premissas após a
transformação para raiz quadrada e exclusão de amostras que se comportaram
como outliers. As variáveis OTR/RPS5 (miométrio), OTR/18S (miométrio), REα/18S
(endométrio), OTR/RPS5 (endométrio), OTR/18S (endométrio), REα/18S (placenta),
REα/RPS5 (placenta), OTR/RPS5 (placenta) e OTR/18S (placenta) obedeceram às
premissas após transformação para logaritmo na base 10 e exclusão de outliers. A
variável REα/RPS5 (miométrio) obedeceu às premissas apenas após exclusão de
outliers. As amostras consideradas outliers foram:
! duas amostras no grupo 1 e uma amostra no grupo 3 para REα/RPS5
(miométrio);
! uma amostra no grupo 3 para REα/18S (miométrio);
! uma amostra no grupo 4 para REα/RPS5 (endométrio);
! uma amostra no grupo 2 e uma amostra no grupo 3 para REα/18S
(endométrio);
MATERIAIS E MÉTODOS
T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � A � T � C � G � A
39
! uma amostra no grupo 4 para OTR/RPS5 (endométrio);
! uma amostra no grupo 2 e uma amostra no grupo 3 para OTR/18S
(endométrio);
! uma amostra no grupo 2 e uma amostra no grupo 3 para REα/RPS5
(placenta);
! uma amostra no grupo 2, uma amostra no grupo 3 e duas amostras no
grupo 4 para OTR/RPS5 (placenta).
Os resultados foram testados utilizando-se a análise de variância para
medidas repetidas (ANOVA). O teste de Tukey foi utilizado como teste de
comparações múltiplas complementar à ANOVA para identificação da origem das
diferenças.
Para verificar a estabilidade dos controles endógenos (RPS5 e 18S) em
cada tecido (miométrio, endométrio e placenta), as variâncias dos dois controles
foram comparadas por meio do teste Brown and Forsythe.
O nível de significância utilizado para rejeitar H0 (hipótese de nulidade) foi
de 5%, isto é, para um nível de significância menor que 0,05, considerou-se que
ocorreram diferenças estatísticas entre as variáveis classificatórias (tratamentos)
para uma determinada variável resposta.
RESULTADOST – C – G – A – T – C – G – A – T - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - A – A – T – C – G – A
RESULTADOS
T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � A � T � C � G � A
41
4 RESULTADOS
Os resultados da análise de expressão gênica relativa, representados por
médias e desvios padrão, foram calculados a partir dos valores de Ct (Cycle
Threshold) que representa o número de ciclos necessários para reação atingir o
limiar da fase exponencial, permitindo a quantificação exata e reprodutível da
fluorescência na reação de PCR em tempo real. Exemplos das curvas de
amplificação e dissociação para cada gene em estudo estão demonstrados nas
figuras 1, 2, 3 e 4.
Figura 1 � Curva de amplificação e dissociação do controle endógeno 18S
Figura 2 � Curva de amplificação e dissociação do controle endógeno RPS5
RESULTADOS
T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � A � T � C � G � A
42
Figura 3 � Curva de amplificação e dissociação do RNAmREα
Figura 4 � Curva de amplificação e dissociação do RNAmOTR
4.1 ANÁLISE DAS VARIÂNCIAS DOS CONTROLES ENDÓGENOS NOS
DIFERENTES TECIDOS
A variância (desvio padrão) dos genes constitutivos utilizados como
controle endógeno (18S e RPS5) não diferiram estatisticamente na placenta e no
miométrio (Tabelas 1 e 2, respectivamente). Entretanto, no endométrio, o gene 18S
apresentou variância superior (em p=0,07) ao gene RPS5, denotando tendência
estatística a serem diferentemente expressos (Tabela 3).
RESULTADOS
T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � A � T � C � G � A
43
Tabela 1 � Variâncias apresentadas pelos controles endógenos 18S e RPS5 na análise de expressão gênica na placenta � São Paulo - 2008
CONTROLE ENDÓGENO VARIÂNCIA
18S 1,79a
RPS5 2,14a
a sem diferença estatística (p=0,70)
Tabela 2 � Variâncias apresentadas pelos controles endógenos 18S e RPS5 na análise de expressão gênica no miométrio � São Paulo - 2008
CONTROLE ENDÓGENO VARIÂNCIA
18S 1,46a
RPS5 1,26a
a sem diferença estatística (p=0,45)
Tabela 3 � Variâncias apresentadas pelos controles endógenos 18S e RPS5 na análise de expressão gênica no endométrio � São Paulo - 2008
CONTROLE ENDÓGENO VARIÂNCIA
18S 3,49a
RPS5 2,91b
a,b diferença em p=0,07
4.2 ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA DO REα E OTR NA PLACENTA
A expressão do RNAmREα na placenta não diferiu estatisticamente ao
longo da gestação, considerando-se o controle endógeno 18S (Figura 5). Ao analisar
o REα em relação ao RPS5 (Figura 6), nota-se que a expressão gênica do
RNAmREα é estatisticamente inferior no grupo 3, porém semelhante à placenta de
cadelas ao início da gestação e durante o parto (grupo 4).
RESULTADOS
T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � A � T � C � G � A
44
0
2
4
6
8
10
12
1 2 3 4
GRUPOS
RE/1
8S
Figura 5 � Expressão gênica do RNAmREα em relação ao 18S na placenta nos
grupos 1, 2, 3 e 4, a,b indica diferença significativa entre grupos (p<0,05)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
1 2 3 4
GRUPOS
RE/R
PS5
Figura 6 � Expressão gênica do RNAmREα em relação ao RPS5 na placenta nos
grupos 1, 2, 3 e 4, a,b indica diferença significativa entre grupos (p<0,05)
Comparando-se todas as fases da gestação (grupos 1, 2 e 3) e o parto
(grupo 4), não houve diferença estatística na expressão do RNAmOTR na placenta,
tanto para o controle 18S (Figura 7) como o RPS5 (Figura 8).
3,21±3,08a
6,29±3,68 a
0,52±0,44 a
2,40±2,67 a
2,38±3,03ab
4,19±3,14a
0,83±0,65b
2,00±1,30ab
RESULTADOS
T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � A � T � C � G � A
45
0
1
2
3
4
5
6
1 2 3 4
GRUPOS
OTR
/18S
Figura 7 � Expressão gênica do RNAmOTR em relação ao 18S na placenta nos
grupos 1, 2, 3 e 4, a,b indica diferença significativa entre grupos (p<0,05)
0
0,5
1
1,5
2
2,5
1 2 3 4
GRUPOS
OTR
/RPS
5
Figura 8 � Expressão gênica do RNAmOTR em relação ao RPS5 na placenta nos
grupos 1, 2, 3 e 4, a,b indica diferença significativa entre grupos (p<0,05)
1,54±0,47a
2,69±2,53a
0,99±1,14a
1,93±1,84a
0,93±0,63a
0,51±0,34a
0,74±0,44a
1,38±0,86a
RESULTADOS
T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � A � T � C � G � A
46
4.3 ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA DO REα E OTR NO ENDOMÉTRIO
Ao analisar a expressão do RNAmREα no endométrio, não houve
diferença estatística entre os grupos em relação ao controle 18S (Figura 9) e ao RPS5 (Figura 10).
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1 2 3 4
GRIPOS
RE/1
8S
Figura 9 � Expressão gênica do RNAmREα em relação ao 18S no endométrio nos
grupos 1, 2, 3 e 4, a,b indica diferença significativa entre grupos (p<0,05)
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1 2 3 4
GRUPOS
RE/R
PS5
Figura 10 � Expressão gênica do RNAmREα em relação ao RPS5 no endométrio
nos grupos 1, 2, 3 e 4, a,b indica diferença significativa entre grupos (p<0,05)
0,40±0,34a
0,45±0,55a
0,37±0,39a
0,24±0,28a
0,42±0,29a
0,72±0,53a0,73±0,57a 0,83±0,55a
RESULTADOS
T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � A � T � C � G � A
47
Considerando-se a expressão do RNAmOTR em relação ao 18S no
endométrio, evidencia-se estatisticamente maior expressão no grupo 4 somente em
relação ao grupo 2 (Figura 11). Já com referência ao RPS5, o grupo 4 é
estatisticamente superior aos grupos 1, 2 e 3 (Figura 12). Como o controle endógeno
RPS5 apresentou maior estabilidade no endométrio em relação ao 18S, os
resultados do OTR/RPS5 são considerados mais fidedignos.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
1 2 3 4
GRUPOS
OTR
/18S
Figura 11 � Expressão gênica do RNAmOTR em relação ao 18S o endométrio nos
grupos 1, 2, 3 e 4, a,b indica diferença significativa entre grupos (p<0,05)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
1 2 3 4
GRUPOS
OTR
/RPS
5
Figura 12 � Expressão gênica do RNAmOTR em relação ao RPS5 no endométrio
nos grupos 1, 2, 3 e 4, a,b indica diferença significativa entre grupos
(p<0,05)
0,73±0,86ab
1,07±0,16b
1,18±1,41ab 1,28±1,20a
1,07±1,75a
0,78±0,67a
1,34±1,71a
4,03±3,47b
RESULTADOS
T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � A � T � C � G � A
48
4.4 ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA DO REα E OTR NO MIOMÉTRIO
O grupo 1 apresentou estatisticamente menor expressão do RNAmREα
em relação ao 18S no miométrio, comparando-se os grupos 2 e 4 (Figura 13). Em relação ao RPS5, não houve diferença na expressão do REα no miométrio ao longo da gestação e parto (Figura 14).
0
1
2
3
4
5
6
7
1 2 3 4
GRUPOS
RE/1
8S
Figura 13 � Expressão gênica do RNAmREα em relação ao 18S no miométrio nos
grupos 1, 2, 3 e 4, a,b indica diferença significativa entre grupos (p<0,05)
0
0,5
1
1,5
2
2,5
1 2 3 4
GRUPOS
RE/R
PS5
Figura 14 � Expressão gênica do RNAmREα em relação ao RPS5 no miométrio nos
grupos 1, 2, 3 e 4, a,b indica diferença significativa entre grupos (p<0,05)
1,26±1,41a
3,65±2,16b
2,86±1,17ab
3,69±2,34b
0,99±0,43a
1,33±0,64a
1,13±0,49a 0,85±0,64a
RESULTADOS
T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � A � T � C � G � A
49
Referindo-se a expressão do RNAmOTR no miométrio em relação ao 18S
e RPS5, evidencia-se diferença significativa dos grupos 3 e 4 em comparação aos
grupos 1 e 2 (Figuras 15 e 16). Nota-se que o OTR é estatisticamente mais expresso
no miométrio ao final da gestação e no parto.
0
5
10
15
20
25
30
1 2 3 4
GRUPOS
OTR
/18S
Figura 15� Expressão gênica do RNAmOTR em relação ao 18S no miométrio nos
grupos 1, 2, 3 e 4, a,b,c indica diferença significativa entre grupos (p<0,05)
0
1
2
3
4
5
6
1 2 3 4
GRUPOS
OTR
/RPS
5
Figura 16 � Expressão gênica do RNAmOTR em relação ao RPS5 no miométrio nos
grupos 1, 2, 3 e 4, a,b indica diferença significativa entre grupos (p<0,05)
0,60±0,46a
3,66±4,51b
8,90±5,39c
15,05±9,40c
0,93±0,35a
1,06±1,07a
3,42±1,73b 3,14±2,24b
RESULTADOS
T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � A � T � C � G � A
50
Ainda, é possível verificar que a expressão do RNAmOTR no miométrio é
crescente ao longo da gestação, havendo diferença estatística entre os grupos 1, 2 e
3 (Figura 15).
As figuras 17 a 20 demonstram o grau de expressão do RNAmREα e
RNAmOTR nos tecidos avaliados de acordo com a fase gestacional.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
Placenta Endométrio Miométrio
TECIDOS
REOTR
Figura 17 � Expressão gênica do RNAmREα e RNAmOTR na placenta, endométrio
e miométrio até 20 dias de gestação (Grupo 1)
0
1
2
3
4
5
6
7
Placenta Endométrio Miométrio
TECIDOS
REOTR
Figura 18 � Expressão gênica do RNAmREα e RNAmOTR na placenta, endométrio
miométrio de 20 a 40 dias de gestação (Grupo 2)
18S
RPS5 18S
RPS5
18S
18S
RESULTADOS
T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � A � T � C � G � A
51
0123456789
10
Placenta Endométrio Miométrio
TECIDOS
REOTR
Figura 19 � Expressão gênica do RNAmREα e RNAmOTR na placenta, endométrio e miométrio de 40 a 60 dias de gestação (Grupo 3)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Placenta Endométrio Miométrio
TECIDOS
REOTR
Figura 20 � Expressão gênica do RNAmREα e RNAmOTR na placenta, endométrio
e miométrio durante o parto (Grupo 4)
RPS5 18S
18S
18S
18S
RPS5
RESULTADOS
T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � A � T � C � G � A
52
4.5 ANÁLISE DAS DOSAGENS HORMONAIS
4.5.1 Dosagem de estrógeno
O grupo 4 apresentou concentrações de estrógeno estatisticamente
superiores aos grupos 1 e 2 (Figura 21). Não houve diferença estatística entre os
grupos 1, 2 e 3, bem como entre os grupos 3 e 4.
1,7
1,8
1,9
2
2,1
2,2
2,3
2,4
1 2 3 4
GRUPOS
[ ] E
stró
geno
pg/
ml
Figura 21 � Concentrações séricas de estrógeno nos grupos 1, 2, 3 e 4, a,b indica
diferença significativa entre grupos (p<0,05)
4.5.2 Dosagem de ocitocina As concentrações de ocitocina não diferiram estatisticamente ao longo da
gestação (grupos 1, 2 e 3) e parto (grupo 4) (Figura 22).
1,94±0,11a 1,99±0,08a 2,00±0,08b
2,14±0,16b
RESULTADOS
T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � A � T � C � G � A
53
0
10
20
30
40
50
60
1 2 3 4
GRUPOS
[ ] O
cito
cina
pg/
ml
Figura 22 � Concentrações séricas de ocitocina nos grupos 1, 2, 3 e 4, a,b indica
diferença significativa entre grupos (p<0,05)
18,13±15,25a
20,95±28,05a
15,29±17,78a
17,64±26,46a
DISCUSSÃOT – C – G – A – T – C – G – A – T - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - A – A – T – C – G – A
DISCUSSÃO
T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � A � T � C � G � A
55
5 DISCUSSÃO
As novas técnicas de biologia molecular são, atualmente, as principais
ferramentas para decifrar as diversas interações hormonais e as conseqüentes
mudanças fisiológicas nas espécies animais. Para a espécie canina, a perspectiva
das pesquisas direcionadas à fisiologia e endocrinologia da gestação e parto inclui a
determinação dos principais órgãos ou tecidos envolvidos na síntese, secreção e
ação dos hormônios reprodutivos, bem como a exata localização de seus
respectivos receptores. Pouco se conhece a respeito dos efeitos e mudanças
decorrentes da interação hormônio-receptor nos tecidos alvo. Desta maneira, o uso
de hormônios para terapia de intercorrências durante a gestação e parto é realizada
de maneira empírica para a espécie canina.
A fase inicial da gestação em cadelas é caracterizada pelo período de
implantação embrionária e placentação, as quais ocorrem a partir do 16° e 20° dias
após o pico de LH, respectivamente (CONCANNON et al., 2001; MIGLINO et al.,
2006). O desenvolvimento e funcionamento normal da placenta são fundamentais
para manter a vida pré-natal e desencadear o parto (AL-BLADER, 2006). Em muitas
espécies de mamíferos, o estrógeno placentário possui também ações autócrina e
parácrina e, por conseguinte, caracteriza-o como principal responsável pelo
crescimento e diferenciação da própria placenta (SCHULER et al., 2002). Os
resultados deste experimento demonstram aumento significativo na expressão do
RNAmREα na placenta durante o terço inicial e médio da gestação (grupo 1 e 2), em
comparação ao período final (grupo 3). Tal resultado sugere que no período
gestacional compreendido entre os dias 17 e 40, momento no qual há importante
desenvolvimento placentário, a ação autócrina ou parácrina do estrógeno é mais
notável que a endócrina, uma vez que os níveis séricos de estrógeno nesta fase
mantiveram-se constantes. A expressão do RNAmREα na placenta sugere a síntese
do REα e comprova a necessidade da ação estrogênica no tecido placentário, pois
este hormônio participa da multiplicação e hipertrofia celular bem como do
desenvolvimento da vascularização placentária, importantes para o progresso da
gestação. Frente a tais resultados, estudos futuros são necessários para comprovar
a presença do REα na placenta e determinar a síntese placentária deste hormônio,
por meio da determinação de sua concentração local na espécie canina.
DISCUSSÃO
T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � A � T � C � G � A
56
A expressão do RNAmREα na placenta sofreu decréscimo significativo
após 40 dias de gestação (grupo 3) e permaneceu baixa até o parto (grupo 4). Deste
resultado, especula-se que no referido período a placenta canina seja pouco
responsiva aos estímulos estrogênicos, pois os níveis séricos deste hormônio
elevam-se de forma significativa. Tais achados podem ser corroborados por estudos
em outras espécies, como roedores, bovinos e humanos (SAUERWEIN et al., 1989;
BUKOWISKY et al., 2003; Al-BLADER, 2006). Em ratas, o aumento dos níveis
estrogênicos durante o transcorrer da gestação resulta em diminuição do RE na
placenta (AL-BLADER, 2006). O autor sugere que este seja um mecanismo protetor
contra os efeitos deletérios do estrógeno ao final da gestação, caracterizados por
retardo no desenvolvimento placentário e secundariamente limitação do crescimento
fetal, evidenciados por Bartholomeusz et al. (1999), após a aplicação exógena de
estradiol em ratas gestantes. Desta maneira, sugere-se que a elevação progressiva
dos níveis estrogênicos, evidenciados neste estudo a partir de 40 dias de gestação,
não influenciam a atividade placentária e, consequentemente, o desenvolvimento
fetal. Neste período, a placenta apresenta menor capacidade de resposta aos
estímulos do estrógeno, em decorrência da baixa expressão do RNAmREα. O
decréscimo na expressão do RNAmREα na placenta associado aos níveis elevados
de estrógeno circulante após 40 dias de gestação indicam que a placenta canina
responde exclusivamente a estímulos estrogênicos de forma temporal e autócrina,
respectivamente.
Não há, até a atualidade, pesquisas que demonstrem a expressão do
RNAmOTR na placenta, bem como a ação da ocitocina neste tecido durante a
gestação e parto na espécie canina. A placenta é considerada um dos órgãos de
síntese da ocitocina, responsável por estimular a produção de PGF2α endometrial,
resultando em lise do corpo lúteo e início do parto. Considerações acerca da ação
mediadora positiva do REα sobre o RNAmOTR no útero foram descritas em diversos
estudos (LARCHER et al.,1995; MURATA et al., 2003). Neste experimento, o perfil
da expressão do RNAmOTR na placenta não se assemelhou ao RNAmREα, pois a
elevação significativa do REα no grupo 2 não foi acompanhada pelo OTR. Ainda, os
altos níveis de estrógeno ao final da gestação não foram capazes de aumentar a
expressão do RNAmOTR na placenta. A expressão homogênea do RNAmOTR
observada neste experimento pode ser atribuída ao bloqueio progestacional para a
síntese do OTR. Tais resultados não excluem a possibilidade de ser o estrógeno o
DISCUSSÃO
T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � A � T � C � G � A
57
principal mediador do RNAmOTR na placenta, mecanismo descrito para outras
espécies. Chan et al. (1993) postulam que a existência de receptores de ocitocina na
placenta e endométrio está relacionada à liberação de PGF2α. Ainda, na placenta de
ratas, o OTR permanece em concentrações mínimas ou não detectadas durante a
gestação e o parto (CHAN et al., 1993). Desta forma, acredita-se que a modulação
dos receptores de ocitocina no miométrio e na placenta/endométrio ocorra por
mecanismos distintos, razão pelo qual os níveis estrogênicos não influenciaram a
expressão do RNAmOTR na placenta. Portanto, a possibilidade de existir uma
modulação negativa do RNAmOTR pela progesterona deve ser melhor estudada em
futuros experimentos de controle hormonal da gestação.
Anterior ao período de implantação embrionária, é essencial que ocorra o
reconhecimento materno da gestação, pois a falha neste mecanismo poderá
culminar em reabsorção embrionária. Nos ruminantes, o embrião é responsável pela
produção do interferon-tau, capaz de inibir os receptores de estrógeno e ocitocina
endometriais e, consequentemente, a liberação de hormônios luteolíticos como a
PGF2α (SPENCER et al., 1995 a,b; SPENCER; BAZER, 1996). Na espécie suína, o
estrógeno produzido pela placenta é o hormônio mais importante entre o 10° e 15°
dias de gestação, pois atua no endométrio promovendo reconhecimento materno da
gestação (GEISERT et al., 1982). A ação parácrina do estrógeno placentário no
epitélio endometrial aumenta a expressão de fatores de crescimento, incluindo o
IGF-1 e FGF-7, os quais estimulam o desenvolvimento e proliferação celular
(SPENCER; BAZER, 2004).
O reconhecimento materno da gestação ainda é um mecanismo incerto
na espécie canina. Estudos recentes demonstram que, semelhante ao que ocorre
em suínos, substâncias embrionárias e uterinas como o IGF-1 e IFN-γ também são
sintetizadas durante a implantação embrionária em cadelas (SCHÄFER-SOMI et al.,
2008). A expressão endometrial do RNAmREα no presente estudo ocorreu de
maneira constante durante todo o período gestacional. Sugere-se que o estrógeno
placentário possa atuar de maneira parácrina no endométrio de cadelas gestantes,
promovendo hiperplasia e hipertrofia de glândulas endometriais. A existência de um
mecanismo de reconhecimento materno da gestação em cadelas semelhante à
espécie suína não pode ser desconsiderada, pois o endométrio é passível de
responder ao estrógeno placentário por via parácrina, ao exibir receptores
estrogênicos durante toda gestação. A determinação das concentrações placentárias
DISCUSSÃO
T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � A � T � C � G � A
58
de estrógeno, bem como sua ação parácrina no endométrio deverão contribuir para
caracterizar o mecanismo de reconhecimento materno na espécie canina.
Neste trabalho, a expressão do RNAmERα no endométrio ocorreu de
maneira similar em todas as fases da gestação e no início do parto. Sabe-se que a
progesterona atua no endométrio inibindo a ação dos receptores de estrógeno e,
consequentemente, a formação dos receptores de ocitocina (MCCRACKEN et al.,
1984) Tal mecanismo é de fundamental importância para a manutenção da
gestação, pois impede a ação da ocitocina endometrial e, em última análise, a
síntese de agentes luteolíticos. Entretanto, a ação contínua da progesterona no
endométrio durante todo período gestacional promove decréscimo dos seus
receptores (RP), sensibilizando progressivamente o endométrio aos estímulos
estrogênicos. Desta forma, ao final da gestação há aumento dos receptores de
estrógeno e estimulação dos receptores de ocitocina endometriais (NOE, 1999). No
presente estudo, o aumento dos níveis circulantes de estrógeno ao final da gestação
não foi acompanhado por acréscimo na expressão do RNAmREα no endométrio. Em
ratas gestantes, a indução do RNAmOTR no útero parece ser mediada pelo REβ e
não pelo REα (MURATA et al., 2003). Os dois subtipos de receptores são
modulados por mecanismos distintos. Por exemplo, a ovariectomia em ratas
gestantes não influencia os níveis de REα, enquanto resulta em aumento do REβ.
Atribui-se a fatores ovarianos ou feto-placentários a mediação dos REβ uterinos.
Portanto, o aumento da expressão do RNAmOTR no endométrio de cadelas
gestantes ao final da gestação pode ser influenciado primariamente pelo REβ e não
pelo REα. Portanto, futuros estudos são necessários para elucidar a participação do
REβ no endométrio de cadelas gestantes.
Em ruminantes, ao final da gestação, os níveis elevados de estrógeno e
do RE promovem tanto a indução dos receptores de ocitocina quanto a liberação de
PGF2α, culminando em luteólise (SPENCER et al., 1995b). Os resultados deste
trabalho vão ao encontro dos estudos prévios em ruminantes. Ao início do parto
(grupo 4), constatou-se altas concentrações séricas de estrógeno, simultaneamente
ao acréscimo significativo na expressão do RNAmOTR no endométrio. Tais
evidências tornam possível afirmar que em cadelas, a expressão do RNAmOTR é
decorrente da ação estrogênica ao final da gestação, semelhante ao descrito nas
demais espécies. O aumento do receptor de ocitocina no endométrio determina a
DISCUSSÃO
T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � A � T � C � G � A
59
síntese e liberação da PGF2α, responsável pela lise do corpo lúteo e início do
trabalho de parto.
Ao final do período gestacional, o evento endócrino crucial é determinado
pela diminuição dos níveis de progesterona e aumento de estrógeno, resultando na
síntese do receptor de ocitocina durante o trabalho de parto (CHALLIS, 1971;
LACHER et al., 1995). Em mulheres gestantes, o parto também é precedido por
maior expressão do REα no miométrio, simultaneamente à queda dos níveis de
progesterona (VEGETO et al., 1993; MESIANO et al., 2002). Por outro lado, a
expressão do RNAmREα no miométrio de cadelas gestantes mantém-se constante a
partir de 20 dias de gestação. Tal resultado pode ser comparado ao obtido no
endométrio, em relação à expressão do RNAmREα. A indução da síntese do
RNAmOTR a partir do REα não pôde ser comprovada neste estudo, embora a
concentração sérica de estrógeno tenha elevado-se significativamente ao final da
gestação. Conforme sugerido anteriormente, acredita-se que a modulação do
receptor de ocitocina em cadelas gestantes possa ocorrer precipuamente por meio
do REβ e de forma menos intensa pelo REα.
A expressão do RNAmOTR no miométrio foi demonstrada durante toda a
gestação e parto. No entanto, a expressão máxima pôde ser observada nos grupos
3 e 4, ou seja, ao final da gestação e início do trabalho de parto. Disto demonstra o
aumento progressivo da sensibilidade miometrial frente ao estímulo da ocitocina
para desencadeamento das contrações uterinas. A significativa elevação dos níveis
séricos de estrógeno nos grupos 3 e 4, concomitantemente ao acréscimo
significativo na expressão do RNAmOTR no miométrio, reforça a importante ação
mediadora do estrógeno nos receptores de ocitocina e, consequentemente, no início
do parto. Ainda, é importante ressaltar que o aumento do RNAmRE no miométrio é
decorrente do aumento do cortisol fetal ao final da gestação em ovelhas,
aumentando a sensibilidade uterina aos estímulos estrogênicos (WU et al., 1996a).
Entretanto, tal mecanismo não pôde ser elucidado em cadelas com os resultados do
presente trabalho.
Em mulheres, a concentração de ocitocina plasmática mantém-se baixa
durante toda a gestação e no parto. No entanto, o tratamento com estradiol resulta
em acréscimo dos níveis circulantes de ocitocina (AMICO et al., 1981; MITCHELL et
al., 1998). Recentemente, Klarenbeek et al. (2007) demonstraram que as
concentrações de ocitocina em cadelas ao final da gestação permanecem baixas,
DISCUSSÃO
T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � A � T � C � G � A
60
podendo oscilar e aumentar somente no estágio expulsivo do parto, mas não
necessariamente no momento da expulsão fetal. Os resultados do presente estudo
vão ao encontro dos relatos prévios, pois as concentrações de ocitocina mantiveram-
se constantes durante toda a gestação e o parto. Apesar da confirmada produção
placentária de ocitocina como mecanismo de indução da luteólise (CHAN et al.,
1993), nota-se que os níveis circulantes deste hormônio não se alteram ao longo da
gestação. Tais observações sugerem que a ocitocina circulante na espécie canina
possui influência mínima para o início do parto. Por este motivo, pode-se considerar
que a ativação dos receptores de ocitocina miometriais dimana da ação parácrina da
ocitocina de origem placentária.
Nas reações de PCR em tempo real neste trabalho, utilizou-se dois genes
denominados constitutivos como controles endógenos (18S e RPS5). As variações
dos resultados encontrados em alguns tecidos denotam diferenças entre os
controles selecionados. Por se tratar de genes constitutivos, variações representam
instabilidade gênica em tecidos específicos. No miométrio e na placenta, os genes
18S e RPS5 não revelaram diferenças importantes para a interpretação dos dados.
Portanto, considera-se que ambos são estáveis nestes tecidos. Por outro lado, os
referidos genes no endométrio geraram distintas interpretações, mas também
evidenciou-se diferenças em suas variâncias. O gene constitutivo RPS5, por
apresentar menor desvio padrão, pode ser considerado mais estável para o
endométrio em relação ao 18S. Portanto, para avaliações futuras da expressão
gênica no endométrio de cadelas, sugere-se o emprego do gene endógeno RPS5.
Considerações importantes a respeito da fisiologia reprodutiva da cadela
foram abordadas no presente estudo. Os novos conhecimentos podem auxiliar
futuras pesquisas voltadas para o estudo da reprodução canina. Da mesma forma,
podem contribuir para a aplicação prática dos hormônios frente às possíveis
alterações maternas ou fetais durante a gestação e parto. Todavia, ainda persistem
lacunas para explicar as diversas interações hormonais e estabelecer padrões
endócrinos. Futuros estudos devem ser conduzidos para elucidar tais
questionamentos e contribuir para o conhecimento técnico-científico nesta espécie.
CONCLUSÃOT – C – G – A – T – C – G – A – T - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - A – A – T – C – G – A
CONCLUSÃO
T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � A � T � C � G � A
62
6 CONCLUSÃO
Nas condições deste estudo e com base nos resultados apresentados
pode-se concluir que:
1. A expressão gênica dos receptores de estrógeno e ocitocina nos tecidos
estudados é modulada segundo o período gestacional e o parto:
Endométrio ! O RNAmREα é expresso de maneira constante durante a gestação e
parto. ! O RNAmOTR possui maior expressão ao início do trabalho de parto.
Miométrio ! O RNAmREα possui maior expressão entre 20 e 40 dias de gestação e
ao início do trabalho de parto. ! O RNAmOTR é mais expresso entre 40 e 60 dias de gestação e ao
início do trabalho de parto.
Placenta ! O RNAmREα possui maior expressão até 40 dias de gestação.
! O RNAmOTR é expresso de maneira constante durante a gestação e ao início do trabalho de parto.
2. As concentrações séricas de ocitocina mantêm-se constantes durante todo período gestacional e no início do parto, enquanto os níveis estrogênicos elevam-se a partir de 40 dias de gestação até o parto.
3. É possível atribuir ao aumento dos níveis circulantes de estrógeno a maior
expressão do RNAmOTR no miométrio e endométrio ao final da gestação.
As concentrações séricas de ocitocina não influenciam o início do parto na espécie canina, bem como a modulação da expressão dos receptores de estrógeno e ocitocina no endométrio, miométrio e placenta.
REFERÊNCIAST – C – G – A – T – C – G – A – T - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - A – T – C – G – A – T – C – G – A – T - A – A – T – C – G – A
REFERÊNCIAS
T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � A � T � C � G � A
64
REFERÊNCIAS
AL-BLADER, D. M. Estrogen receptors alpha e beta in rat placenta: detection by RT-PCR, real-time PCR and Western blotting. Reproductive Biology and Endocrinology, v. 4, n. 13, p. 1-10, 2006.
AMICO, J. A.; SEIF, S. M.; ROBINSON, A. G. Oxytocin in human plasma: correlation with neurophysin and stimulation with estrogen. Journal of Clinical Endocrinology Metabolism, v. 52, n. 5, p. 988-993, 1981.
AMSO, N. N.; CROW, J.; SHAW, R. W. Comparative immunohistochemical study of oestrogen and progesterone receptors in the fallopian tube and uterus at different stages of the menstrual cycle and the menopause. Human Reproduction., v. 9, n. 6, p. 1027-37, 1994.
BARI, F.; ERRICO, R. A.; LOUIS, T. M.; BUSIJA, D. W. Interaction between ATP-sensitive K+ channels and nitric oxide on pial arterioles en piglets. Journal of Cerebral Blood Flow Metabolism., v. 16, p. 1158-1164, 1996.
BARTHOLOMEUSZ, R. K.; BRUCE, N. W.; LYNCH, A. M. Embryo survival and fetal and placental growth following elevation of maternal estradiol blood concentrations in the rat. Biology Reproduction, v. 61, p. 46-50, 1999.
BUKOVSKY, A.; CAUDLE, M. R.; CEKANOVA, M.; FERNANDO, R. I.; WIMALASENA, J.; FOSTER, J. S.; HENLEY, D. C.; ELDER, R. F. Placental expression of estrogen receptor beta and its hormone binding variant � comparison with estrogen receptor alpha and a role for estrogen receptors in asymmetric devision and differentiation of estrogen-dependent cell. Reproductive. Biology. And Endocrinology., v. 1, p. 36-56, 2003.
BURBACH, J. P. H.; LEBOUILLE, J. L. M. Proteolytic conversion of arginine-vasopressin and oxytocin by brain synaptic membranes. Journal of Biological Chemistry., v. 258, p. 1487-1494, 1982.
REFERÊNCIAS
T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � A � T � C � G � A
65
CONCANNON, P. W. Canine pregnancy and parturition. Veterinary Clinics of Norh America Small Animal Practice, v. 16, n. 3, p. 453-475, 1986. CONCANNON, P. W. Effects of hypophysectomy and of LH administration on luteal phase plasma progesterone levels in the beagle bitch. Journal of Reproduction and Fertility, v. 58, p. 407-410, 1980.
CONCANNON, P. W.; HANSEL, W.; VISEK, W. J. The ovarian cycle of the bitch: Plasma strogen, LH, and progesterone. Biology of Reproduction, v. 13, p. 112-121, 1975. CONCANNON, P. W.; TSUTSUI, T.; SHILLE, V. Embryo development, hormonal requirementes and maternal responses during canine pregnancy. Journal of Reproduction and Fertility Supplement., v. 57, p. 169-179, 2001.
CONCANNON, P. W.; VERSTEGEN, J. Pregnancy in dogs and cats. In: KNOBIL, E:, NEIL, J. (Ed).. Encyclopedia of Reproduction, New York: Academic Press, 1999, p. 336-345. CHALLIS, J. R. G. Sharp increase in free circulationg oestrogen immediately before parturition in sheep. Nature, v 208, p. 229, 1971. CHALLIS, J. R. G.; LYE, S. J. Parturition. In: KNOBIL E, NEIL J, (Ed). The physiology of reproduction. New york: Raven Press, p. 985-1031, 1994. CHAN, W. Y., CHEN, D. L.; MANNING, M. Oxytocin receptor subtypes in the pregnant rat myometrium and decidua: pharmacological differentiations. Endocrinology, v. 132, p. 1381-1386, 1993.
CHARD, T. Fetal and maternal oxytocin in human parturition. American Journal of Perinatology, v. 6, p. 145-152, 1989.
REFERÊNCIAS
T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � A � T � C � G � A
66
CHIBBAR, R.; MILLER, F. D.; MITCHELL, B. F. Synthesis of oxytocin in amnion, chorion and deciduas may influence the timing of human parturition. Journal of Clinical Investigation, v. 91, p. 185-192, 1993.
CHIBBAR, R. ; WONG, S.; MILLER, F. D.; MITCHELL, B. F. Estrogen stimulates oxytocin gene expression in human fetal membranes and decidua. Journal of clinical endocrinology metabolism, v. 80, p. 567-572, 1995. DAWOOD, M. Y.; RAGHAVEN, K. S.; FUCHES, F. Oxytocin in juman pregnancy and parturition. American Journal of Obstetrics and Gynecology, v. 51, p. 138-142, 1978. DOBSON, H.; ROWAN, T. G.; KIPPAX, I. S.; HUMBLOT, P. Assessment of fetal number, and fetal and placental viability throughout pregnancy in cattle. Theriogenology, v. 40, p. 411-425, 1993. FRANCZAK, A.; CIERESZKO, R.; KOTWICA, G. Oxytocin (OT) action in uterine tissues of cyclic and early pregnant gilts: OT receptors concentration, prostaglandin F(2)alpha secretion, and phosphoinositide hydrolysis. Animal Reproduction Science, v. 88, n 3-4, p. 325-39, 2005. FUCHS, A. R.; PERIYASAMY, S.; ALEXANDROVA, M.; SOLOFF, M.S. Correlation between oxytocin receptor concentration and responsiveness to oxytocin in pregnant rat myometrium: effects of ovarian steroids. Endocrinology, v. 113, p. 742-749, 1983. FUCHS, A.R.; HUSSLEIN, P.; FUCHS, F. Oxytocin secretion and human parturition: pulse frequency and duration increase during spontaneous labor in women. American Journal of Obstetrics and Gynecology, v. 164, p. 1515-1523, 1991.
GEISERT, R. D.; RENEGAR, R. H.; THATCHER, W. W.; ROBERTS, R. M.; BAZER, F. W. Establishment of pregnancy in the pig: I. Interrelationships between preimplantation development of the pig blastocyst and uterine endometrial secretions.Biology Reproduction, v. 27, n 4, p. 925-39. 1982.
REFERÊNCIAS
T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � A � T � C � G � A
67
GIMPLE, G.; FAHRENHOLZ, F.The oxytocin receptor system: structure, function, and regulation. Physiological Reviews, v. 81, p. 629-683, 2001. GREENE, G.L.; GILNA, P.; WATERFIELD, M.; BAKER, A.; HORT, Y.; SHINE, J. Sequence and expression of human estrogen receptor complementary DNA. Science, v. 231, p. 1150-1154, 1986.
HIRST, J. J.; CHIBBAR, R.; MITCHELL, B. F. Role of oxytocin in the regulation of uterine activity during pregnancy and in the initiation of labor. Seminars in Reproductive Endocrinology, v. 11, p. 219-233, 1993. HOFFMANN, B.; HOVELER, R.; NOHR, B.; HASAN, S. H. Investigations on hormonal changes around parturition in the dog and the occurrence of pregnancy-specific non conjugated oestrogens. Exp. Clin. Endocrinology, v. 102, p. 185-189, 1994. KIMURA, T.; IVELL, R. The oxytocin receptor. Results and Problems in Cell Differentiation, v. 26, p.135-168, 1999. KIMURA, T.; SAJI , F.; NISHMORI, K.; OGITA, K.; NAKAMURA, H.; KOYAMA, M.; MURATA, U. Molecular regualtion of the oxytocin receptor in peripheral organ. Journal of Molecular Endocrinology, v. 30, p. 109-115, 2003.
KIMURA, T.; TAKEMURA, M.; NOMURA, S.; NOBUNAGA, T.; KUBOTA, Y.; INOUE, T.; HASHIMOTO, K.; KUMAZAVA, I.; ITO, Y.; OHASHI, K.; KOYAMA, M.; AZUMA, C.; KITAMURA, Y.; SAJI, F. Expression of oxytocin receptor in juman pregnant myometrium. Endocrinology, v. 137, p. 780-785, 1996.
KUIPER, G. G.; CARLSSON, B.; GRANDIEN, K.; ENMARK, E.; HAGGBLAD, J.; NILSSON, S. Comparisson of the ligand binding specificity and transcript tissue distribution of estrogen receptors α and β. Endocrinology, v. 138, p. 863-870, 1997.
REFERÊNCIAS
T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � A � T � C � G � A
68
KUIPER, G. G. J. M.; ENMARK, E.; PELTO-HUIKKO, M.; NILSSON, S.; GUSTAFSSON, J. A. Cloning of a novel estrogen receptor expressed in rat prostate and ovary. Proceedings of the National Academy of Sciences, v. 93, p. 5925-5930, 1996. KINDAHL, H.; KORNMATITSUK, B.; KÖNIGSSON, K.; GUSTAFSSON, H. Endocrine changes in late bovine pregnancy with special emphasis on fetal well-being. Domestic Animal Endocrinology, v. 23, p. 321-328, 2002.
KLARENBEEK, M.; OKKENS, A. C.; KOOISTRA, H. S.; MOL, J. A.; BEVERS, M. M.; TAVERNE, M. A. M. Plasma oxytocin concentrations during late pregnancy and parturition in the dog. Theriogenology, v. 68, p. 1169-1176, 2007. LARCHER, A.; NECULCEA, J.; BRETON, C.; ARSLAN, A.; ROZEN, F.; RUSSO, C.; ZINGG, H. H. Oxytocin receptor gene expression in the rat uterus during pregnancy and the estous cycle and in response to gonadal steroid treatment. Endocrinology, v. 132, n 12, p. 5350-5356, 1995. LESSEY, B. A.; KILLAM, A. P.; METZGER, D. A.; HANEY, A. F.; GREENE, G. L.; McCARTY JR., K. S. Immunohistochemical analysis of human uterine estrogen and progesterone receptors throughout the menstrual cycle. J. Clin. Endocrinology Metabolism, v. 67, n. 2, p. 334-340, 1988. McCRACKEN, S. A.; GRANT, K. E.; MacKENZIE, I. Z.; REDMAN, C. W.; MARDON, H. J. Gestational regulation of granulocyte-colony stimulating factor receptor expression in the human placenta. Biology Reproduction, v. 60, n. 4, p. 790-796, 1999. MESIANO, S.; CHAN, E. C.; FITTER, J. T.; KENNETH, K.; YEO, G.; SMITH, R. Progesterone withdrawal and estrgen activation in human parturition are coordinated by progesterone receptor A expression in the myometrium. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, v. 87, n. 6, p. 2924-2930, 2002.
REFERÊNCIAS
T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � A � T � C � G � A
69
MIGLINO, M. A.; AMBRÓSIO, C. E.; SANTOS MARTINS, D.; WENCESLAU, C. V.; PFARRER, C.; LEISER, R. The carnivore pregnancy: the developmente of the embryo and fetal membranes. Theriogenology, v.66, n. 6-7, p. 1699-1702, 2006.
MITCHELL, B. F.; CROSS, J.; HOBKIRK, R.; CHALLIS, J. R. G. Formation of unconjugated estrogens from estrone sulfate by dispersed cells from human fetal membranes and decidua. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, v. 58, p. 845-850, 1984 MITCHELL, B. F.; FANG, X.; WONG, S. Oxytocin: a paracrine hormone in the regulatio of parturition? Journal of Reproduction and Fertility, v. 3, p. 113-122, 1998. MITCHELL, B. F.; FANG, X.; WONG, S. Metabolism of oxytocin in rat uterus and placenta in late gestation. Biology of reproduction, v. 57, p. 807-812, 1997. MITCHELL, B. F.; WRONG, S. Metabolism of oxytocin in human deciduas, chorion and placenta. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, v. 80, p. 2729-2734, 1996. MURATA, T.; NARITA, K.; HONDA, K.; MATSUKAWA, S.; HIGUCHI, T. Differential regulation of estrogen receptor α and β mRNAs in the rat uterus during pregnancy and labor: possible involvement of estrogen receptors in oxytocin receptor regulation. Endocrine Journal, v. 50, n. 5, p. 579-587, 2003. NOE, M.; KUNZ, G.; HERBERTZ, M.; MALL, G.; LEYENDECKER, G. The cyclic pattern of the immunocytochemical expression of oestrogen and progesterone receptors in human myometrial and endometrial layers: characterization of the endometrial-subendometrial unit. Human Reproduction, v. 14, n. 1, p. 190-197, 1999. OLSSON, K.; BERGSTRÖM, A.; KINDAHL, H.; LAGERSTEDT, A. S.Increased plasma concentrations of vasopressin, oxytocin, cortisol and the prostaglandin F2α
REFERÊNCIAS
T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � A � T � C � G � A
70
metabolite during labour in the dog. Acta Physiology Scandinavia, v. 179, p. 281-287, 2003. ONCLIN, K.; MURPHY, B.; VERSTEGEN, J. P. Comparisons of estradiol, LH and FSH patterns in pregnant and nonpregnant beagle bitches. Theriogenology, v. 57, p. 1957-1972, 2002. OPONOWICZ, A.; FRANCZAK, A.; KUROWICKA, B.; KOTWICA, G. Relative transcript abundance of oytocin receptor gene in porcine uterus during luteolysis and early pregnancy. Journal Applied Genetics., v. 47, n. 4, p. 345-351, 2006. OTSUKI, Y.; YAMAJI, K.; FUJITA, M. Serial plasma oxytocin concentrations during pregnancy and labor. Acta Obstetrica et Gynecologica Scandinavia, v. 62, p. 15-18, 1983. PFAFFL, M. W.; HORGAN, G. W.; DEMPFLE, L. Relative expression software tool (REST©) for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in real-time PCR. Nucleic Acids Research, v. 30, disponível em: http://nar.oxfordjournals.org. Acesso em 10 de maio de 2006. RIEMER, R. K.; GOLDFIEN, A. C.; GOLFIEN, A.; ROBERTS, J. M. Rabbit uterine oxytocin receptors and in vitro contractile response: abrupt changes at term and the role of eicosanoids. Endocrinology, v.119, n. 2, p. 699-709, 1986. SAUERWEIN, H.; MEYER, H. H. D.; MÖSTL, E. Low sensitivity to estrogens in bovine placenta at term. Zentralbl Veterinarmed A., v. 36, p 236-240, 1989. SAUNDERS, P. T.; MAGUIRE, S. M.; GAUGHAN, J.; MILLAR, M. R. Expression of oestrogen receptor beta (ER beta) in multiple rat tissues visualised by immunohistochemistry. Journal Endocrinololgy., v. 154, n. 3, p. R13-6, 1997. SCHÄFER-SOMI, S.; BECERIKLISOY, H. B.; BUDIK, S.; KANCA, H.; AKSOY, O. A.; POLAT, B.; CETIN, Y.; AY, S. S.; ASLAN, S. Expression of genes in the canine pre-
REFERÊNCIAS
T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � A � T � C � G � A
71
implantation uterus and embryo: implications for an active role of the embryo before and during invasion. Reproduction Domestic Animal, p. 1-8, 2008. SCHULER, G.; WIRTH, C.; TEICHMANN, U.; FAILING, K.; LEISER, R.; THOLE, H.; HOFFMANN, B. Ocurrence of estrogen receptor α in bovine placentomes throughout mid and late gestation and parturition. Biology Rreproduction, v. 66, p. 976-982, 2002. SERNIA, C.; GEMMELL, R. T.; THOMAS, W. G. Oxytocin receptor in the ovine corpus luteum. Journal of Endocrinology, v. 21, p. 117-123, 1989. SOKOLOWSKI, J. The effects of ovariectomy on pregnancy maintenance in the bitch. Laboratory Animal Science, v. 21, p. 696-699, 1974. SOLOFF, M. S. Uterine receptor for oxytocin: effects of estrogen. Biochemichal Biophysical Research and Communication., v. 65, n. 1, p. 205-212,1975. SPENCER, T. E.; BAZER, F. W. Ovine interferon tau suppresses transcription of the estrogen receptor and oxytocin receptor genes in the ovine encometrium. Endocrinology, v. 137, n. 3, p. 1144-1147, 1996. SPENCER, T. E.; BAZER, F. W. Uterine and placental factors regulating conceptus growth in domestic animals. Journal Animal Science, v. 82, p. 4-13, 2004, Supplement, E SPENCER, T. E.; BECKER, W. C.; GEORGE, P. ; MIRANDO, M. A.; OGLE, T. F.; BAZER, F. W. Ovine interferon-tau inhibits estrogen receptor up-regulation and estrogen-induced luteolysi in cyclic ewes. Endocrinology, v. 136, n 11, p. 4932-4944, 1995a. SPENCER, T. E.; BECKER, W. C.; GEORGE, P. ; MIRANDO, M. A.; OGLE, T. F.; BAZER, F. W. Ovine interferon-tau regulates expression of endometrial receptors for
REFERÊNCIAS
T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � A � T � C � G � A
72
estrogen and oxytocin but not progesterone. Biology of Reproduction, v. 53, p. 732-745, 1995b. TELLERIA, C. M.; ZHONG, L.; DEB, S.; SRIVASTAVA, R. K.; PARK, K. S.; SUGINO, N.; PARK-SARGE, O. K.; GIBORI, G. Differential expression of the estrogen receptors α and β in the rat corpus luteum of pregnancy: regulation by prolactin and placental lactogens. Endocrinology, v. 139, n. 5, p. 2432-2442, 1998. TESSIER, C.; DEB, S.; PRIGENT-TESSIER, A.; FERGUSON-GOTTSCHALL, S.; GIBORI, G.B.; SHIU, R.P.; GIBORI, G. Estrogen receptors alpha and beta in rat decidua cells: cell-specific expression and differential regulation by steroid hormones and prolactin. Endocrinology, v. 141, n. 10, p. 3842-3851, 2000. THORNTON, S.; DAVISON, J.; BAYLIS, P. H. Effect of human pregnancy on metabolic clearance rate of oxytocin. American Journal of Physiology, v. 259, p. 21-24, 1990. VEGETO, E.; SHAHBAZ, M. M.; WEN, D. X.; GOLDMAN, M. E.; O�MALLEY, B.W.; McDONELL, D.P.; Human progesterone receptor A form is a cell- and promoter-specific repressor of human progesterone receptor B function. Molecular Endocrinology, v. 7, n. 10, p. 1244-1255, 1993. WATHES, D. C.; HAMON, M. Localization of oestradiol, progesterone and oxytocin receptors in the uterus during the oestrus cycle and early pregnancy of the ewe. Journal Endocrinology, v. 138, p. 479-491, 1993.
WATHES, D. C.; SWANN, R. W. Is oxytocin an ovarion hormone? Nature, v. 297, p. 225-227, 1982. WOOD, C. E. Control o f parturition in ruminants. Journal of Reproduction and Fertility Supplement, v. 54, p. 115-126, 1999.
REFERÊNCIAS
T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � T � C � G � A � T � C � G � A � T - A � A � T � C � G � A
73
WU, W. X.; DERKS, J. B.; NATHANIELSZ, P. W. Effects of glucocorticois on estrogen receptor messenger ribonucleic acid in the pregnant ovine myometrium in vivo and in vitro. Biology of Reproduction, v. 54, p. 230-241, 1996a.
WU, W. X.; VERBALIS, J. G.; HOFFMAN, G. E.; DERKES, J. A.; NATHANIELSZ, P. W. Characterization of oxytocin receptor expression and distribution in the pregnant sheep uterus. Endocrynology, v. 137, n. 2, p. 722-728, 1996b. YAMAGUCHI, K.; ASAISHI, T.; NEGORO, H. Effect of oestrogen treatment on plasma oxytocin and vasopressin in ovariectomized rats. Endocrinologica Japonicum, v. 26, p. 197-205, 1979.