Expressão de Antígenos Recombinantes para …...molecular, as quais migram pelos poros do gel de...
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Expressão de Antígenos
Recombinantes para
Aplicação em Imunologia
Bióloga Mariana Monezi Borzi
Mestranda em Microbiologia Agropecuária
Laboratório de Imunologia e Virologia
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS – FCAV
CAMPUS DE JABOTICABAL
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• Cópia das sequencias de nucleotídeos de uma molécula de DNA parental de fita dupla em duas moléculas filhas de DNA de fita dupla.
• Semi-conservativa
Replicação
Fita molde
Fita nova
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É o processo pelo qual uma molécula de RNA é sintetizada a partir da informação contida na sequência de nucleotídeos de uma molécula
de DNA de fita dupla (gene)
Transcrição
Núcleo
Informação genética
Citoplasma
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Consiste na transformação da mensagem contida no mRNA, via tRNA, na sequência de
aminoácidos que constituem a proteína.
Tradução
Expressão gênica
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Exemplo: Estrutura de um gene procarioto
Expressão gênica
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Polímero de aminoácidos de massa molecular acima de 10.000 Da, com cada aminoácido unido ao seu vizinho por um tipo específico de ligação
covalente.
Proteína
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Ligações peptídicas
Ligações peptídicas
Pontes de hidrogênio
Ligações peptídicas
Pontes de hidrogênio
Ligações dissulfeto
Interações eletrostáticas
Forças de Van der Walls
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Produção em larga escala de proteínas recombinantes - a partir da expressão de uma
molécula de DNA recombinante em um sistema de expressão adequado.
Tecnologia do DNA recombinante
Uso terapêutico
Estudos bioquímicos
- Estrutura 3D
Dificuldades a partir do tecido original
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Células de mamíferos, células de insetos, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis e
Escherichia coli
Taxa de crescimento celular;
Complexidade do meio de
cultura;
Custo do meio de cultura;
Nível de expressão;
Capacidade de expressão
extracelular.
Capacidade de produzir as
modificações pós-tradução tais
como:
- enrolamento correto;
- formação das pontes dissulfito;
- glicosilação;
- fosforilação;
- acetilação.
Sistemas de Expressão
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• Crescimento rápido, em um período curto de tempo, requerem pouco espaço físico e possuem uma nutrição fácil de ser suplementada.
• Genética relativamente simples e bem compreendida
• Único cromossomo de aproximadamente 4,6 milhões de pares de bases e completamente sequenciado
• Código genético quase universal
Escherichia coli
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Vetor: molécula de DNA usada como um veículo para carregar sequências de DNA estrangeiras dentro de uma célula hospedeira.
Plasmídeos:
• Mais simples
(1.000 a 2.000 pb)
• Circulares
• Independentes do cromossomo bacteriano
Vetores de expressão
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Expressão de proteína recombinante em E. coli
Clonagem do gene em vetor de expressão
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Vetor linearizado Preparo do inserto
Reação de ligação
Plasmídeo recombinante
Transformação de E. coli
competente
Plaqueamento e seleção
dos clones recombinantes
Extração do
DNAp e
Sequenciamento
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Indução da expressão da proteína recombinante
Tampão
de lise
Sonicação Purificação
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Análise da expressão da proteína recombinante
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Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS PAGE)
• Separação de proteínas conforme o peso molecular, as quais migram pelos poros do gel de poliacrilamida
• Quanto menor for o peso molecular da proteína mais facilmente ela migrará em relação às outras proteínas
• Após a corrida das proteínas pelos poros do gel, estas poderão ser visualizadas com a aplicação do corante Coomassie Blue
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Preparo da amostra: dodecil-sulfato de sódio e 2-mercapto-etanol
Confere carga negativa Separa as cadeias
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260 kDa
72 kDa
52 kDa
42 kDa
10 kDa
Caracterização por SDS-PAGE da Nucleoprotéina recombinante do
Vírus da Influenza Aviária expressa em E. coli.
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Western blotting
• Técnica bioquímica utilizada para determinar a quantidade relativa e o peso molecular de uma proteína dentro de uma mistura de proteínas ou outras moléculas.
• Detecção de antígenos proteicos - uso de anticorpos específicos
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72 kDa
52 kDa
42 kDa
260 kDa
10 kDa
Caracterização por Western Blotting da Nucleoprotéina
recombinante do Vírus da Influenza Aviária expressa em E. coli.
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• Substâncias (moléculas) estranhas ao SI que são reconhecidas por receptores específicos em linfócitos B e T e também por anticorpos.
Antígenos
Anticorpos
• Proteínas do tipo imunoglobulinas com sítios específicos para interação com os antígenos e que são sintetizadas por linfócitos B e plasmócitos.
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• O Ac se liga somente a uma parte do Ag, denominada epítopo ou determinante antigênico.
• Quando o parátopo do Ac se liga ao epítopo do Ag
Interação Ag-Ac
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Epítopo linear ou contínuo Epítopo conformacional ou
descontínuo
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Análise (mapeamento) dos epítopos
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Aplicações em Imunologia
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Imunodiagnóstico
• Sorologia - detecção de Acs contra antígenos virais e bacterianos específicos
Preparações antigênicas:
Propagação viral em ovos
Ultra-centrifugação
Expressão de proteínas
Imunodifusão em gel de agarose
Inibição da
Hemaglutinação
ELISA
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Diagnóstico da Influenza Aviária
• Clonagem e expressão da NP do VIA
• Aplicação em testes de ELISA
• 121 soros testados
• Positivos – Acs presentes no soro reagiam com a NP recombinante
• Negativos – não ocorria reação
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ELISA indireto
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• Apresentam sequencias do material genético do agente infeccioso que codificam antígenos
Vacinas de DNA
Clonagem e expressão do gene (propagação)
Administração ao indivíduo (transfecção)
Células produzem a própria proteína (antígeno)
Resposta imunológica com memória
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AIDS
Malária
Dengue
Tuberculose humana e bovina
Hepatite B
Raiva
Leptospirose
Teníase
Exemplos: vacinas de DNA
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Perguntas?
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