EXPRESSÃO DA PROTEÍNA HIF1-ALPHA E SUA RELAÇÃO COM O ... · do tecido anormal após a cirurgia...
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i MARCELO DOS SANTOS EXPRESSÃO DA PROTEÍNA HIF1-ALPHA E SUA RELAÇÃO COM O PROGNÓSTICO EM PACIENTES COM CARCINOMA EPIDERMÓIDE DE ANDAR INFERIOR DA BOCA Dissertação apresentada ao Curso de Pós- Graduação da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde. SÃO PAULO 2010
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MARCELO DOS SANTOS
EXPRESSÃO DA PROTEÍNA HIF1-ALPHA E SUA RELAÇÃO
COM O PROGNÓSTICO EM PACIENTES COM CARCINOMA
EPIDERMÓIDE DE ANDAR INFERIOR DA BOCA
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-
Graduação da Faculdade de Ciências Médicas da
Santa Casa de São Paulo para obtenção do título
de Mestre em Ciências da Saúde.
SÃO PAULO
2010
ii
MARCELO DOS SANTOS
EXPRESSÃO DA PROTEÍNA HIF1-ALPHA E SUA RELAÇÃO
COM O PROGNÓSTICO EM PACIENTES COM CARCINOMA
EPIDERMÓIDE DE ANDAR INFERIOR DA BOCA
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-
Graduação da Faculdade de Ciências Médicas da
Santa Casa de São Paulo para obtenção do título
de Mestre em Ciências da Saúde.
Orientador: Prof. Dr. Antônio José Gonçalves
Coorientadora: Profa. Dra. Adriana Madeira
Álvares da Silva.
SÃO PAULO
2010
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FICHA CATALOGRÁFICA
Preparada pela Biblioteca Central da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo
Santos, Marcelo dos Expressão da proteína HIF1-alpha e sua relação com o prognóstico em pacientes com carcinoma epidermóide de andar inferior da boca./ Marcelo dos Santos. São Paulo, 2010.
Dissertação de Mestrado. Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo – Curso de Pós-Graduação em Ciências da Saúde.
Área de Concentração: Ciências da Saúde Orientador: Antônio José Gonçalves Co-Orientador: Adriana Madeira Álvares da Silva 1. Neoplasias de cabeça e pescoço 2. Carcinoma de células
escamosas 3. Prognóstico 4. Subunidade alfa do fator 1 induzível por hipoxia 5. Imunoistoquímica
BC-FCMSCSP/68-10
iv
Dedicado ao doador de meu cromossomo Y.
v
“Viver é como andar de bicicleta:
É preciso estar em constante movimento para
manter o equilíbrio”.
Albert Einstein
vi
AGRADECIMENTOS
À Faculdade de Ciências Médicas Santa Casa de São Paulo (FCMSCSP), à Irmandade
da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo pela oportunidade de realizar o presente trabalho.
À Coordenação de aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pelo
apoio financeiro concedido, auxiliando em minha formação.
Aos órgãos de fomento, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo
(FAPESP) e Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelo
apoio financeiro concedido a este trabalho, através do Projeto Temático Genoma Clínico do
Câncer.
Ao Prof. Dr. Antônio José Gonçalves, meu Orientador, pelos ensinamentos e pelo
constante e persistente incentivo ao meu crescimento profissional.
À Profa. Dra. Adriana Madeira Álvares da Silva, minha Coorientadora, pela
incessante ajuda durante toda minha formação acadêmica, pelos conselhos, pela colaboração,
pela amizade e por me considerar como filho. Obrigado mãe!
À Profa. Ana Maria da Cunha Mercante, Chefe do Serviço de Anatomia Patológica
do Hospital Heliópolis, pelos impagáveis ensinamentos e apoio nas análises de imuno-
histoquímica.
vii
Ao Prof. Dr. Marcos Brasilino de Carvalho, Coordenador de Pesquisa e Chefe do
Serviço de Cirurgia de Cabeça e Pescoço do Hospital Heliópolis, pela imensa dedicação em
repassar suas experiências pessoais e profissionais, por questionar meus conceitos, provocar
minha capacidade, aguçar a curiosidade, por dar corda à criatividade e depois puxar. Obrigado
por proporcionar as melhores condições para meu desenvolvimento.
Aos Biólogos e Pesquisadores colaboradores do Projeto Temático Genoma Clínico do
Câncer, Diana Gazito, Jean Tetsuo Takamori e Liliane Rossi, por agregarem conhecimentos
ao trabalho e pela gratificante amizade.
À Profa. Dra. Eloiza Helena Tajara da Silva, Coordenadora do Projeto Temático
Genoma Clínico do Câncer, pela imensa colaboração e tornar possível a realização deste
trabalho.
Aos Professores do Laboratório de Ciências Fisiológicas da Faculdade de Ciências
Médicas Santa Casa de São Paulo (FCMSCSP), Prof. Dr. Carlos Alberto Longui, Profa. Dra.
Mylene Neves Rocha, Prof. Dr. Murilo Resende Melo, Prof. Flávio Richeti, pelos
ensinamentos agregados.
Aos estatísticos da Faculdade de Ciências Médicas Santa Casa de São Paulo
(FCMSCSP), Profa. Dra. Ting Hui Ching e Prof. Daniel Kashiwamura Scheffer, pelos
ensinamentos de estatística aplicada.
À Danielle Félix dos Santos, por existir em minha vida. Te amo!
viii
Aos meus familiares e amigos, pelo apoio me dado. Amo vocês.
Expresso ainda o meu agradecimento sincero a todos aqueles que, de alguma forma,
colaboraram para a realização deste trabalho.
ix
LISTA DE ABREVIATURAS
µm Micrometro
ARD1 Acetyltransferase Arrest-defective-1
ARNT Aryl Hydrocarbon Receptor Nuclear Translocator
bHLH Basic helix-loop-helix
BSA Solução albumina de soro bovino
cDNA DNA complementar
CID Código Internacional de Doenças
C-TAD C-terminal
EPO Erythropoietin
EST Expressed Sequence tags
HE Hematoxilina-Eosina
HIF1 Hypoxia-inducible factor 1
HR Hazard ratio
HRE Hypoxia response element (Elementos responsivos à hipóxia)
IC Intervalo de confiança
IHQ Imuno-histoquímica
INCA Instituto Nacional de Câncer
Lys Resíduo de lisina
mRNA Ribonucleic Acid (ARNm – Ácido ribonucleico mensageiro)
NDRG1 N-myc downstream regulated 1
N-TAD N-terminal
O2 Oxigênio
ODD Oxygen-dependent degradation (Degradação Dependente de Oxigênio)
x
OMS Organização Mundial da Saúde
OR Odds ratio
p Probabilidade de erro
p16 Protein 16
p27 Protein 27
PBS Phophate Buffered Saline (Tampão Fosfato-Salino)
pH Potencial hidrogênico
PHD Prolyl-hydroxylase
Pro Resíduo de prolina
pVHL Von Hippel-Lindau protein
q Braço longo do cromossomo
Rb Retinoblastoma protein
TMA Tissue microarray
TNM Tamanho do tumor, Status linfonodal e metástase à distância
Tp53 Tumor protein 53
UICC União Internacional Contra o Câncer
VEGF Vascular Endothelial Cell Growth Factor
xi
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................... 1
1.1. Genética do carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço ......................... 3
1.2. Hipóxia e HIF1-alpha ................................................................................. 4
2. OBJETIVOS ........................................................................................................ 9
3. CASUÍSTICA E MÉTODOS .............................................................................. 11
3.1. Local de estudo ........................................................................................... 12
3.2. Casuística .................................................................................................... 12
3.3. Metodologia ................................................................................................ 16
3.3.1. Histologia ........................................................................................... 16
3.3.2. Tissue microarray (TMA) .................................................................. 17
3.3.3. Imuno-histoquímica ........................................................................... 18
3.3.4. Análise da expressão da proteína HIF1-alpha ................................... 19
3.3.5. Análise estatística .............................................................................. 21
4. ASPECTOS ÉTICOS .......................................................................................... 23
5. RESULTADOS ................................................................................................... 25
6. DISCUSSÃO ....................................................................................................... 36
7. CONCLUSÕES ................................................................................................... 44
8. ANEXOS ............................................................................................................. 46
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................ 49
FONTES CONSULTADAS .............................................................................. 64
RESUMO ........................................................................................................... 66
ABSTRACT ........................................................................................................ 68
APÊNDICES ..................................................................................................... 70
1
1. INTRODUÇÃO
2
O carcinoma de boca é uma causa significativa de morbidade e mortalidade em todo o
mundo, com aproximadamente 540.000 casos e 271.000 mortes anualmente com uma taxa de
mortalidade de 50%1, sendo frequentemente localizado na língua
2.
Em São Paulo, os tumores da boca representam aproximadamente 4,7% das doenças
malignas no homem e 1,2% nas mulheres. Classificado como 6º tipo de câncer mais comum
no mundo, ocorre principalmente em indivíduos entre a quinta e sétima décadas de vida3.
Segundo os dados do INCA, a incidência de tumores da boca é de 17,2/100.000 habitantes em
homens e 4,17/100.000 habitantes nas mulheres4. O carcinoma epidermóide é o tipo
histológico predominante, ocorrendo em mais de 90% dos casos5.
Do ponto de vista epidemiológico, sabe-se que existe uma associação entre o consumo
de tabaco e o aparecimento de tumores da boca. O risco de desenvolvimento do câncer de
boca é de cinco a nove vezes maior nos tabagistas do que em não tabagistas, mantendo
relação direta com a quantidade consumida6-7
. O uso do álcool também é fator de risco para o
desenvolvimento do câncer das vias aerodigestivas superiores e potencializa a ação do
tabaco2.
Além dos fatores de risco químicos, existe ainda a associação entre a condição
socioeconômica do paciente e o aparecimento do tumor, essa associação pode ser explicada
pela pobreza, alimentação deficiente e dificuldade de acesso ao serviço de saúde8-9
.
A maioria dos pacientes tem doença avançada no diagnóstico. A sobrevida tem relação
inversa com o estádio avançado do tumor, com idade avançada indicando pior prognóstico. A
presença de metástases linfáticas se relaciona com redução de 50% na expectativa de vida10-11
.
3
Por isso, o diagnóstico precoce é importante e a descoberta de marcadores moleculares
para a doença, assim como para seu prognóstico, é objetivo de estudo de muitos grupos de
pesquisa.
1.1. Genética do carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço
Slaughter e cols, estudando câncer bucal, utilizaram pela primeira vez o termo
cancerização de campo (field cancerization). Baseando-se em análises histológicas de tumores
de pacientes com câncer de cabeça e pescoço demonstrou que: a) o câncer de boca
desenvolve-se em áreas com lesões multifocais com alterações pré-cancerosas; b) um tecido
anormal circunda o foco tumoral; c) as múltiplas lesões são independentes; d) a permanência
do tecido anormal após a cirurgia pode explicar a recidiva do tumor.12-14
.
Fearon e Vogeltein demonstraram as bases moleculares do processo de tumorigênese
utilizando como modelo o carcinoma colorretal. Esse modelo propõe que um acúmulo de
alterações genéticas ao longo do tempo leva o tecido normal ao carcinoma invasivo, passando
por hiperplasia e displasia celular15
.
A maioria das alterações genéticas importantes no desenvolvimento do câncer ocorre
nos genes que controlam a proliferação celular (oncogenes e genes supressores de tumor), ou
ainda genes associados ao processo de reparo de danos no DNA, os quais, quando inativos,
podem levar ao aumento das taxas de mutação, causando eventualmente a alteração de genes
importantes na carcinogênese16-20
.
4
1.2. Hipóxia e HIF1-alpha
O sistema de resposta celular à condições de hipóxia é essencial para a progressão de
tumores sólidos21-22
, como por exemplo os tumores de mama, pulmão, ovário e bucal23-27
.
A hipóxia é encontrada na maioria dos tumores sólidos devido às alterações estruturais
e quantitativas nos vasos, levando a diminuição das concentrações de oxigênio28
. Contudo, a
hipóxia não é um mecanismo exclusivo da progressão tumoral29
, sendo também encontrada
durante o desenvolvimento embrionário30-32
e em doenças isquêmicas33-37
.
Para manter a homeostase do oxigênio, muitos organismos eucariotos adaptaram
evolutivamente um mecanismo especializado para reforçar a ingestão e distribuição do
oxigênio. Consequentemente, uma via responsiva dependente de oxigênio foi conservada e
presente em quase todas as células de mamíferos38-39
.
O complexo transcricional Hypoxia-inducible factor- 1 (HIF1) é o principal e crucial
mecanismo de regulação para a homeostase do oxigênio celular e sistêmico30,38,40-48
.
Quando ligado ao DNA genômico, o complexo HIF1 pode promover a transcrição de
mais de 60 genes que atuam em mecanismos específicos para evitar a morte celular causada
pela hipóxia. Por sua vez, as proteínas produzidas aumentam as concentrações de oxigênio
através da angiogênese49
, além de enzimas do transporte de glicose e metabolismo27,47
.
O complexo HIF1 é um fator de transcrição composto por uma subunidade -alpha e
uma subunidade -beta também conhecida como aryl hydrocarbon receptor nuclear
translocator (ARNT), ambas pertencem a família de proteínas basic helix-loop-helix-Per-
ARNT-Sim (bHLH-PAS)50-51
.
5
A subunidade HIF1-beta é expressa constantemente e seu mRNA e proteína são
mantidos em níveis constantes independente das condições de oxigênio52
. Por outro lado, a
proteína HIF1-alpha tem uma meia vida curta (~5 minutos) e é regulada de acordo com o teor
de oxigênio53
.
Assim como as proteínas da família bHLH-PAS, a subunidade HIF1-alpha possui os
dois domínios bHLH e PAS, necessários para a heterodimerização com a subunidade HIF1-
beta54
(Figura 1). Mais dois domínios presentes na HIF1-alpha, o N-terminal (N-TAD) e o C-
terminal (C-TAD), localizados nas porções C-terminal e mediana da proteína55
. Lando e cols.
verificou o C-TAD atuando na ativação da transcrição gênica, como por exemplo, interagindo
com coativador transcricional CBP/p30056
.
Outro importante domínio presente na subunidade HIF1-alpha é o Oxygen-regulated
degradation (ODD – Degradação regulada por oxigênio), que media sua estabilidade de
acordo com a disponibilidade de oxigênio57
.
FIGURA 1 – Estrutura da proteína HIF1-alpha e os domínios presentes ao longo de sua cadeia. Os domínios
bHLH e PAS possibilitam a heterodimerização com a subunidade -beta. O domínio ODD contém dois resíduos
de prolina (P) e a lisina (K) que podem mediar a degradação da subunidade HIF1-alpha. O domínio N-TAD no
ODD e o C-TAD no C-terminal. A cadeia polipeptídica da subunidade HIF1-alpha totaliza 826 aminoácidos58.
A transcrição e síntese protéica da HIF1-alpha são constitutivas e particularmente não
são afetadas pelo teor de oxigênio50,52,59-61
. Contudo, sob condições de normóxia, a HIF1-
alpha é rapidamente degradada quando detectada50
.
6
A degradação da HIF1-alpha é regulada por modificações pós-traducionais, como a
hidroxilação, acetilação e ubiquitinação do domínio ODD62,63
.
Sob condições de hipóxia, a subunidade HIF1-alpha é estabilizada e traslocada do
citoplasma para o núcleo, onde dimeriza com a subunidade HIF1-beta, formando o complexo
HIF1 trascripcionalmente ativo (Figura 2)47,52,64
.
Transcrição
HIF 1
P
PHIF 1 HIF 1
Membrana Nuclear
HIF 1
P
P
HIF 1
P
P
DNA
HIF 1
FIGURA 2 – Esquema ilustrativo do comportamento da proteína HIF1-alpha sob hipóxia. Sob condição de
hipóxia, a subunidade HIF1-alpha não é hidroxilada. Isso permite que ela entre no núcleo, onde se liga à
subunidade HIF1-beta, formando a proteína HIF1. Quando formado, o heterodímero se liga ao DNA onde inicia
a transcrição de genes que favorecerão a sobrevida da célula.
7
Sob condições normais de oxigênio, a HIF1-alpha é rapidamente hidroxilada pela
proteína Prolyl Hydroxylation (PHD) em seu domínio ODD45-46,65-69
. Em seguida, a proteína
von Hippel-Lindau (pVHL) reconhece a hidroxilação adicionando ubiquitina, marcando-a
para a degradação proteossomal (Figura 3)44,53,70-75
.
OH
OHP HD
HIF 1
P
P
Membrana Nuclear
OH
OH
HIF 1
P
PpVHL
pVHL
OH
OH
HIF 1
P
P
Degradação P roteos s omal
FIGURA 3 – Esquema ilustrativo do comportamento da proteína HIF1-alpha sob normóxia. Na presença de
oxigênio intracelular, as proteínas PHDs hidroxilam dois resíduos de prolina, Pro402 e Pro564, presentes no
domínio ODD da proteína HIF1-alpha. A proteína pVHL reconhece a HIF1-alpha hidroxilizada e a encaminha
para a degradação através do proteossomo 26S.
A degradação da HIF1-alpha também pode ser dada através da acetilação pela proteína
Acetyltransferase Arrest-defective-1 (ARD1), no resíduo de lisina 532 (Lys532) localizado no
domínio ODD, e consequente ubiquitinação e degradação proteossomal46,65,76
.
Entre os genes regulados pela HIF1 importantes para o processo tumorigênico estão os
fatores angiogênicos, de proliferação celular, transportadores de glicose, enzimas glicolíticas
anaerobióticas47,77-78
.
8
O aumento da densidade vascular, a permeabilidade tecidual e, consequente
diminuição da distância para a difusão do oxigênio são resultados da angiogênese79
. É
provável que a HIF1 também contribua para a angiogênese através de mecanismo mais
complexos, recrutando genes envolvidos na maturação dos vasos74
.
A expressão da HIF1-alpha foi observada em vários tipos de tumor, tais como renal80
,
bexiga81
, colorretal82
, mama83-84
, ovário85
e cérvix uterino86-87
, estando frequentemente
associada à carcinogênese, prognóstico e sobrevida dos pacientes.
No carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço, os trabalhos referem a expressão
HIF1-alpha associada à carcinogênese, fatores prognósticos e sobrevida88-94
. Contudo, os
trabalhos apresentam a expressão fraca associada com a pior sobrevida89,95
, enquanto que em
outros a pior sobrevida está associada à expressão forte88,96-97
, não existindo consenso entre os
grupos de pesquisas.
Adicionalmente, a expressão HIF1-alpha também foi associada com a resistência da
doença à quimioterapia e radioterapia28,98-100
.
De acordo com Silva e cols, os marcadores de hipóxia, como a proteína HIF1-alpha,
pode auxiliar na estratificação dos pacientes em categorias, qualificando facilitando identificar
a modalidade terapêutica mais adequada, assim como predizer o prognóstico com maior
precisão101
.
A busca de marcadores moleculares no carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço
tem sido o objetivo de nosso grupo, já que apesar do desenvolvimento nas técnicas cirúrgicas,
novas drogas e da biologia molecular, o prognóstico e a sobrevida dos pacientes com esse tipo
de tumor foi pouco alterada.
9
2. OBJETIVOS
10
Avaliar a expressão da proteína HIF1-alpha em pacientes com carcinoma epidermóide
de andar inferior da boca correlacionando-a com a resposta clínica ao tratamento e
prognóstico quanto à recidiva local, regional e tempo livre de doença.
11
3. CASUÍSTICA E MÉTODOS
12
3.1. Local de estudo
Este trabalho está inserido no projeto Genoma Clínico do Câncer de Cabeça e Pescoço
(Processo FAPESP no. 04/12054-9) e foi desenvolvida no Laboratório de Biologia Molecular
do Hospital Heliópolis e no Serviço de Anatomia Patológica do Hospital Heliópolis. Somada
a colaboração do Serviço de Cirurgia de Cabeça e Pescoço da Santa Casa de São Paulo.
3.2. Casuística
Foram estudados 66 pacientes com carcinoma epidermóide de andar inferior da boca,
tratados cirurgicamente no Departamento de Cirurgia de Cabeça e Pescoço do Hospital
Heliópolis, dentre o período de Janeiro de 2002 a Dezembro de 2005. Todos os casos têm
confirmação histológica do diagnóstico e o seguimento mínimo de 24 meses a partir do
tratamento inicial, realizado de acordo com a rotina estabelecida pelo serviço.
Para a uniformidade da casuística, foram excluídos os casos com tratamento prévio à
cirurgia ou com metástase à distância. Devido à etiologia diferenciada, os casos de neoplasias
de lábio foram excluídos, assim como os tumores de andar superior da boca. Além disso,
foram retirados os casos sem informações relevantes para o estudo ou representatividade das
amostras para a análise histopatológica e imuno-histoquímica. Também foram excluídos os
casos não submetidos ao esvaziamento de linfonodos cervicais ou que apresentaram margens
tumorais positivas.
13
De acordo com o serviço, a indicação de tratamento radioterápico pós-operatório
inclui casos com tumores com invasão de outras estruturas vizinhas e/ou a presença de
linfonodos cervicais acometidos pelo tumor. Os casos em que o tratamento radioterápico pós-
operatório foi descontinuado também foram excluídos.
Segundo a classificação do Código Internacional de Doenças (CID-10), os casos
somados no presente trabalho incluem carcinomas epidermóide de língua, gengiva inferior,
soalho de boca e área retromolar, conforme discriminada sua frequência na tabela 1.
TABELA 1 – Distribuição dos casos com carcinoma epidermóide de andar inferior da boca
em relação ao sítio acometido pela neoplasia.
Sítio acometido Total
Frequência (%)
C.02 – Língua 26 (39,4)
C.03 – Gengiva inferior 12 (18,2)
C.04 – Soalho de boca 22 (33,3)
C.06 – Área retromolar 6 (9,1)
Total 66 (100,0)
Os dados relacionados aos pacientes e à patologia em questão, como a classificação do
sistema TNM102
, foram obtidos a partir dos registros depositados no banco de dados do
Genoma Clínico do Câncer de Cabeça e Pescoço, armazenado online no endereço
<http://www.compbio.ludwig.org.br/clinicalgenomics/>.
Do ponto de vista epidemiológico, 85% dos casos são do sexo masculino, com a
proporção de seis homens para cada mulher. A idade dos pacientes variou de 34 a 81 anos,
com média de idade de 55 anos e o desvio padrão em ±11 anos. O hábito tabagista e etilista,
considerado positivo quando consumidos por pelo menos um ano, estão presentes na maior
parte da casuística (Tabela 2).
14
TABELA 2 – Distribuição da frequência dos casos em relação às características
epidemiológicas.
Características epidemiológicas Total
Frequência (%)
Gênero
Feminino 10 (15,2)
Masculino 56 (84,8)
Faixa etária
≤ 55 anos 33 (50,0)
> 55 anos 33 (50,0)
Hábito tabagista
Não 3 (4,5)
Sim 63 (95,5)
Hábito etilista
Não 10 (15,2)
Sim 56 (84,8)
Total 66 (100,0)
Características clinicopatológicas têm confirmação do exame anatomopatológico e
segue a classificação do sistema TNM102
. A frequência de casos com linfonodo acometido e
do tamanho do tumor, classificado em tumores iniciais (≤ pT2), medianos (pT3) e avançados
(pT4), estão sumarizados na tabela 3.
TABELA 3 – Distribuição dos casos segundo o tamanho do tumor e linfonodo acometido.
Características clinicopatológicas Total
Frequência (%)
Tamanho do tumor
≤ pT2 27 (40,9)
pT3 13 (19,7)
pT4 26 (39,4)
Linfonodo acometido
Ausente 30 (45,5)
Presente 36 (54,5)
Total 66 (100,0)
Os casos submetidos à radioterapia pós-operatória somam 33 (50%) da casuística,
enquanto os outros 33 foram tratados somente com a cirurgia.
15
Com relação às características histopatológicas, 8% dos casos eram pouco
diferenciados. A presença de embolização linfática e invasão perineural foi evidente em 68%
e 53% dos casos, respectivamente. O infiltrado inflamatório peritumoral esteve escasso em 24
(36%), e intenso em 13 casos (20%). A presença de necrose foi detectada em 54 (82%) casos.
A desmoplasia classificada como leve, moderada ou intensa, contou com 32 (49%), 20 (30%)
e 14 (21%) casos respectivamente (Tabela 4).
TABELA 4 – Distribuição dos casos com relação aos critérios histopatológicos revisados.
Características histopatológicas Total
Frequência (%)
Grau de diferenciação
Bem diferenciado 30 (45,5)
Moderadamente 31 (47,0)
Pouco diferenciado 5 (7,6)
Embolização linfática
Ausente 21 (31,8)
Presente 45 (68,2)
Invasão perineural
Ausente 31 (47,0)
Presente 35 (53,0)
Infiltrado inflamatório peritumoral
Escasso 24 (36,4)
Moderado 29 (43,9)
Intenso 13 (19,7)
Necrose
Ausente 12 (18,2)
Presente 54 (81,8)
Desmoplasia
Leve 32 (48,5)
Moderada 20 (30,3)
Intensa 14 (21,2)
Total 66 (100,0)
O trabalho de seguimento dos pacientes verificou que do total de 66 indivíduos
estudados, 27 (41,0%) foram a óbito devido à neoplasia e 3 (4,5%) por outras causas que não
pela neoplasia.
16
Entre os indivíduos estudados houve recidiva da doença local em 23 (34,8%) e
regional em 14 (21,2%) casos. A doença residual após o tratamento foi verificada em 6
(9,1%) casos (Tabela 5).
TABELA 5 – Caracterização dos casos com relação ao status de sobrevida e recidiva local e
regional.
Características prognósticas Total
Frequência (%)
Status de sobrevida
Óbito pelo câncer 27 (41,0)
Vivo 36 (54,5)
Óbito por outras causas 3 (4,5)
Recidiva local
Não 37 (56,1)
Sim 23 (34,8)
Recidiva regional
Não 46 (69,7)
Sim 14 (21,2)
Residual 6 (9,1)
Total 66 (100,0)
3.3. Metodologia
O material utilizado nesse trabalho inclui 66 amostras de tecido tumoral e 35 tecidos
adjacentes não tumorais, proveniente de blocos parafinizados dos pacientes operados com
carcinoma epidermóide de andar inferior de boca.
3.3.1. Histologia
A partir de lâminas convencionais coradas com hematoxilina eosina (HE), os casos
foram revisados e reclassificados por uma patologista do Serviço de Anatomia Patológica do
Hospital Heliópolis (AMCM), segundo os critérios de classificação de Broders103
.
17
O grau de diferenciação histológico foi categorizado em três classes: bem
diferenciado, moderadamente e pouco diferenciado. Características como a embolização
linfática, invasão perineural e necrose foram avaliadas quanto a sua presença no tecido
tumoral. O infiltrado inflamatório peritumoral e a desmoplasia foram avaliados de acordo com
sua intensidade, sendo categorizados em três graus: escasso (leve), moderado ou intenso.
3.3.2 Tissue microarray (TMA)
O Serviço de Anatomia Patológica do Hospital Heliópolis viabilizou a montagem de
um tissue microarray (TMA), no qual foram inseridos os casos de carcinoma epidermóide de
andar inferior de boca, tratados dentre o período de Janeiro de 2002 a Dezembro de 2005.
Após a revisão das lâminas pela coloração de HE dos blocos selecionados, estas foram
analisadas e duas áreas foram delimitadas com caneta apropriada para marcação, foram
marcadas áreas representativas do tumor. Posteriormente, foram delimitadas as áreas nos
blocos de parafina, chamados de blocos doadores.
Dos blocos doadores foram retirados fragmentos cilíndricos de 1mm e estes
acondicionados em outro bloco chamado de bloco receptor. Cada bloco doador foi
representado em duplicata no bloco receptor. Esta etapa foi realiza em um aparelho preciso de
Tissue Arrayer da marca Beecher Instruments® (Silver Spring MD), no Departamento de
Anatomia Patológica do Hospital do Câncer São Paulo, ilustrado na figura 4. Os casos foram
previamente dispostos em ordem numérica crescente de acordo com o registro de prontuário
do Serviço de Cirurgia de Cabeça e Pescoço do Hospital Heliópolis, amostrados em duplicata
e mapeados.
18
FIGURA 4 – Fotos do aparelho Tissue Arrayer da marca Beecher Instruments® (Silver Spring MD). Visto em
dois ângulos diferentes, o aparelho utilizado para confecção do tissue microarray, pertencente ao Departamento
de Anatomia Patológica do Hospital do Câncer São Paulo.
Em seguida esses blocos foram levados ao micrótomo de parafina e obtidos cortes
histológicos sequenciais de 3μm que foram dispostos em lâminas com adesivos da marca
Microsystems Inc®.
As lâminas de TMA foram desparafinadas, desidratadas e feitos cortes histológicos a
cada 9 níveis diferentes e corados pela HE. Posteriormente foram selecionadas duas lâminas
de cada bloco para cada anticorpo para serem submetidas às reações de imuno-
histoquímica104-106
.
3.3.3 Imuno-histoquímica
Uma vez selecionados os casos e construído o bloco de TMA dos blocos de tumores e
selecionados blocos das margens o painel imuno-histoquímico foi completado, realizando-se
reações para o anticorpo anti-HIF1-alpha. O anticorpo anti-HIF1-alpha utilizado tem como
epítopo o C-terminal e foi diluído em 1/150 (Millipore Corporation®, código 07-628).
19
As reações de imuno-histoquímica foram realizadas pela técnica de complexo
estreptavidina-biotina-peroxidase (StreptABC, DAKO®). Foi realizado um controle positivo
e três controles negativos, sendo o primeiro sem anticorpo primário, o segundo sem anticorpo
secundário e o terceiro sem revelação, em todos foram utilizados amostras com a expressão da
HIF1-alpha previamente conhecida em tumor de mama.
Após a hidratação do tecido em álcool com progressiva graduação, seguiu-se a
inibição da peroxidase endógena utilizando o tratamento com peróxido de hidrogênio a 3%
durante 10 minutos. Após lavagem em PBS, as lâminas foram imersas em ácido cítrico (pH
6,0) e aquecidas em panela a vapor a 90ºC por 30 minutos.
O anticorpo primário foi diluído em PBS/1%BSA, sendo incubado durante 60
minutos. Após nova lavagem com PBS, as lâminas foram incubadas com o anticorpo
secundário (biotinyted link universal). A revelação empregou a 3,3'-diaminobenzidina, contra
corado por hematoxilina de Mayer (DAB, Sigma®).
Ao final de todo processo, foi fixada a lamínula utilizando resina. Em seguida, a
lâmina foi observada no microscópio óptico.
3.3.4 Análise da expressão da proteína HIF1-alpha
Como cada lâmina do TMA possui dois spots de tecido tumoral em duplicata do
mesmo paciente, foi calculada a média do resultado das análises. As margens tumorais foram
analisadas em cortes histológicos convencionais.
A análise semiquantitativa da expressão da proteína HIF1-alpha foi realizada através
da microscopia ótica, considerando o número de células marcadas e a intensidade de
marcação, seguindo a metodologia aplicada no trabalho de Soini e cols.107
, modificada por
Campos e cols.108
.
20
A Intensidade da marcação pode ser subdividida em quatro graus com a classificação
apresentada no quadro 1.
QUADRO 1 – Gradação da reação imuno-histoquímica de acordo com a intensidade.
Descrição da intensidade da coloração Grau
Negativa 0
Fraca 1
Moderada 2
Forte 3
Quanto à frequência, foi dividida em três graus com a seguinte classificação
apresentada no quadro 2. Após cálculo do escore final nas quatro observações, foi calculada a
média entre eles.
QUADRO 2 – Gradação da reação imuno-histoquímica segundo porcentual de células
coradas.
Frequência de células coradas Grau
< 10% 1
10% ≤ 50% 2
> 50% 3
A categorização dos resultados foi feita calculando um escore a partir da multiplicação
dos valores relativos à intensidade da coloração e o número de células coradas. Após o
cálculo do escore final, foi calculada a média entre eles. A categorização final dos escores foi
comparada às amostras coradas com o anticorpo HIF1-alpha a fim de comprovar a coerência
da classificação, quanto sua coerência, conforme apresentado no quadro 3. As fotos da
microscopia ótica estão disponíveis para consulta na sessão de anexos.
21
QUADRO 3 – Interpretação da média calculada nas observações dos “spots” de cada paciente
do TMA.
Média final do escore Categorização
≤ 1 Negativo
1 a 6 Positivo fraco
> 6 Positivo forte
3.3.5. Análise estatística
A margem de erro estipulada em menor que 5% foi adotada para confirmar a
associação testada em nível matemático, de acordo com o teste de significância de Lilliefors
(significância de p<0,05).
Para os testes de associação foram utilizados o teste Qui-quadrado em análise
bivariada e, quando necessário, o teste exato de Fisher.
A regressão logística multivariada foi utilizada para ajustar os valores do odds ratio
(OR) e o intervalo de confiança (IC 95%). Para este teste, foram selecionadas as variáveis que
apresentaram o valor de p<0,20 quando testada diante a característica em questão, em análise
bivariada.
A comparação da positividade e perfil da expressão da proteína HIF1-alpha, entre as
amostras de tecidos tumorais e adjacentes não tumorais, foi avaliada somente nos casos com
resultados imuno-histoquímicos em ambos os tecidos.
Para a análise da sobrevida foi calculado o intervalo de tempo (em meses) entre as
datas de cirurgia e óbito de cada paciente, ou do último retorno nos casos sobreviventes.
Entretanto, o intervalo de tempo para as análises de sobrevidas livre de doença local e livre de
doença regional foi calculado utilizando como ponto final as datas de recidiva local e recidiva
regional, respectivamente, ou a data do último retorno nos casos assintomáticos. As curvas de
sobrevidas foram avaliadas segundo o modelo Kaplan-Meier e o valor de p de Wilcoxon.
22
Posteriormente, o modelo Cox Proportional Hazards foi utilizado para a análise multivariada
considerando as variáveis com p<0,20.
Os cálculos matemáticos foram realizados com a utilização dos programas Epi Info®
v 3.4.3, 2007 e o Statsoft Statistica v7.0.61.0.
23
4. ASPECTOS ÉTICOS
24
Este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) do Hospital
Heliópolis em 10 de Junho de 2008, sob o número 619 e é subprojeto do Projeto Genoma
Clínico do Câncer de Cabeça e Pescoço (Processo FAPESP no. 04/12054-9), também
aprovado pelo CEP do Hospital Heliópolis sob o número 386 aprovado em 15 de abril de
2005.
O material utilizado para a realização do estudo consistiu de tecido parafinizado que
foi coletado e armazenado regularmente após o ato cirúrgico pelo Serviço de Anatomia
Patológica.
Os participantes do estudo assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido do
Projeto Genoma Clínico do Câncer de Cabeça e Pescoço e muitos foram a óbito dada a
agressividade da doença.
Os resultados obtidos desse trabalho foram enviados à publicação em revista
científica, garantindo o sigilo e respeito a confidencialidade dos indivíduos envolvidos no
trabalho.
25
5. RESULTADOS
26
A análise microscópica revelou a positividade da expressão da proteína HIF1-alpha
em todas as amostras de tumores (66 casos). A expressão fraca foi verificada em 34 (51,5%)
amostras e a forte em 32 (48,5%).
A mesma avaliação nos tecidos adjacentes não tumorais mostrou positividade em 32
(91,4%) do total de 35 amostras avaliadas, sendo fraca em 25 (78,1%) casos e forte em 7
(21,9%). As amostras de tecidos tumorais correspondentes aos adjacentes não tumorais
positivos apresentaram a expressão fraca em 19 (59,4%) dos casos e forte nos outros 13
(40,6%) (Tabela 6). A análise estatística não mostrou diferenças entre as amostras de tecidos
tumorais e não tumorais quanto à positividade (p=0,239) e o perfil da expressão da proteína
HIF1-alpha (p=0,177), conforme descrito na tabela 6.
TABELA 6 – Análise comparativa entre as amostras de tecido tumoral e não tumoral,
segundo o perfil da expressão da proteína HIF1-alpha.
Expressão HIF1-alpha
Amostra de tecido
Tumor Não tumoral p value
Frequência (%) Frequência (%)
Negativo 0 (0,0) 3 (8,6) 0,239
Positivo 35 (100,0) 32 (91,4)
Fraca 19 (59,4) 25 (78,1) 0,177
Forte 13 (40,6) 7 (21,9)
A expressão da proteína HIF1-alpha nos tecidos tumorais não mostrou associação com
o tamanho do tumor (p=0,284) e a presença de linfonodos acometidos (p=0,787), conforme
apresentado na tabela 7.
27
A frequência da expressão fraca da proteína HIF1-alpha foi maior nos casos bem
diferenciados, entretanto sem significância estatística. A expressão da proteína HIF1-alpha
não foi associada com a presença de êmbolos linfáticos (p=0,923), invasão perineural
(p=0,611), necrose (p=0,420) e intensidade do infiltrado inflamatório peritumoral (p=0,235).
O grau de desmoplasia tecidual apresentou-se com maior frequência da expressão
fraca da HIF1-alpha nos casos com grau leve, porém, sem significância estatística (p=0,066)
(Tabela 7).
TABELA 7 – Análise da associação entre a expressão da proteína HIF1-alpha e as
características histopatológicas do tumor.
Características histopatológicas
Expressão HIF1-alpha
Fraca Forte p value
Frequência (%) Frequência (%)
Tamanho do tumor (pT)
≤ pT2 14 (41,2) 13 (40,6)
0,284 pT3 9 (26,5) 4 (12,5)
pT4 11 (32,4) 15 (46,9)
Linfonodo acometido
Ausente 16 (47,1) 14 (43,8) 0,787
Presente 18 (52,9) 18 (56,3)
Grau de diferenciação
Bem diferenciado 20 (58,8) 10 (31,3)
0,079 Moderadamente 12 (35,3) 19 (59,4)
Pouco diferenciado 2 (5,9) 3 (9,4)
Embolização linfática
Ausente 11 (32,4) 10 (31,3) 0,923
Presente 23 (67,6) 22 (68,8)
Invasão perineural
Ausente 17 (50,0) 14 (43,8) 0,611
Presente 17 (50,0) 18 (56,3)
Infiltrado inflamatório peritumoral
Escasso 13 (38,2) 11 (34,4)
0,235 Moderado 12 (35,3) 17 (53,1)
Intenso 9 (26,5) 4 (12,5)
Necrose
Ausente 7 (20,6) 5 (15,6) 0,420
Presente 27 (79,4) 27 (84,4)
Desmoplasia
Leve 19 (55,9) 13 (40,6)
0,066 Moderada 6 (17,6) 14 (43,8)
Intensa 9 (26,5) 5 (15,6)
Total 34 (51,5) 32 (48,5)
28
Conforme apresentado na tabela 8, a frequência da expressão forte da proteína HIF1-
alpha, apesar de maior nos casos vivos, não mostrou associação estatística (p=0,094).
Não houve associação entre a expressão da proteína HIF1-alpha e recidiva regional da
doença (p=0,348). Entretanto, a expressão forte foi mais frequente nos casos que não
recidivaram localmente, apresentando significância estatística com a recidiva local da doença
(p=0,002) (Tabela 8).
TABELA 8 – Análise da associação entre a expressão da proteína HIF1-alpha e o status de
sobrevida, recidiva local e regional.
Características prognósticas
Expressão HIF1-alpha
Fraca Forte p value
Frequência (%) Frequência (%)
Status de sobrevida
Vivo 15 (46,9) 21 (67,7) 0,094
Óbito 17 (53,1) 10 (32,3)
Recidiva local
Não 14 (43,7) 23 (82,1) 0,002
Sim 18 (56,3) 5 (17,9)
Recidiva regional
Não 23 (71,9) 23 (82,1) 0,264
Sim 9 (28,1) 5 (17,9)
A análise multivariada apontou a expressão fraca da proteína HIF1-alpha como um
fator independente para a recidiva local representando um aumento no risco em mais de sete
vezes (OR 7,59), conforme descrito na tabela 9.
TABELA 9 – Análise da associação entre o perfil da expressão da proteína HIF1-alpha e o
risco de ocorrência de recidiva local.
Expressão HIF1-alpha Recidiva local
OR (IC 95%) a p value
b
Forte 1
Fraca 7,59 (1,94 - 29,75) 0,003 a, b – Valores ajustados por tamanho do tumor e radioterapia pós-operatória.
29
Conforme apresentado na figura 5, o tempo de sobrevida dos casos com expressão
fraca da proteína HIF1-alpha foi menor quando comparados aos casos que tinham a expressão
forte. Contudo essa associação não apresentou significância (p=0,185).
Curva de sobrevida
Expressão HIF1-alpha: Fraca Forte
0 6 12 18 24 30 36 42 48
Mouths
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Cum
ula
tive P
roport
ion S
urv
ivin
g
p = 0,185
FIGURA 5 – Gráfico da curva de sobrevida segundo o perfil de expressão da proteína HIF1-alpha.
30
A expressão fraca da proteína HIF1-alpha foi associada com a precocidade da
ocorrência de recidiva local (p=0,013), conforme demonstrado na figura 6. Segundo a curva
de sobrevida livre da doença local, no período de 12 meses após o tratamento inicial, pouco
mais de 10% dos casos com a expressão forte da proteína HIF1-alpha recidivaram localmente,
enquanto que metade dos casos com a expressão fraca já havia recidivado.
Curva de sobrevida livre de doença local
Expressão HIF1-alpha: Fraca Forte
0 6 12 18 24 30 36 42 48
Mouths
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Cum
ula
tive P
roport
ion S
urv
ivin
g
p = 0,013
FIGURA 6 – Gráfico da curva de sobrevida de doença local segundo o perfil de expressão da proteína HIF1-
alpha.
A análise multivariada mostrou que a expressão da proteína HIF1-alpha é um fator
independente de risco para a ocorrência de recidiva local, sendo sua expressão fraca o motivo
para o aumento de três vezes (OR 3,22) para essa recidiva em relação à expressão forte
(Tabela 10).
31
Tabela 10 – Análise da associação entre o perfil da expressão da proteína HIF1-alpha e o risco
proporcional aumentado de ocorrência precoce da recidiva local.
Expressão HIF1-alpha Sobrevida livre de doença local
HR (IC 95%) a p value
b
Forte 1
Fraca 3,22 (1,16 – 8,93) 0,024 a, b – Valores ajustados por tamanho do tumor e radioterapia pós-operatória.
Segundo o gráfico da curva de sobrevida livre de doença regional (Figura 7), o grupo
de casos com a expressão forte da proteína HIF1-alpha mostra que a recidiva regional da
doença ocorre num período mais tardio que nos casos com a expressão fraca, porém sem
associação estatística (p=0,267).
Curva de sobrevida livre de doença regional
Expressão HIF1-alpha: Fraca Forte
0 6 12 18 24 30 36 42 48
Mouths
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Cum
ula
tive P
roport
ion S
urv
ivin
g
p = 0,267
FIGURA 7 – Gráfico da curva de sobrevida livre de doença regional segundo o perfil de expressão da proteína
HIF1-alpha.
32
A avaliação dos casos segundo a forma de tratamento (operados não-irradiados e
operados irradiados) mostrou que nos casos submetidos à radioterapia pós-operatória, a
expressão fraca da proteína HIF1-alpha foi associada com pior sobrevida, oferecendo um
aumento no risco de óbito de seis vezes (OR 6,13) em relação aos casos com expressão forte
(p=0,031). Nos casos tratados apenas com a cirurgia não houve associação com o óbito na
expressão forte ou fraca da proteína (p=0,366) (Tabela 11).
TABELA 11 – Análise do risco de óbito pela doença, de acordo com o tipo de tratamento
submetido, segundo a expressão da proteína HIF1-alpha.
Expressão HIF1-alpha
Status de sobrevida
Irradiados pós-cirurgicos Não irradiados
OR (IC 95%) a p value
b OR (IC 95%)
c p value
d
Forte 1 1
Fraca 6,13 (1,18 - 31,94) 0,031 2,29 (0,37 - 13,95) 0,366 a, b, c, d – Valores ajustados por tamanho do tumor.
Conforme demonstrado na tabela 12, o risco para a recidiva local é maior nos casos
com a expressão fraca da proteína HIF1-alpha, independente do tratamento ao que os doentes
foram submetidos (p=0,038 nos operados e irradiados; p=0,039 nos operados não-irradiados)
com risco aumentado em mais de 11 vezes tanto nos operados e irradiados (OR 11,47) quanto
nos operados não-irradiados (OR 11,48).
TABELA 12 – Análise do risco para a ocorrência de recidiva local, de acordo com o tipo de
tratamento submetido, segundo a expressão da proteína HIF1-alpha.
Expressão HIF1-alpha
Recidiva local
Irradiados pós-cirurgicos Não-irradiados
OR (IC 95%) a p value
b OR (IC 95%)
c P value
d
Forte 1 1
Fraca 11,47 (1,15 - 114,91) 0,038 11,48 (1,13 - 116,78) 0,039 a, b, c, d – Valores ajustados por tamanho do tumor.
33
Quando a ocorrência de recidiva regional foi testada em análise bivariada, a expressão
da proteína HIF1-alpha não apresentou associação com a recidiva regional da doença, tanto
nos casos tratados somente com a cirurgia (p=0,514), quanto nos tratados com a radioterapia
pós-operatória (p=0,325).
Nos casos tratados apenas com cirurgia, a proteína HIF1-alpha não mostrou associação
com o tempo de sobrevida (p=0,700) (Figura 8B). Nos casos que foram submetidos à
radioterapia pós-operatória, a expressão fraca mostrou-se associada com a menor sobrevida
(p=0,015), como apresentado na figura 8A, metade dos casos com expressão fraca morreu nos
primeiros 12 meses após o tratamento inicial, enquanto que menos de 10% dos casos com a
expressão forte morreu no mesmo período.
FIGURA 8 – Gráfico da curva de sobrevida, segundo a expressão da proteína HIF1-alpha e a modalidade
terapêutica submetida. A) Casos submetidos à radioterapia pós-operatória; B) Casos tratados com cirurgia.
A análise multivariada revelou que a expressão da proteína HIF1-alpha é um fator
independente associado com diminuição no tempo de sobrevida dos casos que foram
irradiados após a cirurgia, oferecendo um risco de óbito aumentado de três vezes (OR 3,41),
em relação aos casos com a expressão forte (Tabela 13).
34
TABELA 13 – Análise do risco proporcional para a diminuição do tempo de sobrevida pela
doença, segundo a expressão da proteína HIF1-alpha, nos casos submetidos à radioterapia
pós-operatória.
Expressão HIF1-alpha Sobrevida doença específica
HR (IC 95%) a p value
b
Forte 1
Fraca 3,41 (1,13 - 10,34) 0,029 a, b – Valores ajustados por tamanho do tumor.
Nos casos tratados apenas com cirurgia, a expressão da proteína HIF1-alpha não foi
associada com a sobrevida livre de doença local (p=0,391) (Figura 9B). Nos casos submetidos
à radioterapia pós-operatória, a expressão fraca da proteína HIF1-alpha foi associada com o
menor tempo da recidiva local (p=0,005). Conforme apresentado na figura 9A, nos primeiros
12 meses após o tratamento inicial, aproximadamente metade dos casos com expressão fraca
da proteína HIF1-alpha apresentou recidiva local da doença, enquanto que em nenhum caso
com expressão forte houve recidiva local no mesmo período.
FIGURA 9 – Gráfico da curva de sobrevida livre de doença local, segundo o perfil de expressão da proteína
HIF1-alpha e a modalidade terapêutica submetida. A) Casos submetidos à radioterapia pós-operatória; B) Casos
tratados com cirurgia.
35
A expressão fraca da proteína HIF1-alpha, nos casos irradiados após a cirurgia, é um
fator independente para a diminuição no tempo de recidiva local, aumentando o risco em dez
vezes (OR 10,20), quando comparado aos casos com expressão forte (Tabela 14).
TABELA 14 – Análise do risco proporcional para a diminuição do tempo de recidiva local,
segundo a expressão da proteína HIF1-alpha, nos casos submetidos à radioterapia pós-
operatória.
Expressão HIF1-alpha Sobrevida livre da doença local
HR (IC 95%) a p value
b
Forte 1
Fraca 10,20 (1,19 – 87,53) 0,034 a, b
– Valores ajustados por tamanho do tumor.
Analisando a expressão da proteína HIF1-alpha nos casos tratados apenas com a
cirurgia, não houve associação com o tempo de recidiva regional da doença (p=0,930) (Figura
10B). Nos casos irradiados após a cirurgia, a expressão da HIF1-alpha não foi associada
significantemente com a sobrevida livre de doença regional (p=0,056) (Figura 10A).
FIGURA 10 – Gráfico da curva de sobrevida livre de doença regional, segundo o perfil de expressão da proteína
HIF1-alpha e a modalidade terapêutica submetida. A) Casos submetidos à radioterapia pós-operatória; B) Casos
tratados com cirurgia.
36
6. DISCUSSÃO
37
No presente trabalho, observamos a expressão da proteína HIF1-alpha presente em
todas as amostras de tecido tumoral, em acordo com os resultados obtidos em outros tipos
tumorais, como o renal80
, bexiga81
, colorretal82
, mama83-84,109
, ovário85
, endométrio110
, cérvix
uterino86-87,111-112
e cabeça e pescoço86,89-93
.
Não foram observadas diferenças na expressão da proteína HIF1-alpha, entre as
amostras de tecido tumoral e adjacente não tumoral (positividade HIF1-alpha p=0,239; perfil
da expressão p=0,177). Entretanto, Yu e cols.113
relataram a associação da presença da
expressão da proteína HIF1-alpha com o processo tumorigênico, analisada através da imuno-
histoquímica em amostras de carcinoma colorretal. Em 2008, Lin e cols.96
publicaram
resultados semelhantes, porém, em carcinoma epidermóide de boca.
A homogeneidade da expressão da proteína HIF1-alpha, presenciada em nossos
resultados, pode ser consequência do aumento na pressão intersticial causada pelo
crescimento tumoral, podendo interromper parcialmente o fluxo sanguíneo dos tecidos
vizinhos. É possível que ambos tecidos estivessem sob hipóxia, porém em graus diferentes.
Assim como pode ser observada, a maioria das amostras de tecido não tumoral apresentaram
expressão fraca da proteína HIF1-alpha, podendo ser devido a condições hipóxicas mais leve
que as do tecido tumoral.
A correlação entre a expressão da proteína HIF1-alpha e o grau de diferenciação não
foi estatisticamente significante (p=0,079), podendo ser devido ao pequeno número de casos
com pouca diferenciação celular (5 casos). Conforme observado, a expressão fraca esteve
mais frequente nas amostras tumorais bem diferenciadas. Segundo descrito por outros grupos,
38
a expressão da proteína HIF1-alpha estaria associada com o grau de diferenciação
celular81,85,109
.
A expressão fraca da proteína HIF1-alpha foi associada com a recidiva local da doença
(p=0,002). Segundo nossos resultados, a expressão fraca aumenta o risco da recidiva local em
7 vezes (OR 7,59), quando comparados aos indivíduos com expressão forte.
Os casos com a expressão fraca da proteína HIF1-alpha apresentaram uma diminuição
significativa no tempo da sobrevida livre de doença local quando comparados aos casos com
expressão forte (p=0,013). O risco de recidiva local é aumentado em 3 vezes (OR 3,22) nos
casos com a expressão fraca, com relação aos casos com expressão forte.
Em acordo com os trabalhos de Beasley et al.89
e Fillies et al.95
que descreveram em
seus trabalhos a expressão forte da proteína HIF1-alpha como fator independente para a
melhor sobrevida livre de doença, assim como para a sobrevida global.
A pior sobrevida e recidivas da doença foram descritas por Aebersold e cols86
e
associadas à expressão forte da proteína HIF1-alpha. Entretanto, seu trabalho analisa
indivíduos com carcinoma epidermóide de orofaringe tratados com radioterapia curativa.
Sabemos que o prognóstico do câncer de orofaringe difere do câncer de boca. A modalidade
terapêutica também é um ponto de discussão entre nossos trabalhos.
Divergências entre nossos achados e os de outros grupos de pesquisas podem ter
ocorrido devido a diferentes casuísticas e metodologia de análise.
Lin e colaboradores96
, estudando indivíduos com carcinoma epidermóide de boca,
associaram a expressão forte da HIF1-alpha com a diminuição do tempo de sobrevida.
Contudo, sua análise imuno-histoquímica foi quantitativa e seus resultados baseados na
marcação nuclear, onde as amostras com mais de 60% de imunopositividade foram
classificadas como expressão forte.
39
A imuno-histoquímica quantitativa também foi o método de análise do trabalho de
Uehara et al.97
, que sugere a proteína HIF1-alpha como fator de importância no prognóstico
de pacientes com carcinoma epidermóide de boca.
Assim como descrito anteriormente, nós consideramos a porcentagem de células
marcadas dentre as tumorais e a intensidade da marcação do conjunto. As duas características
foram pontuadas e seus valores multiplicados. Com isso, o espectro de resultados foi
aumentado, diminuindo a chance de erros de interpretação.
Posteriormente, quando a casuística foi dividida segundo a modalidade terapêutica, a
fim de homogeneizar a amostra e investigar o impacto da expressão HIF1-alpha no
prognóstico desses casos, dois subgrupos foram gerados e analisados paralelamente, sendo: a)
casos submetidos à radioterapia pós-operatória e b) casos submetidos apenas ao procedimento
cirúrgico.
No subgrupo de casos submetidos à radioterapia pós-operatória, a expressão fraca da
proteína HIF1-alpha oferece o aumento no risco de óbito pela doença calculado em 6 vezes
(OR 6,13), quanto aos com expressão forte.
Ainda nesse subgrupo, a expressão da proteína HIF1-alpha foi enormemente associada
com a sobrevida à doença. A expressão fraca oferece um risco de 3 vezes (OR 0,015) para a
diminuição do tempo de vida, em relação a expressão forte. Nos casos operados as mesmas
associações não foram observadas.
A expressão da proteína HIF1-alpha foi altamente associada com a ocorrência de
recidiva local em ambos os subgrupos. Sendo a expressão fraca a causa para o aumento do
risco em mais de 11 vezes (operados não-irradiados OR 11,47; operados e irradiados OR
11,48), em comparação aos casos com expressão forte. No entanto, a expressão HIF1-alpha
foi significativamente associada com a sobrevida livre de doença local, apenas nos subgrupo
40
de casos submetidos à radioterapia pós-operatória, onde a expressão fraca aumenta o risco em
10 vezes (OR 3,41), em relação aos casos com a expressão forte.
Diante das diferenças prognósticas observadas nos dois subgrupos e sua relação com a
expressão da proteína HIF1-alpha, nosso grupo teorizou a seguinte explicativa:
O índice de atividade angiogênica é diretamente proporcional à grandeza da expressão
HIF1-alpha96,113-114
. Desse modo, alta neomicrovascularização seria proveniente da forte
expressão da proteína HIF1-alpha. Maiores taxas de oxigênio e células imunológicas
circulantes poderiam ser resultado da maior permeabilidade tecidual, características
consequentes da alta neomicrovascularização.
Comparados aos casos com expressão fraca da proteína HIF1-alpha, os casos com
expressão forte poderiam ter um combate imunológico mais efetivo contra as células
tumorais, dada pela maior permeabilidade e acessibilidade às células alvo.
A maior eficiência imunológica dos casos com expressão forte poderia ser uma
vantagem sobre os casos com a fraca expressão, aumentando suas chances de controle da
doença (Quadro 4).
QUADRO 4 – Em hipótese, o impacto da proteína HIF1-alpha na biologia do tecido tumoral e
resposta ao tratamento, segundo a modalidade terapêutica.
Modalidade terapêutica Expressão HIF1-alpha
Cirurgia RT pós-operatória Fraca Forte
Submetido
Submetido
↓ rede microvascular ↑ rede microvascular
Menor resposta imunológica Maior resposta imunológica
↓ concentração de O2 ↑ concentração de O2
Menor sucesso da RT Maior sucesso da RT
Não submetido ↓ rede microvascular ↑ rede microvascular
Menor resposta imunológica Maior resposta imunológica
41
O índice de sucesso da radioterapia pós-operatória, aplicada como tratamento
adjuvante, seria maior nos indivíduos que apresentassem forte expressão da proteína HIF1-
alpha devido às altas concentrações de oxigênio tecidual, produto essencial para a utilização
da radiação em seus propósitos. Novamente a expressão forte da proteína HIF1-alpha
proporcionaria vantagem aos seus portadores, podendo aumentar significativamente suas
chances de controle da doença e, sobretudo, a sobrevivência à doença.
A sobrevida livre de doença local é melhor nos pacientes submetidos à radioterapia
pós-operatória do que nos tratados apenas com a cirurgia (p=0,028) (Figura 11). Apesar de
serem grupos não comparáveis devido às diferenças clínicas e patológicas do tumor, fator
usual de indicação terapêutica, é claro a diferença prognóstica entre os grupos. Nos 12 meses
seguintes ao tratamento inicial, quase metade dos pacientes operados não irradiados
recidivaram localmente para a doença estudada, enquanto que para o mesmo período, menos
de 25% dos pacientes operados e irradiados recidivaram.
Curva de sobrevida livre da doença local
Submetido à radioterapia: Sim Não
0 6 12 18 24 30 36 42 48
Mouths
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Cum
ula
tive P
roport
ion S
urv
ivin
g
p=0,028
FIGURA 11 – Gráfico da curva de sobrevida livre de doença local, segundo a modalidade terapêutica.
42
Nos casos com a expressão fraca da HIF1-alpha, a sobrevida livre de doença local não
apresentou diferença entre os pacientes apenas operados e os pacientes operados e irradiados
(p=0,371) (Figura 12A). Apesar de a modalidade terapêutica ser fator influente no
prognóstico do carcinoma epidermóide, assim como no controle local da doença, parece não
ter havido diferença entre os seus resultados terapêuticos. Enquanto que, nos casos com a
expressão forte da HIF1-alpha, a modalidade terapêutica apresentou diferença na sobrevida
livre de doença local. Nos primeiros 12 meses após o tratamento inicial, mais de 30% dos
pacientes operados e não irradiados tinham recidivado localmente, enquanto que nenhum dos
pacientes operados e irradiados recidivaram no mesmo período (p=0,065) (Figura 12B).
FIGURA 12 – Gráfico da curva de sobrevida livre de doença local, segundo a expressão HIF1-alpha e a
modalidade terapêutica. A) Casos com expressão fraca da HIF1-alpha. B) Casos com expressão forte da HIF1-
alpha.
Ao compararmos os diferentes resultados de significância para a sobrevida livre de
doença local, segundo a expressão da HIF1-alpha, fica evidente a influencia que a expressão
HIF1-alpha pode estar ocorrendo na eficiência das modalidades terapêuticas no controle local
da doença. Isso reforça a ideia de que a expressão HIF1-alpha pode ser aplicada na rotina
clínica de serviços para auxiliar na indicação terapêutica, podendo aumentar a confiabilidade
43
da predição do prognóstico e da eficiência terapêutica. Adicionalmente, evitaria com que
pacientes, do ponto de vista molecular, pouco responsivos à irradiação, sejam submetidos à
radioterapia após o tratamento cirúrgico, levando as consequências maléficas do tratamento e
pouco ou quase nenhum efeito benéfico como esperado. Contudo, lembrando que existem
características clínicas e patológicas diferentes entre os pacientes com a expressão fraca da
HIF1-alpha foi indicados à radioterapia pós-operatória e os que foram apenas operados, que
poderiam levar à diferentes prognósticos, é necessário mais estudos para verificar até que
ponto a radioterapia, como tratamento complementar, estaria trazendo benefícios terapêuticos
e qual o custo-benefício de sua omissão para a saúde sistêmica e individual do paciente.
Ainda hoje, a proteína HIF1-alpha é muito estuda no mais diversos tipos de tumores.
Os resultados de grupos de pesquisas do mundo inteiro estão disponíveis para a consulta.
Contudo, não existe unanimidade em suas conclusões que possam levar a utilização da
proteína HIF1-alpha como marcador molecular de prognóstico nos dias de hoje.
Em resumo, apesar de não observarmos, a expressão fraca da proteína HIF1-alpha
pode estar associada com a menor diferenciação celular do tumor. A expressão fraca está
associada com maior ocorrência de recidiva local e óbito e a pior sobrevida da doença
específica e livre de doença local, nos casos submetidos à radioterapia pós-operatória. Por
outro lado, nos casos tratados apenas com a cirurgia, a expressão fraca está associada somente
com a ocorrência de recidiva local.
A proteína HIF1-alpha, em nossa opinião, pode ser considerada um marcador
molecular de prognóstico em carcinoma epidermóide de andar inferior da boca. Sendo
possível no futuro, sua aplicação na rotina clínica como ferramenta auxiliar na escolha da
indicação terapêutica.
44
7. CONCLUSÕES
45
A expressão forte da proteína HIF1-alpha tem efetiva relação com a melhor resposta
clínica aos tratamentos cirúrgicos e radioterápicos dos pacientes com carcinoma epidermóide
de andar inferior da boca. Além disso, pode ser um indicador de melhor resposta aos
tratamentos aplicados.
46
8. ANEXOS
47
ANEXO 1 - Foto da expressão da proteína HIF1-alpha negativa (escore ≤ 1), visualizada em
microscopia ótica (400x).
ANEXO 2 – Foto da expressão da proteína HIF1-alpha positiva fraca (escore 1 - 6),
visualizada em microscopia ótica (400x).
48
ANEXO 3 – Foto da expressão da proteína HIF1-alpha positiva forte (escore > 6), visualizada
em microscopia ótica (400x).
49
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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64
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65
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http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.
66
RESUMO
67
Expressão da proteína HIF1-alpha e sua relação com o prognóstico em pacientes com
carcinoma epidermóide de andar inferior da boca
Autor: Marcelo dos Santos.
Dissertação de Mestrado, 2010.
Introdução: O carcinoma epidermóide é o tipo histológico correspondente a mais de 90% dos
tipos de câncer de cabeça e pescoço, sendo a causa de morbidade e mortalidade em todo o
mundo. Assim como outros tumores sólidos, para a progressão tumoral é vital a adaptação à
hipóxia proposta pelo crescimento da massa tumoral. O principal mecanismo de resposta é
dado pela ativação do sistema HIF1, um heterodímero constituído por uma subunidade alpha
e uma beta, fator de transcrição de muitos genes relacionados ao metabolismo anaeróbico e de
crescimento vascular. Muitos estudos associam a expressão do HIF1-alpha com a progressão
de tumores sólidos. Para o controle da doença local é essencial o sucesso do tratamento
evitando sua progressão sistêmica. Ferramentas moleculares que auxiliem na escolha da
conduta terapêutica tem sido o objetivo de estudo de muitos grupos de pesquisa. Objetivo:
Avaliar a expressão da proteína HIF1-alpha em pacientes com CEC de andar inferior da boca
e correlacionar à sobrevida e progressão tumoral. Metodologia: Investigamos em 66 casos
operados de CEC de andar inferior da boca a expressão da proteína HIF1-alpha com relação à
sobrevida e aos fatores prognósticos do tumor, avaliados pelo método de IHQ em TMA.
Resultados: A expressão HIF1-alpha foi associada com o tempo e a ocorrência de recidiva
local (p=0,005; p=0,038) e óbito (p=0,015; p=0,031) dos casos tratados com radioterapia pós-
operatória. Nos casos tratados apenas com a cirurgia, a expressão HIF1-alpha foi associada
somente com a ocorrência de recidiva local (p=0,039). Conclusão: A expressão da proteína
HIF1-alpha está associada ao prognóstico de pacientes com CEC de andar inferior da boca,
relativos à ocorrência e precocidade da recidiva local e consequente óbito, estando
diretamente relacionada com a modalidade terapêutica aplicada.
Palavra-chave: Carcinoma epidermóide, HIF1-alpha, prognóstico, câncer de cabeça e
pescoço.
68
ABSTRACT
69
Expression of HIF1-alpha and its relationship with prognosis in patients with squamous
cell carcinoma of the floor of the mouth
Author: Marcelo dos Santos
Master of Science degree dissertation, 2010.
Introduction: Squamous cell carcinoma is the histologic type accounting for over 90% of
cancers of the head and neck, and the cause of morbidity and mortality throughout the world.
Like other solid tumors, for tumor progression is vital to adapt to hypoxia proposed by the
growth of tumor mass. The main response mechanism is given by the activation of the HIF1,
a heterodimer composed of an alpha subunit and a beta factor, transcription of many genes
related to anaerobic metabolism and vascular growth. Many studies associate the expression
of HIF1-alpha with the progression of solid tumors. For the control of local disease is
essential to the success of treatment avoiding systemic progression. Molecular tools that help
in the choice of therapy has been the subject of study by many research groups. Objective: To
evaluate the expression of the protein HIF1-alpha in patients with SCC of the floor of the
mouth and correlate with survival and tumor progression. Methods: We investigated in 66
surgical cases of SCC of floor of the mouth protein expression HIF1-alpha with respect to
survival and prognostic factors of tumor, assessed by immunohistochemical method in TMA.
Results: The expression HIF1-alpha was associated with time and the occurrence of local
recurrence (p = 0.005, p = 0.038) and death (p = 0.015, p = 0.031) patients treated with
postoperative radiotherapy. In cases treated with surgery, HIF1-alpha expression was
associated only with the occurrence of local recurrence (p = 0.039). Conclusion: The protein
expression HIF1-alpha is associated with prognosis of patients with SCC of the floor of the
mouth, and on the occurrence of early local recurrence and subsequent death is directly
related to the treatment modality applied.
Keyword: Squamous cell carcinoma, HIF1-alpha, prognostic, head and neck cancer.
70
APÊNDICES
71
1. Aprovação do Projeto Temático Genoma Clínico do Câncer pelo Comitê de Ética em
Pesquisa do Hospital Heliópolis, sob nº 135.
72
2. Aprovação do Presente Trabalho pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital
Heliópolis, sob nº 619.
73
3. Planilha geral com as características relevantes de cada caso estudado no presente
trabalho.
Legenda – ID: número de identificação; HIF1a: expressão da proteína HIF1-alpha; Tu:
amostra de tumor; Mg: amostra de tecido adjacente não-tumoral (margem); (+): positivo; (-):
negativo; Gên: gênero; M: masculino; F: feminino; Cauc: caucasiano; 0: não/ausente; 1:
sim/presente; Linf: linfonodo; G difer: grau de diferenciação; 3: pouco/leve; 4: moderado; 5:
intenso/bem; E linf: embolização linfática; I perin: invasão perineural; I inflam; infiltrado
inflamatório peritumoral; Desm: desmoplasia; Nec: necrose; Rt: radioterapia pós-operatória;
SD: status de sobrevida; 6: óbito pela doença; 7: vivo; T: tempo (em meses); RL: recidiva
local da doença; RR: recidiva regional da doença; n/a: não-avaliável.
74
ID HIF1a Tu HIF1a Mg Gên Idade Etnia Tab Etil Sítio pT Linf G difer E linf I perin I inflam Desm Nec Rt SD T SD RL T RL RR T RR
1 (+) fraco (+) fraco F 79 Cauc 1 0 C03 pT2 1 4 1 0 4 3 1 1 7 48 0 48 0 48
2 (+) fraco (+) fraco M 54 Cauc 1 1 C02 pT2 0 4 1 1 3 3 0 0 7 48 1 15 0 48
3 (+) fraco n/a M 55 Cauc 1 1 C06 pT3 0 5 1 1 3 3 0 0 6 16 1 10 0 16
4 (+) forte (+) forte M 63 Não cauc 1 1 C04 pT3 1 4 1 0 4 3 1 0 6 12 1 3 1 3
5 (+) fraco (+) forte M 54 Cauc 1 1 C02 pT3 0 4 1 0 4 3 1 0 7 48 1 3 1 3
6 (+) forte n/a M 70 Cauc 1 1 C04 pT2 0 4 1 0 4 3 1 0 7 40 0 40 0 40
7 (+) fraco (+) fraco M 55 Cauc 1 1 C06 pT4 1 5 1 1 4 5 1 1 6 48 n/a n/a n/a n/a
8 (+) fraco (+) fraco M 56 Cauc 1 1 C02 pT2 0 5 1 1 3 5 1 0 7 38 0 38 0 38
9 (+) forte (+) fraco M 41 Cauc 0 0 C02 pT1 1 3 1 1 4 3 0 0 7 48 0 48 0 48
10 (+) fraco n/a M 49 Não cauc 1 1 C04 pT4 1 5 1 0 3 3 1 0 6 19 1 3 1 3
11 (+) forte n/a M 40 Não cauc 1 1 C04 pT4 0 5 0 1 3 4 0 0 7 27 1 4 0 27
12 (+) forte n/a F 62 Cauc 1 0 C03 pT4 0 3 0 0 3 4 1 0 6 4 0 4 0 4
13 (+) forte (-) M 69 Cauc 1 1 C03 pT4 1 3 1 1 4 5 1 1 6 42 0 42 0 42
14 (+) forte (+) fraco M 55 Cauc 1 1 C04 pT2 0 5 1 1 3 4 1 1 7 46 0 46 1 38
15 (+) fraco (+) forte M 47 Não cauc 1 1 C02 pT3 1 3 1 1 4 5 1 1 6 19 1 9 0 19
16 (+) forte (+) forte M 63 Cauc 1 1 C04 pT3 0 5 1 1 4 3 0 0 7 48 0 48 0 48
17 (+) forte n/a M 51 Cauc 1 1 C04 pT4 1 4 1 1 3 3 1 1 6 8 n/a n/a n/a n/a
18 (+) fraco (+) forte M 63 Cauc 1 1 C06 pT4 0 5 1 1 4 5 1 0 7 48 1 7 0 48
19 (+) fraco (+) fraco F 81 Cauc 1 0 C02 pT2 0 5 0 0 5 3 0 0 6 44 1 44 1 44
20 (+) fraco (+) fraco M 35 Cauc 1 1 C02 pT2 1 4 1 1 3 3 1 1 6 9 1 6 0 9
21 (+) fraco (+) fraco F 41 Cauc 1 0 C02 pT2 1 4 1 0 3 3 0 1 6 16 0 16 0 16
22 (+) fraco (+) fraco M 56 Cauc 1 1 C04 pT2 1 5 1 0 4 4 1 1 6 21 0 21 0 21
23 (+) fraco (+) fraco M 53 Não cauc 1 1 C03 pT4 0 5 1 1 3 4 1 0 6 10 1 10 0 10
24 (+) forte (+) fraco M 48 Cauc 1 1 C02 pT2 1 4 1 0 4 5 1 1 7 48 0 48 0 48
25 (+) forte n/a M 46 Cauc 1 1 C02 pT4 1 4 1 1 4 4 1 1 7 48 0 48 0 48
26 (+) forte (+) forte M 65 Cauc 1 1 C06 pT2 0 4 1 1 3 4 1 0 7 48 0 48 0 48
27 (+) forte n/a M 58 Cauc 1 1 C04 pT4 1 4 1 0 5 4 1 0 6 7 1 6 0 7
28 (+) forte n/a M 46 Cauc 1 1 C02 pT4 1 4 0 0 3 3 1 1 7 47 0 47 0 47
29 (+) fraco n/a F 62 Cauc 1 0 C03 pT4 1 5 0 1 4 5 1 1 6 8 1 7 0 8
30 (+) forte (+) fraco F 70 Cauc 1 0 C04 pT2 0 5 0 0 5 3 0 1 n/a 32 0 32 0 32
31 (+) forte n/a M 42 Cauc 1 1 C04 pT2 1 4 1 1 5 3 1 1 7 47 0 47 0 47
32 (+) forte (+) forte M 34 Não cauc 1 1 C04 pT4 1 4 0 0 4 3 1 0 6 6 n/a n/a n/a n/a
33 (+) forte (+) fraco M 45 Cauc 0 1 C02 pT3 0 5 1 0 4 4 1 1 7 46 0 46 0 46
34 (+) fraco (+) fraco M 62 Cauc 1 1 C04 pT4 1 5 1 0 4 3 1 1 7 38 0 38 0 38
75
ID HIF1a Tu HIF1a Mg Gên Idade Etnia Tab Etil Sítio pT Linf G difer E linf I perin I inflam Desm Nec Rt SD T SD RL T RL RR T RR
35 (+) forte (+) fraco M 38 Não cauc 1 1 C06 pT4 0 4 1 1 4 4 1 1 7 41 0 41 0 41
36 (+) fraco (-) M 64 Não cauc 1 1 C02 pT2 0 4 1 1 3 5 1 0 6 30 1 2 0 30
37 (+) fraco (+) fraco M 41 Cauc 1 1 C02 pT4 1 3 1 1 3 5 0 1 n/a 14 0 14 0 14
38 (+) forte (+) fraco M 47 Cauc 1 1 C04 pT1 1 4 0 0 4 4 1 1 7 43 0 43 0 43
39 (+) fraco (+) fraco M 69 Não cauc 1 1 C04 pT4 1 5 1 1 3 5 1 0 6 n/a n/a n/a n/a n/a
40 (+) fraco (+) fraco M 59 Cauc 1 1 C02 pT2 1 5 0 0 3 3 1 1 6 10 1 9 0 10
41 (+) forte n/a M 59 Cauc 1 0 C03 pT2 0 5 0 0 3 4 0 0 7 41 0 41 0 41
42 (+) fraco n/a F 68 Cauc 1 1 C03 pT4 1 4 0 0 5 3 1 1 7 41 0 41 1 6
43 (+) fraco (-) M 58 Cauc 1 1 C02 pT1 0 4 0 0 5 3 0 0 7 35 0 35 0 35
44 (+) fraco (+) fraco M 55 Cauc 1 1 C02 pT3 0 5 1 0 5 3 1 0 7 34 0 48 0 34
45 (+) fraco (+) fraco M 37 Cauc 1 1 C04 pT4 1 5 0 1 3 5 1 1 6 16 1 12 1 6
46 (+) forte (+) fraco M 67 Cauc 1 1 C03 pT4 1 5 1 1 3 4 1 1 6 21 n/a n/a n/a n/a
47 (+) fraco (+) fraco M 44 Cauc 1 1 C02 pT3 0 5 1 0 5 3 0 0 7 13 1 5 1 5
48 (+) forte n/a F 57 Cauc 0 0 C03 pT4 0 4 0 1 4 3 1 0 7 38 1 2 1 2
49 (+) forte (+) fraco M 57 Cauc 1 1 C02 pT4 1 4 1 1 4 5 1 1 6 26 0 26 1 24
50 (+) forte n/a M 42 Cauc 1 1 C04 pT4 1 4 1 1 3 3 1 1 7 40 0 40 0 40
51 (+) forte n/a M 69 Cauc 1 1 C03 pT4 1 5 1 1 4 5 1 0 6 n/a n/a n/a n/a n/a
52 (+) fraco n/a F 51 Cauc 1 1 C02 pT2 1 5 1 1 3 4 1 0 7 24 1 11 0 24
53 (+) forte n/a M 56 Não cauc 1 1 C06 pT3 1 5 0 0 3 4 1 1 7 37 0 37 0 37
54 (+) fraco n/a M 59 Cauc 1 1 C02 pT2 0 4 0 1 5 3 1 0 6 15 0 15 1 13
55 (+) forte n/a M 46 Cauc 1 1 C02 pT2 0 4 1 0 3 5 1 0 7 35 0 35 0 35
56 (+) fraco n/a M 44 Cauc 1 1 C02 pT4 1 4 0 1 4 3 1 1 7 33 0 33 0 33
57 (+) forte n/a M 58 Cauc 1 1 C02 pT2 0 4 1 1 5 3 1 0 7 33 0 33 1 7
58 (+) fraco n/a M 78 Não cauc 1 1 C02 pT3 0 5 0 0 5 3 1 1 n/a 17 0 17 0 17
59 (+) fraco n/a M 64 Cauc 1 1 C04 pT2 0 5 0 0 4 4 1 0 7 28 1 7 0 28
60 (+) forte n/a M 56 Não cauc 1 1 C04 pT4 1 5 1 1 4 4 1 1 6 23 1 23 0 23
61 (+) fraco n/a M 67 Cauc 1 1 C02 pT3 1 5 0 0 4 3 1 1 6 10 1 8 1 4
62 (+) forte n/a M 52 Cauc 1 1 C04 pT2 0 4 0 1 4 4 1 0 7 28 0 28 0 28
63 (+) fraco n/a M 42 Cauc 1 1 C03 pT3 1 4 1 0 5 3 1 1 6 9 1 8 1 5
64 (+) fraco n/a F 53 Não cauc 1 0 C04 pT1 0 4 1 1 4 4 1 0 7 28 0 28 0 28
65 (+) forte n/a M 58 Cauc 1 1 C03 pT2 1 4 1 0 4 3 1 1 7 25 0 25 0 25
66 (+) fraco n/a M 47 Não cauc 1 1 C04 pT3 0 5 1 0 5 4 1 0 7 27 0 27 0 27
76
