Exploration de l’hypersensibilité de type IV de...
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Exploration de l’hypersensibilité de type IV : de l’ELISPOT au QUANTIFERON
Lorna GARNIERLaboratoire d’Immunologie – Centre Hospitalier Lyon Sud
DESC d'Allergologie et Immunologie Clinique10/03/2016
Classification de Gells et Coombs
Retardée : 48 à 72 h délai nécessaire à la rencontre de l’Ag avec T spécifiques, leur prolifération et migration des mono/macrophages
Hypersensibilité de type IV : Les Antigènes
Infections bactériennes, parasitaires, mycosiques et viralesDéveloppement intracellulaire
Antigènes protéiquesPoids moléculaires (P.M.) élevédoses faiblesInjection intradermique (ID) ou sous‐cutanée (SC)
Antigènes portés par les allogreffesAntigènes HLA / classe II
Autres substancesCosmétiques, produits d’entretien, industrie, ..Dinitrochlorozène DNCBDinitrofluorobenzène DNFBAdjuvants
Adjuvant complet de Freund
Hypersensibilité de type IVMécanismes effecteurs : exemple du Nickel
Molecular mechanisms of Nickel AllergySaito et al. Int Journal of Molecular Sciences 2016
Phase de sensibilisation
2ème sensibilisation/ persistance de l’antigène : réaction d’hypersensibilité retardée
Hypersensibilité de type IV et Pathologie humaine
1. Défense anti‐infectieuse
2. Dermatite atopique
3. Hypersensibilité médicamenteuse retardée
4. Rejet de greffe
5. Auto‐immunité
1. Défense anti‐infectieuse
Infections bactériennes, parasitaires, mycosiques et virales :Mycobacterium tuberculosis, lepraeBrucellaToxoplasma gondiiLeishmania majorCandida albicansCMV, herpes
Exemple : exploration de l’immunité anti-tuberculeuse
Contamination par Mycobacterium tuberculosis
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Infection abortive
Infection primaire5% des cas
Tuberculose latente95% des casPersistance de la bactérie sous forme quiescente
Kaufmann SHE, Nature Review – Immunology 2001
1. Défense anti‐infectieuse
Détection de l’infection tuberculeuse latente
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Pas de symptômesPas de contagionRéponse immunitaire détectable
1. Défense anti‐infectieuse
Immunité anti‐tuberculeuse : Réponse immunitaire adaptative
11Kaufmann SHE. Immunity, 2010
• Immunité anti‐tuberculeuse protectrice : type Th1
• Antigènes de M. tuberculosis présentés par les cellules dendritiques aux Ly T naïfs
• Différenciation des Ly en Ly Th1 sous l’influence de l’Interleukine 12
1. Défense anti‐infectieuse
Immunité anti‐tuberculeuse : Mémoire immunitaire
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Cellules mémoires
Les cellules mémoires et effectrices circulent dans le
sang
Kaufmann SHE. Immunity, 2010
Tests d’exploration de l’HSR basés sur la détection/activation des LyT effecteurs/ mémoire
1. Défense anti‐infectieuse
Outils diagnostiques de l’infection tuberculeuse latente
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• Test cutané : Intradermoreaction à la tuberculine (hypersensibilité type IV)
• Tests de détection de l’IFN‐g (IGRAs Interferon‐gamma‐release Assays)
1. Défense anti‐infectieuse
Outils diagnostiques de l’Infection tuberculeuse latenteIntradermoréaction (IDR) à la tuberculine
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Limites :• Subjectivité• Sensibilité moyenne• Nécessité de 2 visites• Faible spécificité :
Réaction croisée avec le vaccin BCGMycobactéries non tuberculeuses (NTM)
• Source antigénique : > 200 protéines de M.tuberculosis
• Lecture à 72h par mesure du diamètre d’induration en mm
• Seuil de positivité
1. Défense anti‐infectieuse
QuantiFERON®‐TB GOLD
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Test ELISA (Enzyme linked Immunosorbent Assay)
Incubation du sang total périphérique (anticoagulant héparine) avec les protéines mycobactériennes
Dosage de l’IFN‐g plasmatique par technique ELISA (UI/mL)
BHN 200
Sensibilité : 80‐90%
valeur prédictive négative d’évolution vers la maladie dans les deux ans en pays de faible endémie est autour de 97 ‐ 99 %
incubation à 37ºC pdt 16-24h 2. Centrifugation
ESAT-6CFP-10
Contrôle - Mitogene Contrôle +
4. Lecture spectrophotométrique
3. Plasma +conjugué Incubation 2H.
Test IGRA : QuantiFERON : Interprétation
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NulTémoin –Tube gris
TB Ag – NulTube patientTube rouge
Mit – NulTémoin +Tube violet
Résultat
IFN gamma (UI/mL)
≤ 3 < 0.35 ≥ 0.5 NEGATIF
≤ 3 0,35 – 0,6 ≥ 0.5 DOUTEUX
≤ 3 ≥ 0.6 ≥ 0.5 POSITIF
≤ 3 ≤ 0.5 ININTERPRETABLEAbs ctrl positif
≥ 3 ININTERPRETABLEActivation spontanée
Variabilités inter et intra individuelles importantes : pas d’interprétation quantitative des résultatsZone grise: 0,35 – 0,6 UI/mL‐> résultat à contrôler
1. Défense anti‐infectieuse
Tests IGRA T‐SPOT®TB : Technique ELISPOT
17Lavages et ajout de l’Ac conjugué
Ajout du substrat
PBMC après extraction Ficoll ou tubes BD CPT
Ajout des PBMC et Ags TB. Les Ly T spé sécrètent l’IFN‐g.
Capture de l’IFN‐g par les anticorps. Incubation.
Chaque spot correspond à unecellule sécrétrice
d’IFN‐ɤ
Apparition des spots en 7 minutes
A partir de Cellules mononuclééesAntigènes spécifiques (testés séparément) : ESAT, CFP‐10
1. Défense anti‐infectieuse
Tests IGRA T‐SPOT®TB : Technique ELISPOT : Interprétation
Témoin négatif Témoin positif Panel A Panel B
Interprétation :nb de spots panel A ou B – Témoin nég ≥ 8 : POSITIF
nb de spots panel A ou B – Témoin nég ≤ 4 : NEGATIF
nb de spots panel A ou B – Témoin nég ≥ 5 et ≤ 7 : DOUTEUX
1. Défense anti‐infectieuse
Tests IGRA : sélection d’antigènes spécifiques de M. tuberculosis
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Antigènes spécifiques• ESAT‐6• CFP‐10• TB 7.7
Codage par les gènes de la région RD1
Absents de la plupart des mycobactéries atypiques
Induisent la sécrétion d’IFN‐ɤ
Antigènes spécifiques de M.
tuberculosis
Antigènes spécifiques du BCG
Antigènes communs
ESAT‐6 : Early Secretory Antigen 6CFP‐10 : Culture Filtrate Protein 10 complex
1. Défense anti‐infectieuse
Tests IGRA : Interprétation clinique et biologique
TEST POSITIF
• fréquence élevée de Ly T (effecteurs/mémoires) spécifiques de M. tuberculosis :
rencontre de M. tuberculosis
• faux positifs rares (M. kansasii, M. marinum, M.szulgai <200 cas / an en France)
• Risque de réactivation M. tuberculosis si immunodépression (infection VIH, tt anti‐TNF)
!!Les IGRA ne permettent pas de distinguer l’infection tuberculeuse latente de la tuberculose maladie
Il ne permettent pas non plus de définir l’ancienneté de l’infection, le risque d’évoluer vers une tuberculose maladie, ni le suivi d’une
antibiothérapie anti‐tuberculeuse
1. Défense anti‐infectieuse
Tests IGRA : Recommandations HCSP 2011(Haut Conseil de la Santé Publique)
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Diagnostic de ITL : ↘ le réservoir de patients infectés• Enquête autour d’un cas : prise en charge des sujets contacts (enfants > 5 ans ‐ sujets âgé > 80 ans)• Patients infectés par le VIH (bilan initial)• Dépistage avant mise sous anti‐TNF • Personnel de santé (y compris stagiaires et étudiants) :
embauche (si IDR > 5 mm)cas contact
• Migrants entre 5 et 15 ans
Diagnostic de tuberculose maladie : Chez l’enfant
Utilisation stricte des tests IGRA dans le seul diagnostic de l’ITL et uniquement dans l’objectif de la traiter (sauf cas particulier)
(ITL : Infection tuberculeuse latente)
1. Défense anti‐infectieuse
Exemple 2 : Tests IGRA et CMV
Réponse T est critique dans le contrôle de la réplication du CMV
Evaluation de la réponse immune du patient pour déterminer le risque de réactivation virale.
Application :Suivi post‐transplantation
1. Défense anti‐infectieuse
Evaluation of Cytomegalovirus (CMV)‐Specific T Cell Immune Reconstitution Revealed That Baseline Antiviral Immunity, Prophylaxis, or Preemptive Therapy but not Antithymocyte Globulin Treatment Contribute to CMV‐Specific T Cell Reconstitution in Kidney Transplant Recipients Abate et al. J Infect Dis. (2010)
Elispot (nb de spot /200000 PBMCs)
Exemple 2 : Tests IGRA et CMV
1. Défense anti‐infectieuse
Virémie (nb de copie /mL)
2. Dermite de contact
10% des motifs consultation en dermatologie
Travailleurs de l’industrie, cosmétique, produits d’entretien, médicaments
Haptènes en cause très variés
Diagnostic : Patch tests
Médecine du travail / Médecine médico‐légale
ELISPOT ‐> manque de sensibilité
3. Hypersensibilité médicamenteuse retardée
Différentes formes cliniques Éruptions maculo-papuleusesPustulose exanthématique aiguë généraliséeErythème pigmenté fixe bulleux, Erythème polymorphe majeurDRESS (Drug Rash with Eosinophilia and Systemic Symptoms), Syndrome de Stevens Johnson/Necrolyse epidermique toxique (syndrome de Lyell)
Diagnostic parfois difficile : HS allergique/non allergiqueImputabilité du médicament
Implication des LyT (réponse type Th1)
Présence de LyT spécifiques du médicament
Test de transformation lymphoblastique
Sensibilité : ~60%Spécificité : ~80%
Augmentation de la sensibilité :‐ ajout d’anticorps anti‐CTLA4 et anti‐PDL1‐ déplétion des LyT régulateurs
Non utilisé en pratique courante
3. Hypersensibilité médicamenteuse retardée
ELISPOT
Detection and quantification of drug‐specific T cells in penicillin allergy, Rozieres et al. Allergy 2009
Sensibilité = 91% ‐ spécificité = 95%
Performances analytiques non retrouvées dans étude multicentrique
Erythème maculopapuleux suite à la prise d’Amoxicilline
3. Hypersensibilité médicamenteuse retardée
In vitro drug causality assessment in Stevens‐Johnson syndrome Alternatives for lymphocyte transformation test
15 patients avec syndrome de Steven Johnson ou Toxidermie nécrosante
TTL : positif chez 4/15 patients (Se : 27%)ELISpot Granzyme B : positif chez 5/15 patients (Se : 33%)Test de production d’IFN gamma (type Quantiferon) Se : 55%
Conclusion : combinaison de plusieurs tests :Expression de granulysine par LyT CD4+Granzyme B ELISpotTest de production d’IFN gamma
Se : 80% et Sp : 95%
3. Hypersensibilité médicamenteuse retardée
Porebski et al. , Clinical mechanisms 2013
Hypersensibilité médicamenteuse et présentation antigénique
3. Hypersensibilité médicamenteuse retardée
Pathogenesis and diagnosis of delayed‐type drug hypersensitivity reactions, from bedside to bench and back. Schrijvers et al. Clin Transl Allergy (2015) 5:31
4. HSR et rejet de greffe
Rejet de greffe aiguLe greffon est toujours le siège d’un important infiltrat de cellules mononucléesL’infiltrat est composé en majorité de lymphocytes CD4 +
5. HSR et auto‐immunité
L’HSR serait à la base des mécanismes lésionnels dansLa thyroïditeLe diabète insulino‐dépendantModèle expérimental
Encéphalomyélite allergique expérimentale