Obstaculos a cura nos tratamentos homeopáticos em odontologia
EVALUACIÓN DE MEDICAMENTOS HOMEOPÁTICOS EN EL CULTIVO DE ... · Un medicamento no actúa...
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INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL CENTRO INTERDISCIPLINARIO DE CIENCIAS MARINAS EVALUACIÓN DE MEDICAMENTOS HOMEOPÁTICOS EN EL CULTIVO DE JUVENILES DE PARGO LUNAREJO Lutjanus guttatus TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS EN MANEJO DE RECURSOS MARINOS PRESENTA ANTONIA DEL PILAR ROSERO GARCÍA LA PAZ, BCS. DICIEMBRE DEL 2016
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INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL CENTRO INTERDISCIPLINARIO DE CIENCIAS MARINAS
EVALUACIÓN DE MEDICAMENTOS HOMEOPÁTICOS EN EL CULTIVO DE JUVENILES DE PARGO LUNAREJO
Lutjanus guttatus
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS EN MANEJO DE RECURSOS MARINOS
PRESENTA
ANTONIA DEL PILAR ROSERO GARCÍA
LA PAZ, BCS. DICIEMBRE DEL 2016
Dedicado a mi familia
Cecilia y José, amados padres
Landy y J. Arturo Miler, queridos hermanos
Miler Benjamín, mi querido sobrino.
Agradecimientos
Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT), por la beca otorgada para
realizar la maestría durante los años 2015 y 2016, además de la Beca de Estímulo
Institucional de Formación de Investigadores (BEIFI) asociados a los proyectos IPN-
SIP 20150142 y 20160503. Búsqueda de alternativas innovadoras para aumentar el
éxito en la primera alimentación larvaria en pargos.
Instituto Politécnico Nacional (IPN) y al Centro Interdisciplinario de Ciencias Marinas
(CICIMAR), profesores y personal administrativo, por su aporte y guía durante la
maestría.
Proyecto Ciencia Básica CB-SEP-CONACYT No. 258282. Evaluación experimental
de homeopatía y nuevos probióticos en el cultivo de moluscos, crustáceos y peces
de interés comercial.
Centro de Investigaciones Biológicas del Noreste (CIBNOR), al Laboratorio de
Histología e Histoquímica dirigido por la Dra. Carmen Rodríguez Jaramillo, por su
valioso apoyo brindado en esta investigación. A mis compañeros de laboratorio, Dña.
Eulalia Meza y Biol. José Luís García Corona, por la gran ayuda brindada en el
experimento.
Centro Regional de Investigación Pesquera CRIP- INAPESCA. La Paz. BCS, en
particular a la Dra. Araceli Aviléz Quevedo, por el importante apoyo brindado en el
desarrollo del experimento.
Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A.C. CIAD-Mazatlán,
Laboratorio de Histopatología, en particular a la Dra. Cristina Chávez Sánchez, por
su valioso aporte en el diagnóstico histopatológico de los organismos evaluados,
además de la importante capacitación que me brindó y su atenta hospitalidad durante
mi estancia.
Earth Ocean Farms (EOF), por la donación de los juveniles de L. guttatus.
Dra. Lilia Margarita Bernal, Médico Anatomopatólogo, por sus contribuciones.
Biol. Pablo Guerrero, edición del Índice. Además de su compañerismo durante la
maestría.
A mis amigas y compañeras de maestría, Anabelle, Nuria y Pilar, por su hospitalidad,
amistad y apoyo, durante todo este tiempo.
A los directores de esta tesis. Dra. Silvie Dumas y Dr. José Manuel Mazón Suástegui
por el valioso y constante aporte que dejaron en el desarrollo y fin de esta
investigación.
A los Miembros del Comité Tutorial. Dra. Claudia Hernández Guerrero, Dra. Bárbara
González Acosta y Dr. Renato Peña Martínez, por sus valiosas críticas y sugerencias
en el desarrollo de esta tesis.
A mi familia, por ser mi fortaleza e inspiración.
A todos ustedes, GRACIAS.!
Similia similibus curantur
Debes observar la forma en que los medicamentos
actúan en el cuerpo del hombre cuando éste se
encuentra en la plenitud de la salud. Los cambios
que determinen no tienen lugar en vano sino que
deben, necesariamente significar algo; puesto que
sin ello, ¿por qué se producen?...
S. Hahnemann, 1805.
Un medicamento no actúa directamente sobre el
agente mórbido sino sobre los desarreglos que
éste último ha introducido en la armonía vital de
organismo expresada como buena salud «cuando
la fuerza vital instintiva, automática e incapaz de
razonar, ha sido llevada por la enfermedad a
producir reacciones anormales...»
En la puesta en práctica del tratamiento por los
semejantes (similia similibus curantur) y en virtud
del principio de la similitud, el médico debe buscar
la dosis más baja de medicamento capaz de
provocar una reacción salvadora del organismo,
«mediante una fuerza mórbida apta para producir
síntomas parecidos y un poco más fuertes...»
S. Hahnemann, 1834.
Para la altura de los cielos,
y para la profundidad de la tierra,
y para el corazón de los reyes, no hay investigación.
Proverbios 25:3.
Contenido
Lista de figuras ........................................................................................................... I
Lista de tablas .......................................................................................................... IV
Glosario ...................................................................................................................... V
Abreviaturas ............................................................................................................ VII
Resumen ................................................................................................................. VIII
Abstract ..................................................................................................................... IX
1 Introducción ........................................................................................................ 1
2 Antecedentes ...................................................................................................... 3
2.1 La homeopatía como terapia alterativa .......................................................... 3
2.2 Avances de homeopatía en peces ................................................................. 3
2.3 Cultivo de Lutjanus guttatus ........................................................................... 5
2.4 Importancia del análisis histopatológico. ........................................................ 5
2.5 Alteraciones histopatológicas en peces ......................................................... 8
2.6 Sistema Inmune de los peces ...................................................................... 10
2.6.1 Linfocitos................................................................................................ 11
2.6.2 Monocitos .............................................................................................. 11
2.6.3 Neutrófilos.............................................................................................. 11
2.6.4 Eosinófilos ............................................................................................. 12
2.6.5 Basófilos ................................................................................................ 12
3 Justificación ...................................................................................................... 13
4 Hipótesis ............................................................................................................ 14
5 Objetivos ............................................................................................................ 14
5.1 Objetivo general ........................................................................................... 14
5.2 Objetivos específicos. .................................................................................. 14
6 Materiales y métodos ........................................................................................ 15
6.1 Obtención y manejo de juveniles de L. guttatus ........................................... 15
6.2 Diseño experimental ..................................................................................... 15
6.3 Tratamientos homeopáticos ......................................................................... 16
6.4 Biometrías y obtención de muestras ............................................................ 16
6.4.1 Crecimiento............................................................................................ 17
6.4.2 Supervivencia ........................................................................................ 17
6.4.3 Factor de conversión alimenticia (FCA) ................................................. 18
6.4.4 Factor de condición (FC) ....................................................................... 18
6.5 Análisis histológicos e histoquímicos ........................................................... 18
6.5.1 Carbohidratos en hígado (CH) ............................................................... 19
6.5.2 Producción de mucinas en intestino (MI) y branquias ........................... 19
6.6 Análisis hematológicos ................................................................................. 20
6.7 Análisis histopatológicos .............................................................................. 20
6.7.1 Valor medio de evaluación (MAV) y Grado de cambio en el tejido (DTC) . ............................................................................................................... 20
6.7.2 Evaluación de coccidios en intestino ..................................................... 21
6.8 Análisis estadístico ....................................................................................... 22
7 Resultados ......................................................................................................... 24
7.1 Crecimiento .................................................................................................. 24
7.2 Supervivencia ............................................................................................... 24
7.3 Factor de conversión alimenticia (FCA) ....................................................... 24
7.4 Factor de condición (FC) .............................................................................. 24
7.5 Carbohidratos en hígado .............................................................................. 27
7.6 Producción de mucinas en intestino y branquias ......................................... 30
7.7 Células leucocitarias en sangre.................................................................... 33
7.8 Histopatología de Lutjanus guttatus ............................................................. 37
7.8.1 Valor medio de evaluación (MAV) y Grado de cambio en el tejido (DTC) . ............................................................................................................... 37
7.8.2 Evaluación de coccidios en intestino ..................................................... 51
8 Discusión ........................................................................................................... 54
9 Conclusión ........................................................................................................ 67
10 Recomendaciones ............................................................................................ 68
11 Literatura citada ................................................................................................ 69
12 Anexos ............................................................................................................... 81
I
Lista de figuras
Figura 1. Factor de condición (promedio ± desviación estándar) p>0.05, para
Lutjanus guttatus al inicio y al final del experimento. ................................. 25
Figura 2. Porcentaje promedio (± desviación estándar) de carbohidratos en hígado
de Lutjanus guttatus antes del experimento (grupo Inicial) y al final del
experimento, en los diferentes tratamientos y grupo control. Letras distintas
muestran diferencias significativas (p<0.05). ............................................. 27
Figura 3. a) Hígado de L. guttatus al inicio del experimento, b) Hígado de L. guttatus
del grupo Control al final del experimento. Contenido de carbohidratos (Ch),
vacuolización lipídica (Vl). Azul Alciano, 40X. ............................................ 28
Figura 4. a) Hígado de L. guttatus del grupo Control al final del experimento, b)
Hígado de L. guttatus tratado con el medicamento homeopático Passival®.
Contenido de carbohidratos (Ch), vacuolización lipídica (Vl). Azul Alciano,
40X. ............................................................................................................ 29
Figura 5. Porcentaje promedio (± desviación estándar) de producción de mucinas en
intestino de L. guttatus al principio (grupo Inicial) y al final del experimento
en los diferentes tratamientos y en el grupo Control. n = número de
individuos. .................................................................................................. 30
Figura 6. Número promedio (± desviación estándar) de células mucosas producidas
en branquias de L. guttatus al principio (grupo Inicial) y al final del
experimento en los diferentes tratamientos y el grupo Control. Letras
distintas demuestran diferencias significativas (p<0.05). ........................... 31
Figura 7. Branquias de juveniles de L. guttatus. a) grupo Control, b) grupo tratado
con Pass-SiT. Flechas señalan células mucosas producidas en el tejido.
Azul Alciano, 20X. ...................................................................................... 32
Figura 8. Frotis de sangre periférica de L. guttatus. a) linfocito (Lf); b) monocito (Mn);
c) monocito (Mn), neutrófilo (Nt); d) neutrófilo en banda (Nt); e) eosinófilo
(Eo); f) basófilo (Bs). Tinción Hemacolor. 100X. ........................................ 34
Figura 9. a) Branquia normal de L. guttatus; b) degeneración hidrópica (Dh), lamelas
secundarias con posibles células eosinófilas granulares (CEG); algunos
núcleos picnóticos (Np) y pérdida de la integridad celular. H & E, 40X. ..... 38
II
Figura 10. a) Branquia L. guttatus con degeneración hidrópica (Dh), telangiéctasis
(Tg), células eosinófilas granulares (CEG) y pérdida de la integridad celular
(Pt). H & E, 40X; b) infiltrado inflamatorio (If), hiperplasia del epitelio lo que
genera una fusión de las lamelas secundarias y desintegración tisular (Fl),
degeneración hidrópica (Dh), células eosinófilas granulares (CEG). H & E,
40X. ............................................................................................................ 39
Figura 11. a) Hígado sano de L. guttatus; b) vacuolización lipídica y pérdida de la
arquitectura tisular (Vl), hepatocitos binucleados (Hb), núcleo con dos
nucleolos (Nc). H & E, 100X. ...................................................................... 40
Figura 12. Hígado afectado de L. guttatus. a) núcleos picnóticos de forma y tamaño
irregular (Np), pérdida de la integridad tisular y hepatocitos sin núcleo (Sn);
b) núcleos picnóticos de páncreas (Np), vacuolas (Vl), células rodlet (CR).
H & E, 100X. .............................................................................................. 41
Figura 13. a) Microvellosidades en intestino de L. guttatus (Mv) pérdida de
microvellosidades (Pm), célula rodlet (CR); b) estómago con atrofia en
glándulas digestivas (At) y vacuolas en glándulas digestivas (V). H & E,
100X. .......................................................................................................... 42
Figura 14. a) Células eosinófilas granulares (CEG) y células rodlet (CR) alrededor de
un vaso sanguíneo de hígado de L. guttatus tratado con medicamento
homeopático, núcleos picnóticos (Np) con forma y tamaño irregular. H & E,
40X; b) Células rodlet (CR) alrededor y dentro de páncreas de L. guttatus,
células eosinófilas granulares (CEG), vacuolas en glándulas del páncreas
(V), núcleos picnóticos en glándulas (Np). H & E, 100X. ........................... 43
Figura 15. a) Abundantes células eosinófilas granulares (CEG) en la lámina propia
del intestino, pérdida de microvellosidades (Pv); b) células rodlet (CR) entre
los enterocitos del intestino. H & E, 100X. ................................................. 44
Figura 16. a) Células rodlet (CR) en intestino de L. guttatus intentando atravesar la
capa muscular circular y alrededor de los enterocitos, CEG en la lámina
propia; b) células rodlet (CR) intentando atravesar la muscular externa del
estómago, glándulas digestivas (Gd). H & E, 100X. .................................. 45
III
Figura 17. Presencia de coccidios en intestino de L. guttatus evaluados con
diferentes medicamentos homeopáticos versus grupo Control, valores de
media ± desviación estándar. Letras distintas indican diferencias
significativas (p<0.05). ............................................................................... 51
Figura 18. a) Coccidios en intestino de L. guttatus desprendiéndose del epitelio hacia
la luz del mismo (Cc), células eosinófilas granulares (CEG); b) coccidio
alrededor de los enterocitos (Cc), pérdida de microvellosidades y
desprendimiento del epitelio (Pm), y CEG. H & E, 100X. ........................... 52
Figura 19. Intestino de L. guttatus. a) coccidios desprendidos en la luz del intestino
formando masas (flechas), H & E, 40X; b) coccidios en la luz del intestino
(Cc), macrófago cargado de pigmento (Mf). H & E, 100X. ......................... 53
IV
Lista de tablas
Tabla 1. Esquema de los tratamientos evaluados en el Diseño experimental. ......... 16
Tabla 2. Esquema generalizado para la asignación de un valor numérico cualitativo a
los grados de severidad de infecciones, infestaciones y síndromes. ......... 22
Tabla 3. Crecimiento en peso (g) y longitud (cm), factor de condición y supervivencia
(p>0.05), de juveniles de pargo lunarejo L. guttatus tratados con
medicamentos homeopáticos. Valores promedio ± desviación estándar,
excepto supervivencia. ............................................................................... 26
Tabla 4. Recuento diferencial de leucocitos en juveniles de L. guttatus tratados con
diferentes medicamentos homeopáticos versus el grupo Control. Valores en
porcentaje promedio ± desviación estándar, de los diferentes tipos de
leucocitos identificados en juveniles de L. guttatus. Letras distintas indican
diferencias significativas (p<0.05). n = número de individuos. n = 18 para
los tratamientos Passival, Pass- PhA y Pass-SiT; n = 16 para el tratamiento
End-Inf y el grupo Control. ......................................................................... 36
Tabla 5. Valoración de los cambios patológicos observados en los tejidos de los
juveniles de L. guttatus, al inicio y durante experimento. Grado de alteración
(MAV) y grado de cambio (DTC) ................................................................ 48
Tabla 6. Grado de alteración (MAV) y grado de cambio (DTC) ocurrido en los
órganos de juveniles de L. guttatus tratados con diferentes medicamentos
homeopáticos, versus el grupo Control. ..................................................... 50
V
Glosario
Apicomplejos: Grupo de protozoos endocelulares con reproducción sexual
que poseen un ápice complejo, con estructuras singulares
(roptrías, micronemas, anillos polares, conoide) empleadas para
la penetración celular, y que son vistas bajo el microscopio
electrónico de transmisión (Martínez-Fernández, 2002).
Cambios focales Refiere a cambios presentados en determinadas regiones
del tejido evaluado.
Degeneración hidrópica
Células epiteliales abultadas y llenas de líquido, el mismo que
desplaza el núcleo hacia la periferia.
Degranulación Liberación de las granulaciones contenidas en el protoplasma de
algunas células (polinucleares, mastocitos, basófilos, neutrófilos,
eosinófilos etc.) con objetivo de verter su contenido enzimático
en las vacuolas intracelulares (o fagocitomas) donde se efectuará
la fagocitosis, con la finalidad de destruir microorganismos
invasores (Martín-Lasa, 2016).
Glicocálix Cubierta de la superficie celular que contiene glicoproteínas y
glicolípidos, cuya función es proteger y estabilizar la membrana
celular (Núñez-Cachaza, 1983).
Gluconeogénesis Síntesis de glucosa a partir de fuentes no carbohidratadas, como
son las grasas y las proteínas. Esto tiene lugar cuando las
fuentes de glucógeno del hígado se han acabado (Oxford
University Press, 1998).
Inmunomoduladores
Sustancia, proteína o vector químico que actúa favoreciendo el
balance regulatorio y la respuesta final integrada del sistema
inmune para prevenir o ayudar a corregir una disfunción del
mismo (Herrero, 2009).
VI
Neoplásicas Referente a neoplasias. Crecimiento anormal y descontrolado de
células de un tejido con pérdida del control de los mecanismos
que regulan su reproducción y muerte.
Picnóticos Adjetivo de picnosis; esto es, engrosamiento especialmente de
la degeneración de una célula en la cual el núcleo disminuye de
tamaño y la cromatina se condensa en una masa o masas
sólidas sin estructura, el núcleo se vuelve homogéneo y se
colorea uniformemente. Este fenómeno sería debido a la muerte
del núcleo (Miller & Keane,1996; Martín-Ruíz, 2016).
Señales paracrinas Señales químicas que actúan localmente por medio de unión a
receptores y ejercen un efecto regulador en las células vecinas
(Hill et al., 2006).
Señales autocrinas. Señales químicas que actúan localmente, provocan la unión a
un receptor y ejercen un efecto regulador sobre la célula que lo
secretó (Hill et al., 2006).
Telangiectasia Alteración de la integridad vascular, producto de la ruptura de la
célula pilar o sus uniones, lo cual resulta en una dilatación de los
capilares sanguíneos y acumulación de eritrocitos (Godoy, 2015).
VII
Abreviaturas
CEG Células Eosinófilas Granulares
CH Carbohidratos en hígado
DTC Degree of Tissue Change, o Grado de Cambio del Tejido
End Endecto™
Inf Infecçoes™
MAV Mean Assessment Value, o Valor Medio de Evaluación
MI Mucinas en intestino
Pass Passival®
PhA Ácido fosfórico
SiT Silicia Terra
VIII
Resumen
Con el objetivo de evidenciar si la homeopatía puede o no, ser eficiente en el cultivo
de juveniles de pargo lunarejo Lutjanus guttatus, se evaluaron por duplicado cuatro
tratamientos homeopáticos: Passival®; Passival®/PhA; Passival®/SiT;
EndectoTM/InfecçoesTM y un tratamiento control. Se dispuso de 458 peces con un
peso y longitud promedio inicial de 1.9 ± 0.1 g y 4.9 ± 0.6 cm, respectivamente, de
los cuales, 28 se destinaron al muestreo inicial y el resto fueron distribuidos en
grupos de 43 en 10 unidades experimentales cilíndricas de fibra de vidrio, con
volumen operativo de 100 L. Las condiciones físico-químicas del cultivo fueron
monitoreadas diariamente y se registraron valores promedio de temperatura 22.21 ±
2.14 °C; oxígeno disuelto 5.52 ± 1.03 mg/L; salinidad 35.0 ± 0.6 ups y pH 7.8 ± 0.1.
Aunque no se registraron diferencias significativas (p > 0.05) en el crecimiento ni en
la supervivencia de los juveniles, la tasa de crecimiento específico (TCE) máxima
(3.9%/día) se registró en los tratamientos Pass-SiT y End-Inf. El factor de conversión
alimenticia (FCA) promedio fue de 0.9 y el factor de condición (FC) promedio fue de
1.6 ± 0.1. La supervivencia fue superior al 85%. Los análisis histoquímicos mostraron
diferencias significativas (p < 0.05) en el contenido de carbohidratos en hígado para
los peces tratados con Passival® (28.4 ± 18.8%) y Pass-SiT (22.4 ± 0.4%), en
relación con los peces del grupo inicial y el grupo Control, los cuales tuvieron las
menores reservas de carbohidratos (3.4 ± 3.0 y 5.5 ± 2.1%, respectivamente). La
cantidad de células mucosas (N° de células por área de cobertura) producidas en
branquias fue significativamente mayor (p < 0.05) en los peces tratados con End-Inf
(43 ± 0.7) y Pass-SiT (40 ± 4.2), en relación al grupo inicial y al grupo Control (19 ±
0.7 y 28 ± 3.5, respectivamente). Se obtuvieron diferencias significativas (p < 0.05)
en el recuento leucocitario. Los peces tratados con End-Inf registraron un mayor
porcentaje de linfocitos, mientras que los peces tratados con Pass-PhA tuvieron un
mayor porcentaje de neutrófilos, con respecto a los demás tratamientos. Se registró
infestación de coccidios en intestino de L. guttatus y la menor incidencia de estos
parásitos correspondió a los peces del tratamiento End/Inf (p < 0.05) en comparación
con el grupo Control. Se observaron diferentes lesiones histopatológicas en
branquias, hígado, intestino y estómago. Los tratamientos homeopáticos Pass-PhA,
Pass-SiT y End-Inf lograron disminuir significativamente (p < 0.05) las lesiones y el
grado de alteración y cambio en intestino y estómago. Los resultados obtenidos
permiten concluir que los medicamentos homeopáticos evaluados en juveniles de
pargo lunarejo, tienen un efecto benéfico y significativo en indicadores histológicos e
histoquímicos de nutrición, salud y respuesta inmune, y por consiguiente, una
potencial aplicación en el cultivo de la especie.
IX
Abstract
With the aim to evince if homeopathy may or may not be efficient in the culture of
spotted rose snapper Lutjanus guttatus juveniles, four homeopathic treatments were
evaluated in duplicates: Passival®; Passival®/PhA; Passival®/SiT;
EndectoTM/InfecçoesTM and a control treatment. 458 fish with an initial average weight
and length of 1.9 ± 0.1 g and 4.9 ± 0.6 cm, respectively, were used. Twenty-eight of
them were used for the initial sampling and the rest were distributed in groups of 43 in
ten fiber glass cylindrical experimental units of 100 L. Temperature, dissolved oxygen,
salinity, and pH were monitored daily. Average values were 22.21 ± 2.14 °C; 5.52 ±
1.03 mg / L; 35.0 ± 0.6 ups, and 7.8 ± 0.1, respectively. Although, neither any
significant differences (p > 0.05) in growth nor survival of juveniles were registered,
the maximum specific growth rate (TCE: 3.9% /day) was registered in the Pass-SiT
and End-Inf treatments. The average feed conversion (FCA) was 0.9 and the average
condition factor (FC) was 1.6 ± 0.1. Survival was greater than 85%. Histochemical
analysis showed significant differences (p < 0.05) in the carbohydrate content of the
liver for fish treated with Passival® (28.4 ± 18.8%) and Pass-SiT (22.4 ± 0.4%) in
relation to the fish of the Initial group and the Control group, which had the lowest
carbohydrate reserves (3.4 ± 3.0 and 5.5 ± 2.1%, respectively). The amount of mucus
cells (Number of cells per coverage area) produced in gill was significantly higher (p <
0.05) in fish treated with End-Inf (43 ± 0.7) and Pass-SiT (40 ± 4.2) in relation to the
Initial group and the Control group (19 ± 0.7 and 28 ± 3.5, respectively). Significant
differences (p < 0.05) in the leukocyte count were also obtained. The fish treated with
End-Inf registered a higher percentage of lymphocytes, while fish treated with Pass-
PhA had a higher percentage of neutrophils, with respect to other treatments.
Coccidia infestation was registered in intestine of L. guttatus and the lower incidence
of these parasites corresponded to fish treatment End / Inf (p < 0.05) compared to the
Control group. Different histopathological lesions in gill, liver, intestine and stomach
were observed. Significant decreases (p < 0.05) in lesions and in the degree of
alteration and change in intestine and stomach were observed in the treatments
Pass-Pha, Pass-SiT and End-Inf. The results obtained allow to conclude that
homeopathic medicines evaluated in juveniles of spotted rose snapper, have a
beneficial and significant effect on histological and histochemical indicators of
nutrition, health and immune response, and therefore a potential application in the
cultivation of the species.
1
1 Introducción
La calidad nutricional de los organismos, así como la prevención y control de
epizootias asociadas a virus, bacterias, endo y ectoparásitos, es de vital importancia
en la piscicultura marina comercial. Existen diversos sistemas de control tanto
preventivos como correctivos, que son aplicados para asegurar las condiciones de
sanidad en el cultivo; esto incluye aplicación de vacunas, antibióticos, probióticos, así
como diversos compuestos químicos, algunos para profilaxis y desinfección, y otros
que tienen registro como medicamentos de uso acuícola veterinario.
A pesar de que la gran mayoría de los tratamientos se basan en la medicina
alopática, en diversos países de Europa como Alemania, Francia y España, y de
América, como Colombia, Cuba y Brasil, ya se utilizan alternativas distintas como la
medicina homeopática.
La homeopatía es una concepción médica que comprende el estudio de las
manifestaciones patológicas con respecto a los datos patogénicos con base en la
similitud (Zissu, 1995). Consiste en la aplicación terapéutica del principio de la
similitud, Similia similibus curantur, mediante dosis muy pequeñas de sustancias
especialmente preparadas (Guermonprez, 1995).
Los medicamentos homeopáticos son altamente diluidos e inocuos, logran
reducir el estrés, activan los mecanismos de defensa y homeostasis del organismo y
propician una mejor respuesta inmune frente a infecciones causadas por patógenos.
Un ejemplo de esto, es la aplicación de algunos medicamentos homeopáticos en
peces dulceacuícolas como la tilapia del Nilo Oreochromis niloticus, y el pacú blanco
Piaractus mesopotamicus, que han permitido obtener una respuesta favorable al
estrés durante el transporte (De Oliveira et al., 2013), cambios positivos de tipo
fisiológico y neuroendócrino (Braccini et al., 2013), estimulación de la función
hepática y metabolismo de lípidos (Andretto et al., 2014), al igual que un mayor
crecimiento y supervivencia (Junior et al., 2012).
2
La utilización de la medicina homeopática no ha sido explorada en peces
marinos, por lo que surge la siguiente interrogante ¿pueden los medicamentos
homeopáticos ser eficientes en el cultivo de juveniles del pargo lunarejo Lutjanus
guttatus, ante la presencia de agentes patógenos?, cuya respuesta permitiría
confirmar o no, si dichos medicamentos logran ofrecer un potencial importante para
mejorar la salud, nutrición, crecimiento y supervivencia de los peces marinos en
cultivo. Los antecedentes muestran que la homeopatía puede realmente ofrecer
alternativas para la piscicultura marina, bajo una perspectiva productiva que involucra
aspectos de sanidad, inocuidad y sostenibilidad. El objetivo del presente estudio es
aportar nuevo conocimiento científico con la finalidad de demostrar que la medicina
homeopática tiene potencial aplicación acuícola productiva.
3
2 Antecedentes
2.1 La homeopatía como terapia alterativa
La homeopatía es una disciplina médica que ha propuesto, evaluado y
demostrado, por la vía experimental, que pueden obtenerse resultados notables y de
atractivo interés para el mundo de la ciencia, aplicando dosis mínimas o
imponderables de determinados agentes bioactivos. Uno de los principios básicos de
la medicina galénica conocida también como alopatía, es la supresión de los
síntomas del paciente con la aplicación de antibióticos, antiinflamatorios,
antiespasmódicos, antidepresivos, etc., lo cual va en contra de las reacciones
naturales del cuerpo. Como contraparte, el principio básico de la medicina
homeopática es la estimulación de los sistemas innatos de defensa del organismo
para apoyar el sistema de auto-curación, lo que implica la estimulación y
fortalecimiento del sistema inmune para recuperar y/o mantener la homeostasis
dinámica del organismo. En homeopatía, los síntomas de una enfermedad son un
intento del cuerpo para curarse a sí mismo, de manera que su praxis se enfoca en
lograr el equilibrio o la homeostasis en todo el organismo (Cesar et al., 2008).
2.2 Avances de homeopatía en peces
Diversos estudios han sido enfocados al uso de medicamentos homeopáticos
para incrementar rendimientos y supervivencia en la producción piscícola. Se está
buscando minimizar la mortalidad en peces generada por estrés asociado al
transporte, manejo (De Oliveira et al., 2013), densidades de cultivo y problemas
patológicos como infecciones, enfermedades parasitarias, bacterianas y virales.
Braccini et al. (2013) evaluaron el rendimiento, la prevalencia de ectoparásitos y la
respuesta morfo-funcional del hígado y las branquias en la tilapia del Nilo
Oreochromis niloticus tratada con el complejo homeopático comercial Homeopatila
100® a diferentes concentraciones. Se encontraron diferencias significativas en la
presencia de parásitos y en la condición y relación hepatosomática de los peces
tratados, la cual fue significativamente menor que en los peces del grupo control. Los
mejores resultados en hígado y branquias en términos del número de
4
hepatocitos/mm2, comportamiento glucogénico intercelular, tasa de cambio
histológico (hiperplasia, fusión lamelar y telangiectasia) y porcentaje de células
productoras de mucinas neutras y ácidas, se obtuvieron en los peces que recibieron
Homeopatila 100®, a razón de 40 mL/kg de alimento. Con el uso de Homeopatila
100® en tilapia juvenil, se obtuvieron altas tasas de supervivencia, una mejora en la
condición de los hepatocitos y de los niveles de glucógeno intracelular, una menor
tasa media de cambios histológicos branquiales y un aumento de células productoras
de mucinas-ácidas versus las células productoras de mucina neutras. En cuanto al
análisis del tejido hepático, los mismos autores observaron que los grupos control
mostraron alteraciones histopatológicas en hígado, con una tendencia al
desplazamiento del núcleo hacia la periferia de los hepatocitos, vacuolización
citoplásmica, desarrollo sinusoidal discontinuo con células endoteliales y descarga de
eritrocitos. Estos cambios fueron observados en menor medida en los grupos
tratados con medicamentos homeopáticos.
Recientemente, Andretto et al. (2014) evaluaron el efecto de un complejo
homeopático comercial (HomeoAqua complejo Mega 3®), sobre los ácidos grasos en
tejido muscular de la tilapia del Nilo O. niloticus. El complejo fue diseñado para
estimular la función hepática y mejorar el metabolismo de los lípidos, esperando
obtener un mejor rendimiento general en términos de calidad de la carne. Los
juveniles de tilapia de Nilo que recibieron el HomeoAqua Mega-3® en sus dietas,
tuvieron una disminución en las proporciones de lípidos totales, principalmente en los
ácidos grasos saturados, y en la relación de omegas n6/n-3, comparado con el grupo
control. No se registraron cambios en el rendimiento de carne durante el período
experimental, pero se obtuvo un producto bajo en grasas, que de acuerdo con los
estándares sanitarios es más sano para el consumo humano. En la misma especie,
Valentim-Zabott et al. (2008) evaluaron los efectos del complejo homeopático
comercial Homeopatila RS (REAL Homeopatía, Brasil) en el crecimiento, la
proporción sexual y la histología de branquias e hígado de la tilapia del Nilo
Oreochromis niloticus. Sus resultados revelaron diferencias significativas en
crecimiento, supervivencia, índice somático del hígado y valores medios de las
alteraciones histológicas hepáticas entre tratamientos. La adición de Homeopatila RS
5
a la dieta de tilapias del Nilo, durante la fase de diferenciación gonadal, no indujo
ninguna alteración en la proporción sexual. Los peces tratados fueron
significativamente más pequeños, pero tuvieron una supervivencia significativamente
mayor que otros grupos, y no hubo diferencia significativa en la biomasa total final de
todos los tratamientos. Los peces tratados homeopáticamente presentaron un menor
índice-somático en el hígado y menos inclusiones de lípidos hepáticos que los
grupos restantes (Valentim-Zabott et al., 2008).
2.3 Cultivo de Lutjanus guttatus
La producción pesquera de pargo lunarejo L. guttatus alrededor del mundo se ha
incrementado por más de 50 años, aunque en los últimos 10, el incremento anual ha
sido muy bajo (FAO, 2011), e incluso se reporta que ese recurso pesquero está
sobre explotado en muchas áreas (Davis et al., 2000; Watanabe et al., 2001). Estas
disminuciones en la producción pesquera son las que comúnmente originan el
desarrollo de cultivos de especies acuícolas (Flores, 1995). Se considera que el
pargo lunarejo tiene potencial en maricultura debido a su demanda comercial, su
capacidad de adaptación al manejo zootécnico, y a las facilidades que ofrece su
reproducción en cautiverio para la producción de crías (Ibarra-Castro & Duncan
2007; Alcalá-Carrillo et al., 2016). En consecuencia, si se asegura el suministro de
juveniles, el cultivo de peces en jaulas flotantes o sumergidas, en zonas protegidas,
en mar abierto y en estanques de tierra, esto tiene un alto potencial en Latinoamérica
(Alcalá-Carrillo et al., 2016).
En este sentido, el presente estudio propone evaluar el uso de medicamentos
homeopáticos sobre variables zootécnicas (crecimiento y supervivencia), al igual que
indicadores de nutrición, salud (histoquímica e histopatología) y sistema inmune de
los peces (células leucocitarias), que permitirán responder la interrogante planteada.
2.4 Importancia del análisis histopatológico.
El análisis histológico de órganos que reaccionan de manera importante y
medible a estímulos específicos externos o internos, constituye una herramienta
6
sensible y específica mediante el cual se pueden apreciar alteraciones en los tejidos.
Dichos órganos son conocidos como “órganos diana”, entre los cuales se incluyen
branquias e hígado, que son considerados para las evaluaciones histopatológicas,
tanto en vertebrados como en invertebrados acuáticos (Rojas et al., 2012). Las
branquias están directamente expuestas al flujo continuo del medio líquido
circundante y son las más susceptibles a las variaciones ambientales (Cajaraville et
al., 2000). El hígado es igualmente susceptible porque desempeña una función muy
relevante en los procesos de desintoxicación del organismo (Goessling & North,
2011).
Las branquias son los órganos respiratorios en los peces, encargados de realizar
el intercambio gaseoso con el agua. El conocimiento de su morfología y su fisiología
es de gran importancia porque al describir sus características estructurales normales,
se obtiene una referencia valiosa para determinar lesiones y enfermedades causadas
por diversos agentes contaminantes (Bernet et al., 1999). Por esta razón, los tejidos
branquiales son utilizados como biomarcadores histopatológicos (Verján et al., 2001;
Giari et al., 2007).
Torres et al. (2010) describen histológica y ultraestructuralmente la complejidad
de las branquias y de sus tejidos, entre ellos el epitelial, cuya estructura permite el
intercambio óptimo de gases y de otras sustancias. La formación de los pliegues en
la mucosa y la morfología de micropliegues, con su capa de glicocálix, son
consideradas estructuras importantes en la retención de moco y son
extremadamente sensibles al estrés, grado de madurez celular y a los cambios
ambientales (Wong & Wong, 2000; Mazón et al., 2002; Ferguson, 2006). Las células
caliciformes que están presentes en este órgano, secretan mucinas que son
glicoproteínas que permiten la lubricación del epitelio, forman una película de
protección mecánica en éste y crean una interfase entre el ambiente acuoso y el
tejido; además, participan en la regulación iónica y en la protección inmunológica, ya
que actúan como barrera contra daños mecánicos, desgaste, infecciones
bacterianas, agentes patógenos, y sustancias tóxicas (Ferguson, 2006; Junqueira et
7
al., 2008; Genten et al., 2009). En la base de la lamela y en el epitelio opercular, se
encuentran las células osmorreguladoras de cloro, ricas en mitocondrias, que
secretan NaCl a través de un gradiente electroquímico producido por la acción de
una ATPasa Na+/K+, y participan en el balance ácido base y en los procesos de
aclimatación (Torres et al., 2010).
Varios estudios demuestran que los filamentos que forman parte de la estructura
de las branquias, pueden resultar afectados por exposición a metales, sólidos
suspendidos y otras sustancias tóxicas. Los daños morfológicos ocasionados
interfieren con la alimentación, el crecimiento y el desarrollo del individuo; por lo que
los filamentos branquiales son usados frecuentemente como indicadores de
importancia ecológica (Verján et al., 2001; Lyons et al., 2006).
El aparato digestivo de los teleósteos está formado por el tracto gastrointestinal,
un tubo que se extiende desde la cavidad oral hasta el ano, y una serie de órganos
anexos como el hígado, páncreas y vesícula biliar que secretan enzimas digestivas
hacia el lumen (Romero-Freire, 2013). El tracto gastrointestinal además de ser un
órgano reconocido en el proceso de la digestión y absorción de nutrientes, también
participa en el sistema inmune ya que sirve como una barrera importante y protege a
los peces de patógenos que pueden ser transmitidos por estar incluidos en el
alimento (Byadgi et al., 2014).
El tejido linfoide del intestino del pez comprende leucocitos intraepiteliales que se
extienden por toda la mucosa, destruyen las células infectadas y atraen a otras
células inmunes (Isolauri et al., 2001; Cardenas-Reyna et al., 2016). El aumento de
los leucocitos intraepiteliales, que generalmente son los linfocitos T, tiene una
implicación trascendental en el mantenimiento de la tolerancia oral, los procesos de
inflamación intestinal y la protección contra los patógenos (Cardenas-Reyna et al.,
2016). En los teleósteos, la mucosa del intestino está formada por epitelio cilíndrico
simple (enterocitos o células de absorción), microvellosidades, vacuolas y células
productoras de moco. Además, tienen un sistema inmune adaptativo basado en
8
anticuerpos, células B, células T, macrófagos y granulocitos, que ejercen un rol vital
en la respuesta inmune local que se da durante el proceso de la inmunización y la
inflamación (Gomez et al., 2013; Byadgi et al., 2014; Cardenas-Reyna et al., 2016).
El hígado y el páncreas, considerados como órganos parenquimatosos, están
asociados al aparato digestivo. El hígado está formado por células poligonales,
denominadas hepatocitos, y por fibras de sostén. El páncreas se divide en dos
regiones superpuestas: el páncreas endocrino, formado por los islotes de
Langerhans, que sintetizan hormonas que regulan el metabolismo de la glucosa; y el
páncreas exocrino, compuesto por glándulas acinares zimogénicas que secretan
enzimas y precursores digestivos. Torres et al. (2010) en su evaluación anatómica,
histológica y ultra estructural del hígado de Oreocrhomis niloticus, describen que los
hepatocitos se muestran alineados en filas conformando cordones de forma muy
similar en muchos teleósteos, y a su vez, identifican los lobulillos hepáticos, y las
triadas, como también la presencia de acinos pancreáticos asociados a ductos
biliares localizados dentro del parénquima hepático. Ultraestructuralmente, los
hepatocitos presentan características muy similares, como un alto contenido de
glucógeno en su citoplasma, que es relativamente pobre en organelos.
El hígado en los peces es un órgano metabolizador por excelencia de todas las
sustancias que llegan por vía sanguínea, razón por la cual, sirve como un referente
histológico para el análisis del daño tisular causado por sustancias contaminantes del
medio ambiente, como pesticidas, metales pesados y otros (Amaral et al., 2002). La
histopatología hepática como biomarcador de referencia, tiene una amplia aplicación
para determinar la presencia de lesiones inflamatorias, toxicohepáticas,
preneoplásicas, y neoplásicas, por lo que se ha convertido en una valiosa
herramienta integrativa en programas de monitoreo ambiental (Torres et al., 2010).
2.5 Alteraciones histopatológicas en peces
Existe gran variedad de parásitos en los peces, con la probabilidad de que la
mayoría de las especies de peces alberguen uno o más. En condiciones de
9
portadores normales, los peces a menudo muestran pocos o ningún signo clínico de
infección, pero es un hecho que todos los tejidos pueden ser infectados, incluyendo
la sangre. Las infecciones parasitarias en peces son muy comunes, especialmente
en las poblaciones silvestres de diversos ambientes, donde existan las condiciones
ecológicas favorables para huéspedes intermediarios que facilitan la transmisión del
parásito (Feist & Longshaw, 2008). Estos autores explican que los endoparásitos
pueden encontrarse en casi todos los órganos internos de los peces, aunque
diferentes especies tendrán nichos específicos dentro del hospedero. Los parásitos
tienen ciclos de vida complejos que involucran al menos dos huéspedes. Los niveles
de infección presentes en el órgano o tejido afectado, influencian una gama de
respuestas histopatológicas que pueden variar desde encapsulación benigna del
parásito mediante células portadoras, a una inflamación aguda y/o crónica del órgano
o tejido perjudicado.
En el caso de endoparásitos como los coccidios, éstos generalmente provocan
infecciones intestinales o extraintestinales (Dykova & Lom, 2007), aunque también se
han encontrado en otros órganos como hígado, ciego pilórico y testículo de varias
especies de peces (Morrison & Hawkins, 1984; Abollo et al., 2001; Marty et al., 1998;
Morrison & Marryatt, 2012). Los estudios histopatológicos demuestran que las
primeras etapas de crecimiento de estos organismos se observan en la superficie de
los enterocitos intestinales sin que éstos provoquen daño aparente al huésped; no
obstante, la localización intracelular dentro de una vacuola parasitófora en sus
etapas de desarrollo, induce cambios degenerativos en las células del organismo
portador (Feist & Longshaw, 2008). De acuerdo con Monlár (1989), las infecciones
intensas con Goussia carpelli y Goussia subepithelialis, afectan al epitelio intestinal
de la carpa Cyprinus carpio L, causan la rotura de las células infectadas y generan
una respuesta inflamatoria que resulta en enteritis grave, alterando el epitelio y los
tejidos conectivos subyacentes.
Otra de las causas que pueden ocasionar alteraciones histopatológicas en los
peces, son las condiciones del medio en el que se desarrollan los organismos. Varios
10
estudios han demostrado que cuando los peces son expuestos a metales, sólidos
suspendidos, herbicidas, hidrocarburos y demás sustancias tóxicas, sufren daños
graves e irreversibles en órganos como branquias, hígado y riñón, entre otros
(Jiraungkoorskul et al., 2003; Segnini de Bravo et al., 2005; Lyons et al., 2006;
Camargo & Martinez, 2007; Jines-Muñoz, 2012).
2.6 Sistema Inmune de los peces
El sistema inmune de los peces es efectivo para protegerlos frente a
enfermedades infecciosas, debido a que tiene un conjunto de mecanismos como
barreras mecánicas, sistema de defensa celular y humoral inespecífico y sistema de
defensa celular y humoral específico. Las barreras mecánicas son consideradas la
primera línea de defensa del pez y lo componen la piel, que incluye la dermis,
epidermis, escamas y mucus. El mucus está compuesto de glucoproteínas y actúa
como barrera física y química, ya que contiene lisozima, enzimas proteolíticas y
proteína C reactiva, entre otros, que inhiben e impiden la invasión bacteriana.
Inclusive, se ha reportado que algunos animales inmunizados han portado
aglutininas e inmunoglobulinas específicas en el mucus (Luque-Lara, 1997). La
respuesta inmune innata o inespecífica, depende de varios mecanismos
filogenéticamente muy antiguos que pueden eliminar a los patógenos del organismo
o bloquear su entrada de forma no específica.
La respuesta inmune combinada o específica es inducible, puesto que
intervienen dos elementos, la respuesta humoral mediada por anticuerpos y la
presencia de una serie de células que reaccionan específicamente con el antígeno
inductor, que son principalmente los linfocitos T, aunque también actúan en
cooperación los fagocitos y moléculas efectoras (Luque-Lara, 1997; Bernstein et al.,
1998; Fernández et al., 2002). En los peces hay una serie de inmunomoduladores
cuyas funciones son muy similares a las citoquinas de mamíferos; sin embargo, las
citoquinas no han podido ser aisladas en este grupo de organismos (Luque-Lara,
1997).
11
2.6.1 Linfocitos
Es un hecho que en los peces existen células equivalentes a los linfocitos T y B
de mamíferos, según posean inmunoglobulina en su superficie (LB o Sig +) o no la
posean (LT o Sig -). Los linfocitos T y B de peces asumirían funciones citotóxicas y
sintetizadoras de inmunoglobulinas, similares a las de los mamíferos. Estas células
están presentes en los peces y se suelen describir como linfocitos granulares
pequeños, que son células no B y no T, semejantes a los "natural-killers" de
mamíferos y están implicadas principalmente en la resistencia a protozoos (Luque-
Lara, 1997).
2.6.2 Monocitos
En peces, al igual que en mamíferos, se relaciona a los monocitos como
precursores de los macrófagos, aunque esta particularidad todavía no está muy
clara, ya que se hace referencia a macrófagos, cuando éstos se localizan en tejidos
(Campbell, 1988; Fernández et al., 2002). En sangre circulante de salmónidos, los
monocitos son escasos (Fernández et al., 2002); sin embargo, aumentan tras una
infección o con la inoculación de material particulado, extraño, inerte o antigénico, y
actúan como fagocitadores. Por esta razón, su presencia en tejidos inflamados es
abundante (Campbell & Murru, 1990; Fernández et al., 2002). Estas células se
localizan principalmente en riñón y bazo, donde concentran el material fagocitado y
pasan a formar parte de los centros melanomacrófagos (Campbell & Murru, 1990).
Los melanomacrófagos contienen melanina y otros tipos de pigmentos como
lipofuscinas y hemosiderina, entre otros. Su función no está del todo descrita, pero se
sabe que están presentes en aquellos lugares donde hay agresiones tisulares y
aparentemente secuestran al material extraño degradándolo o almacenándolo en su
interior (Luque-Lara, 1997).
2.6.3 Neutrófilos
Como funciones principales, Los neutrófilos son mediadores de la respuesta
inflamatoria aguda y se desplazan por la sangre, migrando a los lugares de
12
inflamación, en respuesta a estímulos quimiocinéticos. Otras funciones de estas
células son la fagocitosis y la actividad microbicida mediada por el proceso
denominado explosión respiratoria. Esta última consiste en la capacidad de convertir
el oxígeno molecular en una serie de compuestos o metabolitos de oxígeno, entre
ellos el anión superóxido (O2-) y el peróxido de hidrógeno (H2O2), que son potentes
microbicidas capaces de dañar moléculas orgánicas (Plyzycz et al., 1989; Fernández
et al., 2002).
2.6.4 Eosinófilos
Son células de muy escasa aparición en sangre de salmónidos (Ellis, 1977;
Thuvander et al., 1987); sin embargo, se encuentran con más frecuencia en sangre
de ciprínidos y peces cartilaginosos (Campbell & Murru, 1990; Hine, 1992; Fernández
et al., 2002). Aunque no existen evidencias claras, se ha comparado a los eosinófilos
con los mastocitos o células mast, debido a que intervienen en los procesos de
inflamación y defensa celular mediante degranulación (Powell et al., 1991; Fernández
et al., 2002); por ejemplo, en procesos de inflamación en trucha arco iris
Oncorhynchus mykiss causados por los productos extracelulares (ECPs) de
bacterias patógenas como Aeromonas salmonicida y Vibrio anguillarum. En este
estudio se ha relacionado la degranulación de células eosinófilas granulares con la
presencia de histamina en sangre y se han encontrado este tipo de células en bazo y
pronefros (Lamas et al., 1994; Fernández et al., 2002).
2.6.5 Basófilos
Se les considera ausentes en la circulación de la mayoría de especies de
salmónidos (Ellis, 1977; Hine, 1992), y existe poca información referente a este tipo
celular, pero según estudios ultraestructurales y citoquímicos, se pueden confundir
con eosinófilos y no se pueden hacer analogías con las células de mamíferos
(Fernández et al., 2002).
13
3 Justificación
El pargo lunarejo L. guttatus es un pez marino con interés productivo y comercial,
tanto para la pesca como para la acuicultura. Es muy común que el cultivo de peces
se vea afectado por la presencia de patógenos parasitarios, bacterianos o virales y
que éstos propicien enfermedades y causen mortalidades en los organismos. El
desarrollo de patógenos cada vez más resistentes a los tratamientos tradicionales ha
conducido al aumento sistemático de antibióticos de nueva generación, pero esa
cadena incremental debe detenerse por ser contraproducente a largo plazo. Por ello,
es indispensable estudiar nuevas terapias alternativas de prevención y control, para
ofrecer soluciones a la naciente industria acuícola mexicana dedicada a la
piscicultura marina. En este sentido, se busca fortalecer el sistema inmune de los
organismos cultivados para propiciar la activación de sus mecanismos innatos de
defensa que en términos evolutivos les han permitido sobrevivir y sobrellevar a
patógenos y parásitos. En consecuencia, la homeopatía tiene un gran potencial e
inocuidad. El medicamento homeopático, aun en dosis mínima, es capaz de
incrementar la respuesta inmune en humanos, animales y plantas, favorecer su
resistencia ante patógenos en situaciones de estrés y propiciar una mejor
recuperación post-infección, sin causar desequilibrios en la fisiología general y en la
homeostasis dinámica interna del organismo (Bellavite, 2006; Toledo et al., 2011;
Torres, 2012). El desarrollo de estos estudios en juveniles de pargo lunarejo permitirá
generar nuevo conocimiento científico y potenciales aplicaciones zootécnicas en
sanidad e inocuidad de los peces cultivados con aplicabilidad en investigación y en
producción.
14
4 Hipótesis
Los diferentes medicamentos homeopáticos adicionados en el alimento de
juveniles de pargo lunarejo L. guttatus, pueden fortalecer el sistema inmune, lo cual
favorecerá su crecimiento, supervivencia, nutrición y salud, debido a una mejor
asimilación del alimento y acumulación de reservas metabólicas en los órganos
objetivo.
5 Objetivos
5.1 Objetivo general
Evaluar el efecto de diferentes medicamentos homeopáticos incluidos en la dieta
de pargo lunarejo, sobre el crecimiento y supervivencia, así como la presencia de
indicadores histológicos e histoquímicos de nutrición y salud.
5.2 Objetivos específicos.
Determinar el crecimiento (peso y longitud) y la supervivencia (%) en juveniles
de L. guttatus, sometidos a los diferentes tratamientos homeopáticos.
Evaluar la condición nutricional de los organismos mediante el contenido de
carbohidratos en hígado de juveniles de L. guttatus.
Cuantificar las células mucosas en branquias e intestino de juveniles de L.
guttatus.
Identificar y cuantificar los diferentes tipos de leucocitos (linfocitos, monocitos,
neutrófilos, eosinófilos y basófilos) como indicadores de salud en juveniles de
L. guttatus.
15
Evaluar la prevalencia e intensidad de lesiones asociadas a la posible
presencia de parásitos y patógenos mediante análisis histopatológico en
branquias, hígado, intestino y estómago de juveniles de L. guttatus tratados
con homeopatía.
6 Materiales y métodos
6.1 Obtención y manejo de juveniles de L. guttatus
El experimento se realizó en la Planta Piloto Experimental del Centro Regional de
Investigación Pesquera (CRIP, La Paz) dependiente del Instituto Nacional de Pesca
(INAPESCA). Se dispuso de 458 peces, con un peso y longitud promedio inicial de
1.9 ± 0.1 g y 4.9 ± 0.6 cm respectivamente, de los cuales, 28 se destinaron al
muestreo inicial y el resto (430) fueron distribuidos en grupos de 43 en 10 unidades
experimentales cilíndricas de fibra de vidrio, con capacidad total de 120 L y volumen
operativo de 100 L; el flujo proporcionado fue equivalente a un recambio diario del
900% y se utilizó agua de mar sin filtrar. Los 430 peces se aclimataron por 15 días y
se les proporcionó diariamente alimento ad libitum de la marca OTOHIME EP1 (pellet
extruido de 1.7 mm) con un mínimo de 48% de proteína cruda y un mínimo de 14%
de lípidos. Después de este período se inició el experimento y duró 45 días. A partir
del peso de los peces, se calculó la cantidad de alimento a suministrar, utilizando una
taza de alimentación del 10% de la biomasa por unidad experimental, y se ajustó esa
cantidad en el siguiente muestreo. El alimento se pesó diariamente y se dividió en
tres raciones que fueron proporcionadas en distintos horarios, 09:00, 12:00 y 15:00,
aproximadamente. Se monitorearon diariamente las condiciones de cultivo y se
registraron valores promedio de temperatura (22.21 ± 2.14° C); oxígeno disuelto
(5.52 ± 1.03 mg/L); salinidad (35.0 ± 0.6 ups) y pH (7.8 ± 0.1).
6.2 Diseño experimental
Se aplicó un Diseño Completamente al Azar (DCA) por duplicado, con cinco
tratamientos experimentales (Tabla 1). Se incluyeron como tratamientos tres
formulaciones homeopáticas (Passival®, Passival®/PhA, y Passival®/SiT), un
16
medicamento homeopático veterinario exclusivo para el control de endoparásitos e
infecciones en peces, EndectoTM/InfecçoesTM (End/Inf) y un tratamiento Control que
no recibió homeopatía.
Tabla 1. Esquema de los tratamientos evaluados en el Diseño experimental.
Tratamiento Experimental Réplicas Org / Réplica Org / Tratamiento
Passival® 2 43 86 Passival®/PhA 2 43 86 Passival®/SiT 2 43 86
End/InfTM 2 43 86 Control (sin homeopatía) 2 43 86
Total de organismos 430
6.3 Tratamientos homeopáticos
Se utilizaron diluciones/dinamizaciones para uso humano con registro en la
Secretaría de Salud como medicamentos homeopáticos (mezcla registrada como
Passival®, al igual que las combinaciones Passival®/PhA y Passival®/SiT) que han
sido preparados de acuerdo a la farmacopea homeopática en laboratorios
certificados como la Farmacia Homeopática Nacional con registro oficial de acuerdo
con la Ley de Salud y la Normatividad Oficial aplicable en México, y medicamentos
brasileños de uso veterinario, como la combinación de Endecto™ e Infecçoes™ que
son marcas registradas por Arenales Homeopathy. A partir de las dinamizaciones
centesimales de origen (30c), se prepararon nuevas dinamizaciones 31c, mediante
dilución centesimal y agitación en Vórtex durante 3 minutos. Se utilizó como vehículo
de dilución-agitación, etanol de calidad homeopática diluido en agua destilada hasta
obtener una concentración de 20 grados. Los medicamentos homeopáticos se
incorporaron en el alimento rociándolos, hasta obtener una mezcla completamente
uniforme. La dosis usada fue a razón del 5% volumen/peso.
6.4 Biometrías y obtención de muestras
Se realizó una biometría inicial (T0) en el cual se sacrificaron 28 individuos del
total de la población, previo a la distribución en los tanques experimentales, y una
17
biometría final (T45) en el que se obtuvieron 10 individuos por réplica (20 por
tratamiento experimental y control) para un total de 100 peces muestreados. Se
determinó la longitud total en centímetros y el peso en gramos de todos los
organismos. Durante la biometría inicial, debido al tamaño promedio de los peces
(4.9 ± 0.1 cm de longitud total) se fijaron completos en solución Davidson AFA,
mientras que en la biometría final, los peces se diseccionaron para obtener los
órganos objetivo (branquias, hígado, intestino y estómago) y fijarlos en solución
Davidson AFA para su posterior análisis histológico e histoquímico. Así mismo, se
tomaron muestras de sangre y se realizaron frotis sanguíneos para análisis
hematológico. En ambas biometrías, los peces fueron anestesiados con Eugenol®
comercial a una concentración de 0.4 mL/L, y se suspendió la alimentación durante
las doce horas previas. Con los parámetros biométricos obtenidos, se determinaron
las siguientes variables de respuesta.
6.4.1 Crecimiento
El crecimiento se evaluó mediante ganancia en peso y longitud, y tasa de
crecimiento específico (TCE). Se aplicaron las siguientes fórmulas:
Ganancia en peso (GP)
GP = peso inicial (g) - peso final (g)
Ganancia en longitud (GL)
GL = longitud inicial (cm) - longitud final (cm)
Tasa de crecimiento específico (TCE)
TCE = 100 X [(ln peso final (g) – ln peso inicial (g)) /días]
Donde: ln = Logaritmo natural
6.4.2 Supervivencia
18
La supervivencia (S) se determinó al finalizar el bioensayo mediante el conteo de
los peces vivos en cada tratamiento y se usó la siguiente fórmula.
6.4.3 Factor de conversión alimenticia (FCA)
Este índice se determinó de la siguiente forma.
FCA = total de alimento consumido (g) / ganancia en biomasa (g)
6.4.4 Factor de condición (FC)
Este índice se determinó de la siguiente forma.
FC = 100 X [(peso final / (longitud total final)³]
6.5 Análisis histológicos e histoquímicos
Estos análisis se desarrollaron en el Laboratorio de Histología e Histoquímica del
Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, S.C. (CIBNOR). El material
diseccionado se deshidrató en alcoholes de concentración incremental y se incluyó
en parafina (Anexo 1); se utilizó un sistema de inclusión de parafina (Histoembedder
Leica) y se creó un bloque para cada pez muestreado, 10 individuos por réplica (20
por tratamiento experimental y control), para un total de 100 bloques. En cada bloque
de parafina se colocaron branquias, hígado intestino y estómago. Se realizaron dos
cortes histológicos a 4 μm de grosor para cada bloque con un microtomo de rotación
(Leica RM 2155), obteniéndose en total 200 láminas histológicas que se colocaron en
portaobjetos; de las cuales, 100 se tiñeron en solución Hematoxilina-Eosina (Anexo
2) de acuerdo a Humason (1979); Sheehan y Hrapchak (1980), y 100 láminas
histológicas se tiñeron en Azul Alciano (Anexo 3) de acuerdo a Sheehan & Hrapchak
(1980), utilizando un teñidor automático (Leica ST5020). Las láminas teñidas se
montaron en cubreobjetos de vidrio con resina sintética y sus características
histológicas fueron observadas a varios aumentos en un microscopio compuesto
(Olympus BX41), acoplado a una cámara digital (CoolSNAP-Pro).
19
El método de tinción Azul Alciano tiñe de color magenta los mucopolisacáridos
neutros, de color azul los mucopolisacáridos ácidos, y con tonalidades de púrpura a
azul oscuro, a las sustancias cartilaginosas. Las láminas teñidas con este método se
usaron para evaluar el contenido de carbohidratos en hígado y células mucosas en
branquias e intestino.
6.5.1 Carbohidratos en hígado (CH)
Para cuantificar carbohidratos en hígado, se evaluaron un total de 252 imágenes
a 40 X de aumento; éstas se analizaron mediante el software Image-Pro Plus® (v.6.0)
con el cual se calculó el área de cobertura de carbohidratos en el tejido, y se empleó
la siguiente fórmula.
6.5.2 Producción de mucinas en intestino (MI) y branquias
Para cuantificar la producción de mucinas en intestino (MI), se evaluaron un total
de 278 imágenes a 40 X de aumento. Se usó el software Image-Pro Plus® (v.6.0) con
el cual se calculó el área de cobertura de mucinas en el tejido y se empleó la
siguiente fórmula.
En el caso de las branquias, que tienen sustancia cartilaginosa y que también se
tiñeron de azul oscuro, las células mucosas fueron contadas una por una en cada
imagen de branquia capturada; se evaluaron un total de 322 imágenes a 20 X de
aumento. Para el análisis de imágenes también se usó el software Image-Pro Plus®
(v. 6.0).
20
6.6 Análisis hematológicos
Para el análisis de frotis sanguíneos se extrajo aproximadamente 0.1 a 0.15 mL
de sangre de la arteria caudal y se utilizaron jeringas plásticas con aguja 21G,
previamente heparinizadas. Enseguida se colocó una gota de sangre en la parte
central del portaobjetos y colocando otro portaobjetos en una posición de ángulo
agudo, se deslizó la muestra hacia el extremo opuesto, a fin de obtener una película
muy fina de sangre. Los frotis se secaron al aire, se fijaron en alcohol absoluto
durante 5 min, y se tiñeron con Hemacolor® siguiendo las indicaciones del fabricante
(Anexo 4). Las láminas teñidas se montaron en portaobjetos, con resina sintética y
posteriormente fueron observadas al microscopio en objetivo de inmersión (100X).
Se realizó un recuento diferencial de 100 células blancas por portaobjetos a varios
campos, y según sus características morfológicas se identificaron por tipo celular,
como linfocitos, monocitos, neutrófilos, eosinófilos o basófilos, para luego determinar
la proporción de cada uno de ellos.
6.7 Análisis histopatológicos
Los análisis histopatológicos se realizaron en el Laboratorio de Histopatología del
Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A.C. CIAD-Mazatlán. Los
tejidos se observaron a varios aumentos en un microscopio modelo Olympus BX53
con adaptación de una cámara digital Olympus Q Color 5. Para el análisis de
imágenes se usó el software Q-capture Pro (v.7.0).
6.7.1 Valor medio de evaluación (MAV) y Grado de cambio en el tejido
(DTC)
Se evaluaron las alteraciones histológicas en los tejidos objetivo mediante dos
criterios: 1) el Valor Medio de Evaluación (MAV) (Schwaiger et al., 1997; Simonato et
al., 2008) basado en la extensión de las lesiones, grado 1: sin alteraciones
patológicas; grado 2: cambios focales; grado 3: alteraciones patológicas extendidas,
y 2) Grado de Cambio del Tejido (DTC) propuesto por Poleksić y Mitrović-Tutundžić
(1994), que se basa en la gravedad de las lesiones y la posibilidad de recuperación
21
de los tejidos y órganos de la siguiente forma: Fase I, cambios que no dañan el
órgano de tal manera que se puedan reparar por sí mismo, siempre y cuando se
quite el factor estresante; Fase II, cambios que son más severos y que afectan la
función del tejido; Fase III, cambios que se oponen a la restauración del tejido aun
cuando se eliminen los factores estresantes. El cálculo del DTC se realizó para cada
pez mediante la siguiente fórmula:
DTC = 1 X Σ I + 10 X Σ II + 100 X Σ III
Que responde a la sumatoria del número de tipos de lesiones dentro de cada una
de las tres fases, multiplicado por el índice de fase, donde I, II y III son el número de
fases de las lesiones. El promedio DTC se dividió en cinco categorías: 0 a 10, órgano
funcionalmente normal; 11 a 20, órgano ligero a moderadamente dañado; 21 a 50,
órgano moderado a severamente dañado; 51 a 100, órgano dañado severamente; y
100, órgano dañado irreparablemente. Este método de evaluación se ha usado en
varios estudios histopatológicos en peces (Schwaiger et al., 1997; Simonato et al.,
2008; Chávez-Sánchez et al., 2014).
6.7.2 Evaluación de coccidios en intestino
La presencia de parásitos presentes en intestino de los juveniles, fue evaluada
mediante el criterio de asignación a los grados de severidad de infestación (Tabla 2)
propuesto por Ligbtner y Pantoja (1996), quienes asignan un valor numérico
cualitativo a estas alteraciones.
22
Tabla 2. Esquema generalizado para la asignación de un valor numérico cualitativo a
los grados de severidad de infecciones, infestaciones y síndromes.
6.8 Análisis estadístico
Se evaluó la normalidad de los datos mediante la prueba de Kolmogorov-
Smirnov y se verificó la homocedasticidad de varianzas con la prueba de Cochran C.
Se realizó un análisis de varianza de una vía (ANOVA) y se empleó a posteriori la
prueba de Tukey con una significancia estadística de p<0.05. Para los datos que no
presentaron una distribución normal y tampoco fue posible su transformación, se
utilizó la prueba de Kruskal-Wallis (p≤ 0.05) mediante una comparación múltiple de
rangos de medias para todos los grupos y se determinó las diferencias entre los
Grado de severidad
Observaciones clínicas o histológicas
0 No se observan signos de infección por el parásito.
No se observan lesiones características del síndrome.
1
El parásito se encuentra presente pero en números o cantidades que apenas sobrepasan los límites mínimos de detección.
Se observan lesiones características del síndrome pero la manifestación de la enfermedad es insignificante.
La prognosis es de efecto insignificante, excepto en casos tempranos de infección por un patógeno altamente virulento.
2
El parásito se encuentra en cantidades pequeñas o moderadas.
Se observan lesiones ligeras o moderadas, características del síndrome.
La prognosis es de posibles pérdidas en la producción o incrementos ligeros en la mortandad si no se aplica ningún tratamiento (en el caso de que la enfermedad sea tratable).
3
Se observan cantidades moderadas del parásito.
Se observan lesiones moderadas a severas, características del síndrome.
La prognosis es de un efecto potencialmente letal si no se aplica ningún tratamiento (en el caso de que la enfermedad sea tratable).
4
Se observan grandes cantidades del parásito.
Se observan lesiones severas, características del síndrome. Prognosis letal.
23
tratamientos versus el grupo Control. Los resultados se expresaron en medias y
desviación estándar. Se utilizó el software StatSoft. STATISTICA (v.10).
24
7 Resultados
Los parámetros físicos del agua (media ± desviación estándar) registrados a lo
largo del desarrollo experimental fueron: temperatura 22.2 ± 1.0° C; salinidad 35.0 ±
0.1 ups; oxígeno disuelto 5.5 ± 0.6 mg/L; y pH 7.8 ± 0.1. Los cuales se encuentran
dentro de los parámetros normales de cultivo de juveniles de L. guttatus.
7.1 Crecimiento
No se encontró diferencia significativa (p>0.05) en el crecimiento de los juveniles
de L. guttatus, tanto en peso como en longitud. Se registraron valores promedio
iniciales (T0) de 1.9 ± 0.1 g y de 4.9 ± 0.6 cm, así como valores promedio finales (T45)
de 9.8 ± 2.3 g y de 8.5 ± 0.7 cm. Las TCE mínimas fueron de 3.6%/día para el
tratamiento Passival® y el grupo Control, y las máximas de 3.9%/día para los
tratamientos Pass-SiT y End-Inf (Tabla 3).
7.2 Supervivencia
La supervivencia registrada en todos los tratamientos evaluados y en el grupo
Control fue mayor al 85% (Tabla 3) y no se registraron diferencias significativas entre
grupos experimentales (p>0.05).
7.3 Factor de conversión alimenticia (FCA)
No se encontraron diferencias significativas (p>0.05) en el FCA, el valor
promedio registrado fue 0.9. Los resultados se muestran en la Tabla 3.
7.4 Factor de condición (FC)
Al inicio del experimento se determinó un valor promedio de 1.5 ± 0.3 en el FC, y
al final del experimento el valor promedio registrado fue de 1.6 ± 0.1; no se
encontraron diferencias significativas (p>0.05) entre tratamientos. El valor máximo
25
calculado en el FC, fue 1.7 ± 0.3 para el tratamiento Pass-PhA y el valor mínimo fue
1.6 ± 0.1 para el resto de los tratamientos y el grupo Control (Fig. 1, Tabla 3).
Figura 1. Factor de condición (promedio ± desviación estándar) p>0.05, para
Lutjanus guttatus al inicio y al final del experimento.
-
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
Passival Pass-PhA Pass-SiT End-Inf Control
Fa
cto
r d
e C
on
dic
ión
Inicio Fin
26
Tabla 3. Crecimiento en peso (g) y longitud (cm), factor de condición y supervivencia (p>0.05), de juveniles de pargo
lunarejo L. guttatus tratados con medicamentos homeopáticos. Valores promedio ± desviación estándar, excepto
supervivencia.
Tratamientos Peso inicial
(g) Peso final
(g) Longitud inicial
(cm) Longitud final
(cm) TEC¹
(% día) FCA² FC³
Supervivencia (%)
Passival® 1.9 ± 0.6 9.5 ± 2.5 5.0 ± 0.6 8.4 ± 0.8 3.6 0.9 1.6 ± 0.1 97.7
Pass-PhA 2.0 ± 0.7 10.3 ± 2.4 5.0 ± 0.7 8.5 ± 0.6 3.7 0.9 1.7 ± 0.3 86.0
Pass-SiT 1.8 ± 0.7 10.0 ± 1.9 4.8 ± 0.6 8.5 ± 0.6 3.9 1.0 1.6 ± 0.1 86.0
End-Inf 1.8 ± 0.6 10.0 ± 2.1 4.9 ± 0.6 8.5 ± 0.6 3.9 0.9 1.6 ± 0.1 97.7
Control 1.9 ± 0.7 9.3 ± 2.4 5.0 ± 0.6 8.4 ± 0.7 3.6 0.9 1.6 ± 0.1 95.3
¹TEC Tasa específica de crecimiento = 100 X [(ln peso final (g) – ln peso inicial (g)) /días]
ln = Logaritmo natural
²FCA Factor de conversión alimenticia = peso seco del alimento ofrecido (g) / ganancia en biomasa (g)
³FC = 100 X [(peso final / (longitud total final)³]
27
7.5 Carbohidratos en hígado
Al concluir el experimento (T45) se registró un aumento en el contenido de
carbohidratos en hígado con respecto al grupo inicial. El análisis estadístico derivado
de los datos obtenidos durante el estudio histoquímico, mostró diferencias
significativas (p<0.05) en el contenido de carbohidratos en hígado (Figs. 2, 3 y 4). En
términos de porcentaje, los peces analizados al inicio del experimento (T0) y los
peces del grupo Control al final del experimento, presentaron una menor reserva de
carbohidratos (3.4 ± 3.0 y 5.5 ± 2.1%, respectivamente) en comparación con los
peces tratados con Passival® (28.4 ± 18.8%) y Pass-SiT (22.4 ± 0.4%).
Figura 2. Porcentaje promedio (± desviación estándar) de carbohidratos en hígado
de Lutjanus guttatus antes del experimento (grupo Inicial) y al final del experimento,
en los diferentes tratamientos y grupo control. Letras distintas muestran diferencias
significativas (p<0.05).
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
35.0
Grupo Inicial
Passival Pass-PhA Pass-SiT End-Inf Control
Ca
rbo
hid
rato
s e
n h
íga
do
(%
)
c
a
abc a
ab
bc
28
Figura 3. a) Hígado de L. guttatus al inicio del experimento, b) Hígado de L. guttatus
del grupo Control al final del experimento. Contenido de carbohidratos (Ch),
vacuolización lipídica (Vl). Azul Alciano, 40X.
a
Vl
Vl
Vl
bVl
Vl
Ch
Ch
29
Figura 4. a) Hígado de L. guttatus del grupo Control al final del experimento, b)
Hígado de L. guttatus tratado con el medicamento homeopático Passival®.
Contenido de carbohidratos (Ch), vacuolización lipídica (Vl). Azul Alciano, 40X.
Ch
Ch
Ch Vl
Vl
b
30
7.6 Producción de mucinas en intestino y branquias
Al concluir el experimento (T45) se registró un incremento en la cantidad de
mucinas en el intestino, con respecto al grupo inicial. Sin embargo, el análisis
estadístico derivado de los datos obtenidos durante el estudio histoquímico, no
mostró diferencias significativas (p>0.05) en la cantidad de mucinas en intestino entre
los tratamientos y el grupo control. El porcentaje promedio de cobertura de mucinas
en este tejido fue de 1.8 ± 0.6% para los peces del grupo Inicial; 2.7 ± 0.8% para el
tratamiento Passival®; 3.2 ± 1.6% y 3.5 ± 1.6% para los tratamientos Pass-PhA y
End-Inf, así como 4.2 ± 2.5% y 4.3 ± 0.7% para el tratamiento Pass-SiT y el grupo
Control, respectivamente (Fig. 5). No obstante, la cantidad de células mucosas
producidas en branquias fue significativamente diferente (p<0.05) entre los grupos
tratados y el grupo Control (Figs. 6 y 7).
Figura 5. Porcentaje promedio (± desviación estándar) de producción de mucinas en
intestino de L. guttatus al principio (grupo Inicial) y al final del experimento en los
diferentes tratamientos y en el grupo Control. n = número de individuos.
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
Grupo Inicial
Passival Pass-PhA Pass-SiT End-Inf Control
Mu
cin
as
en
in
tes
tin
o (
%)
n = 10
n = 14
n = 15
n = 15
n = 17 n = 15
31
Los tratamientos en donde se observaron significativamente más cantidad de células
mucosas en branquias (p<0.05) fueron End-Inf (43 ± 0.7), Pass-SiT (40 ± 4.2) y
Pass-PhA (39 ± 4.9) con relación al grupo Inicial y al grupo Control (19 ± 0.7 y 28 ±
3.5, respectivamente) y se muestran en la Figura 6. Además, se puede observar las
diferentes abundancias de estas células en la Figura 7.
Figura 6. Número promedio (± desviación estándar) de células mucosas producidas
en branquias de L. guttatus al principio (grupo Inicial) y al final del experimento en los
diferentes tratamientos y el grupo Control. Letras distintas demuestran diferencias
significativas (p<0.05).
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Grupo Inicial
Passival Pass-PhA Pass-SiT End-Inf Control
N
cé
lula
s m
uc
os
as
c
bc
ab a a
bc
32
Figura 7. Branquias de juveniles de L. guttatus. a) grupo Control, b) grupo tratado
con Pass-SiT. Flechas señalan células mucosas producidas en el tejido. Azul
Alciano, 20X.
33
7.7 Células leucocitarias en sangre
En el recuento diferencial de células leucocitarias, se identificaron cinco tipos:
linfocitos, monocitos, neutrófilos eosinófilos y basófilos (Fig. 8a, b, c, d, f). Los
leucocitos predominantes fueron los linfocitos (74.7 ± 9%) seguido de los monocitos
(14.6 ± 3.8%), los neutrófilos (9 ± 5.5%) y eosinófilos (1.4 ± 1.1%). Del total de
células contadas en todas las muestras, aproximadamente 9000, sólo se registraron
dos casos de presencia de células basófilos (0.02 ± 0.03%).
La morfología que presentaron los linfocitos generalmente fue redonda, con un gran
núcleo teñido de violeta que abarcaba casi el 90% de la célula, y por esta razón el
citoplasma fue poco visible (Fig. 8a) Los monocitos tuvieron una forma redonda a
irregular, presentaron un núcleo excéntrico color violeta y de tamaño grande, aunque
en menor proporción que los linfocitos y con un citoplasma mayor de color azul
grisáceo, una característica distintiva de este tipo de células, fueron sus núcleos de
apariencia reniforme (Fig. 8b y c).
Se distinguieron neutrófilos juveniles los cuales tuvieron un núcleo granular,
redondo y excéntrico pero con apariencia en forma de banda y una coloración violeta
claro. También se observaron neutrófilos maduros con uno a dos núcleos, que
generaban una forma bilobular y en pocos casos multilobular. En ambos casos,
neutrófilos juveniles y maduros, los citoplasmas fueron granulares, de coloración
rosado grisácea y con bordes un poco irregulares (Fig. 8c y d).
Los eosinófilos mostraron un citoplasma granular de color pardo rojizo y un
núcleo excéntrico con su cromatina muy visible y compacta; la forma multilobular del
núcleo lo diferenciaba de los neutrófilos (Fig. 8e). Los dos basófilos encontrados se
diferenciaron del resto de células, por tener un citoplasma con muchas granulaciones
de color violeta oscuro, con un núcleo de apariencia poligonal y teñido de violeta (Fig.
8f).
34
Figura 8. Frotis de sangre periférica de L. guttatus. a) linfocito (Lf); b) monocito (Mn);
c) monocito (Mn), neutrófilo (Nt); d) neutrófilo en banda (Nt); e) eosinófilo (Eo); f)
basófilo (Bs). Tinción Hemacolor. 100X.
a) b)
c) d)
Lf Mn
MnMn
Nt
Mn
Mn
Nt
e) f) Bs
Eo
35
Se encontraron diferencias significativas (p<0.05) en el porcentaje de linfocitos y
neutrófilos con relación a los tratamientos homeopáticos evaluados. El tratamiento
End-Inf registró un mayor porcentaje de linfocitos y el tratamiento Pass-PhA fue el
que mostró un mayor porcentaje de neutrófilos. Los resultados se muestran en la
Tabla 4.
36
Tabla 4. Recuento diferencial de leucocitos en juveniles de L. guttatus tratados con diferentes medicamentos
homeopáticos versus el grupo Control. Valores en porcentaje promedio ± desviación estándar, de los diferentes tipos de
leucocitos identificados en juveniles de L. guttatus. Letras distintas indican diferencias significativas (p<0.05). n = número
de individuos. n = 18 para los tratamientos Passival, Pass- PhA y Pass-SiT; n = 16 para el tratamiento End-Inf y el grupo
Control.
Leucocitos Passival Pass – PhA Pass – SiT End – Inf Grupo Control
Linfocitos 78.4 ± 12.3 ab 59.7 ± 26.5 a 77.9 ± 12.4ab 83.3 ± 11.0 b 74.1 ± 15.4 ab
Monocitos 16.3 ± 14.1a 19.8 ± 17.4 a 14.3 ± 9.1 a 9.6 ± 8.9 a 12.9 ± 6.6 a
Neutrófilos 4.4 ± 3.4 a 17.2 ± 15.0 b 5.1 ± 4.3 ab 6.1 ± 4.9 ab 12.0 ± 14.2 ab
Eosinófilos 0.8 ± 1.2a 3.3 ± 4.7 a 1.1 ± 2.0 a 0.9 ± 1.3 a 1.1 ± 1.8 a
Basófilos 0.1 ± 0.2a 0.0 ± 0.0 a 0.0 ± 0.0 a 0.1 ± 0.3 a 0.0 ± 0.0 a
37
7.8 Histopatología de Lutjanus guttatus
7.8.1 Valor medio de evaluación (MAV) y Grado de cambio en el tejido (DTC)
Los órganos y tejidos de los peces muestreados al inicio del experimento,
mostraron caracteres patológicos y según el grado de alteraciones todos fueron
focales (MAV 2). Las lesiones observadas con mayor frecuencia en branquias fueron:
degeneración hidrópica y desprendimiento del epitelio lamelar (Figs. 9b, 10a y 10b).
En hígado se observó vacuolización lipídica (lipidosis hepática), núcleos de tamaño
irregular y hepatocitos binucleados (Figs. 11b y 12a). En páncreas se observó atrofia
y núcleos picnóticos (Fig. 12b). En intestino se observó pérdida de microvellosidades,
desprendimiento del tejido epitelial (Fig. 13a), y en estómago, se observó atrofia de
glándulas digestivas así como vacuolas en glándulas digestivas (Fig. 13b). Tanto en
hígado, como en intestino y estómago, las células rodlet siempre estuvieron
presentes con mayor frecuencia (Figs. 14, 15 y 16), mientras que en branquias se
identificaron células eosinófilas granulares (Mast cell).
38
Figura 9. a) Branquia normal de L. guttatus; b) degeneración hidrópica (Dh), lamelas
secundarias con posibles células eosinófilas granulares (CEG); algunos núcleos
picnóticos (Np) y pérdida de la integridad celular. H & E, 40X.
a
b
Dh
CEG
Np
Np
39
Figura 10. a) Branquia L. guttatus con degeneración hidrópica (Dh), telangiéctasis
(Tg), células eosinófilas granulares (CEG) y pérdida de la integridad celular (Pt). H &
E, 40X; b) infiltrado inflamatorio (If), hiperplasia del epitelio lo que genera una fusión
de las lamelas secundarias y desintegración tisular (Fl), degeneración hidrópica (Dh),
células eosinófilas granulares (CEG). H & E, 40X.
aDh
Dh
Tg
Tg
CEG
Pt
Pt
CEG
b
Dh
Dh
If
CEG
CEG
CEG
Fl
40
Figura 11. a) Hígado sano de L. guttatus; b) vacuolización lipídica y pérdida de la
arquitectura tisular (Vl), hepatocitos binucleados (Hb), núcleo con dos nucleolos (Nc).
H & E, 100X.
Vl
b
Vl
Hb
Hb
Hb
Hb
Nc
41
Figura 12. Hígado afectado de L. guttatus. a) núcleos picnóticos de forma y tamaño
irregular (Np), pérdida de la integridad tisular y hepatocitos sin núcleo (Sn); b)
núcleos picnóticos de páncreas (Np), vacuolas (Vl), células rodlet (CR). H & E, 100X.
a
Np
Np
Sn
Sn
Sn
Np
b
CR
V
Np
Np
V
V
42
Figura 13. a) Microvellosidades en intestino de L. guttatus (Mv) pérdida de
microvellosidades (Pm), célula rodlet (CR); b) estómago con atrofia en glándulas
digestivas (At) y vacuolas en glándulas digestivas (V). H & E, 100X.
CR
a
Mv
Pm
b
At
At
AtAt
V
V
V
43
Figura 14. a) Células eosinófilas granulares (CEG) y células rodlet (CR) alrededor de
un vaso sanguíneo de hígado de L. guttatus tratado con medicamento homeopático,
núcleos picnóticos (Np) con forma y tamaño irregular. H & E, 40X; b) Células rodlet
(CR) alrededor y dentro de páncreas de L. guttatus, células eosinófilas granulares
(CEG), vacuolas en glándulas del páncreas (V), núcleos picnóticos en glándulas
(Np). H & E, 100X.
CR
a
Np
Np CR
CEG
CEG
CEG
CR
Np
b
V
V
V
Np
CEG
CEG
CR
Np
CRCR
CEG
44
Figura 15. a) Abundantes células eosinófilas granulares (CEG) en la lámina propia
del intestino, pérdida de microvellosidades (Pv); b) células rodlet (CR) entre los
enterocitos del intestino. H & E, 100X.
a
Pv
CEG
CEG
CEG
b
CR
CR
CR
45
Figura 16. a) Células rodlet (CR) en intestino de L. guttatus intentando atravesar la
capa muscular circular y alrededor de los enterocitos, CEG en la lámina propia; b)
células rodlet (CR) intentando atravesar la muscular externa del estómago, glándulas
digestivas (Gd). H & E, 100X.
a
CR
CEG
CEG
CR
CR
bCR
CR
Gd
46
Al final del experimento se observaron diferencias significativas (p<0.05) en el
grado de alteración (MAV) de los órganos y tejidos de los peces. Los juveniles de L.
guttatus tratados con Pass-PhA, Pass-Sit y End-Inf mostraron en promedio un menor
grado de alteraciones focales, tanto en intestino como en estómago, comparados con
los peces muestreados al inicio del experimento.
Con respecto al grado de cambio del tejido (DTC), se observaron diferencias
significativas (p<0.05) en hígado, intestino y estómago. En branquias no se
encontraron diferencias estadísticas (p>0.05) en ninguno de los tratamientos
evaluados. Las alteraciones patológicas observadas en este tejido fueron clasificadas
como grado I y se muestran en la Tabla 5.
Los valores calculados para DTC en hígado fueron significativamente menores
(p<0.05) en los peces muestreados al inicio del experimento, comparado con los
peces tratados y el grupo Control al final del experimento (Tabla 6). El valor medio
del DTC en el muestreo inicial fue de 273.81, lo que indica que este órgano ya
estaba irreparablemente dañado pero de manera parcial, debido a que las lesiones
se presentaron de manera focal. Al final del experimento, los valores medios más
altos del DTC fueron para los peces tratados con End-Inf (1955.90) y para el grupo
Control (1895.44), mientras que los peces tratados con Passival mostraron los
valores medios de DTC más bajos (1286.50), y de igual forma, estos valores indican
que este órgano seguía dañado irreparablemente de manera focal.
Las características que inicialmente presentaron los peces fueron clasificados
como grado I en hígado, y atrofia en páncreas clasificado como grado II. En ambos
casos, el tejido estaba de ligero a moderadamente dañado. También se observó
núcleos picnóticos en páncreas, que se clasificó como grado III. Además se
observaron núcleos picnóticos en los hepatocitos, que también se clasificaron como
grado III (Fig. 12). Al final del experimento, las lesiones hepáticas aumentaron en los
peces tratados y también en el grupo Control, sin embargo, es necesario recalcar
47
que todas las alteraciones evidenciadas en estos tejidos se presentaron de manera
focal (MAV 2), como se indica Tabla 5.
Los valores medios calculados para DTC en intestino (Tabla 6) fueron
significativamente menores (p<0.05) en los peces tratados con Pass-PhA (1.28),
Pass-Sit (1.00), End-Inf (1.30) con respecto a los peces muestreados previo al
experimento (2.82), aunque este valor indica que el órgano estaba funcionando
normalmente. Todas las alteraciones en este tejido fueron clasificadas como grado I,
excepto la pérdida de microvellosidades que se clasificó como grado II (Tabla 5).
Los valores calculados para DTC en estómago fueron significativamente
menores (p<0.05) en los peces tratados y el grupo Control (valores medios oscilaron
entre 0.29 y 1.33), con respecto a los peces muestreados al inicio del experimento
(3.25), estos resultados se muestran en la Tabla 6. Todas las alteraciones en este
tejido fueron clasificadas como grado I, excepto unas vacuolas en glándulas
digestivas que se clasificaron como grado II (Tabla 5).
48
Tabla 5. Valoración de los cambios patológicos observados en los tejidos de los
juveniles de L. guttatus, al inicio y durante experimento. Grado de alteración (MAV) y
grado de cambio (DTC)
Cambios patológicos MAV DTC
Branquias
Telangiectasia 2 I
Fusión lamelar por hiperplasia 2 I
Infiltrado inflamatorio 2 I
Células eosinófilas granulares (Mast cell) 2 I
Desprendimiento del epitelio lamelar 2 I
Degeneración hidrópica de células epiteliales (edema) 2 I
Células Rodlets 2 I
Melanización 2 I
Hígado
Vacuolización lipídica (lipidosis hepática) 2 I
Atrofia nuclear 2 I
Núcleo de forma irregular 2 I
Núcleo de tamaño irregular 2 I
Hepatocitos binucleados 2 I
Núcleos (dos nucleolos ) 2 I
Núcleos en posible mitosis 2 I
Núcleos picnóticos 2 III
Melanización 2 I
Inflamación 2 I
Inclusiones eosinófilas brillantes 2 I
Células eosinófilas granulares (Mast cell) 2 I Células Rodlets 2 I
Melanización en páncreas 2 I
Vacuolas en páncreas 2 I
Atrofia de páncreas 2 II
Núcleo picnótico en páncreas 2 III
Intestino
Infiltrado inflamatorio intestino 2 I
Células eosinófilas granulares (Mast cell) 2 I
Pérdida de microvellosidades 2 II
49
Macrófagos cargados con pigmentos 2 I
Desprendimiento de tejido epitelial 2 I
Células Rodlets 2 I
Estómago
Atrofia de glándulas digestivas 2 I
Infiltrado inflamatorio 2 I
Vacuolas en glándulas digestivas focal 2 II
Células eosinófilas granulares (Mast cell) 2 I
Desprendimiento del tejido epitelial 2 I
Células Rodlets 2 I
Macrófagos cargados con pigmentos 2 I
MAV 1: no hay alteraciones patológicas; MAV 2: alteraciones focales; MAV 3:
alteraciones extendidas. DTC I: cambios que no dañan el órgano de tal manera que
se puedan reparar por sí mismos, siempre y cuando se quite el factor estresante;
DTC II: cambios que son más severos, pero que afectan la función del tejido; DTC III:
cambios que se oponen a la restauración del tejido aun cuando se eliminen los
factores estresantes.
Tabla 5. Continuación
50
Tabla 6. Grado de alteración (MAV) y grado de cambio (DTC) ocurrido en los órganos de juveniles de L. guttatus tratados
con diferentes medicamentos homeopáticos, versus el grupo Control.
Valores de media ± desviación estándar de MAV y DTC. Letras distintas indican diferencias significativas (P<0.05).
Valores de DTC: 0 a 10, órgano funcionalmente normal; 11 a 20, órgano ligero a moderadamente dañado; 21 a 50,
órgano moderado a severamente dañado; 51 a 100, órgano dañado severamente; y >100, órgano dañado
irreparablemente.
n = 28 muestreo inicial; n = 19 para tratamientos Passival® y Pass-PhA; n = 17 para tratamiento Pass-SiT; n = 20 para
tratamiento End-Inf; n = 18 para tratamiento Control.
Inicial
Tratamientos
Passival® Pass-PhA Pass-SiT End-Inf Control
MAV Branquias 1.46 ± 0.25a 1.47 ± 0.21a 1.65 ± 0.21a 1.46 ± 0.20a 1.51 ± 0.20a 1.63 ± 0.09a
Hígado 1.37 ± 0.19a 1.44 ± 0.13a 1.45 ± 0.10a 1.50 ± 0.12a 1.46 ± 0.07a 1.49 ± 0.09a
Intestino 1.48 ± 0.22a 1.32 ± 0.25ab 1.21 ± 0.19b 1.18 ± 0.15b 1.23 ± 0.19b 1.32 ± 0.31ab
Estómago 1.46 ± 0.20a 1.22 ± 0.26ab 1.09 ± 0.13b 1.03 ± 0.07b 1.05 ± 0.08b 1.11 ± 0.17b
DTC Branquias 4.46 ± 2.15a 3.78 ± 1.66a 5.11 ± 1.49a 3.71 ± 1.57a 4.05 ± 1.57a 4.94 ± 0.75a
Hígado 273.81 ± 452.35a
1286.50 ± 573.06b
1375.05 ± 596.11b
1594.76 ± 507.64b
1955.90 ± 223.35b
1895.44 ± 322.14b
Intestino 2.82 ± 1.22a 1.89 ± 1.45ab 1.28 ± 1.13b 1.00 ± 0.82b 1.30 ± 0.98b 1.94 ± 1.85ab
Estómago 3.25 ± 1.37a 1.33 ± 1.56b 0.54 ± 0.78b 0.18 ± 0.40b 0.29 ± 0.47b 0.60 ± 0.91b
51
7.8.2 Evaluación de coccidios en intestino
Se observó la presencia de coccidios en intestino en los peces muestreados al inicio
de experimento. Al final del experimento en todos los peces se registró la presencia
de estos parásitos, sin embargo, los peces tratados con EndectoTM/InfecçoesTM
presentaron la menor incidencia estadísticamente significativa (p<0.05) en
comparación con el grupo Control. En los peces tratados con este medicamento
homeopático de uso veterinario, utilizado para reducir la incidencia de ecto y endo
parásitos e infecciones, se registraron valores de 1.3 y 2.4 de presencia/ausencia,
respectivamente (Fig. 17).
Estos grados de severidad indican que los parásitos estuvieron presentes en
cantidades pequeñas a moderadas, sin provocar lesiones histológicas graves en
intestino. La evidencia histológica indicó que aun cuando no lograron infestar por
completo, estaban fijados en el tejido epitelial del intestino (Fig. 18a y b) y después
se desprendieron emigrando hacia la luz del intestino (Fig. 19). En algunos casos,
estos parásitos formaron leves evaginaciones en el epitelio intestinal.
Figura 17. Presencia de coccidios en intestino de L. guttatus evaluados con
diferentes medicamentos homeopáticos versus grupo Control, valores de media ±
desviación estándar. Letras distintas indican diferencias significativas (p<0.05).
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
Grupo Inicial
Passival Pass-PhA Pass-SiT End-Inf Control
va
lor
pre
se
nc
ia-a
us
en
cia
b
abab
a
b
a
52
Figura 18. a) Coccidios en intestino de L. guttatus desprendiéndose del epitelio hacia
la luz del mismo (Cc), células eosinófilas granulares (CEG); b) coccidio alrededor de
los enterocitos (Cc), pérdida de microvellosidades y desprendimiento del epitelio
(Pm), y CEG. H & E, 100X.
b
CEG
Cc
Pm
Pm
CEG
53
Figura 19. Intestino de L. guttatus. a) coccidios desprendidos en la luz del intestino
formando masas (flechas), H & E, 40X; b) coccidios en la luz del intestino (Cc),
macrófago cargado de pigmento (Mf). H & E, 100X.
54
8 Discusión
Los medicamentos homeopáticos que se usaron en este trabajo propiciaron
algunos cambios más a nivel celular, que en las variables zootécnicas estudiadas
como son el crecimiento, TCE, la supervivencia y el factor de condición de los
juveniles de L. guttatus. En un principio se habría asumido que el crecimiento de los
juveniles de pargo lunarejo podría verse modificado por la temperatura, debido a que
estudios de crecimiento en juveniles de lutjánidos reportan temperaturas superiores.
Sin embargo, a excepción de Abdo de la Parra et al. (2010) quienes obtuvieron
valores de TCE superiores a 4.3% día-¹ en L. guttatus, los demás estudios reportados
en las distintas especies de lutjánidos, demuestran TCE menores a las registradas
en el presente estudio (Watanabe et al. 2001; Abbas et al. 2005; Garduño-Dionate et
al., 2010). Estos autores plantean que las mejores TCE (% día-1) en juveniles de
lutjánidos, est n asociadas a temperaturas del agua ≥ 29°C y a dietas con niveles de
proteína que van desde 45 a 50% y de 9 a 16% de lípidos, pero existen otros
factores importantes como la salinidad, la jerarquía de tallas y la densidad de
siembra, entre otros, que también pueden modificar el crecimiento de los peces
(Anguas-Vélez et al., 2003; Alcalá-Carrillo et al., 2016).
Es posible también atribuir la falta de un efecto significativo de los medicamentos
homeopáticos utilizados, por el tiempo de duración en este estudio, que no haya sido
suficiente para apreciar diferencias en las variables zootécnicas.
La supervivencia en juveniles de L. guttatus tratados con medicamentos
homeopáticos fue superior al 85%. Al respecto, Valentim-Zabott et al. (2008)
demuestran que al evaluar los efectos de un complejo homeopático comercial sobre
el crecimiento de la tilapia del Nilo Oreochromis niloticus, los peces tratados con
homeopatía fueron significativamente más pequeños, pero tuvieron una
supervivencia significativamente mayor que otros grupos no tratados con
homeopatía. Al igual que en crecimiento, varios estudios reportan que las mejores
supervivencias en juveniles de lutj nidos est n asociadas a temperaturas del agua ≥
55
29°C y a dietas con niveles de proteína que van desde 45 a 50% y de 9 a 16% de
lípidos (Watanabe et al., 2001; Abbas et al., 2005; Abdo de la Parra et al., 2010;
Garduño-Dionate et al., 2010 & Alcalá Carillo et al., 2016). Sin embargo, en el
presente estudio se registró una temperatura promedio de 22.21 °C y la
supervivencia de los peces (en varios tratamientos) fue similar a las que se reportan.
Se registró un FCA promedio de 0.9 en los juveniles de L. guttatus y no se
mostraron diferencias significativas entre los tratamientos y el grupo Control. Aunque
no se registraron diferencias significativas en el crecimiento de los juveniles de L.
guttatus bajo las condiciones experimentales, los resultados obtenidos muestran un
mejor FCA que los citados anteriormente para la misma especie (Abdo de la Parra et
al., 2010; Alcalá Carillo et al., 2016) a excepción de los reportados para L.
argentimaculatus, que fueron menores (Abbas et al., 2005).
Se registraron valores de 1.5 ± 0.3 en el factor de condición y no se modificó
significativamente en los grupos de peces que recibieron tratamientos homeopáticos,
dado que al final del experimento, este índice fue de 1.6 ± 0.1 (Tabla 3). Estos
valores fueron similares a los que reportan Abdo de la Parra et al. (2010) en la misma
especie. Además, se ha reportado un factor de condición promedio de 1.7 en
juveniles de tilapia del Nilo Oreochromis niloticus, que fueron tratados con un
complejo homeopático comercial (Valentim-Zabott et al., 2008). El factor de condición
es una medida de robustez que aporta información fundamental sobre estrategias de
crecimiento, estado nutricional, reproductivo y de bienestar de los organismos
(González et al., 2006). Álvarez-Mendoza (1997) reportó que el factor de condición
de tres especies de peces Ictalurus punctatus, Micropterus salmoides, y Morone
saxatilis en estado de desnutrición moderada puede variar de 0.2 a 1.3, y para los
peces en estado de desnutrición severa puede variar de 0.04 a 0.4, mientras que en
los peces del grupo control puede registrarse un factor de condición de 1 a 3.5. Al
comparar nuestros resultados con estas referencias, podemos establecer que los
juveniles de L. guttatus estaban en buena condición nutricional.
56
A pesar de no propiciar diferencias en las variables zootécnicas de los juveniles
de L. guttatus tratados con medicamentos homeopáticos, se pudo observar cambios
significativos en la cantidad de carbohidratos en hígado, ya que tanto los peces
analizados al inicio del experimento como los del grupo Control al finalizar el estudio,
mostraron menores concentraciones de carbohidratos en relación a los peces
tratados con los medicamentos homeopáticos Passival® y Pass-Sit. El hígado
produce, utiliza, y almacena carbohidratos y es un órgano importante para el control
de la glucemia sistémica en los vertebrados (Viegas et al., 2013).
El contenido de carbohidratos en los peces varía mucho debido a diferentes
condiciones ambientales y en función de su propia condición y estado fisiológico, por
ejemplo: desove, migración, alimentación, inanición, entre otros (Manzoor et al.,
2014). Además, varias especies de peces pueden almacenar distintas proporciones
de glucógeno y grasa en su hígado (Wolf & Wolfe, 2005), como es el caso de la
trucha arco iris Oncorhynchus mykiss, que almacena principalmente glucógeno
(Hinton et al., 2001), mientras que los hepatocitos de la lubina rayada Morone
saxatilis tienden a almacenar una mezcla de glucógeno y grasa (Wolf & Wolfe, 2005).
En el caso de los juveniles de L. guttatus evaluados en el presente estudio, se
podría descartar que las menores o mayores concentraciones de carbohidratos
presentes en hígado estén asociadas a migración, inanición o procesos
reproductivos, debido a que se trata de un bioensayo realizado en laboratorio con
juveniles que presentaron buen valor de TCE y factor de condición. Sin embargo, el
hígado de estos peces, como se discutirá más adelante (análisis histopatológico), fue
el tejido que mayores cambios histológicos mostró, y estos cambios pudieran estar
relacionados con las variaciones en la cantidad de glucógeno correspondientes a
cada uno de los tratamientos evaluados, y de manera específica, a los que
incluyeron la aplicación de un medicamento homeopático.
En la tilapia de Nilo Oreochromis niloticus, se ha reportado que los peces
tratados con medicamentos homeopáticos presentaron un menor índice somático en
57
hígado, menos inclusiones de lípidos hepáticos, y por consiguiente, una mejora en la
condición de los hepatocitos y de los niveles de glucógeno intracelular (Valentim-
Zabott et al., 2008; Braccini et al., 2013).
En varios estudios se ha reportado que cuando los peces están sometidos a
situaciones de estrés, los niveles de cortisol y glucosa sanguínea se elevan (Wardle,
1972; Pickering & Pottinger, 1989; Thomas & Robertson, 1991). Esta elevación de
glucosa se debe a la movilización del glucógeno hepático (Wardle, 1972) y se
considera que su regulación está mediada por la insulina producida en el tejido de los
islotes pancreáticos en los peces (Epple, 1969). Los medicamentos homeopáticos
que contienen Passival® son usados para controlar pacientes en situaciones de
estrés. Aunque en el desarrollo este estudio los peces no fueron inducidos a ningún
factor estresante, se podría sugerir que los medicamentos homeopáticos Passival® y
Pass-Sit propiciaron una mayor acumulación de carbohidratos en hígado,
preparándolos ante cualquier agente estresante que se pudiera presentar y de esta
manera poder utilizar dicha energía para reaccionar de forma inmediata.
El sistema inmune de los peces teleósteos y cartilaginosos es adaptativo y
basado en anticuerpos, células B y células T. Sin embargo, el intestino, la piel y las
branquias, son las principales superficies de contacto con el medio ambiente. Están
cubiertas de mucus y de esta manera pueden actuar como barreras físicas e
inmunológicas ante agentes externos que afecten su integridad. En el caso de los
teleósteos, las superficies mucosas están provistas de anticuerpos específicos
(Gomez et al., 2013). El mucus y las mucinas que lo conforman se consideran uno de
los mecanismos innatos de defensa presente en las superficies mucosas y actúan
como barrera física y química, debido a que contiene lisozimas, enzimas
proteolíticas, y proteína C reactiva, entre otros, que inhiben e impiden la invasión
bacteriana.
En este estudio, aunque no se encontraron diferencias significativas (p>0.05) en
la cantidad de mucinas en intestino de juveniles de L. guttatus, se observó una mayor
58
cantidad de células mucosas en las branquias de los peces tratados con los
tratamientos homeopáticos End-Inf y Pass-SiT, con respecto a los peces del grupo
inicial y el grupo Control. Braccini et al. (2013) demostraron que en tilapia del Nilo O.
niloticus parasitada, el mayor aumento de células productoras de mucinas ácidas,
versus las células productoras de mucina neutras en branquias, se obtuvo en peces
tratados con medicamentos homeopáticos. Los medicamentos End-Inf y Pass-SiT
usados en este trabajo, actuaron como adyuvantes o promovieron una respuesta
inmunoespecífica favorable, al estimular la producción de glicoproteínas en el tejido
branquial. En este sentido, Luque-Lara (1997) plantea que existe una serie de
factores que pueden aumentar los niveles de protección frente a un agente infeccioso
y es lo que sucede posterior a la administración de sustancias inmunoestimulantes,
que actúan principalmente fortaleciendo las defensas inespecíficas del organismo
tratado, y administrados junto al antígeno pueden aumentar la respuesta específica
del organismo tratado.
En teleósteos y peces cartilaginosos, el intestino, la piel y las branquias son las
principales superficies de contacto que están cubiertas de mucus y de esta manera,
pueden actuar como barreras físicas e inmunológicas ante agentes externos que
afecten su integridad (Gomez et al., 2013).
La cantidad de leucocitos en sangre es muy variable y va a depender del
ambiente, la especie y las condiciones fisiológicas del organismo (Fernández et al.,
2002). Los leucocitos están implicados en la regulación de la función inmunológica
del organismo, y se incrementan como una respuesta protectora del cuerpo durante
el estrés (Del Rio-Zaragoza et al., 2011). La proporción de células leucocitarias
registrada en los juveniles de L. guttatus fue diferente en función de los tratamientos
homeopáticos evaluados.
Los resultados obtenidos durante el presente estudio sugieren que los
medicamentos homeopáticos End-Inf y Pass- PhA actuaron como activadores de la
respuesta inmune específica (Luque-Lara, 1997; Fernández et al., 2002) debido a
59
que dichos tratamientos se asociaron con la presencia de linfocitos y células
neutrófilos, éstas últimas relacionadas con la fagocitosis.
Los peces tratados con el medicamento End-Inf registraron un mayor porcentaje
de linfocitos. En ratones tratados con el medicamento homeopático CANOVA®
diseñado para optimizar la acción fagocítica de los macrófagos sobre procesos
inflamatorios, se ha observado un aumento en el número de leucocitos y linfocitos así
como una mejora en la actividad tumoricida, demostrando que los medicamentos
homeopáticos de acuerdo a su especificidad, pueden propiciar una respuesta inmune
en los organismos tratados (Sato et al., 2005; Lopes et al., 2006). El tratamiento
homeopático End-Inf (Endecto™ + Infeçoes™) diseñado para control de
endoparásitos e infecciones en peces, propició un aumento de linfocitos, lo cual
también se vio reflejado en una disminución significativa de coccidios en intestino de
los juveniles de L. guttatus.
Por otro lado, los peces tratados con Pass-PhA registraron un mayor porcentaje
de neutrófilos. Estas células están relacionados con la fagocitosis (O´Neill, 1985;
Hine, 1992) y la actividad microbicida mediada por el proceso denominado “explosión
o estallido respiratorio”, un proceso capaz de convertir el oxígeno molecular en una
serie de compuestos o metabolitos reactivos de oxígeno (Plyzycz et al., 1989),
además de cumplir funciones como mediadores de la repuesta inflamatoria aguda,
una vez que pasan por el torrente sanguíneo y migran a los lugares de inflamación,
en respuesta a estímulos quimiocinéticos (Fernández et al., 2002). El medicamento
homeopático Pass-PhA contiene fósforo, el cual ha sido evaluado en dosis altamente
diluidas para estimular la producción de células granulocitos (Poitevin et al., 1983).
Estos autores evaluaron el efecto de belladona y fosfato ferroso en potencias
homeopáticas de 5CH y 9CH sobre el metabolismo de los polinucleares neutrófilos
humanos. Sus resultados demuestran que ambos tratamientos inhiben la producción
de radicales libres de oxígeno (ROS) activados por los polinucleares neutrófilos
humanos, cuando existe un proceso inflamatorio.
60
Aunque previo al experimento los peces estaban aparentemente sanos debido a
que no mostraron signos clínicos visibles que pudieran alertar sobre alguna
enfermedad, los estudios histopatológicos evidenciaron frecuentes alteraciones
histológicas como: degeneración hidrópica, fusión lamelar y desprendimiento del
epitelio lamelar en branquias, degeneración vacuolar (lipidosis hepática), núcleos de
tamaño irregular y hepatocitos binucleados en hígado; pérdida de microvellosidades
y desprendimiento del tejido epitelial en intestino, así como atrofia de glándula
digestiva y vacuolas en glándula digestiva en estómago. Estas alteraciones se vieron
acompañadas de la presencia de células eosinófilas granulares CEG (Mast cell) y
células rodlets en todos los tejidos estudiados. En el caso de las CEG, muchos
estudios coinciden en relacionarlas con mecanismos de respuesta frente a procesos
infecciosos de los tejidos, ya sea por parasitosis o por agentes citotóxicos
xenobióticos (Cammarata et al., 2000; Dezfuli et al., 2003; Castañeda-Cortés et al.,
2015). Un ejemplo, es el aumento significativo de estas células en los tejidos de
teleósteos, una vez que éstos han sido expuestos a metales tóxicos, herbicidas y
agentes inmunotóxicos (Ramirez-Duarte et al., 2004; Schmale et al., 2004; Dezfuli et
al., 2008; Lauriano et al., 2012). Durante el desarrollo del presente estudio, tanto al
inicio como al final del experimento, se observaron células eosinófilas granulares
(CEG), en pocos organismos, cerca de los vasos sanguíneos del tejido hepático,
aunque en mayor frecuencia y cantidad en la lámina propia del intestino. La gran
presencia de estas CEGs podría relacionarse con los coccidios encontrados en el
intestino de L. guttatus debido a que estas células cumplen alguna función a manera
de barrera o protección, como lo han citado otros autores (Cammarata et al., 2000).
Se ha observado también las CEGs en las lamelas secundarias branquiales.
Flaño et al. (1996) demostraron que al infectar cultivos de tejidos branquiales de O.
mykiss con Renibacterium salmoninarum, se registró un aumento en el número de
CGEs. Otros estudios coinciden en que las branquias son órganos inmunológicos
importantes por estar en contacto directo con el ambiente, y por lo tanto pueden
regular y controlar diversas señales neurocrinas, endocrinas, paracrinas y autocrinas;
de esta manera, siempre están alertas ante cualquier cambio en el ambiente que
61
genere alguna reacción inmunológica. (Tierney et al., 2010; Chávez -Sánchez et al.,
2014).
En cuanto a las células rodlet, algunas investigaciones demuestran su presencia
en varios tejidos de peces de agua dulce, así como marinos (Leino, 1982; Della-
Salda et al., 1998; Dezfuli et al., 2003; Manera & Dezfuli, 2004). Algunos autores
concluyen que estas células son exclusivas de peces, debido a las evidencias
derivadas de diferentes estudios realizados en vertebrados (Plaul, 2011). La
discusión que estas células ha generado desde hace años ha sido muy amplia.
Inicialmente, las células rodlet fueron consideradas como parásitos (Laibach, 1937;
Mayberry et al., 1979; Richards et al., 1994). Sin embargo, esta teoría fue quedando
aislada desde que varios estudios propusieran que en realidad son (1) células
sanguíneas o del sistema inmune (Duthie, 1939; Leino, 1996; Bielek, 2002; Reite,
2005), (2) células involucradas en la inmunidad innata y la respuesta inflamatoria
(Balabanova & Matey, 1987; Manera & Dezfuli, 2004; Reite, 2005), (3) células
involucradas en el transporte de iones y la osmorregulación (Morrison & Odense,
1978; Mattey et al., 1979), o (4) células secretoras, asociadas a los epitelios (Desser
& Lester, 1975; Mendoça et al., 2005), entre otras hipótesis.
Las células rodlet han sido observadas en epitelios, sangre, órganos
hematopoyéticos y tejidos conectivos de peces (Manera & Dezfuli, 2004), al igual que
en órganos y tejidos como branquias, intestino, piel, túbulos renales (Iger & Abraham,
1997; Bielek, 2002; Kramer & Potter, 2002). Igualmente, se han asociado a los
endotelios (Koponen & Myers, 2000), a lo largo de los vasos sanguíneos (Plaul et al.,
2008), vena porta renal (Imagawa et al., 1990) y vasos sanguíneos del riñón, corazón
y mesenterio (Smith et al., 1995). Estos hallazgos concuerdan con el presente
estudio, debido a que las células rodlet fueron observadas al inicio y al final del
experimento, en branquias, alrededor de los vasos sanguíneos del hígado, en
páncreas y tejido epitelial del intestino, así como intentando atravesar la musculatura
externa del estómago y su epitelio. Algunos estudios confirman que estas células
podrían cumplir una función secretora, ya sea de naturaleza enzimática o proteica,
62
que podría contribuir a la eliminación de patógenos (Meyers et al., 1977; Leino ,1996;
Palenzuela et al., 1999). También se sugiere una función protectora, debido a que
estas células aumentan cuando los peces son expuestos a factores estresantes
como sustancias tóxicas, infecciones parasitarias, intoxicaciones, lesiones,
hacinamiento, o cambios bruscos en las condiciones ambientales (Fearnhead &
Fabian, 1971; Iger & Abrahan 1997; Bielek, 2008).
La presencia de estas células en los tejidos de L. guttatus podría tener una
función específica como barrera o protección ante parásitos como los coccidios, cuya
presencia fue evidenciada en el epitelio y en la luz del intestino, y en muy pocos
casos en hígado de los juveniles de L. guttatus.
Las diferencias significativas encontradas en el valor medio de evaluación
(MAV), sugieren que los tratamientos Pass-PhA, Pass-Sit, y End-Inf lograron
disminuir el grado de alteraciones focales en el intestino y estómago de los juveniles
de pargo, en comparación con los peces del muestreo inicial.
En cuanto al DTC, todos los peces tratados con medicamentos homeopáticos
presentaron disminución significativa en el estómago, mientras que en el intestino se
observó una disminución con tres de ellos (Pass-PhA, Pass-Sit, y End-Inf)
comparado con los peces del muestreo inicial. En caso del estómago, los peces
control muestreados al final del experimento, también mostraron un valor
significativamente menor al muestro inicial. Sin embargo, los resultados obtenidos
para el grado de cambio del tejido (DTC) en hígado, muestran que inicialmente este
tejido estaba irreparablemente dañado pero solamente de manera focal, lo cual
indicaba que el resto del tejido hepático era funcional; además, las alteraciones más
frecuentes (lipidosis hepática, núcleos picnóticos de los hepatocitos, núcleos de
tamaño y forma irregular, atrofia y núcleos picnóticos en páncreas), se mantuvieron
en todos los tratamientos y grupo Control.
La lipidosis hepática es generalmente observada en peces cautivos, debido a
desequilibrios en la ingesta y pérdida de energía provocadas por las condiciones
63
artificiales de alimentación y de vida (Hinton et al., 2001; Wolf & Wolfe, 2005).
Algunas especies de peces como Oncorhynchus mykiss y Morone saxatilis pueden
almacenar distintas proporciones de glucógeno y grasa en su hígado. Estudios
plantean que a diferencia de los peces de agua dulce, los teleósteos marinos en
cautiverio pueden estar sujetos a una lipidosis hepática, porque existe una menor
capacidad de proliferación de peroxisomas en hepatocitos, junto con la alimentación
artificial de las dietas que comúnmente contienen alta proporción de C18:1 y otros
ácidos grasos mono-insaturados (Ferguson, 1989; Spisni et al., 1998). En el presente
estudio, no se presentaron diferencias entre los tratamientos evaluados sobre el
tejido hepático. Cabe mencionar que la selección de los medicamentos
homeopáticos no se basó en tratar de regular el metabolismo lipídico.
Todos estos estudios generan una gran discusión al momento de discernir cuáles
son realmente los factores que desencadenan una lipidosis hepática, y sobre todo,
en qué momento ésta pudiera considerarse excesiva y por lo tanto, indicativa de una
patología grave. Al momento, no existen criterios que pudieran ser aplicados para el
diagnóstico de lipidosis hepática (Wolf & Wolfe, 2005). No obstante, McLelland et al.
(1995) proponen que las concentraciones de lípidos en hígado, mayores de 10 a
12% para la dorada Sparus auratus (Chrysophrys), y mayor a 45-50% para el robalo
europeo Dicentrarchus labrax, constituyen probablemente, lo que en términos
generales se puede considerar una patología.
Es probable que los resultados de lipidosis hepática que se observaron en los
juveniles de pargo lunarejo utilizados durante el presente estudio, se deban a la dieta
suministrada; aunque en la etiqueta del producto no se presenten los valores de
ácidos grasos del alimento, previamente se mencionó que éste contenía un mínimo
de 48% de proteína cruda y 14% de lípidos. La lipidosis se evaluó por presencia o
ausencia, lo que no permitió valorar cuantitativamente las diferencias entre los
tratamientos. Sin embargo, al ser los tratamientos Passival® y Pass-SiT los que
promovieron la acumulación de glucógeno, se puede asumir que también
presentaron una menor lipidosis hepática.
64
Otras de las alteraciones que frecuentemente se encontraron y se mantuvieron
en este tejido fueron, hepatocitos binucleados, núcleos de tamaño y forma irregular,
atrofia nuclear focal, y núcleos picnóticos. Aunque en este estudio se desconozca las
causa de estas alteraciones, probablemente algunas de ellas, como núcleos con dos
nucleolos y hepatocitos binucleados, estén relacionados con una regeneración del
tejido hepático (Torres-Bugarín et al., 2013). El mismo autor manifiesta que estas
células contienen dos núcleos principales que están muy próximos entre sí, e incluso
podrían hacer contacto, ambos con morfología y tinción similar a un núcleo normal;
estas estructuras no parecen tener una interacción directa con el ADN, sino que se
asocian con interferencia en el proceso final de la división celular. Por otro lado, los
núcleos picnóticos se caracterizan por ser pequeños, con una semejante y elevada
densidad de material nuclear, pero intensamente teñidos; el diámetro del núcleo es
aproximadamente un tercio del núcleo normal. Sus características indican muerte
celular (Torres-Bugarín et al., 2013). Estas alteraciones estaban presentes en los
peces desde el muestreo inicial y no existen muchas evidencias del grado en cual
podrían afectar a los peces, debido a que las alteraciones se observaron siempre de
manera focal. Sin embargo, a pesar de ser solamente focales, se consideran
cambios irreversibles y no se observó efectos de los medicamentos homeopáticos.
Los tratamientos basados en medicamentos homeopáticos de uso humano
(Passival®; Pass-PhA y Pass-SiT) que fueron evaluados en este estudio, también se
han valorado en animales de laboratorio, no así en peces marinos. La Passiflora
incarnata L presente en los 3 medicamentos, es usada para tratar varias afecciones
como disturbios nerviosos, hipertensión, arterioesclerosis, cataratas, entre otras. Sin
embargo, una de las sustancias activas que tiene es la cumarina, la cual tiene como
efectos secundarios (en dosis masiva), ser moderadamente tóxica para hígado y
riñón, pero al ser aplicada en dosis ponderables terapéuticas, tiene una acción
linfocinética en diferentes tipos de linfedema. Esto es, que actúa sobre la eliminación
proteica de los macrófagos, aumentando su excreción, y por lo tanto reduce el
edema y la reacción inflamatoria crónica (Pahlow, 2000). En cuanto al fósforo
presente en el Pass-PhA, diversos experimentos demuestran que las preparaciones
65
homeopáticas de Phosphorus (7 CH y 15 CH) tienen un efecto favorable sobre las
hepatitis virales o tóxicas en ratas. Se observa una disminución del nivel de
transaminasas en los grupos tratados con Phosphorus 7 CH y un efecto
hepatoprotector en los cortes histológicos de los grupos tratados con Phosphorus 15
CH (Bildet, 1975; Bildet et al., 1977). Referente al medicamento Pass-SiT, la sílice se
utiliza en el tratamiento de procesos de infección. A dosis ponderal, es un tóxico
conocido de macrófagos y se utiliza para destruir este tipo celular (Poitevin, 1995).
Davenas et al. (1987), al evaluar el efecto de altas diluciones de sílice sobre el
metabolismo de los macrófagos peritoneales de ratón, observaron que las diluciones
de 9 CH respecto a los controles incrementaron considerablemente la producción de
PAF-aceter, que son mediadores en procesos de alergia e inflamación.
La presencia de coccidios en intestino de L. guttatus al inicio y al final del
experimento, permitió valorar el estado de salud de los peces con relación a los
tratamientos homeopáticos evaluados. Los coccidios son comunes en peces
marinos, aunque también se han encontrado en peces anádromos como Alosa
pseudoharengus (Lovy & Friend, 2015). Son parásitos apicomplejos que causan
infecciones intestinales o extraintestinales (Dykova & Lom, 2007). Sin embargo, se
han evidenciado infecciones de coccidios en ciego pilórico y testículo de peces
cupleidos (Marty et al., 1998; Morrison y Marryatt, 2012), al igual que otra especie de
coccidio Goussia sp en hígado de bacaladilla salvaje Micromesistius poutassou
(Abollo et al., 2001) y arenque del Atlántico (Morrison & Hawkins, 1984). Su
presencia se ha asociado a una mala condición corporal de los peces que se refleja
en un aumento de la mortalidad en el cultivo de perca gigante L. calcarifer. Pese a
todo esto, Davies y Ball (1993) consideran que en el medio natural, las infecciones
por estos parásitos no provocan enfermedades en los peces, salvo que se altere el
equilibrio huésped-parásito-ambiente. Estudios histopatológicos manifiestan que las
primeras etapas de crecimiento de los coccidios se presentan en la superficie de los
enterocitos intestinales, sin que éstos provoquen daños al huésped; sin embargo,
cuando empieza su desarrollo dentro de una vacuola parasitófora, estos parásitos se
pueden localizar dentro del tejido epitelial provocando cambios degenerativos en las
66
células huésped (Feist & Longshaw, 2008) como los demostrados por Monlár (1989),
quien revela que las infecciones intensas con Goussia carpelli y Goussia
subepithelialis afectan al epitelio intestinal de la carpa Cyprinus carpio L, lo cual
conduce a la rotura de las células infectadas, produce una respuesta inflamatoria y
da como resultado enteritis grave que altera al epitelio y tejidos conectivos
subyacentes.
En el caso de los juveniles de L. guttatus evaluados en este estudio, los
coccidios se observaron sobre los enterocitos intestinales y en el tejido epitelial en el
cual provocaban una leve evaginación al momento de desprenderse hacia la luz del
intestino, donde en muchos casos se encontraban formando masas, lo cual suponía
que iban a ser expulsados.
El principio de la similitud biológica que manifiesta la homeopatía, ha sido
evaluada tanto en inmunología como en toxicología (Davenas et al., 1987; Poitevin,
1995) al igual que en patología (Nasi et al., 1982). Estos autores evaluaron el efecto
de bioterápicos Trypanosoma cruzi en altas diluciones 10 DH, sobre ratas
previamente infectadas por el mismo parásito. Los resultados demuestran una
disminución del parasitismo y una supresión de mortalidad del 100% en el grupo
control. Trabajos similares a estos, en bovinos, ovinos, caprinos, caninos y murinos
han sido publicados en una revisión de Aleixo et al. (2014). Precisamente el grupo de
juveniles de L. guttatus que menor incidencia parasitaria tuvo respecto al resto de
tratamientos y al grupo Control, fue el grupo tratado con la mezcla del medicamento
homeopático EndectoTM/InfecçoesTM, el cual contenía entre otros parásitos,
diluciones de coccidios.
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9 Conclusión
Los medicamentos no influyeron sobre las variables zootécnicas como el
crecimiento y la supervivencia. No obstante, podemos resaltar que pese a todas las
alteraciones que se encontraron en los órganos examinados, los tratamientos
homeopáticos Pass-PhA, Pass-SiT y Passival®, tuvieron un efecto benéfico en el
estado de salud de los juveniles de pargo lunarejo L. guttatus, debido a que lograron
disminuir el grado de alteración y cambio en intestino y estómago, además hubo una
mayor acumulación de glucógeno en hígado, por lo tanto una menor lipidosis
hepática. Así mismo se observó una mayor cantidad de células neutrófilos en sangre
que pudieron actuar como macrófagos ante la presencia de coccidios en intestino de
los juveniles, estos parásitos se redujeron por la acción del tratamiento End/Inf. Lo
cual pone en evidencia el efecto terapéutico que tuvieron los medicamentos
homeopáticos evaluados durante esta investigación.
Por consiguiente, planteamos como conclusión final que los medicamentos
homeopáticos evaluados en juveniles de pargo lunarejo Lutjanus guttatus, tienen una
potencial aplicación en el cultivo de la especie, debido al efecto benéfico y
significativo evidenciado en indicadores histológicos e histoquímicos de nutrición,
salud y respuesta inmune de los peces.
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10 Recomendaciones
Prolongar el periodo de bioensayo a más de 60 días para determinar el efecto de los
medicamentos homeopáticos en el crecimiento y en el estado de salud de los
organismos tratados.
Realizar análisis patológicos en fresco, tanto de mucosas en piel como en branquias,
de los peces tratados.
Usar pruebas inmunohistoquímicas para evidenciar la capacidad de respuesta de los
medicamentos homeopáticos, ante patologías que no se pudieran describir con
métodos histológicos de tinción convencional.
69
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12 Anexos
Anexo I
Técnica de deshidratación
Procedimiento
1.- Alcohol etílico 70° I y II - 1h
2.- Alcohol etílico 80° - 1h
3.- Alcohol etílico 90° -1h
4.- Alcohol etílico 100° I y II -1h
5.- Alcohol etílico 100° – Xilol (1:1) - 20 min (Tiempo critico)
6.- Xilol absoluto (100%) – 5-10 min (Tiempo critico)
Inclusión en parafina
1.- Parafina-Xilol (1:1) (60°C)- 25 min
2.- Parafina I - 1h
3.- Parafina II - 1-2h
4.- Parafina III - 1-2h
5.- Parafina IV - 1-2h
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Anexo II.
Técnica de tinción de Hematoxilina-Eosina (de Harris)
Procedimiento
1. Xilol I, II y III - 10 min en cada uno.
2. Alcohol etílico 96% - 2 min
3. ROH 70I y 70 II - 2 min c/u
4. Agua destilada 5 min
5. Hematoxilina de Harris 1 min (dependiendo del tiempo de uso del colorante)
6. H2O I y II- 5 min
7. ROH Ácido- 10-15 seg (250 ml deROH 96° más 5 gotas de HCL conc.)
8. H2O- 5 min
9. H2O amoniacal-10-15 seg (250 ml de H2O mas 5 ml de hidróxido de amonio)
10. H2O- 5 min
11. ROH 50- 2 min
12. ROH 70- 2 min
13. Eosina alcohólica- 3 min (dependiendo del tiempo del colorante)
14. ROH 96 I y II, 1-2 min c/u
15. ROH 100 I y II, 1 min c/u
16. XILOL I, II, III (sustituto de xileno ó Hemo-De) - 5 min c/u
17. Montar en resina sintética o Entellan
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Anexo III
Método de Azul Alciano-Schiff para mucopolisacaridos neutros y ácidos
Procedimiento:
1.- Desparafinar e hidratar los cortes hasta agua destilada.
2.- Teñir con azul alciano, durante 3- 12 min.
3.- Lavar en agua destilada durante 2 min.
4.- Pasar los cortes a ácido peryódico al 0.5%, durante 10 min.
5.- Lavar en agua corriente durante 5 min y enjuagar con agua destilada.
6.- Pasar los cortes por el reactivo de Schiff, durante 10 a 15 min en el
refrigerador.
7.- Pasar los cortes a la solución sulfurosa, haciendo tres cambios de dos
minutos cada uno.
8.- Lavar con agua corriente durante 5 min.
9.- Teñir con hematoxilina férrica de Weigert por 5 min, o bien usando la HE
normal.
10.- Lavar con agua destilada por 2 min.
11.- Pasar los cortes por ácido pícrico, por 1 min.
12.- Deshidratar a partir de alcohol de 96 I y II y alcohol etílico absoluto I y II por
5 min en cada uno.
13.- Aclarar en xilol durante 5 min.
14.- Montar con resina sintética o entellan.
Resultados:
Mucopolisacáridos ácidos azul
Mucopolisacáridos neutros magenta
Sustancia cartilaginosa mucina epitelial tonalidades de púrpura a azul
oscuro
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Anexo IV
Hemacolor® Tinción rápida de frotis sanguíneos
Reactivos
Reactivo 1: Hemacolor® Solución 1 solución fijadora 100 mL
Reactivo 2 : Hemacolor® Solución 2 reactivo de coloración roja 100 mL
Reactivo 3: Hemacolor® Solución 3 reactivo de coloración azul 100 mL
Hemacolor® Tabletas tampón pH 7,2 según Weise 3 tabletas
Técnica para frotis secados al aire
Los portaobjetos han de ser inmersos y movidos en las soluciones, la simple
introducción proporcionará resultados de tinción insuficientes.
Los portaobjetos deberían ser escurridos bien por goteo después de los diferentes
pasos de tinción, de esta manera se podrá evitar el innecesario arrastre de
soluciones.
Reactivo 1 (Hemacolor® Solución 1) 5 x 1 segundo
Reactivo 2 (Hemacolor® Solución 2) 3 x 1 segundo
Reactivo 3 (Hemacolor® Solución 3) 6 x 1 segundo
Reactivo 4 (Solución tampón pH 7.2) 2 x 10 segundos
Secar al aire
Montar con Neo-Mount®, DPX nuevo o Entellan® nuevo y cubreobjetos.
Resultados
Núcleos celulares rojo a violeta
Linfocitos plasma gris claro, gránulos azurófilos rojos purpúreo
Monocitos plasma mayormente azul paloma
Granulocitos neutrófilos gránulos violeta claro
Granulocitos eosinófilos gránulos rojo ladrillo a pardo rojizo
Granulocitos basófilos gránulos violeta oscuro a negro
Trombocitos violeta
Eritrocitos rojizo
