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Evaluación preliminar de la diversidad genética de morfotipos de ibia (Oxalis

tuberosa Mol.) en municipios de Ventaquemada y Turmequé (departamento de

Boyacá) por medio de marcadores ISSR

Lucia Carolina Uribe Montes

TRABAJO DE GRADO

Presentado como requisito parcial para optar al título de

Bióloga

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS

DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA

Bogotá D.C. 2015

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Evaluación preliminar de la diversidad genética de morfotipos de ibia (Oxalis tuberosa

Mol.) en municipios de Ventaquemada y Turmequé (departamento de Boyacá) por

medio de marcadores ISSR


Directora

María del Pilar Márquez Cardona M.Sc.

Pontificia Universidad Javeriana

Facultad de Ciencias

Departamento de Biología

Bogotá D.C. 2015

3





APROBADO

_________________________ _________________________

Andrea Forero Ruiz Concepción Judith Puerta

Directora Carrera de Biología Decana Facultad de Ciencias

4





APROBADO

_________________________

María del Pilar Márquez M.Sc

Directora

________________________

Neidy Clavijo Ponce M.Sc

Jurado

5

NOTA DE ADVERTENCIA

Artículo 23 de la Resolución N° 13 Julio de 1946

“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus

trabajos de tesis. Sólo velará porque no se publique nada contrario al dogma y a la moral

católica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien

se vean en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.

6

Agradecimientos

A mis padres y mi hermana por el inmenso amor que me brindan cada minuto del día y por

hacerme feliz.

A mi directora de trabajo de grado María del Pilar Márquez por su confianza depositada en

mí, su ayuda, enseñanzas y su compañía durante este proceso.

A Neidy Clavijo por ser un ejemplo para mí, a través de su trabajo en el campo con las

comunidades y por sus correcciones y enseñanzas en salida de campo.

A los agricultores de los municipios de Turmequé y Ventaquemada por abrirnos las puertas

de sus hogares y compartir su sabiduría con nosotros.

A mis amigos y compañeros del laboratorio de Biologia Molecular Vegetal por su gran

colaboración, amabilidad, y compañía.

A María Paula y Juan Felipe y mis amigos que me han acompañado y apoyado

inmensamente durante la carrera, gracias.

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Tabla de contenido

Resumen .............................................................................................................................................. 8

Introducción ........................................................................................................................................ 8

Justificación y planteamiento del problema ..................................................................................... 10

Marco teórico .................................................................................................................................... 12

Los tubérculos andinos.................................................................................................................. 12

Pérdida de diversidad genética y estrategias de conservación .................................................... 13

Oxalis tuberosa Molina ................................................................................................................. 15

El estudio de la diversidad genética .............................................................................................. 17

a. Cómo se estudia la diversidad genética ............................................................................ 17

b. PCR ....................................................................................................................................... 18

c. Marcadores ISSR ................................................................................................................ 19

d. Extracción de ADN ............................................................................................................. 20

e. Estudios de diversidad de ibia por medio de ISSR ............................................................ 22

Pregunta de investigación ................................................................................................................. 24

Objetivos ........................................................................................................................................... 24

Objetivo general ............................................................................................................................ 24

Objetivos específicos ..................................................................................................................... 24

Metodología ...................................................................................................................................... 24

Fase de campo: ............................................................................................................................. 25

Localización y material vegetal ................................................................................................. 25

Fase de laboratorio ....................................................................................................................... 27

Extracción de ADN ..................................................................................................................... 27

Métodos de análisis del ADN .................................................................................................... 29

PCR ............................................................................................................................................ 29

Análisis de Diversidad Genética ................................................................................................ 31

Resultados ......................................................................................................................................... 32

Extracción de ADN ......................................................................................................................... 32

Condiciones de PCR ....................................................................................................................... 34

Polimorfismo ................................................................................................................................. 35

Evaluación de la diversidad ........................................................................................................... 36

Discusión ........................................................................................................................................... 39

Extracción de ADN ......................................................................................................................... 39

Estandarización PCR ..................................................................................................................... 41

8

Evaluación de la diversidad de muestras de ibia .......................................................................... 42

Conclusiones ..................................................................................................................................... 46

Recomendaciones ............................................................................................................................. 47

Bibliografía ........................................................................................................................................ 48

Anexo 1 formato de datos para colecta ............................................................................................ 52

Anexo 2. Ejemplo de formato de etiquetas para herbario ............................................................... 53

Anexo 3. Lista de accesiones incluidas en estudio de diversidad. .................................................... 54

Anexo 4 Individuos de Oxalis tuberosa utilizados para pruebas de extracción ................................ 55

Anexo 5. Gráficos de medias para parámetros evaluados durante la extracción de ADN ............... 56

Anexo 6 Prueba de amplificación con primers RAM ......................................................................... 57

Anexo 7. Protocolo y concentraciones para primers RAM ............................................................... 58

Anexo 8. Evidencia para condiciones adecuadas de PCR .................................................................. 60

Anexo 9. Protocolo Pissard ............................................................................................................... 61

Anexo 10 Matriz binaria .................................................................................................................... 62

Anexo 12.Tabla de colores de tallos .................................................................................................. 69

Anexo 13 Extracción de 29 muestras de ibia por medio de protocolo CTAB1 ................................. 70

Resumen

La región andina ha sido un centro de domesticación de cultivos entre los que se encuentran

tres especies de tubérculos andinos consideradas especies infrautilizadas o marginadas. Las

especies conocidas en Colombia como Ruba, Cubio e Ibia se encuentran fuertemente ligadas

a prácticas de manejo de cultivos y usos tradicionales, que conforman una identidad en las

comunidades de indígenas y pequeños productores. En estas especies se ha reconocido un

posible proceso de erosión genética, lo que indica la necesidad de caracterizar la variabilidad

genética en regiones consideradas microcentros de diversidad, lo cual permite establecer

estrategias de conservación. Uno de los posibles microcentros de diversidad en Colombia

corresponde a los municipios de Ventaquemada y Turmequé en el departamento de Boyacá.

Con base en caracterizaciones previas de los sistemas productivos de estos cultivos en la

región y la determinación de algunos morfotipos, se realizó una caracterización molecular de

la variabilidad genética intraespecífica de la especie Oxalis tuberosa M. (ibia). Para llevar a

cabo el estudio, es necesaria una estandarización de la extracción de ADN y amplificación

por PCR con marcadores moleculares ISSR (Inter Simple Sequence Repeat). Se define que

9

la extracción resulta exitosa para las muestras de ibia con un protocolo reportado en estudios

previos de O. tuberosa. En cuanto a las condiciones de PCR se determinó que el patrón de

bandeo más claro resulta de aumentar las concentraciones de los reactivos reportadas en

trabajos previos de diversidad de tubérculos andinos. El estudio de diversidad exhibe que en

general las muestras se agrupan según su morfotipo, sin embargo se hace necesario

corroborar esta evaluación preliminar con datos que permitan obtener análisis más robustos.

Introducción

Considerando que el número de alimentos que conforman la dieta básica de la población

mundial se restringe principalmente a maíz, arroz, trigo y papa, es fundamental indagar en

las posibilidades de diversificación de la dieta. Esta vulnerabilidad actual del sistema

alimentario mundial exige emprender esfuerzos por superarla, tales como la investigación

en torno a cultivos que se han denominado marginados o infrautilizados (Galluzzi et al.,

2013). La contribución de estas investigaciones busca comprender el potencial de estas

especies y su valor cultural, nutricional y económico.

Entre estos cultivos marginados se encuentran tres especies de tubérculos andinos Ruba

(Ullucus tuberosus Caldas), Cubio (Tropaeolum tuberosum Ruiz y Pavón) e Ibia (Oxalis

tuberosa Molina) que han hecho parte de la dieta de comunidades indígenas y campesinas de

los países andinos por cientos de años. Hasta el momento se han adelantado pocos estudios

relacionados con estos cultivos, los cuales provienen principalmente de entidades nacionales

e internacionales en Perú, Ecuador y Bolivia. En el caso de Colombia existen algunas

investigaciones relacionadas con etnobotánica, estudio de las prácticas de manejo, fisiología

vegetal y características morfológicas de los tubérculos. Sin embargo estos estudios no han

tenido una alta divulgación e impacto, a pesar de que son un punto de partida para reconocer

la importancia nutricional, cultural y otros usos potenciales de estas especies (Clavijo et al.,

2014).

Teniendo en cuenta la limitada disponibilidad de información con respecto al estudio de estos

tubérculos, es claro que es necesario un mayor aporte de investigación desde distintitos

enfoques. Entre estos, la biología molecular puede proveer herramientas para el estudio de

estas especies, logrando comprender el posible efecto de las prácticas de manejo tradicionales

y la marginalidad, sobre la diversidad genética de los tubérculos (Pissard et al., 2006).

10

En el presente trabajo se implementan los marcadores moleculares denominados ISSR (Inter-

secuencias simples repetidas) para evaluar la diversidad intra específica en las ibias (Oxalis

tuberosa). Para efectuar el estudio se realizó un muestreo en fincas de pequeños agricultores

en los municipios de Turmequé y Ventaquemada (Boyacá), colectando material vegetal de

diferentes morfotipos identificados por los agricultores con base en las características

externas del tubérculo (color). Los estudios previos en la zona señalan la existencia de 5

morfotipos para esta región que corresponden a ibias amarillas, blancas, rosadas, rojas y

amarillas con rayas rojas (Clavijo et al., 2014).

Junto con un estudio de diversidad de la especie Tropaeolum tuberosum (Cubio) desarrollado

a la par, la presente investigación de variabilidad intraespecífica con la ibia se enmarca dentro

de un macro-proyecto interdisciplinar denominado “Memoria histórica, caracterización

genética y aprovechamiento alimentario de tubérculos andinos marginados en las provincias

de Centro y Márquez (Boyacá)”. Este busca realizar caracterizaciones de la zona y de los

cultivos existentes desde tres enfoques, que además de la caracterización genética incluyen

una caracterización bromatológica y nutricional y finalmente una enfoque histórico, que

estudia los cambios sociales, culturales y agroecológicos de los agroecosistemas y su entorno

a través del tiempo.

El estudio de la diversidad se lleva a cabo por medio de marcadores ISSR y busca evaluar la

posibilidad de considerar estos morfotipos como variedades genéticas. Para lograr un

resultado final es necesario procesar las muestras colectadas en el laboratorio y someterlas a

un proceso previo de extracción de ADN y hallar condiciones adecuadas de la técnica de

PCR. A continuación se presentan los resultados de este proceso, que significarán un aporte

hacia la comprensión de las dinámicas y la importancia de estos cultivos, buscando lograr el

uso sostenible y la conservación de la agrobiodiversidad1 de nuestro país.

Justificación y planteamiento del problema

Por miles de años los países andinos han sido centros fundamentales de diversidad y

domesticación de cultivos que han desarrollado adaptaciones para estas regiones específicas.

De los cultivos domesticados existen tres especies de tubérculos de diferentes familias

1 Considerando que la biodiversidad se refiere a la variedad de organismos vivos a diferentes niveles taxonómicos, la

agrobiodiversidad corresponde específicamente a la diversidad entre y dentro de especies y poblaciones de plantas y animales de importancia agronómica. Dentro de esta diversidad se incluye también parientes silvestres (FAO, 2004).

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botánicas poco conocidas internacional e incluso localmente, que guardan similitudes

morfológicas entre ellos: la ruba, el cubio y la ibia (Clavijo, 2014).

Estas especies han sido consideradas especies marginadas o infrautilizadas por asociarse a

prácticas de manejo tradicionales, condiciones agroecológicas poco favorables y baja

competitividad en el mercado, distribuyéndose principalmente en mercados locales (Galluzzi

et al, 2013). Sin embargo especies marginadas como los tubérculos andinos tienen una gran

importancia en la búsqueda de la diversificación de la dieta global.

Estos recursos se han mantenido hasta la actualidad gracias a comunidades indígenas y

campesinas, sin embargo, la pérdida progresiva de conocimiento tradicional y la presión del

mercado ha ocasionado un proceso de erosión genética, generando la disminución de recursos

que tienen un uso y valor potencial que aún no se ha estudiado ampliamente. Esto se

encuentra ligado a la pérdida de prácticas de manejo de cultivos y usos tradicionales que

forjan la identidad de las comunidades andinas (FAO, 2012; Galluzzi et al., 2013; Clavijo et

al., 2014;).

Para evitar esta pérdida y establecer métodos de conservación apropiados para los cultivos,

es necesario el estudio de la diversidad genética en zonas estratégicas. Hasta el momento

estos estudios de diversidad en Colombia han sido muy reducidos, reportándose algunos

esfuerzos de caracterización de los sistemas de producción en el departamento de Nariño

(Rosero, 2010) y Boyacá (Clavijo et al., 2011; Aguirre et al., 2012).

Con el fin de construir estrategias de conservación se debe tener en cuenta que la distribución

de la variabilidad se da en forma desigual, concentrándose en zonas denominadas

“microcentros”, los cuales cuentan con condiciones favorables para el establecimiento de

estos cultivos (García & Cadima, 2003). Al respecto Clavijo y Pérez (2014) indican la posible

existencia de un microcentro de diversidad en los municipios de Turmequé y Ventaquemada

(Boyacá), identificando presencia de ibias, cubios y rubas a diferentes escalas de siembra en

la región. Estos cultivos representan la base principal de la alimentación familiar (Clavijo &

Pérez, 2014).

Hasta el momento en la zona se han realizado estudios de reconocimiento de sistemas de

producción y se identificaron diferentes morfotipos de las especies mencionadas (Clavijo,

12

2014). Para contribuir al reconocimiento de los posibles efectos de la erosión genética en

estos cultivos y establecer la posibilidad de reconocer esta región como un microcentro de

diversidad, la caracterización de la variabilidad genética de las diferentes especies es

indispensable (FAO, 2010).

La ibia, Oxalis tuberosa M. es una de las especies de tubérculos cultivados en esta región

de la cual se han identificado hasta el momento en las fincas de los municipios Turmequé y

Ventaquemada, cinco morfotipos (rosados, amarillos, rojos, blancos y amarillos con rayas

rojas) (Clavijo, 2014). En el presente estudio se plantea como objetivo general, la evaluación

molecular de la diversidad existente entre estos morfotipos.

La caracterización molecular debe incluir una fase inicial de estandarización para lograr

finalmente evaluar la diversidad entre la totalidad de las muestras por medio de los

marcadores moleculares ISSR (Weising et al., 2005). Se espera contribuir al conocimiento

de los patrones de diversidad de esta especie, que puedan incluso servir como modelos de

otras especies con condiciones agroecológicas similares y lograr un aprovechamiento

sostenible de la biodiversidad que ofrecen los suelos colombianos.

Marco teórico

Los tubérculos andinos

Las rubas, cubios e ibias han evolucionado en ambientes inusuales que se caracterizan por

alturas entre 2400 y 4000 msnm, climas fríos y niveles de precipitación anuales entre los

rangos de 700 – 800 mm para rubas, 700-1600mm para los cubios y 570-2500mm para las

ibias. Estas especies de tubérculos poseen una alta tolerancia a condiciones de erosión,

fluctuaciones en temperaturas y lluvias, suelos empobrecidos y alta radiación UV (Flores et

al., 2003).

Estos cultivos son considerados patrimonio ambiental y cultural. Bajo este contexto, las

relaciones entre las prácticas en el campo, los valores e interacciones sociales, son

fundamentales para conformar una memoria colectiva que le confiere un sentido de

pertenencia e identidad a las comunidades. Si bien estas tradiciones se encuentran ligadas a

un sistema económico local, determinan una cultura rural que se mantiene a través de las

generaciones (Clavijo et al., 2011).

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La investigación alrededor de estos cultivos se empieza a desarrollar a partir de 1979 (Clavijo

et al., 2004). Los estudios se han establecido en torno a temas de conservación, diversidad

genética y sistemas de producción (Malice & Baudoin, 2009). Estos se han desarrollado

generalmente en Ecuador, Bolivia y Perú, donde ha habido mayor disponibilidad de recursos

para colecta, conservación y utilización de estas plantas productoras de tubérculos, ya que

históricamente se ha considerado que estos países poseen la mayor diversidad de especies

(Rosero, 2010).

En Colombia la producción de tubérculos se ubica en los departamentos de Nariño, Cauca,

Cundinamarca y Boyacá. Estos cultivos han complementado la dieta de comunidades

indígenas y campesinas en ecosistemas altoandinos y paramunos de Colombia desde la época

prehispánica hasta la actualidad (Pérez, 2009; Rosero, 2010).

Estas especies tienen una importancia fundamental en la seguridad alimentaria ya que ofrecen

una alternativa para diversificar la dieta en la población general y en particular en

comunidades rurales e indígenas (Clavijo et al., 2011). Por esta razón es crucial evitar la

pérdida de sistemas de producción locales y a pequeña escala, lo cual puede lograrse a través

de investigaciones enfocadas en disminuir eventos de “cuello de botella” y en sistemas de

conservación que complementen los métodos in situ y ex situ (Galluzzi et al., 2013),

incrementando posibilidades de uso de los recursos genéticos de tubérculos de forma

sostenible (García & Cadima, 2003).

Pérdida de diversidad genética y estrategias de conservación

Los tubérculos andinos han atravesado un proceso progresivo de deterioro que ha conducido

a la pérdida de diversidad genética2 (Clavijo et al., 2011). Esta pérdida de diversidad, llamada

erosión genética se ha atribuido a factores asociados a presiones del mercado, dificultades

en comercialización, pérdida de conocimiento tradicional o la asociación del producto a un

alimento propio de poblaciones de bajos recursos. Adicionalmente contribuyen aspectos

2 La diversidad genética corresponde a la diversidad de especies y/o variedades que son producto de procesos de evolución y

adaptación generados por selección natural y artificial. Bajo este contexto la erosión genética se refiere a la pérdida de genes o variedades (en un sentido más amplio) como consecuencia de factores como degradación ambiental, sobreexplotación de especies, cambios en sistemas agrícolas o remplazo de variedades locales o tradicionales por variedades de alto rendimiento (García & Cadima, 2003).

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como la degradación de la tierra o factores bióticos como enfermedades (García & Cadima,

2003; Malice & Baudoin, 2009).

Con el fin de conservar la diversidad genética existen dos métodos fundamentales conocidos

como in situ y ex situ.

El enfoque in situ consiste en la conservación de poblaciones y ecosistemas en sus hábitats

de origen. Se busca que este tipo de conservación se constituya en zonas de alta diversidad

genética de especies tanto cultivadas como silvestres, favoreciendo los procesos evolutivos

naturales (García & Cadima, 2003). La influencia humana juega un papel fundamental en la

conservación in situ, ya que el uso y manejo de estas especies puede alterar los patrones de

diversidad genética en estas (Rosero, 2010).

La variabilidad de las especies no se distribuye de igual forma en toda la franja andina, por

lo que se debe priorizar que la conservación in situ se realice en zonas denominadas

“microcentros” que cuenten con características ambientales y socioculturales favorables

(García & Cadima, 2003).

Este enfoque beneficia también a agricultores y comunidades asociadas, constituyendo una

base de seguridad alimentaria. De igual forma se debe considerar que forman parte del

equilibrio de los ecosistemas, puede asociarse a la conservación de parientes silvestres y

permite perpetuar procesos de evolución natural (García & Cadima, 2003).

La conservación ex situ consiste fundamentalmente en bancos de germoplasma que

mantienen muestras de poblaciones en lugares físicos con condiciones apropiadas para

conservar los recursos genéticos. Si bien esto puede implicar que se obstaculicen los procesos

evolutivos naturales, puede por otro lado permitir conservar la biodiversidad que se encuentra

amenazada en condiciones naturales por diversos factores (García & Cadima, 2003).

Considerando tanto ventajas como desventajas de cada método o enfoque, las actuales

estrategias de conservación buscan constituirse logrando complementar ex situ e in situ para

evitar la pérdida de recursos genéticos (Malice & Baudoin, 2009).

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Oxalis tuberosa Molina

Oxalis tuberosa Molina. Pertenece a la familia botánica Oxalidaceae, orden Geraniales; sus

nombres comunes en español incluyen ibia (Colombia); oca, quiba, ciuba, ciuva, huisisai,

(Otras partes de Sur América) y papa roja (México) (National Research Council, 1989).

Además de cultivarse en la región andina con mayor abundancia en Ecuador, Perú y Bolivia,

donde, después de la papa, constituye el cultivo de tubérculo más importante (Flores et al.,

2003), la ibia ha sido cultivada en México y Nueva Zelanda (National Research Council,

1989). La domesticación de esta especie ocurrió probablemente en la región central de Perú

y en el norte de Bolivia donde se presenta la mayor diversidad de formas cultivadas (Pissard

et al, 2006).

Generalmente la propagación de las especies de tubérculos andinos que se han mencionado,

incluyendo la ibia, es vegetativa a través de los tubérculos (Malice & Baudoin, 2009). O.

tuberosa es una hierba anual generalmente de 20 a 30 cm de alto con tallos cilíndricos cuya

variación de color puede ser de verde a rojo (King, 1987). Los tallos normalmente se alzan

desde la base de la planta y son pubescentes. En días largos, los estolones crecen como tallos

aéreos y en días cortos, penetran en el suelo formando tubérculos (National Research

Council, 1989). Los tubérculos exhiben una amplia variación de color y tamaño y poseen

niveles variables de ácido oxálico; las variedades con altos niveles se consideran amargas y

se procesan de diversas formas (King, 1987).

Las hojas son alternas, trifoliadas, pinnadas o palmaticompuestas y pubescentes, los foliolos

son de 1 a 4 cm con color verde oscuro en el haz y purpura o verde en el envés. Las

inflorescencias son axilares con cuatro o cinco flores hermafroditas. El cáliz está conformado

por cinco sépalos y la corola por cinco pétalos unidos en la base, de color amarillo o

anaranjado con bordes trilobados y tres nervios principales de color negro. Los estambres se

encuentran dispuestos en dos verticilos pentámeros de diferente longitud; cuentan con un

ovario pentacarpelar con carpelos separados y cinco estilos libres; El fruto consiste en una

capsula (dehiscencia explosiva) de cinco lóculos de pared membranosa, cada lóculo con una

a tres semillas (Barrera et al, 2004). El ciclo de la planta puede durar entre 7 y 10 meses

dependiendo de la altura a la que se desarrolle el cultivo (Clavijo, 2014)

16

Generalmente se afirma que es una especie octoploide 2n= 8x= 64, sin embargo Rosero

(2010) indica que la naturaleza de la oca no es clara ya que diversas investigaciones

presentan resultados inconsistentes (Rosero, 2010). Posee un sistema trimórfico de

incompatibilidad genética lo que impide el autocruzamiento y conlleva a la polinización

cruzada (Pissard et al, 2006).

O. tuberosa presenta gran variación en los niveles nutricionales y se puede considerar que

su valor nutricional es igual o mejor que la papa. En promedio contienen de 70 a 80% de

humedad, 11-22% de carbohidratos y alrededor de 1% de grasa y fibra. En cuanto a los

niveles de proteína se presenta una gran diferenciación entre variedades, algunos tubérculos

con alta concentración de proteína pueden contener más del 9 % de su peso seco en proteína

de alta calidad con un buen balance de aminoácidos esenciales (National Research Council ,

1989) .

En un estudio realizado por Flores et al. (2002) se presenta una caracterización de la proteína

soluble más importante del tubérculo, denominada Ocatina (constituye del 40% al 60% de

la proteína soluble total) y demostró que posee actividades antibacterianas y antifúngicas

contra diversos microorganismos del suelo, por lo que consideran su función como una

proteína de almacenamiento que puede desempeñar un papel en la resistencia natural a

patógenos (Flores et al., 2002) También se ha determinado que el tubérculo posee un

potencial para producción de almidón, alcohol y alimento de ganado (National Research

Council , 1989).

El germoplasma de ibiaex situ se ha distribuido en diversos bancos de germoplasma en

Suramérica, ubicados principalmente en Perú con el mayor número de accesiones (1696) en

el instituto nacional de investigación agropecuaria (INIA) (Flores et al., 2003).

La caracterización y diversidad de Oxalis tuberosa no ha sido suficientemente explorada en

Colombia y no se registran bancos de germoplasma que conserven una muestra

representativa (Rosero, 2010). Los estudios realizados parecen reflejar una menor

importancia (en cuanto a producción) de este cultivo con respecto a Tropaeolum tuberosus

y Ullucus tuberosus (a diferencia de la tendencia que se presenta en países como Perú y

Bolivia) (Aguirre et al., 2012).

17

El estudio de la diversidad genética

a. Cómo se estudia la diversidad genética

Los organismos se diferencian por variaciones en las secuencias en el ADN y por alteraciones

ocasionadas por el ambiente. El estudio de estas diferencias es fundamental para establecer

estrategias de conservación y esto se ha realizado a través del desarrollo de herramientas

moleculares que han permitido, entre otras utilidades, la identificación de polimorfismos

causantes de la variación genética (FAO, 2010).

Los denominados marcadores genéticos permiten indicar el genotipo de un individuo y de

uno o varios loci relacionados con el marcador, proporcionando herramientas para la

identificación de plantas y el fitomejoramiento (Henry, 2013)

Para determinar un marcador genético ideal se toma en consideración que este sea

polimórfico (con capacidad de revelar variaciones genéticas individuales), multialélico,

codominante (haciendo posible distinción entre homocigotos y heterocigotos), no epistáticos

(independencia entre locus), neutral (lo que implica que las sustituciones de alelos en el locus

del marcador no inciden en el fenotipo o proceso de selección) y que no sean susceptibles a

cambios ambientales. Los marcadores que mejor aplican en la actualidad para estas

condiciones han sido los marcadores de ADN que se han impuesto ante los marcadores

morfológicos o bioquímicos (Vienne, 2003). Esto se debe a que los métodos basados en ADN

permiten un análisis directo en el genoma en lugar de inferencias basadas en el análisis de la

expresión de los genes (Henry, 2013). De igual forma, estos análisis son independientes del

estado de desarrollo o del tejido analizado y son casi infinitos en número, permitiendo

aplicaciones adicionales en biología molecular (Vienne, 2003).

Los marcadores de ADN han sido utilizados ampliamente en análisis de diversidad,

caracterización y mapeo genético (Meena et al., 2015). Los primeros métodos desarrollados

se basaban en la detección de la variación de las muestras mediante la hibridación del ADN.

Este es el caso de la técnica RFLP o polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción,

en la que se hace uso de enzimas de restricción que actúan para obtener fragmentos de ADN

de diferentes longitudes, posteriormente se utilizan sondas que se hibridarán con el fragmento

o fragmentos homólogos (Vienne, 2003).

18

Esta técnica fue ampliamente utilizada hasta la aparición de métodos basados en la reacción

en cadena de la polimerasa o PCR (Joshi et al., 1999). Además de requerir menores

cantidades de ADN, la implementación de los métodos basados en PCR aporta una mayor

sensibilidad, especificidad, poder de resolución y facilidad en la ejecución del

procedimiento, lo que se traduce en una mayor confiabilidad de los datos obtenidos en los

análisis (Henry, 2013).

b. PCR

La técnica de PCR desarrollada por Mullis y colaboradores en 1983 permite la amplificación

in vitro de secuencias de ADN de interés. Desde el momento en el que hubo disponibilidad

de la enzima polimerasa termoestable, esta técnica ha reemplazado ampliamente previas

metodologías de la biología molecular por su mayor sensibilidad y conveniencia (Weising

et al., 2005). La reacción en cadena de la polimerasa se basa en la acción de dos primers

(secuencias de oligonucleótidos o cadenas cortas de ADN o ARN), cada uno complementario

a ambas cadenas opuestas de una sección de ADN. La síntesis de cada nueva cadena debe

direccionarse de tal forma que su extensión se dirija una hacia la otra obteniendo como

producto final la síntesis de una región específica limitada por los dos primers (Mcpherson

et al., 1996).

Para que se lleve a cabo la reacción de amplificación debe prepararse un mix que contenga:

una polimerasa termoestable que adicionará nucleótidos a partir del extremo 3´de los

primers; un buffer que generalmente contiene Tris-HCl, KCl y MgCl; deoxinucleótidos o

dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP); Primers y el ADN que se pretende amplificar. Durante

el primer ciclo, en una primera fase a 94°C, ocurre la denaturación, permitiendo la separación

de la doble cadena de ADN. Posteriormente ocurre una disminución de la temperatura con el

fin de que los primers se hibriden a las secuencias blanco en la cadena; la siguiente etapa

ocurre a una temperatura óptima para la actividad de la polimerasa termoestable (paso de

elongación). En el segundo ciclo ocurre de nuevo una denaturación con el fin de que la cadena

original y la cadena recién amplificada sirvan como moldes para las siguientes

amplificaciones. Estos ciclos pueden repetirse de 25 a 50 veces, permitiendo la amplificación

exponencial de la región especifica (Weising et al., 2005).

19

Con el fin de optimizar las condiciones para la amplificación es posible modificar ciertos

aspectos del proceso de PCR. Determinar las concentraciones apropiadas para reactivos

como magnesio, dNTPs o la polimerasa puede significar una mejora en los resultados del

proceso. Generalmente la optimización inicia con un ensayo de diferentes concentraciones

de magnesio; las concentraciones óptimas reportadas varían entre 1mM a 6 mM. El magnesio

es un cofactor requerido de la taq polimerasa y las variaciones en este pueden afectar el

funcionamiento de la enzima. Debido a que los dNTPs corresponden a las unidades de

construcción para los amplicones de PCR y que se requieren también como cofactor de la

polimerasa, las variaciones en su concentración deben optimizarse para lograr un resultado

exitoso. De igual forma las concentraciones y la calidad de los primers afectarán la

amplificación. Las modificaciones en el protocolo como tal consisten en cambios en

temperaturas de hibridación o en los ciclos , esto puede aumentar la especificidad del

producto y evitar la unión de primers en regiones inadecuadas (Kennedy & Oswald, 2011)

c. Marcadores ISSR

Los marcadores ISSR se encuentran dentro de los marcadores basados en la reacción en

cadena de la polimerasa (PCR). Técnicas como ISSR, AFLP o RAPD son sistemas de

marcadores dominantes y por lo tanto no permiten la detección de variabilidad en los alelos.

Sin embargo, son fáciles de implementar e implican un menor costo (Vijayan, 2005), esto

aplica especialmente para ISSR, por lo que se está implementando cada vez de forma más

frecuente en estudios filogenéticos, de diversidad genética, mapeo genético, entre otros

(Reddy et al., 2002).

La implementación de estos marcadores se basa en la amplificación de segmentos de ADN

que se encuentran entre dos regiones idénticas repetidas de microsatélites (SSR) situadas en

dirección opuesta (Vijayan, 2005). Los primers utilizados corresponden a microsatélites de

16 a 25 pares de bases de longitud, con repeticiones de di, tri, tetra o pentanucleotidos. Los

primers se unen a diferentes loci en el genoma y se genera la amplificación de las secuencias

intermedias entre los microsatélites de diferentes tamaños. Los primers pueden ser de dos

tipos: no anclados o anclados en el extremo 3´o 5´, los cuales poseen extremos degenerados

que se extienden hacia las secuencias flanqueantes en cualquiera de los dos extremos (Figura

1)

20

Modificado de (Reddy et al., 2002)

Figura 1. A) Primer (AG)n no anclado que se une en cualquier parte de la región repetida de la cadena molde.

B) Primer (AG)n anclado con dos nucleótidos (NN) extra en su extremo 5´. Como resultado, amplifica parte

de la secuencia repetida y el producto tiene una mayor longitud en comparación con el primero

Los productos de amplificación corresponden generalmente a 200 a 2000pb y el nivel de

polimorfismo que se revela puede responder a los distintos métodos de detección. Se ha

reportado una mayor resolución de bandas con la técnica de electroforesis en gel de

poliacrilamida (PAGE) con radioactividad, seguido por PAGE con tinción con plata y gel

de agarosa. La longitud de los primers utilizados con ISSR permiten que sea una técnica

altamente reproducible (Reddy et al., 2002)

d. Extracción de ADN

Para lograr llevar a cabo el estudio de diversidad que se pretende desarrollar por medio de

marcadores ISSR es indispensable la disponibilidad de ADN genómico que proceda de un

método de extracción que pueda ejecutarse en el laboratorio de forma simple y rápida sin

implicar un alto costo (Aubakirova et al., 2014).

La estandarización de protocolos de ADN es necesaria debido a que los procedimientos

pueden ser específicos y variar incluso entre individuos de especies del mismo género.

Además, ciertos componentes celulares extraídos pueden llegar a inhibir las reacciones

moleculares (Aubakirova et al., 2014)

En general los métodos de extracción consisten en: una ruptura de la membrana con el fin de

que el material genético sea liberado al buffer de extracción, agentes quelantes que protejan

21

el ADN de endonucleasas y finalmente el aislamiento del ADN de polifenoles, proteínas,

RNA y polisacáridos (Aubakirova et al., 2014).

El primer paso de la extracción corresponde a la disrupción del tejido que consiste en romper

las paredes celulares para facilitar la interacción con los componentes del buffer de lisis.

Este proceso puede realizarse de forma química (en presencia de componentes como

detergentes y proteasas que rompen las uniones celulares) o de forma mecánica (utilizando

nitrógeno líquido que congela inmediatamente la muestra evitando la degradación del ADN

por DNasas) (Henry, 2008).

Para que el ADN tenga acceso al medio de extracción debe ser liberado de la membrana

celular. Entre los componentes del Buffer de extracción se incluyen diferentes tipos de

detergentes que permiten la liberación del ADN unido a la membrana; También se adiciona

Tris (pH 7.0-8.0) que actúa como agente para controlar el pH de la solución, EDTA que

actúa como agente quelante para inactivar la actividad de las nucleasas, sales para solubilizar

el ADN y otras moléculas como β mercaptoetanol para prevenir actividades de la peroxidasa

o polifenoloxidasa (Henry, 2008).

En el siguiente paso que corresponde a la purificación que se realiza con agentes orgánicos

como mezclas de fenol, cloroformo e isoamilalcohol. Posteriormente es necesario separar la

fase orgánica y la fase que contiene el ADN (sobrenadante). Luego de la extracción orgánica

el ADN se precipita por acción de componentes como isopropanol. Finalmente se hidrata el

ADN y se resuspende para mantenerlo en solución, para esto se puede emplear agua a un pH

neutro o Buffer TE (Mezcla de Tris-HCl a 10mM y EDTA a 0.1M a un pH de 8.0) (Cornejo,

Serrato, Rendón, & Rocha, 2014).

Al finalizar el procedimiento, es necesario evaluar el producto obtenido cuantificando

mediante espectrofotometría. De esta forma se puede estimar la concentración y pureza

(evaluada mediante proporciones de absorbancia). Adicionalmente es importante observar la

integridad de la muestra mediante electroforesis (Cornejo et al., 2014)

Con estos criterios es posible determinar si el resultado de un protocolo permite obtener un

ADN genómico con cualidades apropiadas para futuros análisis moleculares como estudios

de diversidad en el caso particular de esta investigación.

22

e. Estudios de diversidad de ibia por medio de ISSR

Los aspectos relacionados con la diversidad genética de esta especie no han sido muy

evaluados y las investigaciones reportadas se han realizado en su mayoría en países andinos

distintos de Colombia como Ecuador, Perú y Bolivia, evaluando la diversidad genética

principalmente a través de marcadores moleculares ISSR (inter-secuencias simples repetidas)

( Pissard et al , 2006; Malice et al., 2007; Pissard et al., 2008).

Al igual que ISSR, se ha implementado la utilización de marcadores AFLP (polimorfismos

en la longitud de fragmentos amplificados) para detectar variación entre taxones

cercanamente relacionados. Sin embargo se indica que los marcadores ISSR pueden tener

una mayor sensibilidad para la distinción de individuos y pares clonales. (Moscoe &

Emshwiller, 2015).

Entre los estudios principales se encuentran los desarrollados por Pissard et al. (2006). En

una primera aproximación a la diversidad de Oxalis tuberosa, Pissard y colaboradores

evaluaron la diversidad entre accesiones de distintos países (Argentina, Bolivia, Perú y

Chile), provenientes de la colección de germoplasma del CIP (Centro internacional de la papa

en Lima, Perú). Los resultados arrojados agrupan las accesiones en conjuntos o clusters de

manera que sugieren que los marcadores ISSR permiten distinguir genotipos cultivados de

acuerdo al sitio de colección. Esto podría indicar que es posible que la estructura genética de

la ibia se encuentre influenciada por la distancia geográfica entre áreas de cultivo (Pissard et

al. 2006).

En un estudio posterior Pissard y colaboradores (2008) evalúan la congruencia entre

marcadores moleculares y morfológicos en la diversidad de accesiones agrupadas en cinco

morfotipos de diferentes regiones de Perú. En los resultados las accesiones correspondientes

al mismo sitio de colección tendieron a agruparse (patrón similar al observado en el anterior

estudio). Sin embargo a pesar de que se presentó una alta correlación entre marcadores

morfológicos y moleculares, el autor expone que esto puede atribuirse a una relación cercana

entre las accesiones y cabe la posibilidad de que no se presente la misma congruencia con un

rango mayor de muestras incluidas en un estudio (Pissard et al. 2008).

Igualmente se ha estudiado la diversidad intra-morfotipo y la influencia que tiene el método

de conservación in situ y ex situ. Pissard y colaboradores (2008) se enfocaron en tres

23

morfotipos de ibia (denominados Señora Oca, K´ellu Qayara y Puca kamusa) cuyas muestras

provienen de orígenes de conservación in situ y ex situ en Bolivia. Los análisis moleculares

arrojan que no fue posible diferenciar dos de los tres morfotipos como variedades

independientes. La totalidad de los grupos reconocidos como morfotipos presentaron una

variabilidad genética dentro de los morfotipos. Los autores determinaron una mayor

variación molecular entre las accesiones ex situ que las in situ (Pissard et al., 2008). Por otro

lado, Malice y colaboradores (2007) evaluaron seis morfotipos y obtuvieron una variación

mayor en las muestras conservadas in situ en comparación con las ex situ. En general, como

en el estudio de Pissard, se evidenció diferenciación genética entre los morfotipos al igual

que un nivel de heterogeneidad dentro de estas (Malice et al., 2007).

Si bien estos trabajos proveen una primera perspectiva de la diversidad de la ibia, la

disponibilidad de información es limitada y los tamaños de las muestras incluidos no parecen

ser lo suficientes para proveer un análisis más robusto.

Hasta el momento los esfuerzos de caracterización de diversidad de la ibia en Colombia se

han llevado a cabo a través de marcadores morfológicos. Rosero (2010) realizó un trabajo de

investigación en seis territorios indígenas en el departamento de Nariño en el cual por medio

de descriptores distinguió ocho grupos entre los que se distribuyen las variedades conocidas

comúnmente por su color. A partir de esta trabajo se conformó el Centro de Conservación de

raíces y tubérculos andinos del Suroccidente Colombiano ubicado en el resguardo indígena

el Gran Cumbal (Nariño) que cuenta con 32 accesiones, este se estableció como una

estrategia de conservación y caracterización, pero sin embargo no constituye una muestra

significativa (Rosero, 2010).

Con la necesidad de fortalecer las investigaciones de esta especie en Colombia para lograr

implementar estrategias sostenibles de conservación, es necesario complementar los estudios

de diversidad incluyendo caracterizaciones genéticas con métodos moleculares.

Debido a que la discriminación de variables se realiza con base en una única característica

morfológica, el color, cabe la posibilidad de una mayor diversidad de variedades que la

reportada en los territorios (Clavijo et al., 2011).

24

Pregunta de investigación

Teniendo en cuenta que para la zona de los municipios de Turmequé y Ventaquemada se han

reportado cinco morfotipos de ibia que corresponden a los colores del tubérculo blanco,

amarillo, rojo, rosado y amarillo con rayas rojas, ¿Existe una correspondencia entre la

diversidad de morfotipos de Oxalis tuberosa M. identificados por medio de características

morfológicas en los municipios de Ventaquemada y Turmequé (Boyacá) y la caracterización

molecular de la diversidad genética realizada por medio de marcadores moleculares ISSR?

Objetivos

Objetivo general

Evaluar la diversidad genética de los morfotipos colectados de Oxalis tuberosa M. existentes

en los municipios de Ventaquemada y Turmequé por medio de marcadores moleculares

ISSR.

Objetivos específicos

- Estandarizar el protocolo de extracción de ADN adecuado para muestras de Oxalis

tuberosa provenientes de municipios de Ventaquemada y Turmequé (Boyacá)

- Estandarizar un protocolo de amplificación por PCR de muestras de Oxalis tuberosa

provenientes de municipios de Ventaquemada y Turmequé (Boyacá) con marcadores

moleculares ISSR

- Realizar la evaluación de la diversidad genética de las muestras de Oxalis tuberosa

colectadas en municipios de Ventaquemada y Turmequé (Boyacá) por medio de

marcadores moleculares ISSR

Metodología

El presente trabajo consiste en una primera aproximación al análisis de diversidad de Oxalis

tuberosa M. en la región de Turmequé y Ventaquemada en el departamento de Boyacá por

medio de marcadores moleculares ISSR. El enfoque metodológico de esta investigación se

compone de una fase de campo y una de laboratorio. Dentro de esta última se describe a su

vez tres etapas acordes con los objetivos específicos formulados. El trabajo se desarrolló en

conjunto con otro estudio de investigación de diversidad genética de cubios (Tropaeolum

tuberosum). Se busca articular los resultados de estos trabajos junto con otras investigaciones

interdiciplinares que involucran el estudio bromatológico de tubérculos andinos, el estudio

de los agroecosistemas y sus cambios a través del tiempo. Esto podría lograr explicar los

25

efectos que han tenido influencia en los patrones de diversidad e identificar propiedades de

estos tubérculos que exalten las bondades de su consumo.

Fase de campo:

Localización y material vegetal

El estudio se llevó a cabo en diferentes agroecosistemas ubicados en los municipios de

Turmequé (ubicado en provincia de Márquez) y Ventaquemada (ubicado en Provincia

Centro), ambos localizados en el departamento de Boyacá. Este departamento, de gran

importancia agrícola ubicado en el centro del país, abastece a las ciudades más importantes

de Cundinamarca, Boyacá e incluso otras regiones de Colombia. Estos municipios se

caracterizan por un legado que conserva aún en la actualidad tradiciones de comunidades

indígenas y el consumo de especies vegetales nativas entre las que se incluyen los tubérculos

andinos hace parte de las tradiciones culturales de esta región (Clavijo et al., 2014).

Turmequé se encuentra a 73° 30´ al oeste de Greenwich a una altura de 2389 msnm y

Ventaquemada se encuentra a 73° 32´al oeste de Greenwich a 2630 msnm (Clavijo, 2014).

La colecta de material se efectuó en diferentes fincas de pequeños productores en ambos

municipios, considerados centros de conservación in situ. Con la colaboración de los

cultivadores se realizó un reconocimiento de la zona, las parcelas y los morfotipos cultivados.

Se registraron las coordenadas geográficas de cada sitio de colecta y datos relacionados con

características particulares de los cultivos, usos o prácticas de manejo, los cuales fueron

consignados en un formato (Anexo 1) diligenciado para cada accesión. Estos datos son

fundamentales en el proceso de análisis, para lograr relacionar los resultados arrojados por el

análisis de diversidad con los factores que han ejercido una influencia sobre los

agroecosistemas y la siembra de estos tubérculos de estudio, en este caso particular, de la

ibia. La tabla a continuación resume las características biofísicas básicas registradas en

campo.

Tabla 1. Resumen de características reportadas en campo

Numero de

Finca

Accesiones

colectadas

Municipio Coordenadas Altura msnm Observaciones adicionales

1 020

022

032

034

035

Ventaquemada N 05°22´39,1”

W073°31´47,5”

2786 Cultivos anexos de papa,

cubio, rubas, maíz, ajo,

habas, entre otros. Las ibias

se siembran en sitios

aleatorios. La parcela donde

26

se siembran los cultivos se

encuentra en una ladera.

2 036

037

038

040

041

043

044


W073°30´41,0”

3027 Parcela en terreno plano.

Gran densidad de

vegetación, cultivo de ibia

alternado aleatoriamente con

cultivos de cubios, rubas,

habas, maíz y otros.

3 051

052

053

054

055

056


W073°30´21,6”

2735 Cultivos situados en surcos,

de forma más homogénea en

el terreno, es posible

identificar más fácilmente

individuos de plantas

aislados.

4 064 Turmequé N 05°19´15,2”

W073°29´59,2”

2387 Asociación de varios

cultivos diferentes

5 068

069

071

074

Turmequé N 05°19´18,7”

W073°30´35”

2368 Plantas de ibia asociados a

otros cultivos.

6 075 Turmequé N 05°18´58,9”

W073°31´38,8”

2374 Asociación de varios

cultivos diferentes

7 079

080

081

082


W073°29´09.1”

2848 Plantas de ibia asociados a

otros cultivos. Gran

densidad de vegetación.

Se tomaron muestras de tejido foliar correspondientes a los diferentes morfotipos de

tubérculos de ibia existentes, para el posterior análisis molecular en el laboratorio. Estas

muestras se almacenaron inmediatamente en bolsas plásticas que contenían gel de sílice para

absorber la humedad y evitar la rápida oxidación de los tejidos. Posteriormente para

conservar las muestras en el laboratorio, fueron almacenadas en nevera a -80°C.

Igualmente se colectaron muestras de las plantas fértiles (aproximadamente 30cm de la

planta) y de los tubérculos de cada morfotipo correspondiente. De las muestras se registraron

datos que incluyeron ciertas características disponibles en campo que puedieran perderse con

la posterior manipulación en laboratorio. Las muestras se organizaron en papel periódico de

tal forma que sus características más importantes fueran observables y se depositaron en una

prensa botánica para someterlas a un proceso de secado en el horno a una temperatura entre

65 y 69°C. Para el ingreso al herbario de la Pontificia Universidad Javeriana, se consignó la

información recolectada en campo en etiquetas que correspondieron a cada muestra botánica

(Anexo 2). Una vez que se ingresaron las muestras al herbario, estas fueron reportadas al

Sistema de Información sobre Biodiversidad- SIB.

27

Las colecciones de herbario representan fuentes de información fundamentales en cualquier

estudio relacionado con plantas y su conservación, por esta razón se considera una

herramienta importante para incluir en este trabajo ya que será un complemento del proceso

de investigación realizado (Vera et al., 2005). Las muestras botánicas incluyendo los

tubérculos estarán disponibles como elementos de referencia en el herbario, y los datos

asociados representarán también un registro importante en cuanto a la especie, la región y

ecosistema. De esta forma estos registros pueden ser utilizados como referencias para futuras

investigaciones en esta y otras regiones del país.

Fase de laboratorio

Extracción de ADN

Para el procedimiento de extracción de ADN se evaluaron cinco protocolos, cuya prueba

tuvo dos repeticiones.

CTAB1 ( Pissard et al., 2006), SDS (Dellaporta et al, 1983 modificado), CTAB 2 (Doyle &

Doyle, 1990 modificado), Stefenon (Stefenon et al., 2004) y CTAB 3 (Doyle & Doyle, 1990

modificado) (Tabla 2).

En todos los casos, se realizó una maceración del material vegetal colectado con nitrógeno

líquido empleando un mortero. A la totalidad de los protocolos se agregaron

aproximadamente 0,2g de material vegetal macerado a cada buffer de extracción específico

en tubos de centrifuga de 0,5 - 2ml. En los pasos finales de cada protocolo se realizó un

lavado con etanol al 70 % que puede permitir la remoción de reactivos que inhiben el proceso

de PCR, se descartó el sobrenadante y como paso final, el pellet se resuspendió con buffer

T10E1 y se trató con RNasa.

Tabla 2. Especificación de procedimientos en cada fase de extracción de los protocolos evaluados Protocolo Homogeniz

ación

tejido

Lisis Separación de

proteínas y lípidos

Precipitación de ADN Redisolución de

ADN

CTAB 1 Macerado

Nitrógeno

líquido

700µl de Buffer de

extracción precalentado:

100mM Tris HCl pH

8,0; 2M NaCl; CTAB

2%; PVP 2%; 20mM

EDTA pH 8,2; β

mercaptoetanol 1%,

600 µl de

cloroformo alcohol

isoamílico (24:1),

mezclar por

inversión y

centrifugar a

14000rpm por 10 minutos

Transferir fase acuosa a un

tubo nuevo y agregar 550

µl de isopropanol. Agitar

por inversión y precipitar

de 2 a 24 horas a -20°C.

Centrifugar a 14000rpm

por 10 min y descartar

sobrenadante. Realizar

Resuspender pellet en

150 µl de Buffer T10E1

y adicionar 1 µl de

RNasa, dejando incubar a 37°C.

28

mezclar con agitador

Vortex e incubar 65°C por 40 min

lavado con 500 µl etanol al

70%, centrifugando esta vez por 5min a 14000rpm.

SDS Macerado

Nitrógeno

líquido

700µl de Buffer de


100mM Tris HCl pH

8,0; 5M NaCl; SDS 2%;

50mM EDTA pH 8,2; β

mercaptoetanol 10mM


Vortex e incubar 65°C

por 30 min mezclando por inversión cada 5min

500 µl de

cloroformo alcohol

isoamílico (24:1),

mezclar por

inversión 5min y

centrifugar a


Transferir sobrenadande a

un tubo nuevo y adicionar

1/10 volumen de Acetato

de Sodio 3M pH5,3 y 6/10

volumen de isopropanol,

mezclando por inversión y

dejando incubar a -20°C

por 30 min.

Posteriormente

centrifugar a 14000rpm

por 15 min, descartar el

sobrenadante dejar secar

precipitado a temperatura

ambiente. Lavar el

precipitado con 500 µl de

etanol a 70 %, y

centrifugar por 5 min a 14000rpm





CTAB 2 Macerado

Nitrógeno líquido

600µl de Buffer de


100mM Tris HCl pH

8,0; 1,4M NaCl; CTAB

3%; PVP 1%; 20mM

EDTA pH 8,2; β

mercaptoetanol 0,2%



por 20 min mezclando por inversión cada 5min

600 µl de

cloroformo alcohol

isoamilico (24:1),

mezclar por

inversión 5min y

centrifugar a



un tubo nuevo y realizar

un lavado con etanol

absoluto (2.5 volumenes)

más acetato de amonio

1/10 de volumen

mezclando de nuevo por

inversión. Incubar por 2

horas a -20°C.

Posteriormente se



sobrenadante y realizar


70%. Centrifugar por 5min a 13000rpm





Stefenon

et al 2004

Macerado

Nitrógeno

líquido

1500µl de Buffer de


100mM Tris HCl pH

8,0; 1,5M NaCl; CTAB

2%; PVP 2%; 20mM

EDTA pH 8,2; β

mercaptoetanol 1%



por 20 min mezclando

por inversión cada

15min

Adicionar 600 µl de

cloroformo alcohol

isoamilico (24:1),

mezclar por

inversión y

centrifugar a

13000rpm por 5

minutos.

Transferir fase

acuosa a tubo nuevo

y adicionar 5µl de

RNasa. Incubar a

34°C por 40 min.

Posteriormente

adicionar 600µl de

cloroformo alcohol

isoamilico.

Centrifugar 5min a

13000rpm y

transperir

sobrenadante.

Adicionar solución

1 (CTAB 10% y

Agregar 2/3 de volumen

de isopropanol y dejar 30

min a -20°C. Se centrifuga

a 4000 rpm por 5 min y se

descarta el sobrenadante.

Lavar el pellet con etanol

al 75% e incubar a -20°C

por 30 min. Centrifugar a

13000rpm por 5 min y descartar sobrenadante.





29

NaCl 1,4M).

Adicionar 600µl de

cloroformo y

centrifugar

nuevamente 5min a 13000.

CTAB 3 Macerado

Nitrógeno

líquido

600µl de Buffer de

extracción

precalentado: 100mM

Tris HCl pH 8,0;

1,4M NaCl; CTAB

3%; PVP 1%; 20mM

EDTA pH 8,2; β

mercaptoetanol 0,2%


Vortex e incubar

65°C por 20 min

mezclando por

inversión cada 5min

Adicionar 600 µl de

cloroformo alcohol

isoamílico (24:1),

mezclar por

inversión 5min y

centrifugar a

13000rpm por 5

minutos


un tubo nuevo y realizar

un lavado con etanol

absoluto (2.5 volumenes)

más acetato de amonio

1/10 de volumen

mezclando de nuevo por

inversión. Incubar por 2

horas a -20°C.

Posteriormente se



sobrenadante y realizar


70%. Centrifugar por 5min

a 13000rpm

Resuspender

pellet en 150 µl

de Buffer T10E1

y adicionar 1 µl

de RNasa,

dejando incubar

a 37°C.

Métodos de análisis del ADN

Por medio de los parámetros de calidad (pureza e integridad) y concentración, se evaluaron

los resultados obtenidos en las pruebas para lograr discernir entre los diferentes protocolos y

elegir el más adecuado para las muestras de O. tuberosa.

La cuantificación de ADN se realizó utilizando un espectrofotómetro NanoDrop™ Thermo

scientific. La valoración de la pureza se realizó a través de la proporción de absorbancias A

260 nm/ 280nm el valor ideal en el que se considera ADN puro corresponde a un rango entre

1,8 y 2,0. Valores menores a este, pueden indicar contaminación de la muestra con proteínas.

Una segunda proporción utilizada para determinar la pureza corresponde a A 260/230, donde

los valores apropiados se consideran entre el rango 2.0 - 2.2 y un valor menor puede reflejar

contaminación por carbohidratos o fenoles (Cornejo et al., 2014).

Para determinar la integridad de las muestras se realizaron ensayos de electroforesis en gel

de agarosa, utilizando el colorante fluorescente SYBR® Safe. (Weising et al., 2015).

PCR

Para el análisis molecular se emplearon primers ISSR reportados como polimórficos por

Pissard et al. (2006) (tabla 3) y se evaluó el protocolo también reportado por este autor en

estudios de diversidad genética de Oxalis tuberosa (Pissard et al., 2008)

30

Tabla 3. Primers ISSR y su temperatura óptima de anillamiento (tomado de Pissard et al 2008)

En primera instancia se realizaron pruebas preliminares con primers de marcadores

moleculares RAM (Random Amplified Microsatellite) para tener una primera aproximación

a la estimación de la calidad de la amplificación y determinar si el ADN extraído posee la

calidad apropiada para llevar a cabo técnicas moleculares como la PCR. Estas pruebas se

efectuaron con 5 primers (figura 5) preparando reacciones con un volumen de 25 µL y

utilizando concentraciones de 50ng del ADN genómico. La concentración de componentes

en cada reacción preparada equivale a 1x de Buffer; 2,5mM de MgCl2; 0,25mM de dNTPs;

4mM de Primer y 1U de la enzima Taq polimerasa. Finalmente se evaluaron los productos

por medio de electroforesis en gel de agarosa al 2% a un voltaje constante de 65V.

Para los primers ISSR se probó el protocolo reportado por Pissard (2006) para la PCR a

unvolumen final de 25 µL (volumen modificado del protocolo original) que contenía 10ng

de ADN, 0,4 µmol/l de primer, 80 µmol/l cada dNTP, 1U de Taq polimerasa y 1x de Buffer

. Para los primers 1-6 (tabla 3), en primer lugar se realizó una denaturación por 10 min a

95°C (35 ciclos) y la elongación final se efectuó por 5 min a 72°C. Para los primers restantes,

el primer paso de denaturación es de 5 min a 94° (35 ciclos) y un paso final de elongación de

4 min a 72 °C. Los productos de PCR se analizaron por electroforesis con un gel de agarosa

al 2% a un voltaje constante de 70 V.

Las condiciones de este proceso de amplificación se modificaron de acuerdo a los resultados

que se obtuvieron, buscando que se acoplaran a un protocolo de PCR adecuado para las

muestras de ibia. Con el fin de optimizar los resultados, se realizaron variaciones en la

concentración de los reactivos. Principalmente se inició estimando un valor de concentración

de magnesio al cual se genera una buena amplificación (Kennedy & Oswald, 2011). Debido

a que estudios previos han reportado condiciones adecuadas para la PCR con esta especie, se

31

restringió el gradiente a valores cercanos al rango entre 1.5 a 3 reportado por Pissard et al.

(2006). Las mejores condiciones se determinaron de acuerdo con la intensidad y claridad de

las bandas en la electroforesis.

Análisis de Diversidad Genética

Para la evaluación de la diversidad de morfotipos de ibia, se analizaron los fragmentos de

ADN amplificados de cada una de las 29 accesiones (Anexo 3) con los primers ISSR

escogidos. Los fragmentos se consideran como un carácter unitario y se evidencian por medio

de bandas que se visualizan en un gel de electroforesis. El análisis inicia asignando un valor

binario para la presencia (1) y la ausencia (0) de las bandas. Teniendo en cuenta estudios

reportados que utilizan ISSR, es recomendable tomar en cuenta para la puntuación aquellas

bandas con una separación de aproximadamente 0,5mm y cuya banda se pueda evidenciar

fácilmente (evitar fragmentos con aplificación tenue) debido a que estas condiciones

aumentan las posibilidades de reproducibilidad de los ensayos (Joshi et al.,2000; Chia, 2009).

Con los valores obtenidos de presencias y ausencias se diseñó una matriz en donde se

enfrentaron las accesiones evaluadas y los loci o caracteres tenidos en cuenta. Posteriormente

se realizó una matriz de similitud, producto del cálculo de un coeficiente de similitud para

los datos, utilizando el software estadístico PAST. Los datos se obtuvieron en principio

empleando el coeficiente de Jaccard. Este coeficiente adquiere valores de 0 a 1 y se basa en

la relación de las presencias y ausencias de una característica, en este caso, en dos muestras

o accesiones comparadas. El coeficiente se define a continuación (Figura 2) (Rodríguez et

al., 2001).

Figura 2. A) Combinaciones para condiciones de presencia y ausencia de una característica con dos muestras

comparadas. B) Fórmulas para cálculo de índice de Jaccard .

B.

Índice de Jaccard = a

a + b+ c

A.

X1 y X2= individuos comparados

a. Característica presente en X1 y X2

b. Característica presente en X1 y

ausente en X2

c. Característica Ausente en X1 y

presente en X2

d. Característica ausente en X1 y X2

32

Con esta matriz se realizó un agrupamiento con el algoritmo UPGMA (por sus siglas en

inglés: Unweighted Pair Group Method using Arithmetic averages) el cual permitió agrupar

los individuos de estudio con base en las distancias genéticas. El resultado de la aplicación

de este algoritmo utilizando el software PAST fue un dendrograma o árbol fenético donde se

evidenció de forma gráfica las distancias y el agrupamiento. De igual forma se obtuvieron

representaciones de los agrupamientos en dos dimensiones por medio de un análisis de

coordenadas principales, que permitió observar gráficamente la diversidad reflejando la

relación entre individuos (Barrera et al., 2004).

Resultados

Extracción de ADN

Como resultado de una primera experiencia en campo se realizó la colecta de 4 individuos

(accesiones) de Oxalis tuberosa (Anexo 4), meterial que se procesó para llevar a cabo el

ensayo de comparación de protocolos en el laboratorio de Biologia Molecular Vegetal de la

Pontificia Universidad Javeriana. El formato de datos de campo de la colecta se incluye en

el Anexo 1.

En la fase extracción de ADN en el laboratorio se pusieron a prueba los protocolos

especificados en la metodología (CTAB 1, SDS, CTAB2, Stefenon y CTAB 3) con las

muestras colectadas.

Tabla 4. Datos de concentración, pureza e integridad de los protocolos evaluados con muestras de ibia.

# de

accesión

ng/ul a 260/280 a 260/230 presencia

de bandas

CTAB 1 005 379,79 2,26 0,99 +

011 275,13 1,89 0,97 +

012 434,28 2,23 1 +

SDS 001b 1022,74 1,93 0,88 +

011 976,63 1,72 0,86 +

012 1388,93 1,81 0,9 +

33

CTAB 2 001b 202,77 2,34 0,73 +

011 107,89 2,08 0,91 +

012 281,81 2,11 0,93 +

CTAB 3 001b 210,89 2,33 0,73 +

011 531,22 2,12 1,06 +

012 374,43 2,13 0,94 +

STEFENON

MODIFICADO

001b 61,03 2,54 0,36 +

011 51,5 2,54 0,45 +

012 32,77 2,6 0,41 +

Los resultados de concentración arrojados por espectrofotometría indican una mayor

concentración en el caso del protocolo SDS, seguido de CTAB 3, CTAB 1 (con un valor

muy cercano a CTAB 3), CTAB 2 y finalmente Stefenon que registró valores mucho menores

en comparación con los otros protocolos (el gráfico de medias de concentración se incluye

en el anexo 5)

En cuanto a los resultados de estimación de la pureza, teniendo en cuenta que se considera

un ADN puro aquel cuya proporción de absorbancia 260 /280 arroje un valor mayor a 1,8, la

totalidad de los protocolos presentan valores óptimos. Si bien los valores no difieren en gran

proporción entre los protocolos, Stefenon modificado exhibe un valor mayor, seguido por

CTAB 3, CTAB 2, CTAB 1 (con un valor muy cercano a CTAB 2) y SDS. La gráfica de

medias de valores de proporciones de absorbancia (anexo 5) permite corroborar estos

resultados demostrando la cercanía entre las medias de los valores. Por otro lado, la

proporción 260 /230 utilizada como indicador de contaminación por compuestos como

carbohidratos y fenoles, no alcanza en ningún resultado el rango óptimo de pureza

considerado entre 2.0 y 2.2. El valor más alto se registra con CTAB 1.

En la evaluación de la integridad por medio de electroforesis, los primeros resultados

comparan el protocolo de SDS con CTAB1, evidenciando degradación del ADN para el

protocolo realizado con SDS (figura 3). En general los resultados muestran un patrón de

34

bandeo de mayor claridad para CTAB 1, con bandas más definidas cercanas a los pozos de

siembra

Figura 3. Electroforesis en gel de agarosa 0,8% con muestras de ibia y los resultados de la extracción de ADN

con los protocolos CTAB 2, CTAB 3, SDS y Stefenon

Finalmente, se escogió el protocolo CTAB 1, que ofrece un buen equilibrio entre los criterios

analizados. El resultado de electroforesis de la extracción con el protocolo CTAB1 con la

totalidad de las muestras colectadas se incluye en el anexo 13. Para evaluar la calidad del

ADN se probó la amplificación por medio de primers de marcadores RAM (Microsatélites

Amplificados al Azar), la cual fue exitosa (Anexo 6) (el protocolo de PCR se encuentra en el

anexo 7).

Condiciones de PCR

Luego de la extracción de ADN se efectuaron las pruebas para observar la amplificación con

los 9 primers de ISSR elegidos según estudios previos de Pissard et al. (2006).

Con el fin de elegir las condiciones más adecuadas para la amplificación, las reacciones se

prepararon según las especificaciones establecidas por Pissard y colaboradores (2006)

comparándolas con las condiciones utilizadas previamente para la amplificación con primers

de los marcadores RAM. Los mejores resultados de amplificación se obtuvieron con las

condiciones evaluadas para los primers de RAM (Anexo 8).

Para optimizar los resultados de amplificación se realizaron modificaciones

fundamentalmente en las concentraciones de magnesio. Los resultados obtenidos indican una

mejor definición de bandas incorporando a la reacción una concentración de MgCl2 de 3mM

(Anexo 8).

35

Bajo estas condiciones se efectuaron pruebas con los primers ISSR restantes para verificar

su amplificación. La totalidad de los primers amplificaron para el ADN de O. tuberosa

extraído, sin embargo, los controles negativos3 permitieron identificar contaminación en

cuatro primers (DHB (CGA)5; VHV (GT)7G; (AG)8T; DDC (CAC) 5), los cuales se

excluyeron de las pruebas posteriores de diversidad. Dos de estos primers (DHB (CGA)5 y

VHV (GT)7G) fueron reemplazados por primers RAM (GT y CGA) que tienen la misma

secuencia microsatélite. Sin embargo, con el primer CGA no se obtuvo amplificación del

ADN de las muestras.

En general comparando los diferentes primers, aquellos que permiten distinguir bandas con

mayor definición son los que incluyen repeticiones de nucleótidos AG, GA y AC.

Finalmente, considerando los resultados de las pruebas, las condiciones elegidas para realizar

la PCR fueron: ADN a 25ng; Buffer 1x, MgCl2 a 3mM, dNTPs 0.25mM, primers 4µM y

1U de Taq polimerasa, en un volumen final de 20ul. Las temperaturas de anillamiento y los

protocolos de PCR usados fueron los propuestos por Pissard et al. (2006) (Anexo 9).

Polimorfismo

En la amplificación de la totalidad de las muestras con los primers elegidos se detectaron

tamaños de fragmentos desde 150 hasta 1700 pb. A través de la matriz binaria generada se

calcularon los porcentajes de polimorfismo de cada uno de los 6 primers utilizados (tabla 5).

Tabla 5. Porcentajes de polimorfismo para primers ISSR seleccionados

primer número

total de

bandas

bandas

monomórficas

bandas

polimórficas

porcentaje de

polimorfismo

VHV(GT)5G 96 28 68 70,80%

BDB(CAC)5 78 54 24 30,80%

(AG)8 YT 135 56 79 58,50%

(GA)8YC 205 56 160 78,04%

(AC)8G 64 0 64 100%

(GA)8A 66 0 66 100%

3 Los controles negativos se incluyen en los experimentos para verificar si hay presencia de alguna contaminación. Estos

consisten en un mix de reacción para la PCR sin incluir un molde de ADN.

36

El menor grado de polimorfismo equivale a un 30% y se obtuvo con el primer BDB (CAC)5.

Los primers más polimórficos fueron (AC)8G y (GA)8A reportando un 100% de

polimorfismo.

Evaluación de la diversidad

Utilizando los 6 primers (tabla 5) que resultaron libres de contaminación y arrojaron una

buena amplificación, se obtuvieron resultados para las accesiones colectadas. La información

proveniente de las bandas evidenciadas en las electroforesis se procesó para obtener una

matriz binaria donde se registró la presencia (1) y la ausencia (0) de cada banda o locus en

los individuos evaluados (Anexo 10 )

Con el análisis de diversidad con el coeficiente de Jaccard se obtuvieron distancias que

oscilaron entre 0.296 y 0.909 lo cual evidencia una alta variabilidad intraespecífica entre los

morfotipos evaluados.

El dendrograma obtenido por medio del software estadístico PAST utilizando el coeficiente

de Jaccard se resuelve en un punto intermedio de similitud entre los valores 0.6 y 0.66 (Figura

5). A este nivel se definen 5 clusters o agrupaciones y una accesión aislada. De estos, los

clusters 2, 3 y 4 agrupan la mayor cantidad de muestras y en general corresponden a los

morfotipos identificados por colores (rojo, rosado y blanco respectivamente). El cluster 1

contiene dos accesiones del morfotipo blanco que se separan de las demás de su tipo, al igual

que dos accesiones rojas (roja 6 y 8) que se agrupan en el cluster 5. Por último, se muestra

una accesión aislada que corresponde a la única muestra del morfotipo amarillo (Figura 5).

Un análisis de coordenadas principales utilizando un índice de Jaccard refleja en un gráfico

de dos dimensiones, patrones de agrupación que corresponden a los generados con el

dendrograma (Figura 4).

37

Figura 4. Análisis de coordenadas principales realizado con coeficiente de Jaccard para 29 muestras de ibia

colectadas.

38

Figura 5. Dendrograma realizado por el método de agrupamiento UPGMA utilizando el coeficiente de

distancias de Jaccard para 29 muestras de ibia colectadas pertenecientes a cuatro morfotipos (roja, rosada,

blanca y amarilla).

39

Discusión

Extracción de ADN

Con un proceso de extracción exitoso, es posible el desarrollo de investigaciones con técnicas

moleculares, logrando obtener resultados confiables y reproducibles.

La principal limitación de la extracción ADN en plantas se atribuye al contenido de proteínas,

polisacáridos (que pueden encontrarse en la pared celular o en acumulaciones como gránulos

de almidón), taninos (u otros compuestos fenólicos), pigmentos y RNA que obstaculizan el

aislamiento y la purificación de la molécula (Bryant, 1997; Puchooa, 2004). Durante la

extracción los metabolitos secundarios pueden liberarse y co-precipitarse con el ADN. Estos

contaminantes son evidenciables durante la extracción e impiden la manipulación de la

molécula de ADN en procesos como el pipeteo y la resuspensión final del pellet ( Porebski

et al., 1997; Puchooa, 2004; Aubakirova et al., 2014)

Las etapas generales de los protocolos manuales de extracción comprenden: la

homogenización o ruptura de uniones celulares del tejido vegetal; etapa de lisis celular por

medio de un Buffer de lisis que incluye detergentes ; separación de proteínas y lípidos;

precipitación y finalmente resuspender el ADN resultante (Cornejo et al., 2014). En la fase

de colecta de material previa a este protocolo es importante buscar en lo posible obtener

muestras frescas y en caso de ser tejido foliar, preferiblemente evitar colectar hojas maduras

con mayor contenido de metabolitos secundarios (Porebski et al., 1997; Wangsomnuk et

al.,2014).

Dentro del Buffer de lisis puede haber diversos tipos de detergentes que permiten la

liberación del ADN. Entre los más comunes se encuentra el Bromuro de cetiltrimetilamonio

(CTAB) y el dodecilsulfato sódico (SDS).

Al momento de comparar un primer protocolo CTAB1 con el protocolo SDS, se observa que

la concentración obtenida con SDS es mucho mayor, sin embargo, la proporción 260/230 es

mejor para CTAB1. Estos criterios evaluados probablemente no proveen información

suficiente para elegir un protocolo más apropiado que otro, sin embargo, la evaluación de

integridad del ADN por medio de electroforesis permite evidenciar mayor degradación de

ADN en las bandas correspondientes al protocolo SDS, ya que además de la banda se observa

un barrido luminoso en el carril (figura 3). Basándose en estos resultados se considera que

40

un protocolo que incluya CTAB es más apropiado para la extracción de ADN de muestras de

ibia.

Estos resultados son consistentes con reportes en la literatura en los que extracción con SDS

en especies con altos contenidos de polifenoles resulta en una baja concentración y pureza

(Minas et al., 2011; Puchooa, 2004). Li et al. (2007) muestran resultados de electroforesis

con bandas degradadas utilizando un protocolo SDS para extracción de ADN de girasol

(Helianthus annuus L.).

Los demás protocolos evaluados (CTAB 2, Stefenon y CTAB 3), además de contener CTAB,

poseen otras sustancias adicionales como NaCl, PVP (polivinilpirrolidona), EDTA y β-

mercaptoetanol. Estos componentes evitan la degradación del ADN, actúan como

antioxidantes y contribuyen a la eliminación de polifenoles y polisacáridos ( Porebski et al.,

1997; Cornejo et al., 2014)

Para lograr separar proteínas y lípidos se utilizan solventes orgánicos, en este caso

Cloroformo alcohol isoamilico (24:1) (Cornejo et al., 2014). Los protocolos que incluyen

solventes orgánicos generan un mejor resultado que protocolos que no utilizan estos

solventes, reportando una gran efectividad (mayor y mejor purificación) en combinar altas

concentraciones de CTAB, NaCl y posteriormente realizar dos lavados con cloroformo-

alcohol isoamílico (Minas et al., 2011; Sá et al.2011). Los protocolos CTAB 1, 2, 3 y SDS

concuerdan con estas condiciones (doble lavado con cloroformo alcohol isoamílico) en su

fase de separación de lípidos y proteínas. A esto podría atribuirse los resultados del índice

260/280 que arrojan valores apropiados de pureza para los protocolos.

Con los resultados obtenidos se escogió el protocolo CTAB 1 que arrojó resultados

adecuados para los criterios evaluados. En promedio se obtuvo una concentración de 363,07

ng/ul. Este protocolo fue reportado por Pissard et al. (2006) para Oxalis tuberosa y se incluye

en reportes de estudios de diversidad con tubérculos andinos ( Pissard et al., 2006; Malice et

al., 2007; Pissard et al., 2008 .

La amplificación exitosa con primers RAM indica que el ADN obtenido se encuentra libre

de contaminantes que inhiben la PCR y por lo tanto permite el acceso para que se lleven a

cabo los procesos de hibridación y la extensión (Bryant, 1997)

41

Estandarización PCR

Para llevar a cabo la amplificación de fragmentos de ADN por la técnica de PCR se debe

tener en cuenta que no existe un único protocolo con variables adecuadas que permita

obtener resultados óptimos para todas las reacciones. Por esta razón es necesario desarrollar

adaptaciones para cada estudio específico, incluso si para este se han reportado condiciones

óptimas previamente (Mcpherson et al., 1995). Por esta razón en el presente trabajo se

realizaron variaciones a las condiciones reportadas para la especie Oxalis tuberosa por

Pissard et al. (2006), debido a que las condiciones establecidas por este autor no resultaron

óptimas para la amplificación del ADN proveniente de las accesiones colectadas.

Los resultados indeseados como barridos, ruido en el patrón de bandeo o bandas poco

distinguibles podrían ser ocasionados por efectos inhibitorios que se traducen en una

reducción de la sensibilidad de la reacción. Las fuentes de inhibición pueden tratarse de

compuestos orgánicos como fenoles, detergentes, polisacáridos, proteínas, etc. que pueden

provenir de un ADN blanco que no se encuentra suficientemente puro (Wilson, 1997).

Esta inhibición puede también ser total manifestándose en la ausencia de bandas, causando

en algunos casos, falsos negativos. Esto podría ser una explicación a la ausencia de bandas

en pruebas con primers como CGA, sin embargo igualmente podría tratarse de un error en el

procedimiento manual de la PCR o posiblemente por la falta de homología entre la secuencia

del primer y de la cadena molde (Mcpherson et al., 1995; Williams et al., 1990; Wilson,

1997). La optimización de las condiciones en donde se utilicen las cantidades adecuadas de

los reactivos minimiza estos efectos inhibitorios.

La principal variable que se evaluó en el presente estudio fue la concentración de MgCl2 ya

que esta es una de las variables más importantes a optimizar para lograr especificidad y

rendimiento óptimo de las reacciones. Hallar la concentración óptima es fundamental debido

a que tanto el exceso como las bajas concentraciones tienen consecuencias negativas. Un

exceso impide la denaturación completa y puede generar la hibridación de los primers en

sitios inespecíficos de la cadena molde; de igual forma, la falta de magnesio imposibilita la

reacción de extensión, limitando la actividad enzimática (Mcpherson et al., 1996; Wilson,

1997).

42

Las condiciones de amplificación de Pissard et al. (2006) indican una concentración óptima

de MgCl2 entre 1.5 y 2.5, sin embargo se usaron las condiciones utilizadas para la

amplificación con RAMs en la que las concentraciones de primer y dNTPs son mayores a las

de Pissard (Anexo7). Resultados de pruebas publicados (Mc phearson et al., 1996) indican

que hay un mejor rendimiento de la reacción cuando el magnesio aumenta proporcionalmente

al aumento de dNTPs , según esto, se consideraría apropiado el aumento en la concentración

de magnesio a 3µM que se indicó en los resultados (Mcpherson et al., 1996).

En concordancia con el trabajo publicado por Pissard et al. (2006), los primers con los que

se obtienen bandas de mejor resolución corresponden en su mayoría a los que incluyen

secuencias de repeticiones AG o GA. De igual forma en primers con repeticiones diferentes

como BDB (CAC)5 se observa una menor cantidad de bandas y también reflejan un menor

grado de polimorfismo (Tabla 6), Pissard indica que estos conjuntos de bases (motivos como

CAC) parecen ser abundantes en el genoma de la ibia.

Evaluación de la diversidad de muestras de ibia

El estudio de la variabilidad genética se puede abordar desde diversos enfoques. Cuando se

implementan marcadores moleculares se busca interpretar esta variabilidad por medio del

análisis de patrones de bandeo a los que se les asignan códigos binarios. A través de estos

patrones binarios se aplican diversas medidas o índices de similitud, los cuales revelan una

información que permitirá dilucidar relaciones genéticas entre individuos. Entre las medidas

más comunes para este tipo de estudios se incluyen los coeficientes de Dice, Jaccard o

distancia Euclídea al cuadrado, que pueden ofrecer distintos resultados y formas de

interpretación (Kosman & Leonard, 2005).

Para este trabajo se utilizó el coeficiente de Jaccard (Anexo 11) que se ha utilizado también

en otros estudios previos de diversidad con O. tuberosa (Malice et al., 2010; Pissard et al.,

2006, 2008;)

Cuando se utilizan marcadores dominantes como ISSR se toma cada banda como un único

locus, por lo tanto se asume que el número de bandas observadas corresponde a los loci que

se pueden identificar para un individuo. Sin embargo, la limitación de los marcadores

dominantes con organismos diploides o poliploides como la ibia es que no es posible

distinguir las bandas que representan un locus con alelos iguales (homocigoto) de un locus

43

con alelos diferentes (heterocigoto). Por esta razón, los resultados obtenidos con estos

marcadores serían estimaciones, mas no una detección exacta de la similitud genética entre

dos individuos (Kosman & Leonard, 2005).

Sin embargo los marcadores moleculares ISSR se han utilizado exitosamente en gran

cantidad de estudios para evaluar la diversidad genética entre e intra variedades en especies

como el piñón (Jatropha curcas L.), manzanilla (Matricaria chamomilla L.) y palma datilera

(Phoenix dactilifera L.). Adicionalmente, los estudios de diversidad que se han realizado

sobre tubérculos andinos, principalmente de la ibia, se han realizado implementando estos

marcadores (Malice et al., 2007, 2010; Pissard et al., 2006, 2008; Sabir et al., 2014; Solouki

et al., 2008; Sujatha, 2007). En algunas ocasiones los ISSR se han comparado con

marcadores morfológicos y se destaca su alta capacidad discriminatoria ya que utilizar

marcadores morfológicos puede acarrear ciertas dificultades. A pesar de ser una medida

indirecta de la diversidad y de su fácil aplicación, los marcadores morfológicos están sujetos

a determinaciones subjetivas y pueden ser influenciados por condiciones ambientales

(Pissard et al., 2008).

La ibia exhibe una alta diversidad morfológica que se evidencia principalmente a través de

los distintos colores de los tubérculos. Este es el principal criterio utilizado por los

agricultores para distinguir la diversidad. Sin embargo, la limitada cantidad o disponibilidad

de estudios de variabilidad genética impiden que estos grupos con características comunes

entre sí puedan denominarse con certeza como variedades. Por esta razón es más preciso

utilizar la unidad taxonómica “morfotipo” ( Pissard et al., 2008). Para la zona de estudio, los

morfotipos identificados se distinguen por cinco colores de los tubérculos: amarillo, rosado,

rojo, blanco y amarillo con rayas rojas. Sin embargo en el muestreo realizado no fue posible

incluir el morfotipo amarillo con rayas rojas, posiblemente debido a que su hallazgo fue

reportado únicamente en una feria de agrobiodiversidad, mas no fue encontrado en las fincas

de agricultores visitadas. De igual forma, la presencia del morfotipo amarillo fue muy poco

frecuente en las fincas muestreadas y por lo tanto se incluye únicamente una accesión (Anexo

3) (Clavijo et al., 2014).

Para el presente estudio se distribuyeron las accesiones en morfotipos con base únicamente

en el color del tubérculo asociándolo a los morfotipos reportados por Clavijo y colaboradores

44

(2014). Adicionalmente se registraron los colores de los tallos utilizando la carta de colores

de la RHS (Royal Horticultural Society) (Anexo 12). Si bien no se realizó una determinación

más profunda utilizando descriptores reportados por el IPGRI/CIP (2001), los estudios de

Pissard y colaboradores (2006, 2008) al igual que el de Malice & Baudoin (2009) indican

una total correspondencia entre la identificación de morfotipos mediante descriptores

morfológicos y los morfotipos establecidos directamente por los agricultores, por lo que

podría considerarse que pocas características morfológicas claves son eficientes para

clasificar los individuos en morfotipos.

Para analizar la diversidad entre las 29 muestras colectadas, se obtuvo un dendrograma

(Figura 5) en el cual se observa variabilidad incluso dentro de los agrupamientos que se

producen.

Como resultado se identificaron 5 clusters y una única accesión aislada. Estos parecen

agruparse de acuerdo a los morfotipos establecidos en un principio según las características

morfológicas (color del tubérculo). El Cluster 2 comprende la mayoría de accesiones del

morfotipo rojo y una única accesión blanca, el cluster 3 incluye las accesiones rosadas (con

excepción de rosada 9) y una blanca; dos clusters más pequeños agrupan cada uno dos

accesiones blancas y dos accesiones rojas respectivamente. Para interpretar estos resultados,

los datos de campo son importantes para analizar posibles situaciones que influyan en los

patrones observados (tabla 1).

Las fincas donde se llevaron a cabo los muestreos se caracterizan por ser parcelas de tamaño

pequeño donde los sitios de siembra de los tubérculos se asocian a otros cultivos como haba,

maíz, papa o arracacha y conforman así un fragmento de tierra bastante heterogéneo (Clavijo

et al., 2014). En ocasiones puede haber una alta densidad de individuos de plantas en una

parcela, lo que puede dificultar el proceso de muestreo al momento de tomar tejido foliar de

individuos independientes y determinar con certeza el morfotipo que se está colectando. Esto

pudo suceder en el caso de las muestras que se incluyen en el cluster 2, ya que entre los datos

de campo se registra una posible imprecisión en la toma de las muestras con respecto al

morfotipo colectado. Igualmente, otro factor que significó un obstáculo en el muestreo fue la

temporada, ya que esta no coincidió con el momento cercano a la cosecha y por lo tanto en

ocasiones no era posible asociar individuos con ningún morfotipo. Ante esta situación, en

45

algunos casos los cultivadores conocían las variedades que habían sembrado en un

determinado sector y con base en esta información se realizó la colecta, sin embargo, sin la

posibilidad de corroborar mediante la observación del tubérculo es posible se procesen datos

equivocados. Por lo tanto estas imprecisiones al momento de la colecta podrían explicar la

inclusión de la accesión “blanco 2” en el cluster 2.

Comparando los datos de campo entre las accesiones que parecen encontrarse agrupadas en

posiciones irregulares en el dendrograma, se observaron diferencias entre los colores

registrados para los tallos de los diferentes individuos. Las accesiones denominadas roja 6 y

roja 8 que se agrupan fuera del cluster 2, son las únicas que presentan coloraciones verdes en

el tallo ya que el resto de accesiones del morfotipo rojo poseen tallos rojizos.

Lo mismo se observa con la accesión “blanca6” que se agrupa con morfotipos rosados. Esta

presenta una coloración rosa o rojiza en los tallos a diferencia del resto de muestras del

morfotipo blanco que poseen tallos verdes. Finalmente la accesión “rosada 9” se diferencia

de las otras accesiones rosadas por expresar una tonalidad verde y rosa en el tallo.

Esto indicaría que para una identificación sencilla de morfotipos de ibia, además del color

del tubérculo, el color del tallo es una característica determinante que se debe tener en cuenta.

Esta información podría ser útil al momento de protocolos de colecta de futuras

investigaciones, sin embargo es necesario corroborar esta información con estudios

adicionales.

La mayoría de estudios de diversidad de la ibia al igual que con otras especies de propagación

vegetativa en agroecosistemas tradicionales como la yuca reportan concordancia entre

marcadores moleculares y morfológicos (Malice et al., 2010; Pissard et al., 2008; Malice &

Baudoin, 2009; Malice et al., 2007; ). Estos estudios y los resultados del presente trabajo

soportarían la información para la forma actual de clasificación que consiste en

características moleculares ( Malice et al., 2007).

Elias y colaboradores (2010) indican que de acuerdo a las prácticas de manejo del cultivo en

las que se utilizan tubérculos de cosechas previas para la nueva siembra se esperaría que se

presentara progresivamente un proceso de deriva genética y en este caso debería encontrarse

una gran diferencia genética únicamente entre posibles variedades. Sin embargo en los

46

resultados evidenciados en el dendrograma (figura ) y análisis de coordenadas (figura ) puede

observarse una variación presente también dentro de los grupos indicando que no se trata de

clones. Esta evidencia se manifiesta también en el resto de estudios de variabilidad de O.

tuberosa mencionados anteriormente.

La variabilidad dentro de un mismo morfotipo puede deberse tanto a procesos de mutación

como a una posible confusión entre individuos con similitudes morfológicas que son

genéticamente diferentes (Elias et al., 2001). Las prácticas de cultivo tradicionales ejercidas

por los cultivadores pueden contribuir en gran medida a esta diversidad. Las actividades que

realizan los agricultores de la zona de Turmequé y Ventaquemada, tales como la rotación de

cultivos, la siembra de las plantas de ibia de diferentes variedades en un mismo espacio y en

diferentes altitudes; al igual que el intercambio constante de semillas entre cultivadores de la

zona que se fomenta por actividades como ferias de agrobiodiversidad, contribuyen a la

diversificación de la especie (Clavijo et al., 2014; Marie Malice et al., 2007).

Este y otros estudios aportan al conocimiento existente de la diversidad de esta especie, sin

embargo es importante para tener una información concluyente, aumentar los tamaños de las

muestras y probablemente incluir otros tipos de marcadores moleculares para obtener un

análisis más robusto y continuar entendiendo las características de la variabilidad y los

factores que contribuyen a esta. Este conocimiento irá permitiendo dilucidar la importancia

de la conservación de la agrobiodiversidad y de conocer y perpetuar las prácticas culturales

que contribuyen a mantenerla en estos campos de conservación in situ. Para lograr objetivos

de conservación debe ejercerse un uso sostenible y en lo posible fomentar la

complementariedad entre conservación in situ y ex situ.

Conclusiones

- El estudio de diversidad parece indicar que efectivamente hay una

correspondencia entre los morfotipos identificados por medio de características

morfológicas y los grupos que se obtienen en el análisis por medio de marcadores

moleculares, lo cual puede indicar un proceso de adaptación de esta especie en la

zona.

- Los individuos de los diferentes morfotipos evaluados en este estudio

presentaron una amplia diversidad genética, la cual se ve reflejada en los índices de

similitud obtenidos que se encuentran en un rango entre 0,296 y 0,909.

47

- Los marcadores moleculares ISSR son una técnica de fácil aplicación. Sin

embargo es fundamental estandarizar los procesos de extracción de ADN para

acoplarse a una especie en particular y optimizar las condiciones de PCR para lograr

determinar de forma confiable patrones de bandeo. Estos marcadores pueden ser una

herramienta polimórfica eficiente para la caracterización de la diversidad genética a

escala de un centro de conservación in situ como son los agroecosistemas evaluados.

- El manejo agronómico tradicional asociado al cultivo de ibia ha contribuido a

mantener una variabilidad genética y morfológica. Esta variabilidad encontrada,

asociada a las condiciones ambientales y socioculturales de la región podría permitir

considerar la zona de los municipios de Turmequé y Ventaquemada como un

microcentro de diversidad para esta especie.

Recomendaciones

- Para la realización de futuros estudios sería pertinente incluir un tamaño

mayor de la muestra, al igual que diferentes marcadores moleculares o una mayor

cantidad de primers en el caso de los marcadores ISSR que permitan identificar

polimorfismos adicionales y obtener análisis más robustos.

-

- Además de considerar únicamente la coloración externa del tubérculo como

indicador de un morfotipo específico, es posible que se deba considerar también el

color de los tallos de las plantas de ibia como una característica principal para

identificar morfotipos en campo.

48

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52

Anexo 1 formato de datos para colecta

Proyecto Tubérculos Andinos

No. de colecta: GTA_____

Especie: __Oxalis tuberosa_______ Morfotipo: __________________

Fecha: ______________________

Lugar de colecta (incluir topónimos físicos):

Altitud: ____________ Coordenadas: _

Descripción de la planta:

Descripción del tubérculo:

Usos del tubérculo: ___________

Usos de otras partes de la planta: ___________

Método de propagación: Sexual ____ Asexual ____

Procedencia de la semilla: __________

Observaciones:

53

Anexo 2. Ejemplo de formato de etiquetas para herbario

54

Anexo 3. Lista de accesiones incluidas en estudio de diversidad.

Morfotipo # de

accesión

Nombre en

dendrograma

Ibia Roja 032 Roja 1

034 Roja 2

035 Roja 3

037 Roja 4

041 Roja 5

051 Roja 6

054 Roja 7

055 Roja 8

056 Roja 9

081 Roja 10

Ibia

blanca

022 blanca 1

036 blanca 2

038 blanca 3

052 blanca 4

053 blanca 5

069 blanca 6

079 blanca 7

082 blanca 8

Ibia

rosada

040 rosada 1

043 rosada 2

044 rosada 3

064 rosada 4

068 rosada 5

071 rosada 6

074 rosada 7

075 rosada 8

080 rosada 9

Ibia

amarilla

020 amarilla 1

55

Anexo 4 Individuos de Oxalis tuberosa utilizados para pruebas de extracción

Número de

accesión

Duplicado de la

muestra

Morfotipo de

tubérculo

001

001a

001b

No posee

005 No presenta No posee

011 No presenta Ibia Blanca

012 No presenta Ibia Roja

Estas son las muestras de ibia colectadas en primera salida de campo con las que se realizó la primera fase de

extraccion de ADN en el estudio.

56

Anexo 5. Gráficos de medias para parámetros evaluados durante la extracción de

ADN

a.

Gráfico representando las medias de los datos de concentración de ADN (ng/ml) en los protocolos evaluados

con muestras de ibia.

b.

Gráfico representando las medias de las proporciones de absorbancia 260/280 para determinar

presencia de proteínas y 260/230 para determinar carbohidratos u otros contaminantes en los

protocolos evaluados con muestras de ibia.

363,07

1129,43

197,49

372,18

48,43

0,00

200,00

400,00

600,00

800,00

1000,00

1200,00

CTAB1 SDS CTAB 2 CTAB 3 STEFENONmodificado

Co

nce

ntr

acio

n n

g/u

l

Concentracion de ADN en protocolos

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

CTAB1 SDS CTAB 2 CTAB 3 STEFENONmodificado

Valores de pureza en protocolos evaluados A260/280 A 260/230

57

Anexo 6 Prueba de amplificación con primers RAM

a) CCA b) GT y TG c) CA y AG). Los números de los carriles corresponden a las cinco muestras colectadas

de ibia (1y 6= 001a; 2 y 7= 001b; 3y 8= 005; 4 y 9= 011; 5 y 10=012).

a

.

b

C.

58

Anexo 7. Protocolo y concentraciones para primers RAM

Primer Segmento Temperatura °C Tiempo Ciclos Reacción

AG 1 95° 10min 37 Desnaturalización inicial

2 95° 30 seg Desnaturalización

3 54° 45 seg Anillamiento

4 72° 2 min Extensión

5 72° 7 min Extensión final

CT 1 95° 10min 37 Desnaturalización inicial





CA 1 95° 10min 37 Desnaturalización inicial





GT 1 95° 10min 37 Desnaturalización inicial





CGA 1 95° 10min 40 Desnaturalización inicial





CCA 1 95° 10min 40 Desnaturalización inicial




59


TG 1 95° 10min 37 Desnaturalización inicial





Secuencias

Reactivos Concentración final

Buffer 1x

MgCl2 2.5mM

dNTPs 0.25mM

Primer 4µM

Taq polimerasa 1U

ADN 25ng

60

Anexo 8. Evidencia para condiciones adecuadas de PCR

Comparación entre amplificación con condiciones reportadas en Pissard et al. (2006) y condiciones utilizadas

previamente para amplificación con primers de marcadores moleculares RAM. a) prueba de amplificación con

primer ISSR: DHB (CGA)5. b) Prueba de amplificación con primer ISSR: DDC (CAC)5.

Diferencias en patrones de bandeo bajo distintas concentraciones de MgCl2 en la reaccion de PCR. Primer

ISSR utilizado: BDB (CAC) 5

Condiciones Pissard Condiciones RAM

a

b

61

Anexo 9. Protocolo Pissard

Protocolo para primers 1 a 6

- Paso de denaturacion de 10 min a 95°C

- 30 seg a 95°C

- 45 seg a Ta

- 2 min a 72°C

- Paso de elongación final 5 min a 72°C

Protocolo para primers 7-9

- Paso de denaturacion de 5 min a 94°C

- 1min a 94°C

- 45 seg a Ta

- 2 min a 72°C

- Paso de elongación final 4 min a 72°C

Reactivos Concentración final

Buffer 1x

MgCl2 1.5 - 2.5mM

dNTPs 0.08mM

Primer 0,4µM

Taq polimerasa 1U

ADN 5-10ng

35 ciclos

35 ciclos

62

Anexo 10 Matriz binaria

VHV (GT)5G BDB (CAC)5

150 200 400 500 600 650 1000 1100 1300 300 375 500

Roja1 1 ? 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1

Roja2 1 ? 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1

Roja3 1 ? 1 0 0 ? 0 0 0 1 1 1

Roja4 1 1 1 0 0 1 0 0 1 1 1 1

Roja5 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1

Roja6 1 0 1 0 0 1 0 0 0 1 1 1

Roja7 1 0 1 0 0 ? 0 0 1 1 1 1

Roja8 1 0 1 ? 0 1 0 0 0 1 1 1

Roja9 1 0 1 ? 0 ? 0 0 1 1 1 1

Roja10 1 ? 1 ? 0 0 0 0 0 1 1 1

Blanca1 1 ? 1 ? 0 1 0 0 0 1 1 0

Blanca2 1 0 1 ? 0 ? 0 0 1 1 1 1

Blanca3 1 0 ? 0 1 0 0 0 0 1 1 0

Blanca4 1 0 1 0 0 0 0 0 ? 0 0 0

Blanca5 1 0 1 ? 0 0 0 0 ? 1 1 1

Blanca6 1 1 1 ? 1 1 1 1 1 1 1 1

Blanca7 1 0 1 0 0 ? 0 0 ? 1 1 1

Blanca8 1 0 1 0 0 0 0 ? ? 1 1 1

Rosada1 1 0 ? 0 0 ? 0 0 0 1 1 1

Rosada2 1 0 1 0 1 1 0 0 0 1 1 1

Rosada3 1 0 1 0 1 1 0 0 0 1 1 0

Rosada4 1 1 1 ? 0 1 1 1 1 1 1 1

Rosada5 1 1 1 ? 0 1 1 1 1 1 1 1

Rosada6 1 ? ? 0 0 1 0 0 0 1 1 1

Rosada7 1 ? 1 ? 0 1 0 0 0 1 1 1

Rosada8 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1

Rosada9 1 ? 1 1 0 ? 0 0 0 1 1 1

Amarilla1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 1 1 1

63

(AG)8 YT

250 350 450 500 700 900 1000 1500

1 1 1 0 0 0 0 0

1 1 1 0 1 1 1 0

1 1 1 0 1 1 1 0

1 1 1 0 1 1 1 0

1 1 1 0 0 1 0 0

1 1 1 1 1 1 0 1

1 1 1 0 0 1 0 0

1 1 1 1 1 1 0 1

0 1 1 1 0 1 0 0

0 1 1 1 ? 1 0 0

1 1 1 0 ? 1 0 0

1 1 1 1 1 1 0 0

1 1 1 1 1 1 0 0

0 1 1 0 0 1 0 0

0 1 1 1 ? 1 1 0

1 1 1 ? 0 1 ? 0

0 1 1 0 0 1 0 0

0 1 1 0 0 1 ? 0

1 1 1 0 0 1 1 0

1 1 1 0 0 1 1 0

1 1 1 0 0 1 1 0

1 1 1 0 0 1 1 0

1 1 1 0 0 1 1 0

0 1 1 0 0 1 1 0

1 1 1 0 0 1 1 0

0 1 1 0 0 1 0 0

0 1 1 ? 0 1 ? 0

0 1 1 0 0 1 1 0

64

(GA)8YC

150 200 250 300 350 400 500 550 700 800 900 1000 1750

0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 1

? 0 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 1

? 0 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 1

? 1 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 1

0 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0

? 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 0

0 1 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1

? 1 1 1 0 0 0 1 1 0 0 1 0

0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 1

0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 1

? 1 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 1

? 1 1 1 0 0 0 1 1 0 0 1 1

? 1 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0

1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 0 1

0 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 0 1

0 1 1 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0

0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1

? 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1

1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 1

1 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0

1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 1

1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1

0 1 1 0 1 0 0 1 1 1 0 0 1

1 1 1 0 1 0 0 1 1 1 0 0 1

0 1 1 0 1 0 0 1 1 1 0 0 1

0 1 1 0 1 0 0 1 1 1 0 0 1

0 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 0 1

1 0 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0

65

(AC)8 G (GA)8A

375 440 470 500 650 1750 200 300 700 1000

1 0 1 0 0 0 1 1 0 0

1 0 1 0 0 0 1 1 0 0

1 0 1 0 0 0 1 1 0 0

1 0 1 0 0 0 1 1 1 0

1 0 1 0 0 0 1 1 0 1

0 1 1 1 1 0 1 1 0 0

1 0 0 0 0 0 1 1 0 1

0 1 1 1 0 0 1 1 0 1

1 0 0 0 0 0 1 1 0 1

1 0 0 0 1 0 1 1 1 0

1 1 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 1 0 0 1 1 1 0 0

0 0 1 0 0 0 0 0 0 0

1 1 0 1 0 1 1 1 0 0

0 0 1 1 0 0 1 1 0 0

1 0 1 1 0 0 1 1 0 0

0 0 0 0 0 0 1 1 0 0

1 0 0 0 0 0 1 1 1 0

1 0 1 0 1 0 1 1 1 0

1 0 1 1 0 0 1 1 1 1

1 0 1 1 1 0 1 1 1 1

1 0 1 0 1 0 1 1 0 1

1 0 1 1 1 0 1 1 0 0

1 0 1 0 0 0 1 1 0 1

1 0 1 0 0 0 1 1 0 0

1 0 1 1 0 0 1 1 0 0

0 0 0 0 1 1 1 1 0 0

1 0 1 0 0 0 1 1 0 0

66

Anexo 11. Matriz de Jaccard

Roja1 Roja2 Roja3 Roja4 Roja5 Roja6 Roja7 Roja8

Roja1 1

Roja2 0.85714286 1

Roja3 0.85714286 1 1

Roja4 0.72 0.84 0.875 1

Roja5 0.66666667 0.65384615 0.65384615 0.65517241 1

Roja6 0.55172414 0.6 0.62068966 0.55882353 0.58064516 1

Roja7 0.73913043 0.72 0.72 0.74074074 0.83333333 0.5483871 1

Roja8 0.53571429 0.5862069 0.60714286 0.59375 0.56666667 0.79310345 0.5862069 1

Roja9 0.65217391 0.64 0.64 0.66666667 0.68 0.48387097 0.82608696 0.62962963

Roja10 0.65217391 0.66666667 0.66666667 0.69230769 0.55555556 0.53333333 0.68 0.57142857

Blanca1 0.59090909 0.60869565 0.63636364 0.64 0.5 0.48275862 0.65217391 0.57692308

Blanca2 0.64 0.69230769 0.69230769 0.71428571 0.60714286 0.63333333 0.66666667 0.74074074

Blanca3 0.5 0.56521739 0.56521739 0.51851852 0.48 0.5 0.48 0.6

Blanca4 0.44444444 0.46428571 0.46428571 0.4516129 0.5 0.46875 0.55555556 0.40625

Blanca5 0.57692308 0.65384615 0.65384615 0.62068966 0.62962963 0.63333333 0.62962963 0.56666667

Blanca6 0.53571429 0.55172414 0.57142857 0.64516129 0.71428571 0.57575758 0.62068966 0.51515152

Blanca7 0.58333333 0.57692308 0.57692308 0.57142857 0.64 0.53333333 0.70833333 0.46666667

Blanca8 0.6 0.61538462 0.61538462 0.64285714 0.65384615 0.48484848 0.72 0.42424242

Rosada1 0.64 0.72 0.72 0.74074074 0.60714286 0.5483871 0.60714286 0.48387097

Rosada2 0.57142857 0.64285714 0.66666667 0.7 0.65517241 0.57575758 0.62068966 0.61290323

Rosada3 0.53333333 0.6 0.62068966 0.65625 0.5625 0.54285714 0.58064516 0.52941176

Rosada4 0.57142857 0.64285714 0.66666667 0.73333333 0.63333333 0.47222222 0.65517241 0.5

Rosada5 0.60714286 0.65517241 0.67857143 0.74193548 0.5625 0.52777778 0.63333333 0.51428571

Rosada6 0.625 0.70833333 0.73913043 0.73076923 0.59259259 0.46875 0.68 0.55172414

Rosada7 0.73913043 0.79166667 0.82608696 0.80769231 0.62962963 0.53125 0.72 0.56666667

Rosada8 0.59259259 0.5862069 0.60714286 0.67741935 0.5483871 0.47222222 0.62068966 0.51515152

Rosada9 0.53846154 0.55555556 0.55555556 0.55172414 0.51724138 0.51612903 0.62962963 0.46666667

Amarilla1 0.56 0.64 0.66666667 0.5862069 0.65384615 0.56666667 0.55555556 0.51724138

67

Roja9 Roja10 Blanca1 Blanca2 Blanca3 Blanca4 Blanca5 Blanca6

1

0.81818182 1

0.63636364 0.60869565 1

0.72 0.68 0.58333333 1

0.52173913 0.54545455 0.63157895 0.65217391 1

0.48148148 0.46428571 0.48 0.44827586 0.2962963 1

0.61538462 0.59259259 0.42857143 0.62962963 0.48 0.62962963 1

0.51724138 0.46666667 0.44827586 0.51612903 0.42857143 0.48387097 0.64285714 1

0.625 0.6 0.5 0.55555556 0.4 0.64 0.79166667 0.57142857

0.64 0.68 0.5 0.51724138 0.37037037 0.68 0.76 0.5862069

0.53571429 0.65384615 0.52 0.55172414 0.44444444 0.51724138 0.64285714 0.56666667

0.55172414 0.53333333 0.5 0.51612903 0.48148148 0.51612903 0.63333333 0.7

0.51612903 0.5483871 0.51724138 0.48484848 0.44827586 0.53125 0.59375 0.60606061

0.5862069 0.53333333 0.5 0.5483871 0.36666667 0.42424242 0.53125 0.73333333

0.56666667 0.56666667 0.51724138 0.5625 0.38709677 0.45454545 0.61290323 0.76666667

0.66666667 0.57692308 0.54166667 0.55555556 0.42307692 0.5 0.62962963 0.55172414

0.64 0.61538462 0.625 0.62962963 0.48 0.48275862 0.66666667 0.64285714

0.62962963 0.57142857 0.51851852 0.56666667 0.36666667 0.48387097 0.62068966 0.75862069

0.6 0.66666667 0.48 0.59259259 0.38461538 0.59259259 0.75 0.5

0.56 0.53846154 0.5 0.51851852 0.4 0.44827586 0.59259259 0.60714286

68

Blanca7 Blanca8 Rosada1 Rosada2 Rosada3 Rosada4 Rosada5 Rosada6 Rosada7 Rosada8 Rosada9

1

0.90909

091 1

0.65384

615

0.79166

667 1

0.55172

414

0.64285

714

0.77777

778 1

0.56666

667

0.65517

241

0.85185

185

0.86206

897 1

0.5

0.55172

414

0.68965

517 0.65625

0.66666

667 1

0.58620

69

0.62068

966

0.72413

793

0.63636

364

0.69696

97

0.83333

333 1

0.66666

667

0.70833

333 0.8

0.74074

074 0.75

0.74074

074

0.71428

571 1

0.70833

333 0.72

0.83333

333

0.71428

571

0.72413

793

0.71428

571

0.81481

481

0.86956

522 1

0.62962

963

0.64285

714 0.6

0.57575

758

0.58823

529

0.73333

333

0.89285

714

0.70370

37

0.76923

077 1

0.82608

696 0.76

0.62962

963

0.48387

097

0.54838

71

0.55172

414

0.64285

714 0.64

0.70833

333

0.64285

714 1

0.53846

154

0.57692

308

0.59259

259

0.62068

966 0.53125

0.56666

667 0.5

0.61538

462

0.61538

462

0.51612

903

0.51851

852

69

Anexo 12.Tabla de colores de tallos

Morfotipo # de accesión Nombre en dendrograma Código de color del tallo

Ibia Roja

032 Roja 1 187A

034 Roja 2 178D con 59b

035 Roja 3 59A

037 Roja 4 187A

041 Roja 5 59A

051 Roja 6 145b

054 Roja 7 187A

055 Roja 8 145b

056 Roja 9 187A

081 Roja 10 187A

Ibia blanca

022 blanca 1 145b

036 blanca 2 145b

038 blanca 3 145b

052 blanca 4 145b

053 blanca 5 145b

069 blanca 6 178D

079 blanca 7 145b

082 blanca 8 145b

Ibia rosada

040 rosada 1 178D

043 rosada 2 178D

044 rosada 3 178D

064 rosada 4 178D

068 rosada 5 59A

071 rosada 6 59B

074 rosada 7 194A

075 rosada 8 178C

080 rosada 9 194A

Ibia amarilla 020 amarilla 1 145b

194 A 178 C 178 D 145B 178C 178D 59 A 59B 187A

70

Anexo 13 Extracción de 29 muestras de ibia por medio de protocolo CTAB1

Evaluación preliminar de la diversidad genética de ... · forjan la identidad de las comunidades...

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