EVALUACIÓN DE LA OBTENCIÓN DE BIOETANOL A PARTIR DEL ALMIDÓN DE ÑAME (DIOSCOREA ROTUNDATA, DIOSCOREA ALATA Y DIOSCOREA

TRÍFIDA) MEDIANTE LA HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA Y POSTERIOR FERMENTACIÓN.

JOSE DAVID MURGAS TORRES MIGUEL ANGEL VASQUEZ MONTERROSA

UNIVERSIDAD DE SAN BUENAVENTURA FACULTAD DE INGENIERÍAS, ARQUITECTURA, ARTE Y DISEÑOS

PROGRAMA DE INGENIERÍA QUÍMICA CARTAGENA

2012

EVALUACIÓN DE LA OBTENCIÓN DE BIOETANOL A PARTIR DEL ALMIDÓN DE ÑAME (DIOSCOREA ROTUNDATA, DIOSCOREA ALATA Y DIOSCOREA

TRÍFIDA), MEDIANTE LA HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA Y POSTERIOR FERMENTACION.

JOSE DAVID MURGAS TORRES MIGUEL ANGEL VASQUEZ MONTERROSA

Trabajo de grado presentado como requisito para optar al título de Ingeniero Químico

Asesora Externa Adriana Alejandra Pérez

Bacterióloga

UNIVERSIDAD DE SAN BUENAVENTURA FACULTAD DE INGENIERÍAS, ARQUITECTURA, ARTE Y DISEÑOS

PROGRAMA DE INGENIERÍA QUÍMICA CARTAGENA

2012

Nota de aceptación

Firma del Presidente del jurado

Firma del jurado

Firma del jurado

Cartagena,Mayo de 2012

DEDICATORIA

Celebramos el fin de una etapa importante en nuestra vida dando las gracias, principalmente a nuestro señor Dios que nos permitió compartir este tiempo

de enseñanza necesaria para nuestra formación.

A mi querida madre María Lourdes por luchar junto a mí en la búsqueda de mis objetivos, por su educación y valores inculcados a lo largo de mi vida.

A mis amigos y todos lo que hicieron parte de esta formación, por brindarme

siempre palabras de aliento y el apoyo en los momentos difíciles.

Dedico esto a una persona muy especial que ha sido una fuente inagotable de luz para mí, que me ha brindado su confianza y que siempre estuvo ahí, para apoyarme cuando lo necesite, la persona que considero como mi padre; por ese

motivo gracias te doy mi querido tío Jonny Torres Saurith, gracias por su apoyo incondicional.

JOSE DAVID MURGAS TORRES

DEDICATORIA

A dios principalmente ya que gracias a él todo esto fue posible

A mí querida madre Milagros Monterrosa quien con mucho sacrificio me saco

adelante durante todos estos años, siempre estuvo apoyándome en las buenas y

en las malas, le doy las gracias por su comprensión y paciencia, por creer en mí

en la adversidad, por darme tú ejemplo y educación me ayudaste a ser una

mejor persona.

A mi tía Carmenza Monterrosa quien siempre estuvo a lo largo del desarrollo de

mi carrera apoyándome.

A mi tía Marina quien a pesar de la distancia me dio su apoyo y consejo.

A mis demás tías Clara y Raquel quienes siempre estuvieron pendientes de mi

proceso y me brindaron su cariño y comprensión.

A mi hermana Gina por ser fuente de alegría en todo momento.

A mis amigos María, Carlos y Fabián con quienes pude compartir alegrías y

tristezas, gracias por su amistad incondicional.

Miguel Ángel Vásquez Monterrosa

AGRADECIMIENTOS

El desarrollo y culminación de este proyecto se debe al apoyo de todas aquellas personas que nos brindaron sus conocimientos y experiencia. Expresamos nuestros más sinceros agradecimientos: A nuestros padres, familiares y amigos que estuvieron siempre presente en cada uno de nuestros felices y difíciles, brindándonos su apoyo de manera incondicional. A la Universidad de San Buenaventura por la excelente formación académica brindada, logrando formar profesionales integrales. A Adriana Alejandra Pérez, Bacterióloga quien estuvo asesorándonos en el desarrollo del proyecto de grado. Al personal de los laboratorios: Aissa Rodríguez, Rosa Rangel, Carmen Muskus y Alma Estrada por brindarnos su ayuda incondicional.

A todos muchas gracias.

I

CONTENIDO Pag

1 PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN 1 1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 1 1.2 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA 4 1.3 JUSTIFICACIÓN 4 1.4 OBJETIVOS 5 1.4.1 Objetivo general 5 1.4.2 Objetivos específicos 5 2 MARCO DE REFERENCIA 6 2.1 ANTECEDENTES INVESTIGATIVOS 6 2.1.1 Historia del etanol 6 2.1.2 Estado actual en Latinoamérica 7 2.2 BASES TEÓRICAS 10 2.2.1 Ñame 10 2.2.2 Dioscorea Alata 11 2.2.3 Dioscorea Trífida 12 2.2.4 Dioscorea Rotundata 13 2.2.5 Producción Mundial de Ñame 14 2.2.6 Producción de Ñame en Colombia 15 2.2.7 Almidón 16 2.2.8 Hidrolisis 20 2.2.9 Hidrolisis Química 21 2.2.10 Hidrolisis Enzimática 22 2.2.11 Fermentación 24 2.2.12 Etanol 38 2.2.13 Destilación 40 2.3 MARCO LEGAL 42 2.4 MARCO CONCEPTUAL 44 3 DISEÑO METODOLÓGICO 46 3.1 TIPO DE INVESTIGACIÓN 46 3.2 POBLACIÓN Y MUESTRA 48 3.3 METODOLOGÍA UTILIZADA EN EL PROYECTO 48 3.3.1 Obtención de la harina de ñame 48 3.3.2 Hidrólisis enzimática 50 3.3.3 Fermentación 52 3.3.4 Destilación 56 3.4 RECOLECCION DE LA INFORMACION 56 3.4.1 Fuentes primarias 56 3.4.2 Fuentes secundarias 56 3.5 INSTRUMENTOS 57 3.5.1 Instrumentos y equipos 57 3.5.2 Materias primas y reactivos 57 3.6 HIPOTESIS 58 3.6.1 Hipótesis nula 58

II

3.6.2 Hipótesis alternativa 58 3.7 VARIABLES 58 3.7.1 Variables Independientes 58 3.7.2 Variables Dependientes 58 3.8 OPERACIONALIZACIÓN DE VARIABLES 59 3.9 PROCESAMIENTO DE LA INFORMACIÓN 59 4 RESULTADOS 60 4.1 Comportamiento de Dioscorea Alata en la hidrólisis enzimática 60 4.2 Comportamiento de Dioscorea Trífida en la hidrólisis enzimática 62 4.3 Comportamiento de Dioscorea Rotundata en la hidrólisis enzimática 64 4.4 Lectura de pH 66 4.4.1 Lectura de pH para Dioscorea Alata 66 4.4.2 Lectura de pH para Dioscorea Trífida 67 4.4.3 Lectura de pH para Dioscorea Rotundata 68 4.5 Lectura de °BRIX 69 4.5.1 Lectura de °BRIX para Dioscorea Alata. 69 4.5.2 Lectura de °BRIX para Dioscorea Trífida 70 4.5.3 Lectura de °BRIX para Dioscorea Rotundata 71 4.6 Lectura de azucares reductores en la fermentación. 72 4.6.1 Lectura de azucares reductores para Dioscorea Alata 72 4.6.2 Lectura de azucares reductores para la Dioscorea Trífida 73 4.6.3 Lectura de azucares reductores para Dioscorea Rotundata 74 4.7 Conteo de microorganismos 75 4.7.1 Conteo de microorganismos para Dioscorea Alata 75 4.7.2 Conteo de microorganismos para Dioscorea Trífida 76 4.7.3 Conteo de microorganismos para Dioscorea Rotundata 77 4.8 Producción de etanol 78 4.8.1 Producción de etanol de Dioscorea Alata 78 4.8.2 Producción de etanol de Dioscorea Trífida 80 4.8.3 Producción de etanol de Dioscorea Rotundata 82 4.9 Rendimientos del proceso 84 4.9.1 Rendimiento para Dioscorea Alata . 84 4.9.2 Rendimiento para Dioscorea Trífida 84 4.9.3 Rendimiento para Dioscorea Rotundata 85 4.10 ANÁLISIS ESTADÍSTICO 85 5 CONCLUSIONES 87 6 RECOMENDACIONES 88

BIBLIOGRAFÍA 89 ANEXOS 92

III

LISTA DE FIGURAS

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Figura 1. Línea de tiempo de utilización de bioetanol a nivel mundial. 6 Figura 2. Imagen sobre hojas de Dioscorea (izquierda) y morfología 10 del ñame (derecha) Figura 3. Hojas D. Alata (izquierda) y tubérculo (derecha) 12 Figura 4. Hoja de D.Trífida (izquierda) y tubérculo (derecha) 13 Figura 5. Hojas de D. Rotundata (izquierda) y tubérculo (derecha) 14 Figura 6. Producción de ñame en los departamentos de 16 Colombia año 2010 Figura 7. Estructura del almidón 18 Figura 8. Esquema del proceso de glucolisis. 27 Figura 9. Esquema de distintas formas de levadura 34 Figura 10. Diagrama de la estructura de una levadura 35 Figura 11. Curva de crecimiento de un microorganismo 37 Figura 12. Diagrama de flujo de un proceso de destilación 42 Figura 13. Equipo de destilación simple 42 Figura 14. Proceso de extracción de harina de ñame 49 Figura 15. Esquema general del proceso de hidrólisis 52 Figura 16. Hidrolizados Esterilizados 53 Figura 17. Fermentadores usados 54 Figura 18. Toma de muestras 55 Figura 19. Lecturas de pH 55 Figura 20. Montaje del equipo de Destilación 56

IV

LISTA DE GRAFICAS.

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Gráfica 1. Comportamiento de azucares reductores en la hidrólisis 61 enzimática de D. Alata Gráfica 2. Comportamiento °Brix en la hidrolisis enzimática 62 de D. Alata Gráfica 3. Comportamiento azucares reductores en la hidrólisis 63 enzimática de D. Trífida. Gráfica 4. Comportamiento °Brix en la hidrólisis enzimática 64 de D. Trífida. Gráfica 5. Comportamiento azucares reductores en la hidrólisis 65 enzimática de D. Rotundata. Gráfica 6. Comportamiento °Brix en la hidrólisis enzimática 66 de D. Rotundata. Gráfica 7. Comportamiento del pH durante la fermentación 67 de D. Alata. Gráfica 8. Comportamiento del pH durante la fermentación 68 de D. Trífida. Gráfica 9. Comportamiento del pH durante la fermentación 69 de D. Rotundata. Gráfica 10. Comportamiento del descenso de °Brix durante 70 la fermentación de D. Alata. Gráfica 11. Comportamiento del descenso de °Brix durante 71 la fermentación de D. Trífida. Gráfica 12. Comportamiento del descenso de °Brix durante 72 la fermentación de D. Rotundata. Gráfica 13. Comportamiento del descenso de azucares 73 reductores durante la fermentación de D. Alata.

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Gráfica 14. Comportamiento del descenso de azucares 74 reductores durante la fermentación de D. Trífida Gráfica 15. Comportamiento del descenso de azucares 75 reductores durante la fermentación de D. Rotundata Gráfica 16. Comportamiento del crecimiento de biomasa 76 durante la fermentación de D. Alata Gráfica 17. Comportamiento del crecimiento de biomasa 77 durante la fermentación de D. Trífida Gráfica 18. Comportamiento del crecimiento de biomasa 78 durante la fermentación de D. Rotundata Gráfica 19. Comportamiento de la producción de alcohol 79 durante la fermentación de D. Alata Gráfica 20. Gráfico de medias variedad Dioscorea Alata 80 Gráfica 21. Comportamiento de la producción de alcohol 81 durante la fermentación de D. Trífida. Gráfica 22. Gráfico de medias de la variedad Dioscorea Trífida 82 Gráfica 23. Comportamiento de la producción de alcohol 83 durante la fermentación de D. Rotundata Gráfica 24. Gráfico de medias de la variedad Dioscorea Rotundata 83

VI

LISTA DE TABLAS

Pag

Tabla 1. Producción de Ñame A nivel Mundial año 2005. 15 Tabla 2. Almidón presente en diferentes alimentos. 19 Tabla 3. Compuestos producidos por el proceso de fermentación. 29 Tabla 4. Metabolitos microbianos comerciales. 29 Tabla 5. Tamaño de células en procesos Biotecnológicos. 34 Tabla 6. Cantidad de ñame utilizada en el proceso 49 Tabla 7. Condiciones de la enzima α Amilasa 51 Tabla 8. Condiciones de la enzima AMG (Amiloglucosidasa) 51 Tabla 9. Condiciones en el proceso de la fermentación 53 Tabla 10. Equipos e instrumentos laboratorio 57 Tabla 11.Lista de materias primas y reactivos 57 Tabla 12. Operacionalización de las variables 59

VII

RESUMEN

Hoy en día la búsqueda de energías alternativas y su utilización se ha convertido en una de las principales preocupaciones y desafíos para la humanidad. De seguir así, con el consumo desaforado de los combustibles fósiles, el futuro de la humanidad y del planeta se prevé desastroso debido al acelerado ritmo de contaminación y al gran impacto que se ha generando en la capa de ozono por su combustión. Por lo planteado anteriormente esta investigación tiene como finalidad realizar la evaluación de la obtención de etanol a partir de tres variedades de ñame como sustrato,mediante el proceso de hidrólisis enzimática y posterior fermentación, teniendo en cuenta las propiedades que posee este tubérculo y sualta producción en las zonas regionales, con lo que se busca darle un valor agregado al uso de este producto agrícola. De acuerdo a lo planteado anteriormente, en el primer capítulo del proyecto se realizó el planteamiento y la formulación del problema, en donde se destaca la importancia de evaluar un nuevo sustrato (ñame) para la obtención de etanol y utilizarlo como alcohol carburante y así minimizar las emisiones de gases en la atmósfera reduciendo así el impacto ambiental, también se proponen los objetivos los cuales deben ser alcanzables para que la investigación sea valedera. En el segundo y tercer capítulo, se recopilaron las investigaciones realizadas previamente a esta investigación, las bases teóricas que fundamentan la investigación y se planteo la metodología empleada para la obtención de los resultados, además se establece las fuentes de información utilizadas y la descripción de las variables implicadas en el proceso. En el capítulo 5 y 6 se encuentran las conclusiones y recomendaciones que se pudieron extraer del proyecto, que servirán como punto de referencia a futuros investigadores que decidan indagar o explorar en este campo o que deseen llevar a cabo el proceso a escala piloto o industrial

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ESTUDIO DE LA OBTENCIÓN DE BIOETANOL A PARTIR DEL ALMIDÓN DE ÑAME (DIOSCOREA ROTUNDATA, DIOSCOREA ALATA Y DIOSCOREA

TRÍFIDA), MEDIANTE LA HIDRÓLISIS ENZIMATICA Y POSTERIOR FERMENTACIÓN.

1. PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN

1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Históricamente las fuentes de energía que se han utilizado en el desarrollo de muchos procesos (el transporte, las fábricas, la calefacción y las industrias de generación de energía eléctrica) son los combustibles fósiles (petróleo, carbón y gas natural). Por eso estos compuestos son claves en el desarrollo de la vida y sociedad de nuestro planeta. Debido al agotamiento progresivo de los combustibles fósiles, en los últimos años se ha generado una gran preocupación por parte de los países de todo el mundo por buscar nuevas fuentes de energía, pero hasta el momento no se ha desarrollado una fuente de energía que reemplace por completo a los combustibles fósiles, debido a que poseen un gran potencial energético. Sin embargo, se han desarrollado innumerables estudios a lo largo de estas cuatro últimas décadas y en la literatura científica se reporta que una potencial fuente nueva energía es la biomasa, que supone la obtención de combustibles desde fuentes vivas (plantas, microorganismos, incluso algunos residuos de animales), como el etanol o alcohol etílico, producido a partir de la fermentación de los azucares que se encuentran en los productos vegetales (cereales, caña de azúcar, remolacha, maíz entre otros). Este combustible debidamente procesado poco a poco comienza a penetrar como combustible en el mercado internacional1. Cada día que pasa se hace más evidente la necesidad de encontrar nuevas alternativas que puedan reemplazar a los combustibles fósiles, que ayuden a la conservación y recuperación del medio ambiente. Es por esto que la energía a partir de la biomasa, es sin lugar a duda una fuente importante a tener en cuenta, porque se puede reducir la contaminación proveniente de la utilización de energía a partir de los combustibles fósiles. Teniendo en cuenta esto, para la investigación se utilizó como biomasa un producto vegetal(ñame), que por su composición permite la obtención de bioetanol, que se puede utilizar como combustible o como aditivo de la gasolina.

1 Estudio realizado por Global Bioenergy Partnership (Asociación Global de Bioenergía) [GBEP

(2007)]

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El ñame pertenece a la familia DIOSCOREACEA, género Dioscorea. Se encuentra distribuido en las regiones tropicales de alta pluviosidad, contiene fécula abundante y constituye un importante alimento en las regiones tropicales. Las especies más cultivadas corresponden a Dioscorea Alata, D. Rotundata, D. Cayenensis, D. Esculenta, D. Bulbífera y D. trífida, de los cuales la primera es la preferida en la producción de tubérculos para el consumo humano. El área mundial cultivada comprende tres regiones principales: África occidental, sur de Asia incluyendo parte de China, Japón, Oceanía y los países del Caribe. En América, el ñame es solo importante en Brasil, Colombia, Haití, Venezuela y Antillas Francesas. En Colombia se pueden encontrar varias especies de ñame, como el ñame criollo (D. Alata), ñame espino (D. Rotundata), ñame papa (D. Bulbífera), ñame azúcar (D. Esculenta) y ñampin (D. Trífida). D. Alata y D. Rotundata son las especies de mayor importancia tanto por el área sembrada como por la demanda del tubérculo, seguidas por D. Trífida. El cultivo del ñame se considera abundante en la Costa Atlántica, las áreas de mayor producción en Colombia son: la zona costera del departamento de Córdoba, la subregión natural de los montes de María en los departamentos de Sucre y Bolívar, y algunos municipios de los departamentos del Cesar y la Guajira. Aun cuando actualmente se le conoce en todo el mundo, en Colombia el ñame se ha caracterizado como producto de cultivo y consumo tradicional en la Costa Atlántica2. El uso del ñame se ve en reflejado en las comidas cotidianas como (mote de ñame, dulce de ñame y sancocho). El cultivo de este tubérculo involucra a 9.000 familias de pequeños productores cuyos sistemas de comercialización se caracterizan por bajos volúmenes, escasa infraestructura de acopio, transporte y almacenamiento y una reducida transformación, donde el 78% de la producción se dirige al mercado en fresco; además en la región de la Costa Atlántica, donde se cultivan alrededor de 29.757 ton/año3; a pesar de la alta producción en el año el ñame no es utilizado con otros fines a parte del alimenticio, ya que no se conocen transformaciones tecnológicas que permitan generar otro uso para este. Su condición de alimento regional que no se sitúa como de primera necesidad ha estancado su explotación, que se realiza generalmente en predios de economía campesina con bajo nivel de tecnificación. Es necesario realizar un análisis sobre cómo afecta la producción de biocombustible al campo, y hay que tener presente que se necesitan alimentos para vivir, pero también se necesitan combustibles para atender las necesidades

2Evaluación De Propiedades Tecnofuncionales De Variedades De Ñame De La Costa Atlántica.

Disponible en: http://www.unicordoba.edu.co/pregrado/copia%20alimentos/proyectos/pba.pdf fecha:13/03/2012 3ALVIS, Armando y VELEZ, Carlos. Información Tecnológica-Vol. 19 N°5-2008, pág.: 11-18

Disponible en: http://www.scielo.cl/scielo.php?pid=S0718-07642008000500003&script=sci_arttext

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de transporte, industria, vivienda, comercio, etc. La elección entre alimentos y biocombustibles no se puede plantear en términos absolutos, porque no se puede renunciar a ninguno. La demanda de alimentos y la demanda de combustibles van en aumento, tanto por el desarrollo económico, como por el crecimiento poblacional. Ambos mercados, el de alimentos y el de combustibles, existen y van a seguir existiendo; están y seguirán compitiendo por los productos agrarios que son materia prima para la fabricación de biocombustibles. Se necesita tanto de los alimentos como de los combustibles. Esta competencia exige volcar la vista al campo, a la agricultura. En el mundo son aproximadamente 5.000millones de hectáreas las que se ocupan en agricultura. Sin embargo, todavía queda superficie cultivable, aproximadamente 4.000 millones de hectáreas, la que actualmente está cubierta por bosques. Pero mejor si no los tomamos en cuenta. Si hoy en día de una hectárea se puede obtener aproximadamente 3.000 – 9.000 litros de bioetanol/año y 1.000 – 5.000 litros de biodiesel, entonces se necesitarían entre 220 y 800 millones de hectáreas para producir un volumen de bioetanol y biodiesel igual al volumen de gasolina y diesel consumidos actualmente. Si se mantiene la superficie agrícola actual solamente para la producción de alimentos, entonces se necesitará incrementar las hectáreas arriba mencionadas. ¿Habrá otras alternativas? Sí, elevar la productividad y hacer más eficiente el uso de combustibles. Fuera de ampliar la frontera agrícola, elevar los rendimientos de producción agraria y reducir el consumo de combustibles por persona son alternativas viables para enfrentar la crisis. Para elevarla productividad agraria se tiene que aplicar nuevas tecnologías en la producción. Las nuevas tecnologías incluyen riego, semillas mejoradas, técnicas más eficientes, mecanización, mejoramiento del empresariado, créditos, etc. La reducción del consumo de combustibles por persona tiene mucho que ver con el tipo de vehículos que se utilizan4. Debido a la creciente necesidad en el país para la producción de bioetanol, es relevante realizar investigaciones relacionadas con la evaluación de nuevos sustratos y metodologías para la obtención de azucares fermentables por medio de hidrólisis. El ñame en su composición química posee almidón, que es un componente importante de los tubérculos encontrándose en una concentración aproximada de 15,5 %5, por lo que se puede considerar una buena fuente de dicho polisacárido6,

4BARRIENTOS, Juan Carlos. Alimentos o combustible ¿Sinergia o dilema? Revista “Análisis” ISSN

1999‐6233vol 1 Nr 1 2008.Disponible en www.ibepa.org 5TREADWAY, R. H. Manufacture of potato starch. In Whistler & Paschal (Eds.), Starch: Chemistry

and Technology (pp 87-101). New York: Academic Press Inc.1984. fecha: 30/11/2011 6GONZALES, Jorge y MOLINA, Manuel. Estudio de los factores que afectan la hidrolisis enzimática

y el proceso fermentativo para la producción de alcohol a partir de la papa. Revista de ingeniería vol. 16(1), Enero/Julio 2006.

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Por tal razón en esta investigación se evaluará un sustrato rico en almidón. Es necesario realizar este estudio ya que busca dar un uso diferente a este alimento, utilizándolo como materia prima para la obtención de etanol a partir de la hidrolización del almidón mediante el uso de enzimas como la alfa amilasa, Amiloglucosidasa y posteriormente la fermentación con la Saccharomyces cerevisiae. 1.2 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA

¿Se podrá obtener bioetanol a partir de la hidrólisis de almidón de ñame a concentraciones de 10.5, 13.5 y 15 en %m/v utilizando las enzimas alfa amilasa, Amiloglucosidasa y la fermentación con Saccharomyces cerevisiae? 1.3 JUSTIFICACIÓN Los recursos no renovables (combustibles fósiles) en el país día a día se están agotando debido a la gran demanda que estos generan a nivel mundial por las diferentes aplicaciones y usos que estos tienen en procesos industriales. Este proyecto se hace necesario para la búsqueda de alternativas energéticas viables con el fin de disminuir el consumo de los combustibles fósiles debido a la contaminación que estos generan y con el tiempo poder llegar a remplazarlos. Por otra parte generaría desarrollo en las investigaciones del país cerrando poco a poco la brecha tecnológica con los países industrializados de Suramérica como Brasil. Este proyecto es importante para investigadores y la comunidad científica porque se aplican las bases y conocimientos prácticos adquiridos a lo largo del proceso de aprendizaje, para enfrentar los retos que se nos presenten a lo largo de nuestra carrera profesional. Esto permite tener una visión más amplia del papel que ocupa el profesional formado en la Universidad de San Buenaventura en la sociedad. La Ingeniería Química como ciencia está a la expectativa de nuevas investigaciones, teorías o procesos de fabricación las cuales conforman una ciencia más competitiva frente al ámbito laboral ya que el papel del ingeniero químico en la industria es fundamental en el desarrollo de muchos procesos. Mediante la obtención de etanol a nivel de laboratorio se desarrollaran los pasos adecuados para realizar el proceso en mayores proporciones. Este proyecto se caracterizó por su proyección social, debido a la generación de oportunidades para personas de escasos recursos que pueden desempeñarse en la siembra y recolección de la materia prima, mejorando así su calidad de vida, razón por la cual se identifica con las políticas de la Universidad de San Buenaventura planteado en su PEB “ La Universidad de San Buenaventura concibe

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la proyección social como la relación permanente que la institución establece con la comunidad o medio externo para articularse en ella; influir en los procesos de transformación social y en las realidades de su propio desarrollo, comunidades regionales y nacionales.”7 En la realización de este proyecto se hizo necesaria la utilización de conocimientos, información, adquiridos durante la formación universitaria las áreas de operaciones unitarias, biotecnología, tecnología ambiental, ética, evaluación de proyectos entre otras. Y con ellas se desarrollaran todas las actitudes y destrezas necesarias para la gestión del proyecto, ayudando por medio de estas a la conservación del medio ambiente en busca del mejoramiento de su entorno. Además en esta investigación se ponen al servicio de la sociedad los conocimientos adquiridos para mejorar la calidad de vida del hombre sin causar daño a la naturaleza. Dentro de la trascendencia de esta investigación, se hace necesaria relacionarlas con la orientación y aplicación de los programas académicos vistos en la Facultad de Ingeniería, Arquitectura, Arte y Diseño de La Universidad de San Buenaventura. 1.4 OBJETIVOS 1.4.1 Objetivo general Evaluar la obtención bioetanol a partir del almidón de ñame (Dioscorea Rotundata, Dioscorea Alata y Dioscorea Trífida) mediante la hidrolisis enzimática y posterior fermentación. 1.4.2 Objetivos específicos

Realizar la hidrólisis enzimática de las tres variedades de harina de ñame a las concentraciones 10.5, 13.5y 15% m/v utilizando la enzima α amilasa y la amiloglucocidasa.

Realizar la fermentación del hidrolizado obtenido, mediante la utilización de la levadura Saccharomyces cerevisiae.

Determinar los parámetros (azucares reductores, crecimiento microbiano y etanol producido) de las 3 variedades a las concentraciones 10.5, 13,5 y 15% m/v.

7Proyecto Educativo Bonaventuriano. 2010. P49

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2. MARCO DE REFERENCIA

2.1 ANTECEDENTES INVESTIGATIVOS La producción de alcohol existe desde que el hombre conoce el fenómeno de la fermentación. Una de las primeras menciones, se han hallado en papiros egipcios que datan de 3.500 A.C, sin embargo, la preparación de vinos y cervezas se sugiere desde la prehistoria. La figura 1 ilustra la evolución del uso de bioetanol a nivel mundial en el siglo 20. Figura 1. Línea de tiempo de utilización de Bioetanol a nivel mundial.

Fuente:http://www.epn.edu.ec/bio2008/Documentos/BIOETANOLPPT.pdf fecha: 28/10/2011

2.1.1 Historia – etanol El Programa PROALCOHOL, iniciado en 1975 por el gobierno brasileño a raíz de la crisis del petróleo, tenía por finalidad reducir la dependencia del país respecto a las importaciones del combustible fósil. Este programa se basó en los siguientes conceptos:

Un volumen de compras y precio garantizados de etanol por parte de Petrobras.

El establecimiento de incentivos a la inversión en nuevos centros de producción.

Una subvención a la compra de vehículos impulsados por etanol puro.

A mediados de los 80’s, el descubrimiento de yacimientos de Petrobras, debilitaron el argumento de la independencia del petróleo y la caída de los precios

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de este, hizo que el apoyo a la producción de etanol decayera por el diferencial elevado de precios. Por otro lado, la evolución del mercado del azúcar, hizo para los productores de caña más atractivo la producción de éste que del etanol. Durante la década del 90, el programa fue revisado a fondo y a partir de 1999 se produjo la apertura del mercado de etanol y el fin de los precios garantizados y con las siguientes modificaciones:

Orientación hacia el sistema de mezcla.

Desgravación fiscal prácticamente total para la venta de etanol.

La obligación de añadir a la gasolina una proporción mínima de etanol del 22-24%, determinada por el gobierno8.

2.1.2 Estado actual Latinoamérica El sector mundial de la producción de etanol se encuentra en plena expansión, ejemplo claro de esto se ve en su parque automovilístico que suma hoy casi tres millones de vehículos “dedicados” (solo etanol) y cerca de 16 millones de vehículos que consumen mezcla etanol – gasolina. En los últimos años, la industria automovilística brasileña desarrolló vehículos que operan con flexibilidad en el tipo de combustible, popularmente conocidos como "Flex", ya que el motor funciona con cualquier proporción de gasolina (mezcla E20-E25) y etanol anhidro (E100), disponibles en el mercado a partir de 2003. En agosto de 2008 la flota de carros "Flex" ya había alcanzado 6 millones de vehículos, incluyendo automóviles y vehículos comerciales livianos, representando un 23% de la flota de vehículos livianos de Brasil. En Colombia desde el 2005 se usa E10 en el 70% del territorio y a finales de 2009 estará el 100% del país usando esta mezcla. La legislación sobre producción y uso de biocombustibles también se está aplicando en países como: Argentina, Bolivia, Costa Rica, Guatemala, Honduras, Nicaragua, Paraguay, Perú9. En Colombia las investigaciones para utilizar el etanol como combustible comenzaron en 2001, año en que el gobierno aprobó la ley 693 que obligaba al enriquecimiento en oxígeno de la gasolina. Esto se hizo inicialmente para reducir las emisiones de monóxido de carbono de los coches. Regulaciones más recientes eximieron al etanol elaborado a partir de biomasa de algunos impuestos que gravan la gasolina, haciendo así más barato el etanol que la gasolina10. Al principio todo el interés en la producción del etanol vino de la industria de azúcar existente,

8LEÓN, José Guillermo. Los Biocombustibles. Conferencia ARPEL 2009. Punta del Este. Uruguay

p.6 9Ibíd. p.7

10Ley 788 de 2002 articulo 88 “Exención de impuestos para el alcohol carburante” disponible

en:http://www.alcaldiabogota.gov.co/sisjur/normas/Norma1.jsp?i=7260

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ya que es relativamente fácil añadir un módulo para desarrollar etanol al final de una fábrica de azúcar, y las necesidades energéticas son similares a las que se necesitarían para producir el azúcar. El gobierno alienta a convertir gradualmente las fuentes de combustible de los coches a una mezcla del 10 por ciento de etanol y de 90 por ciento de gasolina. Las plantas del etanol están siendo incentivadas por tratos fiscales. Ha habido interés en plantas de etanol de yuca (mandioca) y de nuevas plantaciones de la caña de azúcar, pero aún no se ha conseguido producir carbohidratos a bajo precio. Las investigaciones sobre el bioprocesamiento de ñame y de tubérculos afines son escasas debido a que por lo general su estudio va más dirigido como alimento.En la industria del alcohol el ñame es muy poco empleado, pero este es de los tubérculos con mayor presencia de almidón, lo que lo convierte en materia disponible para el procesamiento de etanol, algunos de los que se han utilizado con estos fines son la yuca y la papa, por lo tanto se realizó una recopilación de estudios e investigaciones afines con esta proyecto y que presentamos a continuación: CASTAÑO y colaboradores, (2011) Evaluaron la producción de etanol a partir de harina de yuca en un sistema de hidrolisis enzimática y fermentación. Se obtuvo una concentración de etanol de 14,6% v/v con una productividad de 2.5 g/h (48 horas de proceso) y con una concentración de harina de ñame de 28% m/v empleando la enzima STARGENTM0.01 (mezcla de alfa amilasa y glucoamilasa) en la hidrolisis y la Saccharomyces cerevisiae en la fermentación. ASTURIZAGA y BOCANEGRA, (2008) Evaluaron los rendimientos en el proceso de obtención de alcohol a partir de harina de Ñame (Dioscorea Bulbífera, Trífida) por vía enzimática. Los resultados en la producción de alcohol demostraron que la variedad D. Trífida en las concentraciones 10% y 13% m/v presentó mayores rendimientos en cuanto a volúmenes de alcohol, con valores de 786,87 y 792,96 L/Tm de harina respectivamente. De forma similar se demostró que la variedad D. Bulbífera en las concentración 16% m/v arrojo los menores rendimientos con un valor de 520,66 L/Tm de harina. Empleando las enzimas comerciales Pectinex UltraSP-L, Termamyl 120 L y la AMG 300 L de la Novo Nordisk en la hidrólisis y Saccharomyces cerevisiae en la fermentación. Assis. T, (2007), en el estudio para la cuantificación de alcohol a partir de harina de batata obtuvo una concentración de etanol del 9.4% v/v y un rendimiento de 129 L de etanol/Tm de harina de batata, durante un tiempo de fermentación de 56 horas, empleando como microorganismo Saccharomyces cerevisiae. González y Molina en el 2006, estudiaron la hidrólisis enzimática y la fermentación de la papa (Solanum tuberosum), a fin de determinar las mejores condiciones para producir alcohol, quienes en el seguimiento del proceso de fermentación alcanzaron una concentración máxima de alcohol de 10,33% v/v. El rendimiento

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de etanol del proceso fue de 94,5 L de etanol/Tm de papa, utilizando una concentración de 20% m/v de sustrato. BRINGHENTI. L y CABELLO. C, también en el 2006, en el estudio de la fermentación alcohólica de sustrato amiláceo hidrolizado enriquecido con melaza de caña, obtuvieron concentraciones de etanol del 1.6% v/v; 2% v/v; 2.4% v/v; 3.6% v/v y4% v/v a partir de un hidrolizado de almidón residual de harina de yuca del 10%m/v, enriquecido con concentraciones de melaza de caña del 5, 10, 15 y 20% v/v respectivamente, en un volumen de reacción de 500 ml, usando como microorganismo Saccharomyces cerevisiae. BRINGHENTI. L y CABELLO. C en el 2005, obtuvieron una concentración de etanol del9.76% v/v a partir de residuos del proceso de obtención de harina y almidón de yuca usando una concentración del 18% m/v y enriquecido con un 12% de melaza residual del proceso de producción de sacarosa de caña de azúcar. MAGALY L. CEREDA M., en Brasil 2004.Desarrollaron un estudio sobre la utilización del residuo sólido obtenido en la extracción de almidón de yuca que es usado fundamentalmente en la alimentación animal, el objetivo de este trabajo fue desarrollar la evaluación técnica económica de la producción de alcohol a partir del subproducto de la obtención del almidón de yuca. Para esto se usó como enzima complementaria la pectinasa para la hidrólisis del mosto, la caracterización del subproducto presentándolos siguientes resultados en base seca: 80% de almidón, 11.5% de fibra, 1.14% de cenizas, 0.85% de proteínas y 0.45% de azucares. El proceso de hidrólisis tuvo una conversión de 86.31% del almidón inicial y un 80% de rendimiento de azucares totales. Un análisis mostró que cerca del 75% de la materia seca inicial fue hidrolizado y el residuo presento 37% de almidón, 30% de azucares totales, 30% de fibra en base seca, el mosto obtenido presentó una concentración de 13 ºBrix siendo necesario concentrarlo, la fermentación alcohólica se realizó en 48 horas, el análisis económico demostró un proceso viable, necesitando un ajuste para su realización comercial. GRISALES. P. A, et, al., (2001). En el diseño de un proceso de producción de etanol anhidro a partir de jugo de caña, obtuvieron una concentración de 6 - 8% v/v de etanol. El jugo de caña contenía una composición de 14% de sólidos solubles (14 ºBrix) y en la fermentación el microorganismo utilizado fue Saccharomyces cerevisiae. En el trabajo “Estudio preliminar para la obtención de jarabe de glucosa a partir de la hidrólisis enzimática del almidón de yuca utilizando extractos crudos de alfa amilasa (B. Licheniformis) y glucoamilasa (A. Níger)”, aplicaron extractos crudos enzimáticos a una solución de almidón de yuca 20% (m/v). Se ensayaron tres relaciones enzimas /sustrato 10, 20 y 30 ml/Kg. de almidón para el extracto de alfa amilasa y 15, 20, 45 ml/ Kg. de almidón para el extracto de glucoamilasa. Los

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mejores resultados de la hidrólisis del almidón de yuca se lograron con las relaciones de 30 ml/ Kg. de almidón en la, licuefacción y 45 ml/Kg de almidón en la licuefacción, con lo que se obtuvo un jarabe de glucosa de 83.34% de equivalente de dextrosa (Lujan D. Alvarino N. Salcedo J., Revista Temas Agrarios, SIN 012-7610, 2001)11. 2.2 BASES TEÓRICAS

2.2.1 Ñame

Nombre Científico: Dioscorea spp

En la figura 2 se puede observar la forma de las hojas y del tubérculo de una de las especies de este género.

Figura 2. Imagen sobre hojas de Dioscorea (izquierda) y Tubérculo (derecha)

Fuente: www.infojardin.com y www.elapuron.com/blogs/cocina/9/el-ame/ fecha: 13/06/2011

Identificación del Producto

El ñame es una de varias especies de plantas del género Dioscorea (de la familia Dioscoreácea), nativo a regiones cálidas de ambos hemisferios. Este tubérculo tropical cuya parte expuesta es en forma de enredadera, es muy popular en centro y sur América, al igual que en el Caribe, África y partes de Asia. Diversas variedades de ñame se cultivan a través de los trópicos y en parte de las regiones sub-tropicales y templadas. En África occidental y en Nueva Guinea el de ñame es uno de los principales cultivos primarios.

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ASTURIZAGA AVILEZ, Yajaira y BOCANEGRA AMAYA, Carmen. Evaluación de los rendimientos en el proceso de obtención de alcohol a partir de harina de Ñame (Dioscorea Bulbífera, Trífida) por vía enzimática. Sincelejo. Universidad de Sucre. Facultad de Educación Y Ciencias. Programa de Biología, 2008. 108 p.

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Aunque el Camote "SweetPotato" y el ñame son similares en muchas formas, (y por ello en países como los EE.UU. y Canadá se presta a confusión), estas son plantas de diferentes especies.

Existen más de 150 especies de ñames en el mundo, dependiendo de la variedad del ñame, la parte carnosa puede ser de diferentes tonalidades de blanco, amarillo, púrpura o rosado, y la piel desde blancuzca a chocolate oscuro. La textura de este tubérculo puede variar de suave y húmedo a áspero, seco y harinoso. En nuestro medio el ñame se presenta por regla general en trozos y se vende por masa.

Ecología

El ñame requiere para su cultivo temperaturas entre 18º C y 34º C y condiciones de precipitación de entre 1,200 mm y 1,300 mm Y suelo franco arenoso (más arenoso que arcilloso), con altura máxima de 800 más. Sobre el nivel del mar.

Características

El ñame es un planta (tubérculo) cuya raíz comestible es muy apetecida por su valor alimenticio y rico sabor. La parte superficial de la planta es una enredadera trepadora con tallos (bejucos) que pueden alcanzar hasta más de 3 m, estas especies tienen hojas de forma acorazonada y se propagan por rajas (trozos), cada una con dos o tres yemas.

Variedad

Dioscorea spp., Dioscorea Alata (ñame de agua), Dioscorea Rotundata (ñame blanco), Dioscorea Cayenensis (ñame amarillo), Dioscorea Japónica, Diamante 22, Baboso de Ocú, Culebra, Mano de Tigre.

2.2.2 Dioscorea Alata (Ñame Diamante)

Tipos silvestres de esta especie se encuentran aún en las selvas húmedas de malasia. En el viejo continente su área de distribución solo incluye zonas de alta humedad. A América fue introducido por los esclavos africanos y navegantes portugueses en el siglo XVII. En la actualidad el ñame es el más difundido especialmente en las Antillas, Brasil y Venezuela.

Esta especie se caracteriza por sus tallos cuadrangulares, con las alas membranosas de borde irregular, con frecuencia manchadas de morado. La lámina es acorazonada, con 3 a 5 nervios principales que salen de la inserción del peciolo.

Como es una planta de cultivo muy antiguo se conocen numerosos clones, estos se caracterizan principalmente por la forma de los rizomas (esféricos, planos, cilíndricos,

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encorvados y alargados) son de forma irregular generalmente. El color de la pulpa varía de blanco a amarillento12. La figura 3 ilustra el tipo de hojas y la forma del tubérculo de la especie Dioscorea Alata

Figura 3. Hojas D. Alata (izquierda) y tubérculo (derecha)

Fuente:http://www.stuartxchange.org/Ubi.html y http://www.flickr.com.Fecha: 13/06/2011

2.2.3 Dioscorea Trífida (Ñame Baboso).

D. trífida es una planta de tallos volubles, delgados que enrollan hacia la izquierda, provistos de dos a ocho alas membranosas, generalmente en mayor número y desarrollo en la parte inferior del tallo. Las hojas miden hasta 25 cm de largo, son digitadas, con tres a siete segmentos o lóbulos, con el central más grande.

Las plantas son unisexuales. Las inflorescencias estaminadas son racimos simples o muy ramificados, con flores verduzcas de 4 a 6 mm de diámetro; mientras que las inflorescencias pistiladas consisten de dos racimos simples qué nacen de la misma axila con flores de 12 a 24 mm de largo. Esta especie florece más regularmente que las otras especies del genero Dioscorea spp cultivadas. El fruto es una cápsula, con tres lóculos, cada uno con dos semillas diminutas, aladas. El tallo subterráneo es un órgano irregular y corto del que emergen los tallos aéreos, raíces y estolones, estos últimos en círculos sucesivos. El estolón que mide hasta 70 cm de largo, se ensancha formando el tubérculo.

Los tubérculos varían mucho en forma y tamaño, aun en la misma planta; se observa forma esférica, fusiforme, claviforme y a menudo con ramificaciones muy cortas. La superficie es rugosa, a veces con raicillas. La pulpa es uniforme, compacta y varía de

12LEÓN, Jorge. Fundamentos Botánicos de los Cultivos Tropicales. Costa Rica. 1968. 92p.

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color blanco, amarillo hasta morado, con un sabor y apariencia muy agradable después de cocinado. El peso de los tubérculos está entre 300 y 400g cada uno13.

La figura 4 muestra ejemplares que corresponden a las características descritas anteriormente.

Figura 4. Hoja de Dioscorea Trífida (izquierda) y tubérculo (derecha)

Fuente:http://www.tramil.net/fototeca/imageDisplay.php?id_elem=160&famil=DIOSCOREACEAE fecha: 06/05/2012

2.2.4 Dioscorea Rotundata (Ñame Espino)

El ñame espino (Dioscorea rotundata) es un cultivo de pequeños y medianos agricultores, que constituye en muchas regiones la principal fuente de ingresos, de empleo rural y de oferta de alimento a sus pobladores y también es un producto de exportación. En Colombia, el ñame se usa para alimentación de la población de la Costa Atlántica; es cultivado por pequeños y medianos agricultores y constituye la principal fuente de ingresos y de empleo rural en muchas zonas. Además su exportación a los mercados de Estados Unidos y Europa le genera al país más de US$2.5 millones anuales14.

La planta de ñame tiene un sistema de raíces fibroso. Los tubérculos durante el período de almacenamiento, presentan puntos elevados semejantes a pústulas que van a dar origen a raíces. El tubérculo es una estructura del tallo y no de la raíz cuya función es el almacenamiento de gránulos de almidón. Los gránulos de almidón son

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ASTURIZAGA AVILEZ, Yajaira y BOCANEGRA AMAYA, Carmen. Evaluación de los

rendimientos en el proceso de obtención de alcohol a partir de harina de Ñame (Dioscorea Bulbífera, Trífida) por vía enzimática. Sincelejo. Universidad de Sucre. Facultad de Educación Y Ciencias. Programa de Biología, 2008. 108 p. 14

SÁNCHEZ, C., HERNÁNDEZ, L., “Descripción de aspectos productivos, de postcosecha y de comercialización del ñame en Córdoba, Sucre y Bolívar”, Corpoica, 2003.

14

redondeados o elípticos y algunas especies de ñame (D. rotundata) los concentran más que otras especies (D. Alata). Además de almidones los tubérculos de ñame, dependiendo de la especie, tienen concentraciones de sustancias urticantes, de taninos, fenoles y otras sustancias como esteroides o corticoides15. En la figura 5 se observa la forma de las hojas y el tubérculo de la especie Dioscorea Rotundata.

Figura 5. Hojas de D. Rotundata (izquierda) y tubérculo (derecha)

Fuente:http://insumosdeamecoloso.blogspot.com/y species.wikimedia.org.fecha: 13/06/2011

2.2.5 Producción de Ñame a nivel Mundial La mayoría de los ñames cultivados pertenecen a la familia Dioscoreácea, y al género Dioscorea. Es el principal alimento cultivado en África occidental, el Caribe, islas del Pacifico sur, sur este de Asia, India y partes de Brasil)16. Esta planta se presenta como una enredadera y se caracteriza por la presencia de tubérculos subterráneos y aéreos, los cuales junto con la papa, la yuca, la arracacha y la batata ocupan un lugar importante en la alimentación humana. Está estimado que existen más de 600 especies en el mundo. Las especies más cultivadas son: D. Alata, D. Rotundata, D.Cayenensis, D.Esculenta, D.Bulbífera y D. trífida, de los cuales la primera es la preferida en la producción de tubérculos para el consumo humano. La mayor producción de ñame y los mejores rendimientos de los cultivos se dan en el continente africano, en donde en una escala de mayor a menor productor los primeros 9 países constituye a este continente, siendo Nigeria el mayor productor con 26587000 toneladas; Colombia ocupa el séptimo lugar con una producción de 333532 y en el último lugar se encuentra se encuentra la República Democrática del Congo, con una producción de 84900. Todas las estadísticas están reflejadas en la tabla 1.

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GAMERO, Galo. “Consideraciones sobre fisiología de la planta de ñame”, Corpoica, 2004 16

ADELUSI A, LAWANSON AO. (1987). Disease induced changes in carotenoid content of edible yam (Dioscorea spp) infected by Botryo diploid theobromaeandAspergillusNiger. Mycopathologia 98:49-58.

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Tabla 1. Producción de Ñame A nivel Mundial año 2005

Fuente: www.fao.org - dirección estadística, “principales productores de alimentos y productos agrícolas. Fecha: 06/05/2012

2.2.6 Producción de ñame en Colombia De acuerdo con las cifras del Ministerio de Agricultura y el Instituto Colombiano Agropecuario (2009), en el país se cultivan 25,000 hectáreas en ñame y se producen 200,000 Tm, con un rendimiento medio de 12 a 15 Tm/ha entre las variedades espino y diamante17. La producción se realiza principalmente en las regiones de las costas Atlántica y Pacífica, siendo los principales productores los

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Articulo exportadores de ñame de la mano del ICA (2009) disponible en: www.ica.gov.co

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departamentos de Córdoba, Bolívar y Sucre, como se ilustra en la figura 6. Figura 6. Producción de ñame en los departamentos de Colombia año 2010

Fuente: Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural. Anuario estadístico (2010) fecha de actualización 27/03/2012

En Colombia el ñame es cultivado por pequeños y medianos agricultores, con bajo nivel tecnológico, generalmente asociado con cultivos de yuca y maíz, y constituye la principal fuente de ingresos y de empleo rural en muchas zonas de la Costa Atlántica. La comercialización de ñame es regional para consumo en fresco, aunque una parte se exporta a Estados Unidos, España y Alemania para alimento de la población latina y uso farmacológico. Además su exportación a los mercados de Estados Unidos y Europa le genera al país más de US$2.5 millones anuales. En el anexo A se observa la superficie cosechada, producción y rendimiento obtenido por los departamentos de Colombia entre los años 1997 – 2008.

2.2.7 ALMIDÓN Historia del almidón Exactamente no se sabe desde que época es conocido como el almidón. Los griegos los llamaron Anylon quizás debido a que el contrario de lo que sucede con la harina, se obtenía no por el molino, sino por el lavado18.Según rastros arqueológicos hallados en las tumbas de los reyes egipcios, presentan muestras

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ULLMAN, F, enciclopedia de química industrial. tomo VI. Barcelona: Gustavo Gill, 1954 p.

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de pegantes a base de almidón, los cuales datan aproximadamente de año 3500 A.C. En la industria de almidón se conoce muy poco acerca de su aparición. Se admite probablemente que los holandeses en el siglo XVI habían fabricado almidón a gran escala, pero usando como materia prima el trigo; el desarrollo debió efectuarse muy lentamente al igual que en otros países. Después de la celulosa, el almidón es la sustancia orgánica más ampliamente distribuida en la naturaleza; la celulosa forma parte del armazón de las plantas, mientras que el almidón representa su reserva de carbohidratos, transformándolos por hidrolisis en glucosa la cual es transformada por medio de la savia, aprovechando su solubilidad. En las plantas existen tres clases de almidón: Almidón de asimilación, transitorio y de reserva. El almidón de asimilación es aquel que ha de hervir en la nutrición de la planta y el cual se encuentra en forma de almidón soluble. El almidón en el interior de la planta, es transformado en azucares por medio de enzimas diastáticas; pasando primero por la fase de almidón soluble, el cual puede transformarse algunas veces en gránulos muy finos, formando así el almidón transitorio. El resto de almidón es transportado a los sitios de almacenamiento donde tiene como función servir de alimento para los brotes jóvenes; es llamado almidón de reserva. El almidón se halla en forma de gránulos con la forma y tamaño característicos de la planta de la cual se obtiene, por lo que un análisis microscópico es muy útil para confirmar el origen del almidón; además ayuda a determinar la presencia de materiales extraños, afrecho, insectos o residuos de estos. Cuando los gránulos están intactos, son insolubles en agua fría; si su membrana externa se rompe al ser molidos, estos gránulos se hinchan en agua fría y si se calienta por encima de 55 ºC, forma un gel19.

El almidón es un polisacárido de reserva alimenticia predominante en las plantas, y proporciona el 70-80% de las calorías consumidas por los humanos de todo el mundo. Tanto el almidón como los productos de la hidrólisis del almidón constituyen la mayor parte de los carbohidratos digestibles de la dieta habitual. Del mismo modo, la cantidad de almidón utilizado en la preparación de productos alimenticios, sin contar el que se encuentra presente en las harinas usadas para hacer pan y otros productos de panadería. En la figura 7 se ilustra la estructura química del almidón.

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FERMEMA, O. Química de los Alimentos, 2da

ed. Editorial ACRIBIA, Zaragoza, España 2000. P. 228-240

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Figura 7. Estructura del almidón.

Fuente: http://www.biologia.edu.ar/botanica/tema8/8-4plastidios.htm. Fecha: 24/04/2011

Los almidones comerciales se obtienen de las semillas de cereales, particularmente de maíz (Zea mays), trigo (Triticum spp.), varios tipos de arroz (Oryza sativa), y de algunas raíces y tubérculos, particularmente de patata (Solanum tuberosum), batata (Ipomoea batatas) y mandioca (Manihot esculenta).

Tanto los almidones como los almidones modificados tienen un número enorme de posibles aplicaciones en los alimentos, que incluyen las siguientes: adhesivo, ligante, enturbiante, formador de películas, estabilizante de espumas, agente anti-envejecimiento de pan, gelificante, glaseante, humectante, estabilizante, texturizante y espesante.

Propiedades del almidón El almidón es un polvo blanco, amorfo, plástico, cuya densidad es 1,6 mg/ml, que a veces se caracteriza por un brillo peculiar. Es insoluble en agua, alcohol y éter. Al microscopio presenta características definidas, pudiéndose identificar fácilmente. Químicamente, es un hidrato del carbono (oxigeno, nitrógeno y carbono). Su procedencia se distingue por el tamaño y la forma de los granos. En virtud de su forma podemos dividir los almidones en 5 clases:

Almidones de gránulos en forma de óvalos grandes formando anillos concéntricos y con el núcleo (hilum) colocado excéntricamente. Ejemplo: la papa.

Almidones de gránulos ovoides usualmente formando anillos concéntricos, con núcleo irregular. Ejemplo: las leguminosas.

Almidones de gránulos ovoides con núcleo central. Ejemplo: el trigo.

Almidones de gránulos truncos en uno de los extremos. Grupo del sagú. Ejemplo: la yuca.

Almidones cuyos gránulos forman ángulos pequeños y poligonales. Ejemplo: el arroz.

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La tabla 2 muestra la concentración en masa seca de almidón presente en varios alimentos.

Tabla 2. Almidón presente en diferentes alimentos

Fuente: FAO (1999). Los carbohidratos en la nutrición humana, estudio de alimentación y nutrición año 1997.

Estructura y composición Todos los almidones tienen fórmula empírica (C6H10O5)n. el factor n tiene por lo menos un valor igual a 4; llegándose a encontrar fórmulas con 100 a más átomos de carbono. La diferencia entre la celulosa y el almidón radica en que en el almidón, los restos de glucosa están unidos entre sí por uniones glucosidicas 1-4, con orientación α, mientras que la celulosa tiene uniones 1-4 glucosidicas con orientación β. Además de esto se sabe que el almidón contiene alrededor del 20 % de una fracción soluble en agua llamado Amilosa y el 80% de una solución insoluble conocida como amilo pectina. En el granulo de almidón podemos distinguir tres partes: La primera es una envoltura de amilopectina y α-amilosa o un almidón a menos soluble y que contiene un Ester fosfórico, el cual es un Ester amilofosfórico. Es difícilmente atacada por enzimas, necesitándose para ello un calentamiento. Con dicho calentamiento forma una pasta y con una solución alcohólica de yodo-yoduro da una coloración violeta

La segunda parte es una sustancia inerte formada por β-amilosa, granulosa o β-almidón. Esta parte es más soluble que la anterior y no forma una pasta, ni da color con el yodo-yoduro. La tercera parte es hallada solo en los cereales, pero no como constituyente del granulo, la hemicelulosa. Químicamente es una mezcla de dos polisacáridos muy

Alimento % en masa de Almidon

Cereal 65-75

Edulcorantes 10-12

Raices y Tuberculos 70-75

Frutas 5-8

Hortalizas 8-15

Legumbres 50-60

Cantidad de almidon presente en algunos alimentos

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similares, la amilosa y la amilopectina; contienen regiones cristalinas y no cristalinas en capas alternadas.

Puesto que la cristalinidad es producida por el ordenamiento de las cadenas de amilopectina, los gránulos de almidón céreo tienen parecido grado de cristalinidad que los almidones normales. La disposición radial y ordenada de las moléculas de almidón en un gránulo resulta evidente al observar la cruz de polarización (cruz blanca sobre un fondo negro) en un microscopio de polarización cuando se colocan los polarizadores a 90° entre sí. El centro de la cruz corresponde con el hilum, el centro de crecimiento de gránulo20

Amilosa La α- amilosa está constituida por cadenas largas no ramificadas en las que todas las unidades de D- glucosa se encuentran unidas mediante enlaces glucosidicos α (1,4); por lo tanto la unidad que se repite es la maltosa. El peso molecular de la amilosa depende de su origen botánico, su aislamiento y el método utilizado. Entre los valores aceptados para la amilosa están entre 1,1 y 1,9 millones de daltons. Amilopectina

Presenta una cadena lineal de tipo α como en la amilosa; además tiene alrededor de 4-5% de las unidades de glucosa unidas por enlaces α (1,6) dando una estructura ramificada creciente. El peso molecular de la amilopectina es muy variable; las mejores valoraciones del peso molecular promedio (pro difracción) es de 10 a más de 20 millones de daltons21.

2.2.8 Hidrólisis Se denomina hidrólisis a las reacciones de la química inorgánica, en donde el agua efectúa una doble descomposición con otro compuesto, (el H+ va en un componente y el OH- va en el otro). Este término también puede aplicarse a reacciones en donde un ácido se añade al agua, en mayor o menor cantidad para acelerar la reacción; esta hidrólisis puede llevarse a cabo con ácidos inorgánicos, ácidos orgánicos o por acción enzimática, la cual es la más utilizada industrialmente22.

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Disponible en: http://www.eis.uva.es/~macromol/curso08-09/pls/quees.htm 21

MORRISON, Robert. Y BOYD, Robert.Química Orgánica. 5taEd. Addison–Wesley

Iberoamericana. USA. 1996. 22

FERMEMA, O. Química de los Alimentos, 2da

ed. Editorial ACRIBIA, Zaragoza, España 2000. P. 228-240

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Reacción de hidrólisis enzimática:

Con la finalidad de transformar las moléculas del almidón en azucares fermentables los cuales son asimilados por las levaduras o bacterias. El almidón es sometido a un proceso de hidrolisis mediante la cual ocurre un desdoblamiento ya sea por un exceso de agua o por la presencia de una pequeña cantidad de fermento o acido. 2.2.9 Hidrólisis Química. El almidón tratado con ácidos se rompe en cadenas cortas de dextrina. El grado de degradación depende de la concentración del ácido, la temperatura, y el tiempo de hidrolisis. A medida que actúa el ácido, el peso molecular y la viscosidad de los productos decrecen y el poder reductor aumenta. Los ácidos utilizados para la producción de dextrinas son el Ácido clorhídrico y el Ácido Nítrico. Si hervimos el almidón con ácido Clorhídrico 1N durante 1 hora, el almidón se rompe totalmente y se reduce a glucosa esta reacción es conocida como hidrolisis intensa. Los productos de degradación son principalmente el hidroximetulfurtutal, el ácido levulinico, y el ácido fórmico, que da al jarabe un sabor amargo. La recombinación de unidades de D-glucosa o de esta con fragmentos como maltosas, conducen a la formación de productos de reversión los cuales pueden ser hidrolizados, un ejemplo de estos productos en la Genciobiosa. Mediante este procedimiento se logra el desdoblamiento de las moléculas de almidón por la acción de ácido sulfúrico o ácido clorhídrico diluidos. La clase de ácido, su concentración, la cantidad empleada referida a la cantidad de almidón, así como la presión y la temperatura ejercen gran influencia en la duración de la sacarificación. Por lo general, la cantidad de ácido empleado es tal que el valor de pH se ajuste a 1.5 paz una solución al 33% de almidón. El agua utilizada, de ser lo más pura posible y libre de hierro, ya que el ácido fosfórico que existe en el almidón forma después de neutralizarse fosfatos de hierro insolubles, finamente dividido, quedando en suspensión en el jarabe y es muy difícil su separación por filtración23.

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FERMEMA, O. Química de los Alimentos, 2da

ed. Editorial ACRIBIA, Zaragoza, España 2000. P. 228-240

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2.2.10 Hidrólisis enzimática (sacarificación de materiales amiláceos) La sacarificación es el proceso que tiene por objeto la transformación del almidón de las materias primas amiláceas en azucares. Dicha transformación es catalizada por enzimas. Estas enzimas se encuentran en la saliva, los jugos pancreáticos, las células de la sangre, las semillas y granos de muchas plantas, en hongos y bacterias. La función de estas enzimas se encuentra en la saliva, los jugos pancreáticos, las células de la sangre, las semillas y granos de muchas plantas, en hongos y bacterias. La función de estas enzimas es de romper las moléculas de almidón, dando productos semejantes a los obtenidos por hidrólisis acida. Las dos clases de amilasas más conocidas actualmente son: Alfa-amilasas: las cuales desdoblan el almidón en glucosa y maltosa, se caracteriza por la facilidad de fragmentación de los almidones en dextrinas reductoras, que no dan color con el yodo. Beta-amilasas: convierten el almidón en glucosa. Las amilasas actúan muy lentamente sobre el almidón, por lo que debe ser sometido a un proceso de cocción para obtener una buena dispersión y rompimiento de los granos de almidón llevándose a cabo una hidrolisis rápida. La acción de las amilasas sobre el almidón depende del origen del mismo; ya que el almidón consta de una mezcla de 75-80% de amilopectina y el recto de amilosa. Esta última se compone de cadenas longitudinales que contienen unidades de glucosa unidas por enlaces α-1,4 glucosídicos. Una cadena lineal puede contener de 70 a 100 unidades de glucosa aproximadamente24 Enzimas. Las enzimas son piezas esenciales en el funcionamiento de todos los organismos vivos, actuando como catalizadores de las reacciones de síntesis y degradación que tienen lugar en ellos25.La utilización de estas en la hidrolisis del almidón presenta una serie de ventajas, además de las de índole económica o tecnológica, su gran especificidad de acción hace que no se produzcan reacciones laterales imprevistas26. Asimismo se puede trabajar en condiciones moderadas, especialmente de temperatura, lo que evita alteraciones de los componentes. La producción de jarabes de glucosa a partir de almidón se realiza en dos pasos, primero la

24

DE RAFOLS, W. Aprovechamiento Industrial de los productos agrícolas. Barcelona. 1964 25

MONTES, M y MAGANA, I. Enzimas con Aplicación Industrial. Disponible en: http://www.cinvestav.mx/publicaciones/avaype/sepoct02/HORCASITAS.PDF.2004. 26

TUCKER, G y WOODS, L. Eds.Enzymes in Food Processing. Blackie and Son Ltd. London.1991.

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licuefacción del almidón y segundo la sacarificación (conversión de la molécula de almidón en moléculas de glucosa). La licuefacción se realiza utilizando como catalizador las enzimas α-amilasas ó β-amilasas, y la sacarificación se realiza utilizando como catalizador la glucoamilasa o la pollulanasa y también se puede utilizar mezclas de enzimas27. Enzimas degradadoras de almidón (amilasas). Se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza, son las enzimas responsables de la degradación del almidón, hidrolizan los enlaces glucosídicos α 1-4. Las amilasas se pueden dividir en tres grupos: α amilasas, las cuales rompen al azar enlaces α 1-4 glucosídicos presentes en la parte interior del sustrato o de la cadena de amilasa y amilopectina (endo amilasas); β amilasas o examilasas, que rompen enlaces α 1-4 y enlaces α1-6 glucosídicos ordenadamente a partir de los extremos no reductores del sustrato28. Actúan sobre los residuos de glucosa externos de la amilasa y amilopectina produciendo solamente glucosa (glucoamilasa y glucosidasa) o maltosa y dextrinas y glucoamilasa que liberan unidades de glucosa a partir de los extremos no reductores del sustrato. Existen otras enzimas que degradan almidón tales como las desramificantes que hidrolizan enlaces α 1-6 glucosídicos. La isoamilasa hidroliza enlaces α 1-6 en la amilopectina y la pollulanasa tipo I hidroliza enlaces α 1-6 glucosídicos en pululan y amilopectina29. Estas enzimas degradan amilopectina obteniéndose así polisacáridos de longitud lineal. Enzimas α – amilasas. La familia de la α- amilasas puede ser dividida en dos grupos. Las enzimas que hidrolizan el almidón y las que lo modifican o enzimas transglicolisantes30. Las enzimas hidrolizadas prefieren la hidrolisis acida, en los procesos de industria del almidón y de un número de ventajas tales como: especificidad de la reacción, estabilidad de los productos generados, bajo requerimientos de energía y eliminación de la etapa de neutralización. Estas enzimas se caracterizan por actuar sobre los enlaces α glucosídicos e hidrolizan estos enlaces para producir mono u oligosacáridos α-anomericos (hidrolisis), de enlaces α 1-4 o α 1-6 glucosídicos (transglicosilación), o una combinación de ambas actividades; poseen una estructura (β/α) o barril TIM conteniendo residuos

27

FRAZIER, W. y WESTHOFF D. Microbiología de los alimentos. Zaragoza, España. Acribia S.A 1993, p. 431-438 28

ARTIME, R. Aplicaciones de las enzimas. Universidad de Salamanca. 2005 29

SATYANARAYANA, T; RAO, J; EZHILVAN NAN, M. 2005. a- Añilases. In: Enzyme Technology, A. Pandey, C. Webb, CR. Soccol, C. La roche (Eds.), Asiatech Publishers Inc; New Delhi, India pp 189 – 220. 30

CARRERA, J. Módulos de Biotecnología. Enzimas industriales, Universidad del Cauca, 1ª edición.

24

del sitio catalítico y tienen cuatro regiones altamente conservadas en su secuencia primaria que contienen los aminoácidos que forman el sitio catalítico31. La acción de la α- amilasas sobre la fracción de amilasa del almidón, se da en dos etapas. Inicialmente, tiene lugar una rápida degradación de la amilasa para dar maltosa y maltotriosa. En la segunda fase, más lenta ocurre hidrolisis de los oligosacáridos, formando glucosa y maltosa como productos finales. La acción sobre la amilopectina produce glucosa, maltosa y una serie de dextrinas y oligosacáridos de cuatro o más residuos de glucosa todos con enlaces glucosídicos α 1-632. Enzimas β- Amilasas.AMG 300L. Es una Amiloglucosidasa de grado alimenticio, producida a partir de una cepa seleccionada de Aspergillus Níger. La enzima hidroliza los enlaces α 1-4 y α 1-6 del almidón licuado. Durante la hidrolisis, elimina gradualmente las unidades de glucosa de los extremos no reductores desacarificado. La velocidad de hidrolisis depende del tipo de enlace y del rompimiento de la cadena. La AMG es recomendada para la sacarificación del almidón y la producción de glucosa33. 2.2.11 Fermentación. Una fermentación es una reacción de oxidación-reducción interna equilibrada en la que algunos átomos de la fuente de energía (donador de electrones) se reducen mientras otros se oxidan34, y la energía se produce por fosforilación a nivel sustrato. Una ruta bioquímica muy usada para la fermentación de la glucosa es la glucolisis, también denominada vía de Embdem-Meyerhof en atención a sus descubridores. El proceso, simplificado, de la fermentación es:

Ahora bien la glucolisis se puede dividir en tres etapas principales, cada una de las cuales comprende una serie de reacciones individuales catalizadas enzimáticamente.

31

KURIKI, T; IMANAKAT, T. The concept of the a-amylase family: structure Similarity and common catalytic mechanism. J. Biosci, Bioeng. 1999, p.p87, 557 – 565. 32

LOPEZ, J. Semilla vegetativa de yuca. En: Ospina, B y Ceballos, H. La yuca en el tercer milenio. Sistemas modernos de producción, procesamiento, utilización y comercialización, 2002. pp. 49-75. CIAT. Cali, Colombia. 586 pp. 33

CARRERA, Jorge y MERA, Ingrid. Obtención de glucosa a partir de almidón de yuca Manihot sculenta. Facultad de Ciencias Agropecuarias Vol 3 No.1 Marzo 2005. 34

BROCK y MADIGAN. Michael. Biología de los Microorganismos. 2004. Editorial prentice hall. 10 edición. 114 p.

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La etapa 1 incluye una serie de reacciones preparatorias que no implican ni oxidación ni reducción y que no liberan energía, pero que conducen a la producción a partir de glucosa de dos moléculas del intermediario clave gliceraldehido-3-fosfato. En la etapa 2 ocurre un proceso redox, la energía se conserva en forma de ATP, y se forman dos moléculas de piruvato. En la etapa 3 tiene lugar una segunda reacción redox y se originan los productos de fermentación (etanol y CO2 o ácido láctico) Etapas I y II: reacciones preliminares y reacciones redox. En la etapa 1, la glucosa es fosforilada por el ATP dando lugar a glucosa-6-fosfato, que es convertida a continuación a una forma isomérica, la fructosa-6-fosfato, que mediante una segunda fosforilación se convierte en fructosa-1,6-difosfato, que es un metabolito intermediario clave de la glucolisis. Si se fermentan otros azucares distintos a la glucosa, se convierte antes a fructosa-1,6-difosfatopara poder ser utilizados por la ruta de Embdem-Meyerhof. La enzima aldolasa cataliza la rotura de la fructosa-1,6-difosfato en dos moléculas de tres átomos de carbono, el gliceraldehido-3-fosfato y su isómero dihidroxiacetona-fosfato. Existe una enzima que cataliza la interconversión de dihidroxiacetona-fosfato a gliceraldehido-3-fosfato pero, para simplificar, se considera solo este último ya que es el que será metabolizado. En esta primera etapa no ha ocurrido ninguna reacción redox y que todas las reacciones, incluyendo las del consumo de ATP, tienen lugar sin transferencia de electrones. La primera reacción redox de la glucolisis tiene lugar en la etapa 2 durante la conversión del gliceraldehido-3-fosfato a acido 1,3-difosfoglicerico. En esta reacción (que ocurre dos veces, una por cada molécula de gliceraldehido-3-fosfato), una enzima cuyo coenzima es NAD+ acepta 2 átomos de hidrogeno y el NAD+ se convierte en NADH; la enzima que cataliza esta transformación se llama gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa. Simultáneamente, cada molécula de gliceraldehido-3-fosfato es fosforilada por la acción de una molécula de fosfato inorgánico se convierte en orgánico, prepara el escenario para la conservación de la energía por fosforilación a nivel de sustrato; la formación de ATP es posible porque cada uno de los fosfatos de la molécula de ácido 1,3-difoglicerico y cuando más tarde se convierte en acido 1,3-fosfoglicerico y cuando más tarde en la vía, cada molécula fosfoenol piruvato se convierte en piruvato. En la glucolisis, se consumen dos moléculas de ATP en las dos fosforilaciones de la glucosa y se sintetizan cuatro moléculas de ATP (dos por cada molécula de ácido 1,3-difosfoglicerico convertida a piruvato). Por tanto, la ganancia neta del organismo es de dos moléculas de ATP por cada molécula de glucosa.

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Etapa III Producción de productos de fermentación Durante la formación de dos moléculas de ácido 1-3, difosglicerico, se reducen dos moléculas de NAD+ a NADH. Sin embargo, las células contienen solo una pequeña cantidad de NAD+, y si todo se convirtiera en NADH se detendría la oxidación de la glucosa, la oxidación continuada del gliceraldehido-3-fosfato solo se puede proseguir si está presente una molécula de NAD+ para aceptar los electrones liberados. Este bloqueo se supera en la fermentación mediante la nueva oxidación de NADH a NAD+, a través de reacciones que suponen la reducción del piruvato a una extensa variedad de productos de fermentación. Se conocen muchas rutas para la oxidación del piruvato en procariotas fermentativos, pero el resultado final es el mismo; el NADH debe volver a la forma oxidada NAD+, a fin de que las reacciones que liberan energía en la fermentación puedan continuar. Como coenzima difusible, el NADH puede soltarse de la enzima gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa y unirse a una enzima que reduzca el piruvato de nuevo, haciendo que le ciclo de reconversión del NADH a NAD+ y de NAD+ a NADH se repita otra vez. En cualquier proceso que produzca energía, la oxidación debe acompañarse de una reducción y debe haber un aceptor de electrones por cada electrón cedido. En este caso, la reducción del NAD+ en un paso enzimático de la glucolisis se equilibra con su oxidación en otro paso. Los productos finales deben estar también en equilibrio redox con el sustrato inicial, la glucosa. De aquí que los productos que aquí se generan, etanol más CO2 o lactato más protones, estén en equilibrio atómico y electrónico con la glucosa inicial35. En la figura 8 podemos ver una descripción del proceso de glucolisis.

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BROCK y MADIGAN. Michael. Biología de los Microorganismos. 2004. Editorial prentice hall. 10

edición.120-123 p.

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Figura 8. Esquema del proceso de glucolisis.

Fuente: BROCK y MADIGAN. Michael. Biología de los Microorganismos. 2004. Editorial Prentice hall. 10edición.

28

Concepto Microbiológico de la fermentación Se entiende por fermentación aquel proceso en el que los microorganismos producen metabolitos o biomasa, a partir de la utilización de sustancias orgánicas en ausencia o presencia de oxígeno. La descomposición de los sustratos es llevada a cabo por enzimas producidas por microorganismos para tal finalidad. Se debe observar que el concepto llega a excluir a los microorganismos del proceso, siempre y cuando estén presentes sus enzimas; sin embargo, en estos casos, la velocidad de obtención y los rendimientos del producto son menores. Clasificación de los primeros procesos de fermentación La gran cantidad de procesos y productos que involucra el termino fermentación hace difícil no solo la definición del concepto si no también su clasificación. En general, se establecen divisiones con base en:

El tipo de producto final por obtener

La presencia o ausencia de oxígeno en el proceso. Productos Finales de la fermentación Desde el punto de vista comercial se pueden clasificar tomando en cuenta los productos que se obtendrán entre ellos, se pueden mencionar:

Células microbianas (biomasa)

Metabolitos microbianos: metabolitos primarios y secundarias (enzimas, etanol, butanol, acetona, ácidos orgánicos, etc.

Células Microbianas (biomasa). Esto ocurre en el proceso de fermentación cuando hay un sobre crecimiento de células, y solo utilizan el sustrato para su crecimiento y hay poca producción de metabolitos36. Metabolitos primarios microbianos. Son moléculas de bajo peso molecular que se forman en la fase exponencial o tropofase e intervienen como productos finales o intermediarios, en las distintas rutas anabólicas y catabólicas del proceso. Algunos ejemplos de éstos, Que poseen importancia comercial se encuentran en la tabla 3.

36

HERNÁNDEZ, Alicia. Microbiología industrial. 2003. Editorial EUNED. Edición 1 pág. 37-39

29

Tabla 3. Compuestos producidos por el proceso de fermentación

Fuente: Hernández, Alicia. Microbiología industrial. 2003. Editorial EUNED. Edición 1. pág. 39

Metabolitos Secundarios Microbianos. Son moléculas orgánicas complejas que para su formación requieren un gran número de reacciones enzimáticas específicas. Estos se forman durante la ideofase (fase durante la cual un cultivo sintetiza productos distintos a los Metabolitos primarios, sustancias que no tienen un papel significativo en el metabolismo celular) y donde los metabolitos secundarios tienden a ser sintetizados de los productos intermedios y finales del metabolismo primario, en la tabla 4 podemos ver algunos de estos metabolitos.

Tabla 4. Metabolitos microbianos comerciales

Fuente: WALKER, J.M. Gingold. Biotecnología Molecular. Edición, Acribia, SA. Pág. 5-6

Tipo de Sustancia Productos

acético, cítrico fumarico,

gluconico, itaconico, láctico

Aminoácidos lisina, metionina, triptófano, valina

acetona, butanol, 2,3-butanodiol

etanol, glicerol

bacitracina, estreptomicina, neomicina

Penicilina, tetraciclina

Esteroides cortisona, hidrocortisona, testosterona

acido ascórbico, cianocobalamina

caroteno, riboflavina

Células de hongos, levaduras, bacterias

y algas

Alcaloides, Enzimas, insecticidas, Biológicos,

metano, polisacáridos y saborizantes

Algunos compuestos de interés comercial

producidos por fermentación

Ácidos orgánicos

Alcoholes y Solventes

Antibióticos

Vitaminas

Proteína Unicelular (biomasa)

Otros

Metabolito Secundario Utilidad Comercial

Penicilina Antibiotico

Cefalosporina Antibiotico

Tretraciclina Antibiotico

Estreptomicina Antibiotico

Griseofulvina Antibiotico (antifungico)

Actinomicina Antitumoral

Pepstatina Tratamientos antiulcerosos

Ciclosporina A Inmunosupresor

Krestina Tratamiento de cancer

Betatina Tratamiento de cancer

Gibberelina Regulador de crecimiento vegetal

Metabolitos microbianos secundarios comercializados

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A simple vista puede resultar extraño que los microorganismos elaboren compuestos que no parecen tener ninguna función metabólica y que, en realidad no constituyen productos intermediaros del catabolismo, como por ejemplo, el etanol y la acetona. Sin embargo, muchos Metabolitos secundarios poseen propiedades anti-microbianas y por lo tanto, en el medio ambiente natural podrían ser implicados en procesos competitivos37. Oxígeno en el proceso de fermentación También es posible clasificar las fermentaciones con base en la presencia o ausencia de oxigeno molecular durante el proceso. De acuerdo con esta división, los procesos se denominan: Fermentación aerobia. En este tipo de fermentación el aceptor final de electrones es el oxígeno; es imprescindible su presencia para el desarrollo del microorganismo y la producción del compuesto deseado. En este tipo de procesos, se produce fundamentalmente biomasa, dióxido de carbono y agua. Fermentación anaerobia. En este tipo de fermentación el proceso de producción de metabolito de interés se desarrolla en ausencia de oxigeno; los productos finales son sustancias orgánicas, por ejemplo, ácido láctico, ácido propionico, ácido acético, butanol, etanol, y acetona. Sin embargo, en la mayoría de las fermentaciones anaeróbicas se requiere un poco de oxígeno al principio del proceso para favorecer el crecimiento y la reproducción del microorganismo. En los procesos anaerobios, los microorganismos producen mucho menos energía que en los aerobios y, para suplir sus necesidades de energía, metabolizan una mayor cantidad de azucares; por consiguiente, elaboran más metabolitos. Entonces, a través de la cantidad de oxígeno, se puede manipular un proceso de fermentación para incrementar la producción de la sustancia de interés: Cuando se trabaja con un microorganismo facultativo (capaz de crecer en presencia o ausencia de oxigeno), como Saccharomyces cerevisiae, se obtienen diferentes productos mayoritarios, según la concentración de oxígeno en el medio: si es muy limitada, habrá una mayor producción de etanol, mientras que si es alta, se favorece la reproducción del microorganismo, o sea, la producción de biomasa38.

37

WALKERJ.M. E.B. Gingold. Biotecnología Molecular, , Edición, Acribia, S.A. Pág. 5-6 38

Hernández, Alicia. Microbiología industrial. 2003. Editorial EUNED. Edición 1. pág. 39

31

Cultivo en lote Es un sistema cerrado, porque, después de iniciado el proceso (al mezclar los nutrimentos y el microorganismo), solo se adiciona oxígeno, antiespumantes y bases o ácidos para el control de pH. La fermentación se lleva a cabo en un periodo definido de tiempo, durante el cual varia la composición del medio de cultivo, la concentración de biomasa y la de metabolitos. Después, se interrumpe el proceso y se recupera el producto. Para realizar exitosamente una fermentación en lote, es necesario conocer la curva de crecimiento del microorganismo: al saber el comportamiento de su crecimiento , se pueden manipular las condiciones de manera que se obtenga el producto deseado, por ejemplo si lo que se requiere es la producción de metabolitos primarios , se debe alargar la fase logarítmica; si son metabolitos secundarios, se extiende la fase estacionaria y, para aumentarla cantidad de biomasa, se buscan las condiciones de mayor producción de células. Cultivo continuo Se puede describir como un sistema abierto, y a diferencia del cultivo por lotes, se adiciona constantemente medio de cultivo fresco a los microorganismos, a una determinada velocidad, y se extrae caldo de fermentación (medio de cultivo con microorganismos y metabolitos), a las mismas velocidades. Así, se logra mantener en el reactor, una población estable de microorganismos en condiciones uniformes. En muchas fermentaciones, el compuesto de interés se produce durante la fase exponencial; al respecto, una de las ventajas del sistema continuo es que se puede mantener estable la población en esta fase por periodos prolongados de tiempo. Para que el cultivo continuó sea efectivo es necesario que el proceso se encuentre en estado estacionario. El estado estacionario se define como una condición de estabilidad, en la que varios factores permanecen constantes a través del tiempo; entre ellos, el volumen del cultivo, la concentración celular y de metabolitos, y las condiciones fisicoquímicas necesarias para el desarrollo del proceso. Como resultado de la estabilidad, los procesos fermentativos se pueden mantener por largos periodos, siempre y cuando el sistema se mantenga libre de contaminación. El cultivo continuo se ha utilizado para fabricar una serie de productos, entre ellos, la cerveza y el etanol; también, se ha utilizado en el tratamiento de aguas residuales. Algunas sustancias obtenidas por fermentación continua son: acetona, cloranfenicol, ácido acético, etanol, ácido cítrico, estreptomicina, ácido gluconico, glucosa-isomerasa, ácido itacónico, glicógeno, ácido láctico, penicilina, butano, penicilinasa, butanodiol. Proteína unicelular, celulasa y vitamina B12

39.

39

Hernández, Alicia. Microbiología industrial. 2003. Editorial EUNED. Edición 1. pág. 51-54

32

Condiciones que deben medirse y controlarse en una fermentación discontinua. Una vez que el sustrato y el organismo han sido seleccionados es necesario darles las condiciones adecuadas de operación y optimización del sistema. Desde el punto de operación es importante decidir las siguientes variables: temperatura, pH, ºBrix, nutrientes y productividad entre otras. Una de estas variables se mide de manera continua y otras intermitentemente. Las variables que se puede medir de manera continua son: temperatura, pH, ºBrix, nutrientes y las variables que se puede medir de manera intermitente son: biomasa, producto y consumo de sustrato. Temperatura La temperatura ejerce un marcado efecto sobre la velocidad metabólica del organismo. La temperatura tiene una influencia directa sobre la velocidad de reacción y esta puede cambiar la configuración de los constituyentes celulares, especialmente de las proteínas y de los componentes de la membrana. La temperatura optima de crecimiento de las levaduras especialmente de la Saccharomyces cerevisiae es de 30 a 35°C. La temperatura afecta al organismo de manera notable ya que los organismos de una especie dada solo pueden crecer en un rango de temperatura y esto afecta de manera notable al organismo. pH La acidez o alcalinidad de una solución se expresa por su índice de pH en una escala de 0 a 14. Es importante recordar que el pH es una función logarítmica, un cambio en una unidad de pH representa un cambio de diez veces en la concentración de iones hidrogeno. El pH tiene un marcado efecto en la velocidad de crecimiento y en el rendimiento. El pH óptimo para algunos organismos en especial para las levaduras se encuentra en un rango de 4.0 a 6.0. Un cambio en el valor de pH puede afectar su composición o su naturaleza de la superficie microbiana al disociarse ácidos y bases. Este último21puede afectar la floculación de la biomasa o la adhesión a las paredes. El pH tiene una gran influencia en los productos finales del metabolismo anaerobio40.

40

NIETO, GALARZA. (2009). Evaluación de las condiciones de la fermentación alcohólica

utilizando Saccharomyces cerevisiae y jugo de caña de azúcar como sustrato para obtener etanol. Extraído del sitio web de la escuela politécnica del ejército ecuatoriano.http://repositorio.espe.edu.ec/bitstream/21000/990/1/T-ESPE-026782.pdf

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ºBrix El ºBrix o grados Balling es otra escala del hidrómetro utilizada en la industria azucarera. Normalmente las escalas ºBrix se calibran a 15.6 a20°C. Conla escala a 20°C, cada ºBrix indica 1 gramo de sacarosa por cada 100 gr de líquido. Aireación La ausencia o abundancia de oxigeno permite una selección tanto de microorganismo como de productos metabólicos. Cuando el cultivo se produce en presencia de oxigeno molecular, la fermentación se denomina fermentación aeróbica y cuando se realiza en ausencia de oxigeno molecular se denomina anaeróbico. Si la fermentación es anaeróbico, la mayor parte del carbono se emplea como energía y solo el 2% se asimila como material celular. Saccharomyces cerevisiae es una levadura que posee alta actividad metabólica, por lo que en un proceso fermentativo en base aeróbica se caracteriza por la producción de biomasa y en base anaeróbica generalmente por la producción de etanol. Principios del crecimiento microbiano. El crecimiento de los microorganismos puede verse como el incremento de material celular expresado en términos de masa o número de células y procede de una serie de pasos biológicos coordinados y muy complicados catalizados enzimáticamente. El crecimiento dependerá de la disponibilidad y transporte de nutrientes necesarios para la célula y su subsiguiente captación y del mantenimiento óptimo de los parámetros medioambientales tales como la temperatura, pH y la aireación. La cantidad de biomasa o de un componente celular específico en un biorreactor puede determinarse gravimétricamente (por peso seco, peso húmedo, DNA, o proteína) o numéricamente para los sistemas unicelulares (por número de células). El tiempo de duplicación hace referencia al periodo de tiempo requerido para la duplicación del peso de la biomasa, mientras que el tiempo de generación se refiere al periodo necesario para duplicar el número de células. Los tiempos de duplicación medios se incrementan con el aumento del tamaño celular. La tabla 5 muestra el tamaño de las células de algunos microorganismos utilizados en procesos biotecnológicos.

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Tabla 5. Tamaño de células en procesos Biotecnológicos

Tamaño aproximado de las células usadas en procesos biotecnológicos

Tipo celular Tamaño (µm)

Bacterias 1 x 2

Levaduras 7 x 10

Células de mamífero 40 x 40

Células Vegetales 100 x 100

Fuente: SMITH, John E. Biotecnología. 2006. Editorial Acribia. Edición 4. Pág. 53

Un organismo raramente tendrá condiciones totalmente ideales para un crecimiento ilimitado; más bien, el crecimiento dependerá de un factor limitante, por ejemplo un nutriente esencial, a medida que la concentración de este factor cae también lo hará el potencial de crecimiento del organismo41. Levaduras Están agrupadas en unas 350 especies (clasificadas a su vez en 39 géneros), lo que muestra que dentro de los hongos constituyen un pequeño grupo. Las levaduras son bastante heterogéneas en su morfología y fisiología; sin embargo, la forma habitual en que se les encuentra es la unicelular. Algunas, además de la forma unicelular o de levadura, pueden presentar micelio. Ambas formas, en estos casos, dan simultáneamente en el medio donde se encuentra el microorganismo. La figura 9 ilustra las distintas formas de levadura que se pueden encontrar.

Figura 9. Esquema de distintas formas de levadura.

Fuente: GARCÍA CORTES, Vera. Introducción a la microbiología. 2004. Editorial EUNED. Edición 2. Pág. 109

Es importante señalar que las condiciones ambientales influyen para que algunos hongos crezcan como filamentos o como levaduras. Este fenómeno, que se conoce como dimorfismo, se presenta en varios hongos patógenos.

41

SMITH, John E. Biotecnología. 2006. Editorial Acribia. Edición 4. Pág. 53-54

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Las levaduras se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza, localizada en el suelo, en la superficie de las frutas, en el néctar de las flores y en ambientes acuático. A continuación la figura 10 ilustra los componentes internos de la célula de la levadura

Figura 10. Diagrama de la estructura de una levadura.

Fuente: GARCÍA CORTES, Vera. Introducción a la microbiología. 2004. Editorial EUNED. Edición 2. Pág. 109

Requerimientos nutricionales

Las levaduras son organismos heterótrofos, por lo tanto, requieren de carbono orgánico para la síntesis obtener la energía y el carbono para la síntesis de sus componentes celulares. Sin embargo, los requerimientos nutricionales específicos de las levaduras pueden variar entre las diferentes especies. Los azucares constituyen el mejor alimento energético de las levaduras. Muchas pueden catabolizar la glucosa, ya sea en forma aerobia (respiración) o anaeróbica (fermentación). El proceso típico es la disimilación anaerobia, conocido comúnmente como fermentación alcohólica, el cual da como resultado etanol y dióxido de carbono.

Las levaduras requieren, como otros seres, minerales para su crecimiento. Se ha determinado que le potasio, el magnesio, el sodio y el calcio se incluyen dentro de los necesarios. En relación con los elementos traza, se ha demostrado que para obtener un rendimiento óptimo en medios de cultivo sintéticos se requiere la presencia de boro, cobre zinc, manganeso, hierro, iodo y molibdeno. La mayor parte de las levaduras crece mejor en medios en los que está disponible una buena cantidad de agua. Sin embargo, muchas de ellas pueden crecer en medios con relativamente poca cantidad de agua como en soluciones con una

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concentración elevada de solutos (sal o azúcar), por lo que puede decirse que en general requieren para su crecimiento menos humedad que las bacterias42. Condiciones ambientales requeridas para el crecimiento. Oxigeno Las levaduras crecen bajo condiciones aerobias. Algunas son estrictamente aerobias y otras son facultativas. Las facultativas crecen mejor en aereobiosis y bajo condiciones anaerobias lo hacen más lentamente. Las levaduras aerobias estrictas se conocen como oxidativas; y las que pueden desarrollarse en medios aerobios como en anaerobios se denominan fermentativas. pH En general se considera que las levaduras, al igual que los mohos, se desarrollan mejor en medios ácidos (3,8 - 5,6). Sin embargo, estas pueden tolerar un rango de pH que va desde 2 a 8. Temperatura Existen levaduras que pueden crecer a muy diversas temperaturas, generalmente en un rango que va desde 0 a 50 °C. la mayoría de las especies saprofitas, sin embargo, tienen temperaturas optimas de crecimiento entre los 22 y los 30 °C. Concentración de solutos Generalmente pueden desarrollarse en medios con concentraciones altas de solutos. Existe un grupo que tolera cantidades de solutos mayores, por lo que se denominan osmófilas. Estas tienen importancia en el deterioro de alimentos tales como la miel de abeja, los siropes y los concentrados de fruta43. Curva de crecimiento de un microorganismo Esta curva representa el comportamiento del crecimiento del microorganismo a través del tiempo, con base en ella, se determina cuando se produce la mayor cantidad de biomasa o metabólicos (primarios o secundarios). La figura 11 ilustra el crecimiento de un microorganismo en el tiempo.

42

Fuente: GARCÍA CORTES, Vera. Introducción a la microbiología. 2004. Editorial EUNED. Edición

2. 112 p. 43

GARCÍA CORTES, Vera. Introducción a la microbiología. 2004. Editorial EUNED. Edición 2. Pág. 112-114

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Figura 11.Curva de crecimiento de un microorganismo.

Disponible en: http://www.facmed.unam.mx/deptos/microbiologia/bacteriologia/generalidades.html Fecha: 10/05/2012

Fase de latencia También conocida como fase lag; coincide con el periodo de adaptación del microorganismo a las nuevas condiciones nutricionales y ambientales. Se presenta inmediatamente después de la inoculación y su duración depende del estado fisiológico de la célula inoculada y de las condiciones ambientales. Si el microorganismo se encuentra en su fase logarítmica antes de la inoculación, la fase lag es muy pequeña o puede no presentarse. Durante este periodo no existe aumento en el número de células, pues el microorganismo utiliza la energía disponible con el fin de sintetizar las enzimas que requiere para su desarrollo en el nuevo medio. Fase logarítmica o exponencial. En esta fase las células se multiplican a la máxima velocidad y su crecimiento puede ser cuantificado con base en el número de células que se producen por unidad de tiempo (para levaduras y bacterias) o por el aumento en la biomasa por unidad de tiempo (para hongos filamentosos). La velocidad de crecimiento durante este periodo permanece constante y es independiente de la concentración del sustrato, siempre y cuando esta sustancia se encuentre en exceso.

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La fase logarítmica termina cuando se produce alguna de estas tres situaciones: los nutrimentos se agotan, las condiciones ambientales indispensables para la célula se modifican o cuando la célula produce metabolitos tóxicos o que inhiben su reproducción. Fase estacionaria La velocidad de crecimiento (reproducción) del microorganismo es igual a la velocidad de muerte y se llega a un equilibrio celular. La importancia de esta fase varía con el tipo de fermentación. Si el objetivo final de la fermentación es la producción de etanol, no es necesario (ni rentable) continuar el proceso cuando se alcanza la fase estacionaria, ya que una vez que se obtiene la máxima concentración de las células, la producción de etanol disminuye. Por el contrario en la producción de antibióticos, la mayor acumulación de estas sustancias se presenta durante la fase estacionaria44. Fase de muerte Se inicia cuando los nutrimentos que están en el medio de cultico no son suficientes para que el microorganismo pueda reproducirse. Otro de los motivos por los cuales empieza esta etapa es la producción, como parte del metabolismo, de sustancias toxicas que impiden la multiplicación de las células. 2.2.12 Etanol.

El compuesto químico etanol es un alcohol que se presenta como un líquido incoloro e inflamable con un punto de ebullición de 78°C. Al mezclarse con agua en cualquier proporción, da una mezcla azeotrópica. Su fórmula química es CH3 -CH2 -OH y su fórmula molecular es C2H5OH. El etanol está presente en diversas bebidas fermentadas. Desde la antigüedad se obtenía el etanol por fermentación anaeróbica de una disolución con contenido en azúcares con levadura y posterior destilación. Dependiendo del género de Bebida alcohólica que lo contenga, el alcohol aparece acompañado de distintos elementos químicos que lo dotan de color, sabor, olor, entre otras características. Separación de la Mezcla Agua-Etanol (Destilación). Para obtener etanol libre de agua se aplica la destilación azeotrópica en una mezcla con benceno o ciclo hexano. De estas mezclas se destila a temperaturas más bajas el azeótropo, formado por el disolvente auxiliar con el agua, mientras que el etanol se queda retenido. Otro método de purificación muy utilizado actualmente es la absorción física mediante tamices moleculares A escala de laboratorio también se pueden

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HERNÁNDEZ, Alicia. Microbiología industrial. 2003. Editorial EUNED. Edición 1. pág. 43-45

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utilizar disecantes como el magnesio, que reacciona con el agua formando hidrógeno y óxido de magnesio.

Aplicación. Además de usarse como bebida alcohólica, el etanol se utiliza ampliamente en muchos sectores industriales y en el sector farmacéutico, como principio activo de algunos medicamentos y cosméticos .Según su pureza el etanol

recibe distintas nominaciones:- Alcohol Industrial: Es alcohol etílico, normalmente

de alta graduación, producido y vendido para cualquier uso, excepto bebidas. Se distribuye generalmente en forma de alcohol puro (96% en volumen), alcoholes naturalizado (mezclado con sustancias amargas o toxicas que lo convierten en no apto para consumo en licores) y mezclas de solventes de marca registrada. Muchas medicinas, productos alimenticios, condimentos y cosméticos no se podrían producir sin él. Se utilizan para producir vacunas, tónicos compuestos, jarabes, tintes, antisépticos, cloroformo, barbitúricos, pegamentos, cosméticos, detergentes, explosivos , tintas, cremas , plásticos y textiles. Alcohol Absoluto: Se usa como reactivo en laboratorio o en biomedicina, como combustible en motores de explosión y también en múltiples procesos industriales. Se produce deshidratando alcohol puro de 96%, por medio de ácido sulfúrico concentrado, cloruro de calcio anhidro o alúmina. Gasohol: Es un sustituto de la gasolina, hecho de una mezcla de gasolina y de 10% a 20% de etanol45. El gasohol posee un octanaje más alto que la gasolina normal y quema a menor temperatura, por lo cual produce menores emisiones contaminantes tipo NOx.

Toxicología. El etanol puede afectar al sistema nervioso central, provocando estados de euforia, desinhibición, mareos, somnolencia, confusión y alucinaciones. Con concentraciones más altas impide la coordinación correcta de los miembros, pérdida temporal de la visión, etc. En ciertos casos se produce un incremento en la irritabilidad del sujeto intoxicado como también en la agresividad; en otra cierta cantidad de individuos se ve afectada la zona que controla los impulsos, volviéndose impulsivamente descontrolados y frenéticos, finalmente, conduce al coma y puede provocar la muerte. La resistencia al alcohol parece aumentar en las personas adultas, de mayor peso y de menor altura, mientras que los niños son especialmente vulnerables. Se han comunicado casos de bebés que murieron por intoxicación debida a la inhalación de vapores de etanol tras haberles aplicado trapos impregnados de alcohol. La ingesta en niños puede conducir a un retardo mental agravado o aun

45

E. Tiezzi. Tiempos históricos, tiempos biológicos.(la tierra o la muerte: los problemas de “la nueva ecología”. Fondo de cultura económica. México.1990. 215 p.

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subdesarrollo físico y mental46.En el anexo se encuentra la ficha técnica del etanol

o alcohol etílico 2.2.13 DESTILACIÓN La destilación es una operación unitaria que consiste en la separación de los componentes de una mezcla líquida (en la que todos los compuestos son más o menos volátiles) por evaporación y condensación sucesivas. La separación se basa en la diferencia de volatilidades absolutas de los componentes, lo que tiene como consecuencia la formación de un vapor de composición diferente a la del líquido del que procede. Lógicamente, cuanto mayor sea la diferencia de volatilidades mayor será la separación que se puede conseguir. Para el cálculo de la composición del vapor que se desprende se supondrá que éste se encuentra en equilibrio con la fase líquida presente en cada instante. Los distintos métodos empleados en la destilación se pueden clasificar del siguiente modo: Destilación simple:

Abierta

Intermitente o diferencial.

Continua.

Cerrada o de equilibrio. Destilación con enriquecimiento de vapor:

Repetida.

Condensación parcial.

Rectificación

Continua

Intermitente.

Destilación con arrastre de vapor. La destilación simple se caracteriza porque no se establece ningún tipo de contacto entre el vapor generado por el líquido que hierve y un líquido cualquiera, de composición diferente a la del equilibrio; es decir, el vapor generado y el líquido en ebullición están en equilibrio. Puede ser abierta o cerrada. En la destilación simple cerrada o de equilibrio, también llamada destilación súbita o destilación flash, el producto a destilar se calienta y luego se descarga en un recipiente a presión muy reducida, donde experimenta una expansión súbita que conduce a la

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JIMENEZ, Sonia. MARBELLO, Linda Luz y ACEVEDO, Evelin. Evaluación comparativa de la actividad fermentativa de Células libres e inmovilizadas de Saccharomyces cerevisiae Sobre cáscaras de naranja y gluten. para la obtención de Grado el Título de ingeniero Químico. Cartagena. 2008

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formación de las dos fases, vapor y líquido, en equilibrio. En la destilación simple abierta se carga una caldera, de forma intermitente o de forma continua, y el destilado se va recogiendo a la salida de un condensador. Obsérvese que, mientras que en la destilación simple abierta continua y en la destilación simple cerrada, la composición del líquido que hierve y la del destilado que se recoge (en fase vapor o en fase líquida, tras su condensación) permanecen constantes con el tiempo, en la destilación simple abierta diferencial, la composición del líquido cambia de forma continua y, en consecuencia, también lo hace la del vapor; por tanto, el destilado que se va acumulando a la salida del condensador tendrá una composición que será el resultado de la acumulación de los sucesivos destilados de composición variable y, por tanto, no estará en equilibrio con el líquido que va que dando en cada momento en la caldera. Destilación simple abierta diferencial La destilación simple abierta diferencial es una operación intermitente en la que la mezcla a destilar se carga en la caldera, donde se suministra el calor necesario para llevarla a su temperatura de burbuja. En ese instante comienza la ebullición, que se mantiene mientras se va eliminando continuamente el vapor generado. Este vapor se condensa en el exterior dando lugar al producto destilado. Conforme transcurre el proceso se va modificando la composición del líquido, ya que se eliminan preferentemente los componentes más volátiles, con lo cual va aumentando, consiguientemente, la temperatura de burbuja de la mezcla. Lógicamente, el vapor (siempre en equilibrio con el líquido en la caldera) también cambiará continuamente su composición, empobreciéndose en el componente más volátil. El calor debe suministrarse en la caldera de modo que en todo instante el vapor generado esté en equilibrio con el líquido en la caldera. Debe por tanto compensar las pérdidas, el calor latente de vaporización y el calor sensible del líquido. Lógicamente, en este proceso tampoco podrá haber reflujo (el vapor se debe eliminar instantáneamente y separarse del líquido). Estas condiciones pueden ser difíciles de conseguir en la práctica. El proceso se continúa hasta que se alcanza la separación deseada. Este tipo de destilación se usa frecuentemente en trabajos de laboratorio y en plantas piloto. El destilado puede recogerse en distintos recipientes, en función de su composición, lo que se conoce como destilación fraccionada. También se utiliza con fines analíticos en caracterización de fracciones de petróleo o distintos productos (por ejemplo en algunas normas ASTM para la determinación de intervalos de destilación). La figura 12 muestra como se realiza el proceso de destilación y la figura 13 un montaje a nivel de laboratorio de un proceso de destilación simple.

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Figura 12. Diagrama de flujo proceso de destilación

Figura 13. Equipo de destilación simple

Fuente:http://www.monografias.com/trabajos83/destilacionsimple/destilacionsimple.shtml fecha:: 24/04/2011

2.3 MARCO LEGAL A continuación se hace mención a la normativa en Colombia relacionadas con el alcohol como combustible. Ley 693 de 2001 (Uso de alcoholes carburantes en Colombia) en donde se estableció lo siguiente: • Las gasolinas que se utilicen en el país, tendrán que contener compuestos Oxigenados tales como alcoholes carburantes. • Se decreto que el uso del alcohol carburante recibirá un tratamiento especial en las Políticas sectoriales de autosuficiencia energética de producción agropecuaria y de Energética, generación de empleo. • A partir de septiembre 2005, las ciudades de más de 500.000 habitantes deben tener gasolina oxigenada. Alcohol Carburante.

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ESTÍMULOS TRIBUTARIOS Ley 788 de 2002 (Reforma Tributaria) en donde se dan incentivos tributarios a la producción de alcohol carburante, los artículos de mayor importancia en esta reforma fueron: • ARTÍCULO 31: Se declara exento del IVA al alcohol carburante con destino a la mezcla con el combustible motor. • ARTÍCULO 88: Se exoneró del pago del impuesto global y de la sobretasa al porcentaje de alcohol carburante que se mezcle con la gasolina motor. • Subsidios por us$80 millones para los productores47. DECRETO ZONAS FRANCAS (Decreto 383 de 2007), en este decreto se establecen estímulos para la implementación de zonas francas para de biocombustibles Tasa de proyectos agroindustriales en materia – renta diferencial y beneficios en materia de exenciones de aranceles en bienes de capital – proyectos con potencial exportador). CALIDAD DEL COMBUSTIBLE (Resolución 447 de 2003), modificada por la resolución 1565 de 2004 (Ministerios del Ambiente, Vivienda y Desarrollo Territorial y Minas y Energía), se establecen los requisitos técnicos y ambientales de los alcoholes carburantes y los combustibles oxigenados que se vienen distribuyendo en el país desde el año 2005 PRECIOS Resolución 18 0222 de 2006 (Ministerio de Minas y Energía), Se definió una banda de precios que toma el mayor valor entre un precio de estabilidad de $4.594 pesos por galón para el Alcohol Carburante (que es equivalente aproximadamente a US$2.26 dólares por galón), recientemente definido y un precio que reconoce los costos de oportunidad de las materias primas que se utilizan en la producción del alcohol (Paridad exportación del azúcar refinado). Actualmente se viene ajustando el precio gradualmente con el fin de alcanzar el precio piso48. REGLAMENTACION TECNICA Resolución 18 0687 de 2003, modificada a través de la resolución 18 de Ministerio de Minas y Energía), con esta resolución Se definió la regulación técnica en

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Disponible en: www.secretariasenado.gov.co/senado/basedoc/ley/2001/ley_0693_2001.html 48

Disponible en: Asociación colombiana de productores y proveedores de caña de azúcar- procaña.com

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relación con la producción, acopio, distribución y puntos de mezcla de los alcoholes carburantes y su uso en los combustibles nacionales e importados 2.4 MARCO CONCEPTUAL ALCOHOL ANHIDRO: es un alcohol que se ha sometido a un proceso de deshidratación para eliminar el agua contenido en él. ALCOHOL CARBURANTE: es un compuesto inflamable que no tiene color y tiene olor característico de los alcoholes. AZÙCAR: termino aplicado a cualquier compuesto químico del grupo de los hidratos de carbono.

BIOCOMBUSTIBLE: cualquier combustible sólido, liquido o gaseoso producido a partir de materia orgánica. Se produce directamente a partir de plantas o indirectamente de desechos industriales, comerciales, domésticos o agrícolas BIOMASA: se define como la energía solar convertida en materia orgánica por la vegetación, que se recupera como combustión directa, o transformando la materia orgánica en otros combustibles.

CARBOHIDRATOS: son los compuestos orgánicos más abundantes de la biosfera y a su vez los más diversos normalmente se los encuentra en las partes estructurales de los vegetales y también en los tejidos animales, como glucosa o glucógeno.

COMBUSTIBLES FOSILES: sustancias ricas en energía que se han formado a partir de plantas y microorganismo enterrados durante mucho tiempo, los combustibles fósiles, que incluyen el petróleo, el carbón y el gas natural, proporcionan la mayor parte de la energía que mueven a la sociedad moderna.

COMBUSTION: es un proceso químico, una reacción exotérmica entre una sustancia (combustible) y un gas (oxidante), generalmente O2 para lanzar calor.

DESTILACION: método de separación de mezclas que se basa en el aprovechamiento de las diferencias de composición de las mezclas liquidas y de vapor originadas por la vaporización parcial de una mezcla liquida o por la condensación parcial de una mezcla vapor.

ENZIMA: es un biocatalizador de naturaleza proteica cualquiera de las numerosas sustancias orgánicas especializadas compuesto por polímeros de aminoácidos, que actúan como catalizadores en el metabolismo de los seres vivos. Con su acción, regulan la velocidad de muchas reacciones químicas.

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FERMENTACION: cambios químicos en las sustancias orgánicas por la acción de las enzimas.

GLUCOSA: azúcar monosacáridos de formula C6H12O6 se encuentra en la miel y en el jugo de numerosas frutas. Se produce la hidrólisis de numerosos glucósidos naturales.

HIDRÓLISIS: tipo de reacción química en que una molécula de agua reacciona, con una molécula de una sustancia A-B en la que A y B representan átomos o grupos de átomos. En la reacción, la molécula de agua se descompone n los fragmentos H+ y OH-, y la molécula AB se descompone en A+ y B-. Luego estos fragmentos se unen proporcionando los productos finales AOH y BH.

pH: es el logaritmo negativo de la concentración de los iones de hidrogeno. Es una escala numérica utilizada para medir la acidez y basicidad de una sustancia.

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3 DISEÑO METODOLÓGICO

3.1 TIPO DE INVESTIGACIÓN El tipo de estudio que se desarrolla es explicativo porque se tomaron 81 muestras, debido a que eran 3 variedades de ñame con 3 concentraciones y se midieron a 9 tiempos diferentes en la etapa de hidrolisis, y para la etapa de fermentación se efectuaron 56 muestras, además se efectuaron pruebas (DNS, cámara Neuvauer, refractómetro y Dicromato de potasio) para determinar el comportamiento de las variables (azucares reductores, concentración de células, ºBrix y concentración de alcohol) que rigen el proceso, se medirán concentraciones de sustratos y cantidades de aguas específicas, se realizaran cálculos para determinar la cantidad de azucares que se obtenga de la hidrolisis. Además se observó la relación de ciertas variables que afectan el rendimiento del proceso que explicaran los resultados. De acuerdo a Roberto Hernández Sampierí el tipo de investigación experimental se define como un“estudio explicativo” porque muchas veces los resultados experimentales no explican lo que en cierto fenómeno ha ocurrido. Este tipo de investigación va más allá de la descripción de conceptos o fenómenos o del relacionamiento entre conceptos; están dirigidos a responder a las causas de los eventos físicos o sociales. Como su nombre lo indica, su interés se centra en explicar por qué ocurre un fenómeno y en qué condiciones se da éste, o por qué dos o más variables están relacionadas. El tipo de diseño que se adopta es el experimental ya que se manipularon las variables independiente como son: la concentración de reactivos y complejos enzimáticos así como los complejos de la levadura manteniendo fijos los valores óptimos de temperatura y pH, con el fin de garantizar la acción efectiva de estos complejos, en los proceso de hidrolisis y fermentación. Luego se observó cómo se ven afectadas las variables independientes en el proceso. Según Roberto Hernández el término experimento que va más de acuerdo con un sentido científico del término, se refiere a un estudio de investigación en el que se manipulan deliberadamente una o más variables independientes (supuestas causas) para analizar las consecuencias de esa manipulación sobre una o más variables dependientes (supuestos efectos), dentro de una situación de control para el investigador” El tipo de enfoque es cuantitativo de acuerdo a la teoría referenciada, esta investigación cumple con todos los requisitos descritos. Los fundamentos de la metodología cuantitativa se pueden encontrar en el positivismo. Donde la clave del positivismo lógico consiste en contrastar hipótesis probabilísticamente y en caso de ser aceptadas y demostradas en circunstancias distintas, a partir de ellas elaborar teorías generales. La estadística dispone de instrumentos cuantitativos para contrastar estas hipótesis. Por tanto el método

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científico, tras una observación, genera una hipótesis que contrasta y emite posteriormente unas conclusiones derivadas de dicho contraste de hipótesis. En general los métodos cuantitativos son muy potentes en términos de validez externa. La investigación cuantitativa con los test de hipótesis no sólo permite eliminar el papel delazar para descartar o rechazar una hipótesis, sino que permite cuantificar la relevancia clínica de un fenómeno midiendo la reducción relativa del riesgo. El enfoque cuantitativo pretende acotar la información, medir con precisión las variables del estudio49. El enfoque cuantitativo se caracteriza por los siguientes pasos que emplea el investigador:

Plantea un problema de estudio delimitado y concreto.

Una vez planteado el problema de estudio delimitado y concreto Sobre la base de la revisión de la literatura construye un marco teórico. De esta teoría deriva hipótesis.

Somete a prueba las hipótesis mediante el empleo de los diseños de investigación apropiados.

Para obtener tales resultados el investigador recolecta datos numéricos de los objetos fenómenos o participantes.

a) Las hipótesis se generan antes de recolectar y analizar los datos. b) La recolección de los datos se fundamenta en la medición. c) Debido a que los datos son productos de mediciones, se representan

mediante números (cantidades) y se deben analizar a través de métodos estadísticos.

d) En el proceso se busca el máximo control para lograr que otras explicaciones posibles distintas a la propuesta del estudio (hipótesis) sean desechadas y se excluya la incertidumbre y minimice el error.

e) Los análisis se interpretan a la luz de las prodiciones iníciales (hipótesis) y de estudios previos (teoría)

f) La investigación cuantitativa debe ser lo más objetiva posibles. g) Los estudios cuantitativos siguen un patrón predecible y estructurando (el

proceso). h) En una investigación cuantitativa se pretende explicar y predecir los

fenómenos investigados, buscando regularidades y relaciones causales entre elementos.

i) Con los estudios cuantitativos se pretende explicar y predecir los fenómenos investigados.

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FERNADEZ, Pita y PÉRTEGAS Díaz, S. Investigación cuantitativa y cualitativa. Unidad de epidemiologia Clínica y Bioestadística. La Coruña (España). 2002.

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j) Los datos generados poseen los estándares de validez y confiabilidad, las conclusiones derivadas contribuirán a la generación de conocimiento.

k) Este enfoque utiliza la lógica o razonamiento deductivo, que comienza con la teoría y de esta se deriva expresiones lógicas denominadas hipótesis que el investigador busca someter a prueba.

l) La búsqueda cuantitativa ocurre en la realidad externa del individuo50. 3.2 POBLACIÓN Y MUESTRA

La población tenida en cuenta para la producción de etanol a nivel de laboratorio, fueron 3 kg del ñame fresco de cada una de las 3 variedades (ñame espino, ñame diamante y ñame baboso) que se comercializa en el mercado Bazurto de Cartagena, teniendo en cuenta que no tuvieran ningún tipo de problema de descomposición, y para la extracción del almidón solo se utilizo1,3 kg por cada variedad. La caracterización de las muestra se determinó mediante un muestreo no probabilístico, debido a que no todos los sujetos de la población tienen la misma probabilidad de ser elegidos, por lo tanto no garantizan la representativa de la muestra y así no permiten realizar estimaciones inferenciales sobre la población. En este caso las concentraciones en cada punto del Erlenmeyer varía, por lo cual, al tomar la muestra no se garantiza que ésta tenga un valor promedio o real, para ello se seleccionaron las muestras siguiendo determinados criterios procurando que ésta sea representativa. Las muestras tomadas en la etapa de fermentación fueron de 5ml en cada uno de los biorreactores por cada tipejo. 3.3 METODOLOGÍA UTILIZADA EN EL PROYECTO

La investigación de la obtención de etanol a partir de 3 variedades de ñames se dividió en tres etapas: obtención de la harina de ñame, la hidrólisis enzimática y la fermentación, a continuación se describirá la metodología llevada a cabo en estas tres etapas. 3.3.1 Obtención de la harina de ñame

Para la obtención de la harina de ñame se pesaron 1.34 kg de cada una de las variedades y se procedió a ser pelados, a continuación se procedió a lavarlos con una solución de amoniaco 0.1M, con el fin de eliminar la babosidad del ñame o el residuo mucilaginoso del tubérculo, luego se cortaron en trozos pequeños para poder rallarlo con más facilidad y así lograr un completo secado, luego de secado fue molido, se procedió al proceso de tamizado para obtener las partículas más

50

Hernández Sampierí, Roberto Metodología de la investigación Editorial MC. Graw-Hill México 2006

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finas, y finalmente fue empacado en bolsas ziploc. En la tabla 6 se ilustra la cantidad de ñame utilizada, con el peso antes y después del proceso de pelado. Tabla 6. Cantidad de ñame utilizada en el proceso

Fuente: los autores del proyecto

A continuación en la figura 14 se ilustra la metodología utilizada en la obtención de la harina de ñame. Figura 14. Proceso de extracción de harina de ñame

Fuente: los autores del proyecto.

Peso con cascara Peso sin cascara Peso de la cascara

D. Rotundata 1,34 1,05 0,29

D.Alata 1,34 1,09 0,25

D. Trifida 1,34 1,09 0,25

Variedades

Peso del ñame

(kg)

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3.3.2 Hidrólisis enzimática Basado en investigaciones anteriores citadas en el capítulo 2 de acuerdo al contenido de humedad los mejores rendimientos de etanol se han obtenido en el rango de concentraciones entre 10 y 16% en peso seco de la harina de ñame, de acuerdo a estos lineamientos en esta investigación se evaluaron los sustratos a 10.5, 13.5 y 15%m/v. La cantidad de harina de ñame con la cual se trabajó fue de 68.25, 87.5 y 97.5 gramos para un volumen de agua de 650ml, que corresponde a las concentraciones de 10.5, 13.5 y 15%m/v respectivamente, esto se realizó por cada especie de ñame. Este proceso de hidrolisis de la harina de ñame se realizó en dos etapas: Licuefacción y sacarificación. Licuefacción.

Para esta primera etapa se utilizó la enzima Alfa amilasa suministrada por la empresa Procesos y Fermentación S.A (Cartagena) en las cantidades y en las condiciones óptimas estipuladas en la ficha técnica del fabricante de acuerdo a su actividad enzimática, en la tabla 7 se observa las condiciones utilizadas de la enzima alfa amilasa en la etapa de hidrólisis. En el proceso de hidrolisis las soluciones preparadas se montaron en frascos de 750 ml con un volumen de reacción de 650 ml, en total fueron 9 Biorreactores, 3 por cada variedad de ñame D. Alata, D. Trífida y D. Rotundata (diamante, baboso y espino respectivamente) con sus respectivas concentraciones 10.5%, 13.5% y 15% m/v. Ya con las soluciones preparadas se les midió el pH y se ajustó a 6.5 con una solución de HCl 0.1N, luego se colocaron en horno con control de temperatura entre 90 – 95 ºC con un tiempo de residencia de 24 horas. Durante el tiempo de residencia de la enzima se realizaron mediciones; de los ºBrix, mediante el Refractómetro (modelo VBR90A) y azucares reductores, mediante la técnica del ácido 3,5 Dinitrosalicilico (DNS). Al momento de realizar la lectura de azucares reductores fue necesario diluir las muestras en 100 ml para que el espectrofotómetro pudiera captar un valor de absorbancia visible. En el anexo E se observa la técnica de DNS, junto con la curva de calibración empleada en la lectura de azucares reductores.

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Tabla 7. Condiciones de la enzima α Amilasa

Variedad Enzima

Cantidad de enzima por concentración (ml)

Temperatura pH 10,5% 13,5% 15%

D. Alata Alfa

Amilasa 0,042 0,054 0,072 90 – 95 6,5

D. Rotundata

Alfa Amilasa 0,042 0,054 0,072 90 – 95 6,5

D. Trífida Alfa

Amilasa 0,042 0,054 0,072 90 – 95 6,5

Fuente: los autores del proyecto

Sacarificación. Para esta etapa se agregó la enzima Amiloglucosidasa (AMG 300 L) para la obtención de glucosa en mayor proporción mediante la sacarificación, esta fue suministrada por la empresa Nutrianálisis (Bogotá) en las cantidades y en las condiciones óptimas estipuladas en la ficha técnica del fabricante de acuerdo a su actividad enzimática para este proceso, en la tabla 8 se ilustra las condiciones a las que se utilizo la enzima Amiloglucosidasa en la etapa de sacarificación. Para la etapa de sacarificación fue necesario ajustar el pH a 4.5 con una solución de HCl 0.1N y se debió ajustar la temperatura a 55º, ir al anexo B. Durante este proceso el tiempo de residencia de la enzima fue de 4 horas donde los azucares reductores se tornaron constante, durante este tiempo se efectuaron mediciones de grados Brix, y también se efectuaron mediciones de azucares reductores a partir de la técnica del ácido 3,5 dinitrosalicilico (DNS). Tabla 8. Condiciones de la enzima AMG (Amiloglucosidasa)

Variedad Enzima

Cantidad de enzima por concentración (ml) Temperatura

ºC pH 10,5% 13,5% 15%

D. Alata AMG 2,4 3,3 4,02 55 4,5

D. Rotundata AMG 2,4 3,3 4,02 55 4,5

D. Trífida AMG 2,4 3,3 4,02 55 4,5 Fuente: los autores del proyecto

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En la figura 15 se presenta el resumen general del proceso de hidrólisis enzimática. Figura 15. Esquema general del proceso de hidrólisis Fuente: los autores del proyecto

3.3.3 Fermentación Culminando el proceso de hidrólisis se procedió a filtrar cada uno de las biorreactores, para la obtención del caldo glucosado que posteriormente sería fermentado, el volumen final de este caldo fue de 350 ml por cada uno de los 9 frascos, A continuación los frascos se llevaron al proceso de esterilizado por 2 horas y posteriormente se sellaron lo más hermético posible, para que no se contaminaran con algún microorganismo hasta ser usados, en la figura 16 se observa los biorreactores después de esterilizados.

(D. Alata, D. Rotunda y D. Trífida)

Acción Enzimática

Sacarificación: AMG 300

3 Biorreactores controlando

Temperatura a 55

0C, pH de 4.5 muestreo durante

4horas. DNS y 0Brix

Licuefacción: Alfa amilasa

3 Biorreactores controlando

Temperatura a 90 0C, pH de 6.5

muestreo durante 24horas. DNS y

0Brix

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Figura 16. Hidrolizados Esterilizados

Fuente: autores del proyecto

Teniendo en cuenta que la investigación era a escala de laboratorio y que el volumen del medio final fue de 350 ml se procedió a utilizar las relaciones correspondientes para este volumen, se utilizó 1 g de levadura y se le proporcionaron los nutrientes característicos para su crecimiento ((NH4)2SO4 (0,5g/l), KH2PO4 (0,25g/l) y (0,2g/l)MgSO4 . 7 H2O. se procedió a la adición de levadura activa seca se humedeció en cada uno de los 9 fermentadores de 750 ml, agitándose hasta disolución completa para estimular su crecimiento, periodo que alcanza los 20min hasta notar un aumento del volumen tres veces mayor al inicial esta etapa se le denomina etapa de inoculación en donde se desea conseguir que el microorganismo reconozca el sustrato y se adapte más fácil al medio y así estimular su crecimiento, el tiempo de fermentación fue de 52 horas. En la tabla 9 se muestran las condiciones utilizadas en la fermentación. Tabla 9. Condiciones en el proceso de la fermentación

Fuente: los autores

Los fermentadores se sellaron con tapones elaborados con gasa y algodón; se adaptaron cánulas estériles las cuales permitirían la toma de las muestras y no hubiese contacto con el medio y este fuera contaminado, los tapones fueron

Variables Cantidad/unidad

Volumen del Rx 350 ml

pH 4,66 - 5,06

Temperatura 26°C

Cantidad de levadura 1 g

(0,5g/l) (NH4)2SO4

Nutrientes para el crecimiento (0,25 g/l) KH2PO4

(0,2 g/l) MgSO4. 7H2O

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asegurados con cinta de enmascarar para lograr el mayor hermetismo posible. En la figura 17 se ilustran los fermentadores sellados y hermetizados. Figura 17. Fermentadores usados

Fuente: los autores del proyecto

El proceso fermentativo se llevó a cabo durante 52 horas, este tiempo fue un valor tomado de distintas referencias citadas en el capítulo 2 (Marco de referencia) donde aconsejan que este sea entre 2 y 3 días, aunque la gran mayoría de las investigación de fermentaciones de tubérculos este tiempo no sobrepasa las 50 horas, durante el proceso fermentativo se tomaron 3 muestras diarias, con el fin de conocer y evaluar el comportamiento de las variables en esta etapa, se evaluaron los valores de pH, los ºBrix, la concentración de etanol y el crecimiento microbiano. La toma de muestras en esta etapa se midieron tres veces por día de cada uno de los fermentadores y los análisis que realizaron fueron: lecturas de pH en donde se utilizó un peachimetro digital, para la medición de los ºBrix se utilizó el Refractómetro (Modelo VBR90A), se le aplico también la técnica de DNS para conocer la concentración de azucares reductores presentes en la fermentación, además para la medición de la concentración de etanol se aplicó el método de dicromato de Potasio mediante espectrofotometría (Spectronic 20D+ Instruments), y para el crecimiento microbiano se realizó por conteo directo en la cámara de Neuvauer. En la figura 18 se ilustra en donde se conservaban las muestras para su posterior análisis.

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Figura 18. Toma de muestras

Fuente: los autores del proyecto

Lecturas de pH

En la etapa de inoculación se hizo el ajuste respectivo de pH en cada uno de los medios para el buen funcionamiento de la levadura y estuvo en un rango de 4.66 a 5.06. Las lecturas se efectuaron mediante la utilización de un pH metro digital y estas se realizaron 3 veces por día. Se notó durante todo el proceso para las 3 especies q hubo variaciones de pH debido a que en la fermentación hay formación de ácido láctico pero en este caso prevaleció la formación de etanol. En la figura 19 se ilustra la toma de la lectura de pH. Figura 19. Lecturas de pH

Fuente: los autores del proyecto

56

3.3.4 Destilación El liquido fermentado se procedió a filtrar mediante papel filtro para eliminar los sólidos presentes (biomasa) y el liquido final se procedió ha realizar la separación del producto de nuestro interés (etanol) mediante el proceso de destilación, para esto se realizó el montaje del equipo de destilación en el laboratorio de ingeniería de la Universidad de San Buenaventura, el alcohol separado se procedió a envasar en frascos con sus respectivas etiquetas con la variedad y su respectiva concentración. En la figura 20 se ilustra el montaje del equipo de destilación. Figura 20. Montaje del equipo de Destilación.

Fuentes: autores del proyecto

3.4 RECOLECCION DE LA INFORMACIÓN 3.4.1 Fuentes primarias. Las fuentes primarias que se utilizaron para la realización de la investigación se obtuvo a partir de los diferentes experimentos y pruebas a realizar en el laboratorio, como la técnica de DNS que permitió conocer la cantidad de azucares presentes durante la etapa de hidrolisis y fermentación, también el método colorimétrico para cuantificar el etanol (Dicromato de potasio), en donde con el análisis de los resultados pudo establecer que tan viable es el proyecto. También se utilizó las asesorías y consultorías con docentes especialistas en el tema de investigación, que aportaron información de gran importancia para elaborar y ejecutar el proyecto de forma adecuada. 3.4.2 Fuentes secundarias. Se utilizaron recursos bibliográficos, libros, revistas, artículos especializados, etc. Otra fuente de información que ayudarán al desarrollo de la investigación está relacionada en su mayoría por el internet, donde se ha obtenido la mayor parte de la información, así como tesis, manuales, prensa.

57

3.5 INSTRUMENTOS 3.5.1 Instrumentos y equipos

Se utilizaron una gran cantidad de equipos e instrumentos durante la investigación la tabla 10 muestra cada uno de estos elementos. Tabla 10. Equipos e instrumentos de laboratorio

3.5.2 Materias primas y reactivos Los reactivos utilizados en el proyecto se muestran a continuación en la tabla 11. Tabla 11. Lista de materias primas y reactivos

Fuente: los autores del proyecto

EQUIPOS

espectrofotómetro

Refractómetro

Densímetro

Medidor de Ph

Balanza Analítica

Secador de Bandejas

Refrigerador

Equipo de filtración al vacio

Incubador

Equipo de Destilación Simple

INSTRUMENTOS

Beaker

Espátula

Vidrio de Reloj

Policía

Mortero

Erlenmeyer

mechero

Molino

Rallador

Matraz de 500 y 1000 ml

Peras de Succión

Glucosa Anhidra

Acido 3,5- Dinitrosalicilico

Yoduro de Potasio

Sodio Sulfito Anhidro

Tiosulfato de Sodio Pentahidratado

Fenol o acido Fenico

Hidróxido de Sodio

Dicromato de Potasio

MATERIAS PRIMAS Y REACTIVOS

harina de ñame

α Amilasa

Amiloglucosidasa

Saccharomyces cereviciae

Acido Sulfúrico Depurado

58

3.6 HIPÓTESIS 3.6.1 Hipótesis nula Estableciendo los parámetros fisicoquímicos y biológicos (concentración glucosa, pH, humedad, temperatura) será posible obtener etanol con 10% v/v.

3.6.2 Hipótesis alternativa Estableciendo los parámetros fisicoquímicos y biológicos (concentración glucosa, pH, humedad, temperatura) será posible obtener etanol con una %v/v diferente al 10%v/v. 3.7 VARIABLES 3.7.1 variables independientes Concentración de levadura /sustrato Concentración de almidón de ñame en la solución Concentración de enzima / sustrato Temperatura pH 3.7.2 Variables dependientes Concentración de etanol Concentración de Azucares reductores Grados ºBrix Concentración de microorganismos Rendimiento

59

3.8 OPERACIONALIZACION DE VARIABLES La Tabla 12 muestra la operacionalización de todas las variables que se tomaron para la investigación. Tabla 12. Operacionalización de las variables

Fuente: autores del proyecto

3.9 PROCESAMIENTO DE LA INFORMACIÓN Para la realización del proyecto de grado, se analizó la información recolectada (internet, revistas, monografías), los datos obtenidos de las experiencias en el laboratorio y el estudio de las condiciones técnicas para el desarrollo del proceso. Esta información se organizó en tablas, cuadros y graficas en Excel. Se describieron cada uno de los cambios observados durante el proceso. Se analizaron las variables antes mencionas, las cuales son claves en la síntesis del producto deseado. El análisis de las variables, en conjunto con los resultados que se obtuvieron en experimentos y pruebas en el laboratorio (DNS o azucares reductores, ºBrix análisis colorimétrico con Dicromato de potasio), mostraron que tan viable puede ser el proyecto, además de las recomendaciones que se ofrecerán para el mejoramiento del mismo.

Variable Dimensión Indicador

Variable independiente

Concentración de levadura sustrato Física g

Temperatura Física 0C

pH Química pH

Variable dependiente

Concentración de etanol Física g/L

Rendimiento de etanol Física l/kg

Concentración de microorganismo Física UFC/ml

Concentración de azucares reductores Física g/L

Grados ºBrix Física

Concentración de harina de ñame en la solución Física g/l

Concentración de enzima Física L

60

4 RESULTADOS 4.1 Comportamiento de Dioscorea Alata en la hidrólisis enzimática. En la gráfica 1 se observa el comportamiento de ART de la variedad de ñame Dioscorea Alata, en donde se refleja cómo estos van en aumento a medida que se adicionan las enzimas y transcurre el tiempo. Al examinar los resultados de esta variedad se observa que la concentración de 15%m/v presento los valores más bajos de concentración de azucares al iniciar la hidrolisis enzimática con un valor de 1,57g/L que indica que hubo problemas de experimentación a la hora de la preparación de la solución, existían partículas más grandes y no se tuvo en cuenta y esto dificulto la degradación de la enzima a lo largo de la etapa de la licuefacción, afectando la conversión de almidón en azucares reductores. En la concentración de 10.5% la conversión de almidón en ART a lo largo de todo el proceso fue normal, presentando como valor final de 57.12g/L, inicialmente había una concentración de 4,32 g/L, la concentración de 13.5% m/v inicio con los valores más altos de ART y se observa un aumento en la concentración de forma abrupta, pero a partir de la 10 horas se empezó a regular y a las 24 horas posee una concentración de ART similar al de la concentración de 15%m/v. Con la adición de la enzima alfa amilasa se refleja su gran importancia en la primera etapa de la hidrolisis (licuefacción) por como aumenta la velocidad y alteración química de la composición química del almidón de ñame, haciendo referencia de la concentración de azucares reductores finalizando así esta primera etapa y dando así paso a la ejecución de la etapa de sacarificación, en donde se adiciono la enzima AMG 300L que cobra un papel definitivo en este proceso, dando una aumento en la concentración de azucares de manera transcendental y vertiginoso en todas las variedades. En esta variedad las concentraciones de azucares con la adición de la enzima AMG 300L varían desde 35,02g/L a 57.12g/L para la concentración de 10,5%, en la concentración de 13,5%m/v los valores oscilan entre 53,82g/L a 69,68g/L y para la concentración de 15%m/v los valores oscilaron entre 47,32g/L y 61,32g/L, finalizando así la etapa de hidrolisis, con este análisis se observa que la mayor concentración para esta variedad lo presento la concentración de 13,5% con un valor de 69,68g/L

61

Gráfica 1. Comportamiento de azucares reductores en la hidrólisis enzimática de D. Alata

Fuente: autores del proyecto

En la gráfica 2 se presenta el comportamiento de los 0Brix de las tres concentraciones (10,5%, 13,5% y 15%) usadas, en donde se refleja una notable diferencia en los valores máximos debido a la acción de la enzima en cada una de las concentraciones, aunque al iniciar el proceso no hay diferencias significativas en la cantidad de sólidos solubles en el jugo glucosado aun así la de mayor ºBrix al iniciar el proceso la tiene la concentración de 13.5%m/v que coincide con la de mayor concentración de ART al iniciar.

-20,00

-10,00

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

0 5 10 15 20 25 30

[AR

T] g

/L

HORAS

D. Alata 10,5%

D. Alata 13,5%

D. Alata 15%

α Amilasa

AMG

62

Gráfica 2. Comportamiento ºBrix en la hidrolisis enzimática de D. Alata

Fuente: autores del proyecto

En el anexo C se encuentran los datos correspondientes a la concentración de azucares reductores y de grados Brix, se observa de acuerdo a estos datos que los grados 0Brix son directamente proporcional a los de azucares reductores, aunque el máximo valor lo presento la concentración de 11,21% con 0Brix. 4.2 Comportamiento de Dioscorea Trífida en la hidrólisis enzimática. La gráfica 3 muestra el comportamiento que se dio durante el proceso de hidrólisis enzimática del ñame baboso a concentraciones de (10.5%, 13.5% y 15%). Se observa que menor concentración de ART la posee la concentración de 15%m/v se puede deber al aglutinamiento de las partículas de almidón y fue más difícil evidenciar la presencia de ART al inicio de esta etapa. A pesar de que hubo un aumento progresivo en las 3 concentraciones, con la adición de la enzima AMG en la segunda etapa se observan cambios representativos en la producción de azucares, se observa un aumento en la conversión de almidón en ART debido a la actividad enzimática, y en la concentración de 10.5%m/v aumento significativamente con respecto a la concentración de 15%m/v, aun así la concentración de 13.5%m/v presento los valores más altos de ART comparada con las otras 2 concentraciones.

-1,00

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

9,00

10,00

11,00

12,00

0 5 10 15 20 25 30

°BR

IX

HORAS

D. Alata 10,5%

D. Alata 13,5%

D. Alata 15%

α Amilasa

AMG

63

Gráfica 3. Comportamiento azucares reductores en la hidrólisis enzimática de D. Trífida.

Fuente: los autores del proyecto

En el anexo C se encuentran los datos tabulados de la producción de azucares reductores y grados ºBrix, los comportamientos de los ºBrix son directamente proporcionales a la producción de azucares. La gráfica 4 ilustra la cantidad de sólidos solubles generada para cada una de las concentraciones de ñame dentro de las cuales la del 15%, oscilo entre 1,6 y 13. Esta presento el mejor resultado con 12,99, la concentración de 13,5% entre 1,24 y 11 con 10,88 como valor final y la de 10,5% entre 0,92 y 9 con 8,64 como valor final.

-10,00

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

0 5 10 15 20 25 30

[AR

T] g

/L

HORAS

D.trifida 10,5%

D.trifida 13,5%

D.trifida15%

AMG

α Amilasa

64

Gráfica 4. Comportamiento ºBrix en la hidrólisis enzimática de D. Trífida

Fuente: los autores del proyecto

4.3 Comportamiento de Dioscorea Rotundata en la hidrólisis enzimática.

La gráfica 5 ilustra el comportamiento de azucares reductores de la variedad de ñame Dioscorea Rotundata, en donde se observa que el comportamiento es similar al de las otras 2 variedades aumentando las concentraciones a medida que transcurre el tiempo y se desarrolla la hidrolisis enzimática, en donde los valores para la concentración de 10,5% el valor inicial es de2,82gr/L a 67,57g/L, para la concentración de 13,5% el valor mínimo fue de 11,82g/L y el máximo fue de 71,32g/L, y los mejores rendimientos los presento la concentraciones de 15% con un valor inicial de 21,37g/L y un valor final de 78,82g/L que a diferencia de las otras variedades las mejores concentraciones de azucares reductores las presento la concentración de 15%.

-2,00

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

14,00

0 5 10 15 20 25 30

°BR

IX

HORAS

D.trifida 10,5%

D.trifida 13,5%

D.trifida15%

α Amilasa

AMG

65

Gráfica 5. Comportamiento azucares reductores en la hidrólisis enzimática de D. Rotundata.

Fuente: autores del proyecto La gráfica 6 muestra que el comportamiento de los 0Brix de las tres concentraciones (10,5%, 13,5% y 15%) usadas, para esta variedad tuvo un comportamiento similar al de las otras 2 variedades, aunque a diferencia tuvo el mayor valor final de los ºBrix de todo el proceso de hidrolisis enzimático, donde la acción de la enzima fue más efectiva, el valor fue de 15,70 ºBrix y lo presentó la concentración de 15%

-20,00

-10,00

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

0 5 10 15 20 25 30

[AR

T] g

/L

HORAS

D. Rotundata 10,5%

D. Rotundata 13,5%

D. Rotundata 15%

α Amilasa

AMG

66

Grafica 6. Comportamiento ºBrix en la hidrólisis enzimática de D. Rotundata

Fuente: autores del proyecto

4.4 Lectura de pH

4.4.1 Lectura de pH para Dioscorea Alata. En la gráfica 7. Se ilustra el comportamiento del pH en el proceso fermentativo de esta especie, mostrando disminución a través del tiempo, a partir de las 44 horas presento variaciones mínimas y los valores se tornaron constante. En el anexo B se reportan los datos correspondientes a la variación de pH a través de todo el proceso fermentativo para Dioscorea Alata.

-2,00

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

14,00

16,00

18,00

0 5 10 15 20 25 30

°BR

IX

Horas

D. Rotundata 10,5%

D. Rotundata 13,5%

D. Rotundata 15%

α Amilasa

AMG

67

Gráfica 7. Comportamiento del pH durante la fermentación de D. Alata

Fuente: los autores del proyecto

4.4.2 Lectura de pH para Dioscorea Trífida La gráfica 8. Muestra un comportamiento similar del pH a la anterior especie, se ilustra disminución a lo largo del tiempo, pero a partir de las 28 horas presento valores promedios a 4.27 para las concentraciones 10.5% y 15% hasta finalizar el proceso fermentativo. En el anexo C se reportan los datos correspondientes a la variación de pH a través de todo el proceso fermentativo para Dioscorea Trífida.

4

4,2

4,4

4,6

4,8

5

5,2

0 10 20 30 40 50 60

pH

HORAS

D. Alata 10,5%

D. Alata 13,5%

D. Alata 15%

68

Gráfica 8. Comportamiento del pH durante la fermentación de D. Trífida

Fuente: los autores del proyecto 4.4.3 Lectura de pH para Dioscorea Rotundata.

En la gráfica 9. Se nota claramente que hay una disminución pronunciada del pH, y este no logra a estabilizarse, es evidente que en la concentración de 13.5% de esta especie comparada con las otras 2 especies sufrió un descenso de pH más rápido en donde pudo verse afectado el microorganismo y reteniendo la producción de Etanol.

4,1

4,3

4,5

4,7

4,9

5,1

0 10 20 30 40 50 60

pH

HORAS

D.trifida 10,5%

D.trifida 13,5%

D.trifida15%

69

Gráfica 9. Comportamiento del pH durante la fermentación de D. Rotundata

Fuente: los autores del proyecto 4.5 Lectura de ºBrix.

4.5.1 Lectura de ºBrix para Dioscorea Alata. En la gráfica 10. Se ilustra el comportamiento de los ºBrix de las 3 concentraciones (10,5%, 13,5% y 15% m/v) de la especie D. Alata donde se nota una disminución progresiva de los ºBrix a lo largo del proceso fermentativo, los valores finales en cada una de las concentraciones (10.5%, 13.5 y 15%) fueron 0.80, 1.12 y 1,13 respectivamente. Se destaca que la concentración de 10.5% presento la mayor disminución 0.80 indicando que la fermentación fue completa.

4,10

4,30

4,50

4,70

4,90

5,10

0 10 20 30 40 50 60

pH

HORAS

D. Rotundata 10,5%

D. Rotundata 13,5%

D. Rotundata 15%

70

Gráfica 10. Comportamiento del descenso de ºBrix durante la fermentación de D. Alata.

Fuente: los autores del proyecto

En el anexo B se presentan los datos correspondientes a los ºBrix en la etapa de fermentación para la especie Dioscorea Alata. 4.5.2 Lectura de ºBrix para Dioscorea Trífida La concentración 13,5% presento un comportamiento irregular donde a partir de las 30 horas los ºBrix no hubo variación considerable, pero a las 44 horas descendió nuevamente para finalizar así el proceso con un valor de 2.2 ºBrix, el cual es el valor más pequeño de esta especie, lo cual indica que su fermentación fue completa.

-2,00

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

14,00

16,00

0 10 20 30 40 50 60

°Bri

x

HORAS

D. Alata 10,5%

D. Alata 13,5%

D. Alata 15%

71

Gráfica 11. Comportamiento del descenso de ºBrix durante la fermentación de D. Trífida

Fuente: los autores del proyecto En el anexo C se presentan los datos correspondientes a los ºBrix en la etapa de fermentación para la especie Dioscorea. 4.5.3 Lectura de ºBrix para Dioscorea Rotundata. La siguiente grafica 12. Muestra que el comportamiento de esta especie es similar al de las otras 2 especies, con disminución a lo largo del proceso y refleja para las concentraciones de trabajo (10.5, 13.5 y 15% m/v) valores similares destacando que la concentración de 10% presento siempre los valores más bajos, esto es gracias a que el alcohol genera modificaciones en la organización y permeabilidad de las células presentes por concentración, afectando su composición lipídica y el funcionamiento de proteínas de membrana involucradas en el transporte de azúcares y aminoácidos51.

51

AGUILERA, A.; BENITEZ, T. 1986.Role of mitochondria in ethanol tolerance of Saccharomyces

cerevisiae. Arch. Microbiol. Vol 142. pp 389–392.

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

14,00

16,00

0 10 20 30 40 50 60

°Bri

x

HORAS

D.trifida 10,5%

D.trifida 13,5%

D.trifida15%

72

Gráfica 12. Comportamiento del descenso de ºBrix durante la fermentación de D. Rotundata.

Fuente: los autores del proyecto

En el anexo D se presentan los datos correspondientes a los ºBrix en la etapa de fermentación para la especie Dioscorea Rotundata. 4.6 Lectura de Azucares Reductores en la fermentación

4.6.1 Lectura de Azucares Reductores para Dioscorea Alata. En la gráfica 13 se ilustra como fue el consumo de azucares reductores para la especie D. Alata, el descenso de azucares en general fue muy similar, se observa que la concentración 10,5% disminuyo rápidamente con un consumo notable de azúcar. A las 28 horas presentaba una caída de 9,31 g/L y a las 50 horas un valor de 3,12 g/L siendo este ultimo el valor más bajo y también se evidencia que la concentración de 15% presento a las 50 horas menos consumo de azucares reductores por lo tanto se espera que tenga una menor producción de etanol en comparación a las demás variedades. Los valores finales de concentración de azucares reductores fue de 3.12g/L, 6.52g/L y 3,75g/L para 10.5%, 13.5% y 15% respectivamente.

-2,00

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

14,00

16,00

18,00

20,00

0 10 20 30 40 50 60

°BR

IX

HORAS

D. Rotundata 10,5%

D. Rotundata 13,5%

D. Rotundata 15%

73

Gráfica 13. Comportamiento del descenso de azucares reductores durante la fermentación de D. Alata

Fuente: los autores del proyecto

Los datos correspondientes al consumo de azucares se encuentra en el anexo B, evidenciando la disminución de esta y que los valores finales de las concentraciones 10.5% m/v y 15% m/v son los de menor valor, aunque quien presento mayor producción de etanol es la concentración de 13.5% 4.6.2 Lectura de azucares reductores para D. Trífida En la gráfica 14, se ilustra el consumo de glucosa para la especie D., y se observa un mayor consumo en las concentraciones de 13% y 15% m/v un comportamiento similar, al finalizar el proceso de fermentación, el valor final para estas dos concentraciones fue de 2,16g/L y 2,60g/L que indica eficiencia en la fermentación.

-10,00

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

90,00

0 10 20 30 40 50 60

[AR

T] g

/L

HORAS

D. Alata 10,5%

D. Alata 13,5%

D. Alata 15%

74

Gráfica 14. Comportamiento del descenso de azucares reductores durante la fermentación de D. Trífida

Fuente: los Autores del proyecto

En el anexo C se encuentra los datos correspondientes al consumo de Azucares evidenciando la disminución de la concentración de azucares reductores a lo largo de la fermentación y que los valores finales de las concentraciones 13.5% m/v y 15% m/v existe poca diferencia. 4.6.3 Lectura de azucares reductores para Dioscorea Rotundata.

A continuación en la gráfica 15, se ilustra el comportamiento del consumo de glucosa para Dioscorea rotundata en donde se puede inferir que es similar al de las otras 2 especies, don la diferencia que al final el valor más bajo lo obtuvo la concentración de 10,5% con 2,22 g/L. Los valores finales de concentración de glucosa fueron 5,89g/L y 4,34g/L para las concentraciones restantes 13,5% y 15% m/v respectivamente.

-10,00

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

90,00

0 10 20 30 40 50 60

[AR

T] g

/L

HORAS

D.trifida 10,5%

D.trifida 13,5%

D.trifida15%

75

Gráfica 15. Comportamiento del descenso de azucares reductores durante la fermentación de D. Rotundata

Fuente: los autores del proyecto

En el anexo D se presenta los datos correspondientes a la concentración de glucosa en el tiempo, para el proceso de fermentación de la especie Dioscorea Rotundata. 4.7 Conteo de microorganismos Los datos para cada una de las variedades se encuentran en los anexos B. C, y D del documento. 4.7.1 Conteos de microorganismos para Dioscorea Alata. La grafica muestra el comportamiento de la levadura durante el proceso de fermentación para el D. Alata en sus tres concentraciones (10.5%, 13.5% y 15%), durante el inicio del proceso se observa que el crecimiento del microorganismo es lento y pequeño, esto es debido a que la levadura está reconociendo y se está adaptando al medio de donde debe tomar los nutrientes necesarios para desarrollarsu proceso productivo, esto corresponde del tiempo 0 al 10, aquí la célula reconoció al alimento enseguida y empezó a crecer por lo tanto no hubo fase de adaptación. como se puede observar en la gráfica 16.

-20,00

0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

0 10 20 30 40 50 60

[AR

T] g

/L

HORAS

D. Rotundata 10,5%

D. Rotundata 13,5%

D. Rotundata 15%

76

Gráfica 16. Comportamiento del crecimiento de biomasa durante la fermentación de D. Alata

Fuente: los autores del proyecto

Durante este proceso también podemos observar una segunda fase en donde se origina un crecimiento exponencial para las tres concentraciones, en donde se puede apreciar que la concentración de D. Alata 13.5% es la primera que comienza con el crecimiento con 3,16E+6 UFC/ml, para esta concentración el crecimiento total va desde 1,00E+06 hasta 1.32E+07 UFC/ml. A las 44 horas se ve un descenso en la concentración de células que puede ser el resultado de la formación de metabolitos secundarios durante el proceso. También se puede destacar que el mayor crecimiento se produce en la concentración de 15% con un valor de 1.4E+07 UFC/ml. Para esta concentración el crecimiento va desde 1.40E+06/ml hasta 1,40E+07/ml. Esta variedad de ñame fue la que obtuvo la menor formación de microorganismo durante el proceso. 4.7.2 conteos de microorganismos para Dioscorea Trífida. En la primera etapa la adaptación del microorganismo fue similar al de la del D. Alata, para esta especie la levadura demoro un poco más tiempo en adaptarse al medio, sin embargo la fase lag para esta especie es pequeña y la levadura toma acción y en la segunda fase se produce un incremento para las concentraciones

1,00E+05

2,10E+06

4,10E+06

6,10E+06

8,10E+06

1,01E+07

1,21E+07

1,41E+07

1,61E+07

1,81E+07

0 10 20 30 40 50 60

UFC

HORAS

D. Alata 10,5%

D. Alata 13,5%

D. Alata 15%

77

de 10.5 y 15 % en donde el crecimiento fue constante, para la concentración de 13.5% en las primeras 10 horas tuvo una etapa de adaptación normal, pero a las 20 horas se produjo un descenso en la concentración de las levaduras hasta 1.19E+06 UFC/ml esto se puede deber a que en el momento de tomar las muestras no hubo un rígido control y haya habido un aumento en la cantidad de oxigeno disminuyendo la actividad de la levadura e impidiendo su crecimiento normal, aunque posteriormente se produjo un incremento en la producción de levadura para esta concentración y finalmente termino con 1.77E+07 UFC/ml como se puede ver en la gráfica 17. . Gráfica 17. Comportamiento del crecimiento de biomasa durante la fermentación de D. Trífida

Fuente: los autores del proyecto El crecimiento total de la concentración 10.5% fue desde 1,18E+06/ml hasta 1,68E+07 UFC/ml, para la concentración de 13.5% fue desde 2,31E+06/ml hasta 1,77E+07 UFC/ml y finalmente la concentración de 15% desde 4,50E+06/ml hasta 2,02E+07 UFC/ml, siendo este último el de mayor crecimiento para esta especie. 4.7.3 conteos de microorganismos para Dioscorea Rotundata. El crecimiento para esta especie en la primera fase fue pequeño pero acelerado ya que la levadura tuvo una muy buena adaptación al medio, prácticamente no hubo fase lag con esta especie. Esto origino un incremento constante de la producción de biomasa este medio en general para las tres concentraciones como se ve en la gráfica 18.

-3,00E+06

0,00E+00

3,00E+06

6,00E+06

9,00E+06

1,20E+07

1,50E+07

1,80E+07

2,10E+07

2,40E+07

0 10 20 30 40 50 60

UFC

HORAS

D.trifida 10,5%

D.trifida 13,5%

D.trifida15%

78

Gráfica 18. Comportamiento del crecimiento de biomasa durante la fermentación de D. Rotundata

Fuente: los autores del proyecto

Durante la fase logarítmica se logró un buen rendimiento en la producción de biomasa donde se obtuvieron los siguientes crecimientos, para la concentración de 10,5% 1,30E+06 UFC/ml hasta 1,76E+07 UFC/ml, para la de 13,5% de 5,35E+06 UFC/ml hasta 1,95E+07 UFC/ml y para la de 15% 8,00E+06 hasta 2,46E+07UFC/ml. Esta especie fue la que genero mayor producción de Biomasa durante el proceso de fermentación con la concentración 15% con un valor de 2,46E+07 UFC/ml. 4.8 Producción de etanol 4.8.1 Producción de etanol de Dioscorea Alata. La producción de etanol durante el tiempo de Fermentación para las concentraciones de harina de ñame del 10.5%, 13.5% y 15%M/v de la variedad D. Alata se representan en la gráfica, observándose una Concentración final de etanol de 3,22% v/v; 3,64% v/v y 3,27% v/v respectivamente, observándose la producción de alcohol a partir de las 4 horas hasta alcanzar un valor máximo a las 50 horas para las tres concentraciones de D. Alata donde se observa que las tres tienen valores muy similares. Sin embargo la que mayor valor obtuvo fue la D. Alata 13,5% con 3,64% v/v.

3,00E+05

4,30E+06

8,30E+06

1,23E+07

1,63E+07

2,03E+07

2,43E+07

2,83E+07

0 20 40 60

UFC

HORAS

D. Rotundata 10,5%

D. Rotundata 13,5%

D. Rotundata 15%

79

Gráfica 19. Comportamiento de la producción de alcohol durante la fermentación de D. Alata

Fuente: los autores del proyecto

La grafica 19.Muestra el incremento de la producción de etanol durante el proceso de fermentación con Saccharomyces cerevisiae, en donde esta especie obtuvo los menores porcentajes de alcohol de las tres variedades presentadas para el estudio. La grafica 20. Ilustra la diferencia de medias para la variedad D. Alata, el análisis de varianza realizado para esta especie dio como resultado un valor de p> a 0,05 lo que indica que no existen diferencias significativas entre las medias de alcohol de un nivel de concentraciones a otro.

-1,00

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

0 10 20 30 40 50 60

%V

/V

HORAS

D. Alata 10,5%

D. Alata 13,5%

D. Alata 15%

80

Grafica 20. Gráfico de medias, variedad Dioscorea Alata

Fuente: los autores

4.8.2 Producción de Etanol de Dioscorea Trífida. La producción de alcohol para esta especie se produjo entre el tiempo 4 y 50 de fermentación en donde la concentración de 15% tuvo el menor valor con 3,4% v/v Lo cual sedebe a un menor consumo de los Azucares reductores por parte de Saccharomyces cerevisiae. Las concentraciones 13,5% y 10,5%m/v dieron los mayores resultados para esta variedad con 4,43% v/v y 3,53% v/v, superando con la de 13,5% a las concentraciones obtenidas por D. Alata. En La grafica 21 muestra el comportamiento del D. Trífida durante la producción de alcohol y no se observa mucha variación en la producción de etanol, los mejores resultados se presentó en la concentración de 13,5% para esta especie.

81

Gráfica 21. Comportamiento de la producción de alcohol durante la fermentación de D. Trífida

Fuente: los autores

La grafica 22. Ilustra la diferencia de medias para la variedad D. Trífida, el análisis de varianza realizado para esta especie dio como resultado un valor de p> a 0,05 lo que indica que no existen diferencias significativas entre las medias de alcohol de un nivel de concentraciones a otro.

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

0 10 20 30 40 50 60

%V

/V

HORAS

D.trifida 10,5%

D.trifida 13,5%

D.trifida15%

82

Gráfica 22. Gráfico de medias, de la variedad Dioscorea Trífida

Fuente: los autores 4.8.3 Producción de etanol de Dioscorea Rotundata. En la gráfica 23, se observa como aumenta la concentración de alcohol a partir de las 4 horas hasta alcanzar un punto máximo a las 50 horas para las tres concentraciones de D. Rotundata donde el menor valor lo obtiene 10.5% m/v con un 3,62% v/v, este valor es mayor al valor obtenido por la concentración 13.5%de los datos obtenidos por la variedad D. Alata. Las concentraciones 15% m/v y 13.5%m/v presentaron los mejores resultados, esto es de 4,55% v/v y 3,7% v/v respectivamente, con lo que se puede asumir que la concentración más rentable para el proceso de obtención de alcohol es la de 15%m/v de D. Rotundata. En la grafica

83

Gráfica 23. Comportamiento de la producción de alcohol durante la fermentación de D. Rotundata

Fuente: los autores del proyecto

La grafica 24 ilustra la diferencia de medias para la variedad D. Rotundata, el análisis de varianza realizado para esta especie dio como resultado un valor de p> a 0,05 lo que indica que no existen diferencias significativas entre las medias de alcohol de un nivel de concentraciones a otro. Gráfica 24. Gráfico de medias, para la variedad Dioscorea Rotundata

Fuente: los autores

-1,00

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

0 10 20 30 40 50 60

%V

/V

HORAS

D. Rotundata 10,5%

D. Rotundata 13,5%

D. Rotundata 15%

84

4.9 Rendimientos del proceso Para calcular el rendimiento del proceso se procede de la siguiente manera de

acuerdo a la ecuación

entonces

( )

Yp/s: Rendimiento producto- sustrato P: concentración de etanol (g/L) S: concentración de glucosa (g/L) Hay que tener en cuenta que al iniciar el proceso de fermentación en P0 no hay producción de etanol. Esta ecuación se aplicó para cada una de las especies y para las 3 concentraciones de trabajo. 4.9.1 Rendimiento para Dioscorea Alata Concentración 10.5% m/v

( ) Remplazando los valores

( )

( )

Concentración 13,5% m/v

( )

( )

Concentración 15% m/v

( )

( )

4.9.2 Rendimiento para Dioscorea Trífida Concentración 10.5% m/v

( ) Remplazando los valores

( )

( )

Concentración 13,5% m/v

( )

( )

85

Concentración 15% m/v

( )

( )

4.9.3 Rendimientos para Dioscorea Trífida Concentración 10.5% m/v

( ) Remplazando los valores

( )

( )

Concentración 13,5% m/v

( )

( )

Concentración 15% m/v

( )

( )

De acuerdo al cálculo de los rendimientos de cada una de las 3 especies a las diferentes concentraciones de trabajo (10.5%, 13.5% y 15%) m/v la concentración que presento mayor rendimiento fue la concentración de 15% con 49.5% que representa un 96.8% del rendimiento teórico, lo cual supera el rendimiento alcanzado a nivel industrial que varía entre 87 y 95%, siendo el rendimiento teórico o estequiométrico 51.1%52 4.10 ANÁLISIS ESTADÍSTICO Para el análisis estadístico de esta investigación se utilizaron como herramientas tecnológicas los software Statgraphics 5.1 y Statistical Package for the Social Sciences (SPSS), el primero para realizar el análisis de varianza (ANOVA)en donde se trabajó con un nivel de significancia o error estadístico del 5% (0,05) que permitió determinar si los datos arrojados en la investigación existen o no variaciones significativas de las variables que interesan a los investigadores, se realizaron 3 análisis de varianza, es decir uno por cada especie.

52VÁZQUEZ, H.J. y DACOSTA, O. Fermentación alcohólica: Una opción para la producción de

energía renovable a partir de desechos agrícolas. Ingeniería, investigación y tecnología. v.8 n.4 México oct./dic. 2007

86

El análisis de varianza en cada una de las especies determino que no hay estadísticamente diferencias significativas entre las medias de etanol de una concentración a otra (10.5%, 13.5% y 15%), también se determino con el análisis de varianza que la variedad que ofrece los mejores resultados en cuanto a la producción de etanol es la Dioscorea Trífida y con las concentraciones de 10.5 y 13.5 %m/v, ya que con la concentración de 15%m/v se desaprovecha mucha materia prima y no hay diferencias significativa en los resultados que con las otras dos concentraciones, en el anexo G se encuentran los resultados del ANOVA de las 3 variedades. El segundo software se utilizó para contrastar las hipótesis propuestas en el capítulo 3 en donde la Hipótesis nula afirmaba que la concentración de etanol es igual a 10% y la hipótesis alternativa es diferente al 10%; para comprobar las hipótesis fue necesario realizar inicialmente la prueba no paramétricas Kolmogorov-Smirnov para una muestra que se busca comprobar si los datos proviene de una distribución normal y así aplicar la prueba T de Student que es la prueba que permite el contraste de las Hipótesis, la primera prueba dio positivo, es decir que los datos si provienen de una distribución normal y si se puede aplicar la prueba T de Student. La prueba se realizó a las 3 especies y a cada una de las concentraciones, para un total de 9 pruebas y se aceptó la hipótesis alternativa en las 9 pruebas, es decir, que la concentración es diferente de 10%. En el anexo H se reportan los resultados de las pruebas no paramétricas Kolmogorov-Smirnov y de las pruebas T de Student.

87

5 CONCLUSIONES

Se obtuvo etanol a partir de tres variedades de ñame (Dioscorea Alata, Dioscorea Trífida y Dioscorea Rotundata) con valores máximos de concentración de 4.55%v/v a la concentración de 15%m/v, 4.43%v/v a la concentración de 13.5%m/v y 3.66%v/v a la concentración de 13.5%m/v, en las variedades Dioscorea Rotundata, Dioscorea Trífida y Dioscorea Alata respectivamente.

Durante la etapa de hidrolisis enzimática (licuefacción y sacarificación) los azucares reductores y ºBrix aumentan significativamente, alcanzándose máximos valores al final del proceso de 78.82g/L en concentración de 15%m/v en la variedad Dioscorea Rotundata, 73.84g/L en la concentración de 13.5% en la variedad Dioscorea Trífida; mientras que para la variedad Dioscorea Alata e obtuvieron valores de 61.68g/L a la concentración de 13.5%m/v. Al calcular los parámetros cinéticos, los valores mínimos obtenidos de azucares reductores al final de la fermentación fueron de 4.34g/L para la concentración de 15% en la variedad Dioscorea Rotundata, 9.18g/L en la concentración de 13.5% m/v y para la variedad Dioscorea Trífida valores mínimos 3.32g/L y el crecimiento de microorganismos presento valores máximos al final de la etapa exponencial en la variedad Dioscorea Rotundata de 1.90x107UFC/ml en la concentración de 15%m/v, en la variedad Dioscorea Trífida, fue de 1.69x107UFC/ml en la concentración de 15%y en la variedad Dioscorea Alata, el valor fue de 1.25x107UFC/ml. Es posible obtener bioetanol con cualquier de las especies de ñame (Dioscorea Rotundata, Dioscorea Alata y Dioscorea Trífida) utilizadas en esta investigación, cualquiera de las concentraciones utilizadas. .

88

6 RECOMENDACIONES

Para este tipo de investigación es recomendable el empleo de la enzima Pectinex ultra, antes de usar la enzima alfa amilasa, para complementar y que haya una ataque oportuno sobre el almidón en la hidrolisis y así obtener mayores resultados y altas concentración en cuanto a la conversión de azucares reductores que garantizan mayor producción de alcohol. Se recomienda reducir el tiempo de residencia de la enzima alfa amilasa debido a que esta trabaja entre 88 a 95ºC el mantener esta temperatura por mucho tiempo implica altos costos de combustible. Para la cuantificación de etanol es importante emplear el método cromatografía de gases debido a que es un método más exacto y representa mayor confiabilidad en los resultados. Evaluar los rendimientos durante el proceso de obtención de alcohol usando otro tipo de microorganismos como las bacterias Zymomonas mobilisque transforman la glucosa en etanol con un rendimiento del 5 al 10 % mayor que la mayoría de las levaduras. En cuanto a la celulosa liberada (cascara del ñame) está también se puede utilizar para la producción de etanol o de compostaje y así aprovechar los residuos de cualquier proceso en donde se trabaje con ñame, este estudio se recomienda para futuros investigadores en donde le darían un valor agregado a este promisorio tubérculo. Se recomienda trabajar con la especie Dioscorea Trífida debido a que presento un comportamiento estable durante toda la investigación, además hay que tener en cuenta que este proyecto es un estudio preliminar y se desea que quede como línea base para futuras investigaciones.

89

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WALKER J.M. E.B. Gingold. Biotecnología Molecular, , Edición, Acribia, S.A. Pág. 5-6

92

ANEXOS

93

ANEXO A. SUPERFICIE COSECHADA, PRODUCCIÓN Y RENDIMIENTO DEL CULTIVO DE ÑAME EN COLOMBIA AÑOS 1997 – 2008

94

ANEXO B. FICHAS TÉCNICAS DE LAS ENZIMAS Α AMILASA Y AMILOGLUCOSIDASA

α Amilasa

Aplicaciones

cerveza, industria de fermentaciones, vitaminas, aminoácidos, antibióticos

industria textil y adhesivos

Apariencia: liquido no viscoso de grado alimenticio

Características Color: marrón oscuro

Densidad : 1,20 -1,25 g/ml

Propiedades

Actividad: 120 KNU/g (1 KNU: cantidad de enzima que rompe 5,26 g de almidón Por hora, avalado por el método estándar de Novozymes A/S).

PH: 6,5

Parámetros óptimos Temperatura 90-105 °C

Calcio 50-70 ppm

Amiloglucosidasa

Industria alimenticia: producción de glucosa y fructosa

Aplicaciones industria del papel: protección contra daños mecánicos

Industria de la Cerveza: producción de cerveza clara

Apariencia: liquido no viscoso de grado alimenticio

Características Color: marrón

Densidad : 1,20 g/ml

Propiedades

Actividad: 1 unidad Novo Amiloglucosidasa (AGU): cantidad de la enzima que

Hidroliza 1µmol de maltosa/min a condiciones estándar.

PH: 4.5

Parámetros óptimos Temperatura 55 - 60 °C

95

ANEXO C. RESULTADOS PARA LA ESPECIE D. ALATA.

A continuación se registraron los resultados obtenidos durante la etapa de hidrolisis enzimática y de la fermentación para la especie Dioscórea Alata a. Azucares reductores en la hidrolisis enzimática

Tiempo (H)

α Amilasa

Tiempo (H)

AMG

Concentraciones Concentraciones

10,5% 13,5% 15% 10,5% 13,5% 15%

0 4,32 16,82 1,57 25 35,02 53,82 47,32

4 7,47 34,32 12,52 26 42,32 61,32 54,32

10 15,32 36,62 32,52 27 48,27 66,82 58,32

18 22,82 42,32 41,72 28 64,12 69,68 61,32

24 33,52 51,52 45,32

b. Comportamiento De Grados ºBrix Durante La Hidrólisis Enzimática.

Tiempo (H)

α Amilasa

Tiempo (H)

AMG

Concentraciones Concentraciones

10,5% 13,5% 15% 10,5% 13,5% 15%

0 0,7 0,9 1,0 25 5,4 7,6 8,9

4 1,3 1,4 2,2 26 6,7 8,3 10,3

10 2,6 3,7 5,0 27 7,0 8,9 10,9

18 4,1 6,2 7,5 28 7,1 9,2 11,2

24 4,9 7,1 8,2

c. Comportamiento De pH Durante El Proceso De Fermentación De D. Alata.

Tiempo (H)

D. Alata

Concentraciones

10,5% 13,5% 15%

0 4,97 5,06 5,06

4 4,84 4,90 4,96

8 4,70 4,79 4,84

19 4,55 4,64 4,74

23 4,44 4,49 4,56

28 4,31 4,36 4,41

44 4,21 4,25 4,29

50 4,13 4,11 4,16

96

d. Descenso de Azucares Reductores durante el proceso de Fermentación de D. Alata

Tiempo (H)

D. Alata

Concentraciones

10,5% 13,5% 15%

0 65,32 70,32 60,32

4 50,81 61,74 50,30

8 42,22 48,34 45,08

19 29,17 36,27 35,27

23 21,12 29,73 21,28

28 9,31 18,64 12,98

44 6,22 8,28 7,52

50 3,12 6,52 3,75

e. Descenso de Grados ºBrix durante el proceso de Fermentación de D. Alata.

Tiempo (H)

D. Alata

Concentraciones

10,5% 13,5% 15%

0 7,3 9,5 12,3

4 6,8 8,8 11,7

8 6,0 8,3 11,0

19 4,6 7,3 9,1

23 4,2 5,5 8,5

28 2,9 4,1 5,6

44 1,4 2,1 4,0

50 0,7 0,8 1,1

f. Crecimiento de Biomasa durante el proceso de Fermentación de D. Alata.

Tiempo (H)

D. Alata

Concentraciones

10,5% 13,5% 15%

0 8,00E+05 1,00E+06 1,40E+06

4 1,00E+06 2,00E+06 1,56E+06

8 1,10E+06 3,16E+06 1,50E+06

19 4,50E+06 6,90E+06 9,54E+06

23 6,80E+06 1,04E+07 1,25E+07

28 8,80E+06 9,69E+06 1,33E+07

44 1,15E+07 1,31E+07 1,36E+07

50 7,00E+06 1,32E+07 1,40E+07

97

g. Producción de Alcohol durante el proceso de Fermentación de D. Alata.

Tiempo (H)

D. Alata

Concentraciones

10,5% 13,5% 15%

0 0,0 0,0 0,0

4 1,5 2,1 2,3

8 1,8 2,4 2,5

19 2,1 2,6 2,8

23 2,6 3,0 3,0

28 3,0 3,1 3,4

44 3,1 3,4 3,5

50 3,2 3,5 3,7

98

ANEXO D. RESULTADOS PARA LA ESPECIE D. TRÍFIDA.

A continuación se registraron los resultados obtenidos durante la etapa de hidrolisis enzimática y de la fermentación para la especie Dioscórea Trífida

a. Resultados de la Hidrólisis Enzimática Para la D. Trífida

Tiempo (H)

α Amilasa

Tiempo (H)

AMG

Concentraciones Concentraciones

10,5% 13,5% 15% 10,5% 13,5% 15%

0 5,85 14,32 2,5 25 48,82 53,32 48,62

4 8,52 38,32 20,9 26 55,32 58,32 52,82

10 19,82 42,32 35,8 27 61,32 66,32 58,32

18 25,62 47,32 41,4 28 67,42 73,84 67,18

24 44,42 51,32 45,8

b. Comportamiento de Grados Brix durante la Hidrólisis enzimática de D. Trífida.

Tiempo (H)

α Amilasa

Tiempo (H)

AMG

Concentraciones Concentraciones

10,5% 13,5% 15% 10,5% 13,5% 15%

0 0,9 1,2 1,6 25 6,2 8,5 10,6

4 1,5 1,9 2,8 26 7,0 9,2 11,4

10 3,6 4,3 6,1 27 7,9 9,9 12,0

18 4,8 7,1 8,3 28 8,6 10,9 13,0

24 5,5 7,8 9,2

c. Comportamiento de pH durante el proceso de Fermentación de D. Trífida.

Tiempo (H)

D. Trífida

Concentraciones

10,5% 13,5% 15%

0 4,66 5,02 4,87

4 4,58 4,93 4,75

8 4,46 4,88 4,67

19 4,33 4,75 4,55

23 4,29 4,61 4,43

28 4,25 4,53 4,27

44 4,21 4,41 4,23

50 4,18 4,24 4,21

99

d. Descenso de Azucares Reductores durante el proceso de Fermentación de D. Trífida.

Tiempo (H)

D. Trífida

Concentraciones

10,5% 13,5% 15%

0 68,82 74,52 68,94

4 62,05 63,81 57,75

8 48,68 52,55 46,83

19 43,51 44,66 41,15

23 34,19 36,12 34,57

28 26,31 23,60 20,31

44 14,83 12,08 11,27

50 9,75 2,16 2,60

e. Descenso de Grados ºBrix durante el proceso de Fermentación de D.

Trífida.

Tiempo (H)

D. Trífida

Concentraciones

10,5% 13,5% 15%

0 8,8 11,1 13,1

4 8,4 10,7 12,4

8 7,7 10,0 12,2

19 5,9 8,1 10,2

23 4,9 5,5 8,7

28 4,3 4,5 6,2

44 3,1 4,0 3,2

50 2,4 2,2 2,6

100

f. Crecimiento de Biomasa durante el proceso de Fermentación D. Trífida.

Tiempo (H)

D. Trífida

Concentraciones

10,5% 13,5% 15%

0 1,18E+06 2,31E+06 4,50E+06

4 1,51E+06 2,59E+06 4,57E+06

8 1,61E+06 2,79E+06 6,61E+06

19 7,60E+06 1,19E+06 1,30E+07

23 1,09E+07 1,45E+07 1,69E+07

28 1,45E+07 1,65E+07 1,86E+07

44 1,54E+07 1,76E+07 1,91E+07

50 1,68E+07 1,77E+07 2,02E+07

g. Producción de Alcohol durante el proceso de Fermentación de D. Trífida.

Tiempo (H)

D. Trífida

Concentraciones

10,5% 13,5% 15%

0 0,0 0,0 0,0

4 1,9 2,4 2,7

8 2,2 2,7 3,1

19 2,7 2,7 3,5

23 3,0 3,3 3,7

28 3,2 3,5 3,9

44 3,3 3,7 4,0

50 3,5 3,9 4,2

101

ANEXO E. RESULTADOS PARA LA ESPECIE D. ROTUNDATA.

A continuación se registraron los resultados obtenidos durante la etapa de hidrolisis enzimática y de la fermentación para la especie Dioscorea Rotundata a. Resultados de la Hidrólisis Enzimática Para la D. Rotundata.

Tiempo (H)

α Amilasa

Tiempo (H)

AMG

Concentraciones Concentraciones

10,5% 13,5% 15% 10,5% 13,5% 15%

0 2,82 11,82 21,37 25 54,22 58,17 63,32

4 7,02 34,62 45,82 26 63,32 67,82 70,32

10 14,07 40,32 53,82 27 66,77 69,22 71,07

18 31,72 48,32 56,32 28 67,57 71,32 78,82

24 50,92 53,62 59,82

b. Comportamiento de Grados Brix durante la Hidrólisis enzimática de D. Rotundata.

Tiempo (H)

α Amilasa

Tiempo (H)

AMG

Concentraciones Concentraciones

10,5% 13,5% 15% 10,5% 13,5% 15%

0 1,5 1,8 2,4 25 10,7 12,6 13,9

4 2,9 4,2 7,8 26 11,5 13,4 14,4

10 6,2 8,6 10,6 27 12,0 14,1 15,1

18 8,7 10,0 11,3 28 12,3 14,7 15,7

24 9,4 11,1 12,0

102

c. Comportamiento de pH durante el proceso de Fermentación de D. Rotundata.

Tiempo (H)

D. Rotundata

Concentraciones

10,5% 13,5% 15%

0 4,97 4,7 5,04

4 4,81 4,63 4,98

8 4,757 4,55 4,84

19 4,607 4,47 4,72

23 4,521 4,41 4,66

28 4,421 4,36 4,58

44 4,411 4,29 4,46

50 4,281 4,21 4,23

d. Descenso de Azucares Reductores durante el proceso de Fermentación

de D. Rotundata.

Tiempo (H)

D. Rotundata

Concentraciones

10,5% 13,5% 15%

0 67,32 70,27 79,87

4 50,92 60,05 65,32

8 47,22 51,18 51,86

19 46,12 44,82 41,81

23 43,72 30,81 33,15

28 31,07 23,76 26,76

44 25,32 13,04 16,30

50 2,22 5,89 4,34

103

e. Descenso de Grados ºBrix durante el proceso de Fermentación de D. Rotundata.

Tiempo (H)

D. Rotundata

Concentraciones

10,5% 13,5% 15%

0 12,5 15,2 16,0

4 11,9 14,9 15,4

8 11,4 14,2 14,7

19 9,7 12,2 12,8

23 8,3 9,8 12,2

28 7,6 8,5 9,3

44 5,2 7,0 7,7

50 1,2 2,4 3,3

f. Crecimiento de Biomasa durante el proceso de Fermentación D. Rotundata.

Tiempo (H)

D. Rotundata

Concentraciones

10,5% 13,5% 15%

0 1,30E+06 5,35E+06 8,00E+06

4 1,49E+06 6,37E+06 9,04E+06

8 4,10E+06 7,04E+06 1,06E+07

19 1,10E+07 1,30E+07 1,58E+07

23 1,41E+07 1,60E+07 1,90E+07

28 1,56E+07 1,80E+07 2,00E+07

44 1,58E+07 1,88E+07 2,30E+07

50 1,76E+07 1,95E+07 2,46E+07

104

g. Producción de Alcohol durante el proceso de Fermentación de D. Rotundata.

Tiempo (H)

D. Rotundata

Concentraciones

10,5% 13,5% 15%

0 0,0 0,0 0,0

4 1,7 2,0 2,4

8 2,0 2,3 3,0

19 2,5 2,6 3,1

23 2,7 3,0 3,4

28 3,2 3,4 4,0

44 3,4 3,9 4,4

50 3,6 4,2 4,9

105

ANEXO F. AZUCARES REDUCTORES (METODO DEL DNS)

Referencia: MILLER, G.L. 1959. Use of dinitrosalicylieachlreagattforDetermination of reducing sugar.AnalyeChen, 31:426429.(Fer. Labo MT205) Fundamento: El ácido 3.5, dinitrosalicilico en presencia del calor se reduce un color amarillo café. La lectura se realiza a 575 nm. Interferencias,. Ventajas y desventajas: Altas concentraciones de proteínas interfieren en la determinación de los Azúcares reductores. Otra desventaja es el costo de los reactivos Principalmente en del ácido 3,5 dinitrosalicilico y fenol. Una de las ventajas de este método es que el calor final desarrollado es estable hasta 24 horas. Además de que es un método sencillo y rápido.

Curva estándar Establecer una escala estándar de 0 a 1mg/cm 3 dentro de una serie de tubos de ensayo introducir: 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 y 1 cm 3 de la solución estándar y Completar a 1 cm 3 con agua destilada.

Materiales y equipo

Tubos de ensayo con tapa

Pipeta de 1ml.

Pipeta de 5ml.

Pipeta o distribuidor automático

Matraz aforado de 100ml o 1000ml

Frasco color ámbar

Macerador de tejidos Potter

Espectrofotómetro para leer a 575 nm

Balanza analítica

Agitador de tubos (vórtex)

Centrifuga

Baño de María

Baño de Hielo

Reactivos

Reactivos

1 g Ácido 3.5 dinitrosalicílico

1 g Hidróxido de sodio (NaOH)

0.5 g Sulfito de sodio anhidro

0.2 Fenol

100cm 3 Agua destilada C.B.P.

106

Cálculos Con los valores obtenidos de la curva estándar de D.O. se hace una regresión lineal, sacar el coeficiente de correlación (el cual no debe ser menor a 0,99), la pendiente y la ordenada al origen. Sustituir estos valores en la ecuación de la recta:

( ) Dónde: Y = absorbancia, M = pendiente. X = concentración (mg de azúcar/1) b = ordenada al origen. Reordenando la ecuación (1) en términos de X, tenemos:

( )

Sustituir las lecturas que se obtengan en la ecuación (2) para conocer X concentración de azúcares.

Curva de Calibración

Tubo concentracion

(Mg de azucar/1)

0 0 1 0

1 0,2 0,8 200

2 0,4 0,6 400

3 0,6 0,4 600

4 0,8 0,2 800

5 1 0 1000

Muestra Agua destilada ml

107

ANEXO G. MÉTODO COLORIMÉTRICO DICROMATO DE POTASIO

EVALUACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE ETANOL (Método Colorimétrico de Dicromato de potasio). Para cuantificar la cantidad de etanol producido en la fermentación se realizara aplicando el Método Colorimétrico de Dicromato de Potasio. PROCEDIMIENTO: Se colocan 4 ml de solución oxidante (mezcla formada por 4.165 g de Dicromato de potasio y 250 ml de ácido sulfúrico, aforado con agua destilada a un litro) en tubos de ensayo; luego se adicionan 2 ml de solución saturada de carbonato de potasio gota a gota por las paredes del tubo hasta que cese el burbujeo y agitar por 10 segundos, seguidamente agregan 2 ml de la muestra a analizar, previamente centrifugada a 3000rpm durante 20 minutos y diluida al 5% v/v con agua destilada. Después, todos los tubos se agitan a 1500 rpm durante 10 segundos. Para homogenizar la solución se calienta en un baño de maría termostato a una temperatura ambiente se procede a leer la absorbancia a 440 nm en el espectrofotómetro UV-Vis, se recomienda realizar este procedimiento por duplicado. Los datos obtenidos se deben llevar a una curva patrón que se trazara a partir de estándares de etanol, los cuales se elaboran por medio de una solución patrón de etanol al 1% (7894 ppm) en el rango de 315.76 ppm hasta 1894.56 ppm (hacer por duplicado y sacar promedio) a los que se les aplica el método descrito anteriormente. Con las absorbancias obtenidas de la serie de patrones estimar la ecuación de la recta (coeficiente de determinación R2) y luego hallar las diferentes concentraciones.

108

ANEXO H. ANÁLISIS DE VARIANZA PRUEBA ANOVA SIMPLE

Análisis Estadístico para el alcohol producido D. Rotundata Este procedimiento realiza un análisis de la varianza simple para Alcohol. Realiza varios test y gráficos para comparar los valores medios de Alcohol para los 3 diferentes niveles de Concentraciones. El F-test en la tabla de ANOVA comprobará si hay alguna diferencia significativa entre las medias. Si hay, los Test de Rangos Múltiples le indicarán las medias que son significativamente diferentes unas de otras. Si le preocupa la presencia de valores atípicos, puede elegir el test Kruskal-Wallis que compara las medianas en lugar de las medias. Los diferentes gráficos le ayudarán a juzgar la significación práctica de los resultados, y le permitirán buscar las posibles violaciones a las asunciones subyacentes en el análisis de la varianza. Resumen Estadístico para Alcohol

Esta tabla muestra los datos estadísticos de Alcohol para cada uno de los 3 niveles de Concentraciones. El análisis de la varianza simple está pensado principalmente para comparar las medias de los diferentes niveles, listados aquí bajo la columna Media. .

109

Tabla ANOVA para Alcohol según Concentraciones

La tabla ANOVA descompone la varianza de Alcohol en dos componentes: un componente entre grupos y un componente dentro de los grupos. El F-ratio, que en este caso es igual a 0,755223, es el cociente de la estimación entre grupos y la estimación dentro de los grupos. Puesto que el p-valor del test F es superior o igual a 0,05,no hay diferencia estadísticamente significativa entre las medias de alcohol de un nivel de Concentraciones a otro para un 95,0%. Grafica 23.Gráfico de dispersión para D. Rotundata

110

Grafica 24. Gráfico de cajas y bigotes para D. Rotundata

Análisis Estadístico para el alcohol producido D. Alata Este procedimiento realiza un análisis de la varianza simple para Alcohol. Realiza varios test y gráficos para comparar los valores medios de Alcohol para los 3 diferentes niveles de Concentración. El F-test en la tabla de ANOVA comprobará si hay alguna diferencia significativa entre las medias. Si hay, los Test de Rangos Múltiples le indicarán las medias que son significativamente diferentes unas de otras. Si le preocupa la presencia de valores atípicos, puede elegir el test Kruskal-Wallis que compara las medianas en lugar de las medias. Los diferentes gráficos le ayudarán a juzgar la significación práctica de los resultados, y le permitirán buscar las posibles violaciones a las asunciones subyacentes en el análisis de la varianza.

111

Resumen Estadístico para Alcohol producido ñame D. Alata

Esta tabla muestra los datos estadísticos de Alcohol para cada uno de los 3 niveles de Concentración. El análisis de la varianza simple está pensado principalmente para comparar las medias de los diferentes niveles, listados aquí bajo la columna Media. Tabla ANOVA para Alcohol según Concentración.

La tabla ANOVA descompone la varianza de Alcohol en dos componentes: un componente entre grupos y un componente dentro de los grupos. El F-ratio, que en este caso es igual a 0,283889, es el cociente de la estimación entre grupos y la estimación dentro de los grupos. Puesto que el p-valor del test F es superior o igual a 0,05,no hay diferencia estadísticamente significativa entre las medias de alcohol de un nivel de Concentración a otro para un 95,0%.

112

Grafica 26. Gráfico de dispersión para D. Alata.

Grafica 27. Gráfico de cajas y bigotes para D. Alata

113

Análisis Estadístico para el alcohol producido D. Trífida. Este procedimiento realiza un análisis de la varianza simple para Alcohol. Realiza varios test y gráficos para comparar los valores medios de Alcohol para los 3 diferentes niveles de Concentraciones. El F-test en la tabla de ANOVA comprobará si hay alguna diferencia significativa entre las medias. Si hay, los Test de Rangos Múltiples le indicarán las medias que son significativamente diferentes unas de otras. Si le preocupa la presencia de valores atípicos, puede elegir el test Kruskal-Wallis que compara las medianas en lugar de las medias. Resumen Estadístico para Alcohol producido ñame D. Trífida.

Esta tabla muestra varios estadísticos de Alcohol para cada uno delos 3 niveles de Concentraciones. El análisis de la varianza simple está pensado principalmente para comparar las medias de los diferentes niveles.

114

Tabla ANOVA para el etanol según las concentraciones

La tabla ANOVA descompone la varianza de Alcohol en dos componentes: un componente entre grupos y un componente dentro de los grupos. El F-ratio, que en este caso es igual a 0,0705905, es el cociente de la estimación entre grupos y la estimación dentro de los grupos. Puesto que el p-valor del test F es superior o igual a 0,05,no hay diferencia estadísticamente significativa entre las medias de alcohol de un nivel de Concentraciones a otro para un 95,0%. Grafica 29. Gráfico de dispersión para D. Trífida.

115

Grafica 30. Gráfico de cajas y bigotes para D. Trífida

116

ANEXO H. PRUEBAS NO PARAMETRICAS Y PRUEBA T DE STUDENT. A continuación se encuentran reportada las pruebas de no paramétricas y la prueba T de Student en donde se comprueba que en todas se acepta la Hipótesis alternativa.

Dioscorea. ALATA 10,5% Pruebas no paramétricas

Prueba de Kolmogorov-Smirnov para una muestra

Etanol

N 8

Parámetros normales(a,b)

Media 2,1675

Desviación típica 1,07449

Diferencias más extremas Absoluta ,164

Positiva ,164

Negativa -,156

Z de Kolmogorov-Smirnov ,463

Sig. asintót. (bilateral) ,983

a La distribución de contraste es la Normal. b Se han calculado a partir de los datos.

Prueba T Estadísticos para una muestra

N Media Desviación

típ. Error típ. de

la media

etanol 8 2,1675 1,07449 ,37989

Prueba para una muestra

Valor de prueba = 10

t gl Sig. (bilateral) Diferencia de medias

95% Intervalo de confianza para la

diferencia

Inferior Superior

etanol -20,618 7 ,000 -7,83250 -8,7308 -6,9342

117

D. ALATA 13,5% Pruebas no paramétricas

Prueba de Kolmogorov-Smirnov para una muestra

etanol

N 8

Parámetros normales(a,b)

Media 2,0513

Desviación típica 1,36307

Diferencias más extremas Absoluta ,163

Positiva ,122

Negativa -,163

Z de Kolmogorov-Smirnov ,460

Sig. asintót. (bilateral) ,984

a La distribución de contraste es la Normal. b Se han calculado a partir de los datos.

Prueba T Estadísticos para una muestra

N Media Desviación

típ. Error típ. de

la media

etanol 8 2,0513 1,36307 ,48192

Prueba para una muestra

Valor de prueba = 10

t gl Sig. (bilateral) Diferencia de medias

95% Intervalo de confianza para la

diferencia

Inferior Superior

etanol -16,494 7 ,000 -7,94875 -9,0883 -6,8092

118

D. ALATA 15% Pruebas no paramétricas

Prueba de Kolmogorov-Smirnov para una muestra

etanol

N 8

Parámetros normales(a,b)

Media 1,7238

Desviación típica 1,20983

Diferencias más extremas Absoluta ,165

Positiva ,143

Negativa -,165

Z de Kolmogorov-Smirnov ,467

Sig. asintót. (bilateral) ,981

a La distribución de contraste es la Normal. b Se han calculado a partir de los datos.

Prueba T Estadísticos para una muestra

N Media Desviación

típ. Error típ. de

la media

etanol 8 1,7238 1,20983 ,42774

Prueba para una muestra

Valor de prueba = 10

t gl Sig. (bilateral) Diferencia de medias

95% Intervalo de confianza para la

diferencia

Inferior Superior

etanol -19,349 7 ,000 -8,27625 -9,2877 -7,2648

119

D. TRÍFIDA 10,5% Pruebas no paramétricas

Prueba de Kolmogorov-Smirnov para una muestra

Etanol

N 8

Parámetros normales(a,b)

Media 1,8000

Desviación típica 1,27250

Diferencias más extremas Absoluta ,121

Positiva ,109

Negativa -,121

Z de Kolmogorov-Smirnov ,343

Sig. asintót. (bilateral) 1,000

a La distribución de contraste es la Normal. b Se han calculado a partir de los datos.

Prueba T

Estadísticos para una muestra

N Media Desviación

típ. Error típ. de

la media

Etanol 8 1,8000 1,27250 ,44990

Prueba para una muestra

Valor de prueba = 10

t gl Sig. (bilateral) Diferencia de medias

95% Intervalo de confianza para la

diferencia

Inferior Superior

Etanol -18,226 7 ,000 -8,20000 -9,2638 -7,1362

120

D. TRÍFIDA 13,5% Pruebas no paramétricas

Prueba de Kolmogorov-Smirnov para una muestra

Etanol

N 8

Parámetros normales(a,b)

Media 2,0463

Desviación típica 1,50003

Diferencias más extremas Absoluta ,107

Positiva ,107

Negativa -,095

Z de Kolmogorov-Smirnov ,301

Sig. asintót. (bilateral) 1,000

a La distribución de contraste es la Normal. b Se han calculado a partir de los datos.

Prueba T

Estadísticos para una muestra

N Media Desviación

típ. Error típ. de

la media

Etanol 8 2,0463 1,50003 ,53034

Prueba para una muestra

Valor de prueba = 10

t gl Sig. (bilateral) Diferencia de medias

95% Intervalo de confianza para la

diferencia

Inferior Superior

Etanol -14,997 7 ,000 -7,95375 -9,2078 -6,6997

121

D. TRÍFIDA 15% Pruebas no paramétricas

Prueba de Kolmogorov-Smirnov para una muestra

Etanol

N 8

Parámetros normales(a,b)

Media 1,8763

Desviación típica 1,23848

Diferencias más extremas Absoluta ,157

Positiva ,116

Negativa -,157

Z de Kolmogorov-Smirnov ,443

Sig. asintót. (bilateral) ,989

a La distribución de contraste es la Normal. b Se han calculado a partir de los datos.

Prueba T Estadísticos para una muestra

N Media Desviación

típ. Error típ. de

la media

Etanol 8 1,8763 1,23848 ,43787

Prueba para una muestra

Valor de prueba = 10

t gl Sig. (bilateral) Diferencia de medias

95% Intervalo de confianza para la

diferencia

Inferior Superior

Etanol -18,553 7 ,000 -8,12375 -9,1591 -7,0884

122

D. ROTUNDATA 10.5% Pruebas no paramétricas

Prueba de Kolmogorov-Smirnov para una muestra

Etanol

N 8

Parámetros normales(a,b)

Media 1,6213

Desviación típica 1,16104

Diferencias más extremas Absoluta ,217

Positiva ,217

Negativa -,131

Z de Kolmogorov-Smirnov ,615

Sig. asintót. (bilateral) ,844

a La distribución de contraste es la Normal. b Se han calculado a partir de los datos.

Prueba T

Estadísticos para una muestra

N Media Desviación

típ. Error típ. de

la media

Etanol 8 1,6213 1,16104 ,41049

Prueba para una muestra

Valor de prueba = 10

t gl Sig. (bilateral) Diferencia de medias

95% Intervalo de confianza para la

diferencia

Inferior Superior

Etanol -20,412 7 ,000 -8,37875 -9,3494 -7,4081

123

D. ROTUNDATA 13.5% Pruebas no paramétricas

Prueba de Kolmogorov-Smirnov para una muestra

Etanol

N 8

Parámetros normales(a,b)

Media 1,9050

Desviación típica 1,32571

Diferencias más extremas Absoluta ,123

Positiva ,123

Negativa -,119

Z de Kolmogorov-Smirnov ,348

Sig. asintót. (bilateral) 1,000

a La distribución de contraste es la Normal. b Se han calculado a partir de los datos.

Prueba T

Estadísticos para una muestra

N Media Desviación

típ. Error típ. de

la media

Etanol 8 1,9050 1,32571 ,46871

Prueba para una muestra

Valor de prueba = 10

t gl Sig. (bilateral) Diferencia de medias

95% Intervalo de confianza para la

diferencia

Inferior Superior

Etanol -17,271 7 ,000 -8,09500 -9,2033 -6,9867

124

D. ROTUNDATA 15% Pruebas no paramétricas

Prueba de Kolmogorov-Smirnov para una muestra

Etanol

N 8

Parámetros normales(a,b)

Media 2,4300

Desviación típica 1,49834

Diferencias más extremas Absoluta ,092

Positiva ,079

Negativa -,092

Z de Kolmogorov-Smirnov ,260

Sig. asintót. (bilateral) 1,000

a La distribución de contraste es la Normal. b Se han calculado a partir de los datos.

Prueba T

Estadísticos para una muestra

N Media Desviación

típ. Error típ. de

la media

Etanol 8 2,4300 1,49834 ,52974

Prueba para una muestra

Valor de prueba = 10

t gl Sig. (bilateral) Diferencia de medias

95% Intervalo de confianza para la

diferencia

Inferior Superior

Etanol -14,290 7 ,000 -7,57000 -8,8226 -6,3174

125

ANEXO I.ESTIMACIÓN DE COSTOS El estudio fue realizado a escala de laboratorio y a continuación en la tabla 13 se presentan los costos de los reactivos y materiales. Tabla 13. Estimación de costos de proyecto

RUBROS COSTOS FUENTES DE

FINANCIACIÓN

Kg D. Alata Ñ. Diamante 4800 Recursos propio

Kg D. Trífida Ñ. Baboso 5400 Recursos propio

Kg D. Rotundata Ñ. Espino 7200 Recursos propio

Reactivos 724000 Recursos propio

Gasa Estéril 12000 Recursos propio

Jeringas de 10 ml 10000 Recursos propio

Cinta de Enmascarar 10000 Recursos propio

Algodón 3000 Recursos propio

Venoclisis de Macrogoteo 25000 Recursos propio

Tubos Cónico con tapa 44080 Recursos propio

COSTO TOTAL 845480 Fuente: los autores del proyecto

Al observar los costos presentados en la tabla anterior, se puede realizar una proyección a escala industrial ya que los costos de materia prima no son tan elevados lo cual puede sustentar viabilidad para proyectos futuros, claro está que se propone como alternativa la siembra de células productoras de las enzimas; alfa amilasa y glucoamilasa, debido a que los costos de estas enzimas comercialmente son bastante elevados y la siembra de células supone costos más bajos por los requerimientos del cultivo.