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Carla Sofia de Oliveira Ferreira

Estudos de Modelação Molecular e de Ressonância Magnética Nuclear de Complexos de

Inclusão entre Ciclodextrinas e Poliazamacrocíclos de Gadolínio (III)

Mestrado em Química Departamento de Química

Faculdade de Ciências da Universidade do Porto

Fevereiro 2001

Carla Sofia de Oliveira Ferreira

Estudos de Modelação Molecular e de Ressonância Magnética Nuclear de Complexos

de Inclusão entre Ciclodextrinas e poliazamacrociclos de Gadolínio (III)

Tese submetida à Faculdade de Ciências da Universidade do Porto para obtenção do grau de Mestre em Química

Mestrado em Química Departamento de Química

Faculdade de Ciências da Universidade do Porto Fevereiro 2001

Em memória de minha avó Maria Isabel Duarte Moreira

Alma minha gentil, que te partiste Tão cedo desta vida, descontente, Repousa lá no Céu eternamente

E viva eu cá na terra sempre triste..

Luís de Camões, extracto de Versos e alguma Prosa de Luís de Camões, Sonetos, Fundação Calouste Gulbenkian (1977).

AGRADECIMENTOS

Desejo agradecer em primeiro lugar à minha supervisora, Prof. Dra. Maria João Ramos, pela orientação prestada que muito contribuiu para a realização deste trabalho.

Ao Conselho de Mestrado em Química e ao Conselho Científico da Faculdade de Ciências da Universidade do Porto, pelo apoio e confiança que me concederam, permitindo a entrega da dissertação para além do tempo previsto.

Ao Prof. Dr. Carlos Geraldes pela amabilidade com que me recebeu no Laboratório de R.M.N. da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra possibilitando a realização da parte experimental deste trabalho.

Aos Prof, (s) Dr. (s) José Ferreira Gomes, André Melo, Alexandre Magalhães e Natália Cordeiro, pela simpatia e colaboração demonstradas.

Ao Alfredo, ao Daniel, à Elsa, ao Gabriel, à Olga, ao Pedro, ao Nelson, ao Richard, à Sandra e à Sara pelo tempo dispendido em frutuosos esclarecimentos e pela boa disposição sempre presente.

A todos os amigos e colegas, particularmente à Claudia, à Cristininha, à Magda, ao Miguel, ao Pablo, à Raquel, à Sandra Martins, à Sofia, à Sofia Gameiro, à Vanda Lopes, ao Tó e ao Tózé pela amizade e estimulo que sempre me transmitiram.

Aos meus alunos e colegas das escolas onde leccionei e aos colegas da empresa Águas de São Cristóvão por toda a solidariedade e apoio manifestados.

Finalmente quero expressar um especial agradecimento aos meus Pais, aos meus Avós, Tios, Primos e ao Leopoldo, por todo o apoio, carinho e estímulo que sempre me revelaram.

RESUMO

A Imagem por Ressonância Magnética (I.R.M.) é um recente e importante instrumento no diagnóstico médico actual. O contraste entre os diversos tecidos do corpo humano (normais e patogênicos) é criado em função do número de átomos de hidrogénio existentes num determinado tecido e do meio onde se encontram. A administração de adequados agentes de contraste (AC) é um modo de melhorar o contraste I.R.M. Neste sentido, complexos de metais paramagnéticos têm sido utilizados, e poliazamacrociclos (DOTA-, DOTP- e DTPA derivados) de catiões trivalentes de Gadolínio (Gd) e de Túlio (Tm) foram recentemente reconhecidos como capazes de actuar como AC em I.R.M., uma vez que induzem melhoramentos na taxa de relaxação.

Ciclodextrinas são moléculas com a forma de cones truncados formadas por unidades de D-glucose, ligadas entre si por ligações a-1,4. O interior das Ciclodextrinas é basicamente não polar devido aos oxigénios e hidrogénios glicosídicos alinhados nas paredes da cavidade. As Ciclodextrinas têm um interesse particular devido à sua capacidade de formar espécies do tipo hóspede-hospedeiro. Este facto pode conduzir a alterações vantajosas nas propriedades físicas e químicas da molécula hóspede, como o melhoramento da sua estabilidade e solubilidade em água ou no meio fisiológico.

O objectivo deste estudo é o microencapsulamento, em solução, por parte das Ciclodextrinas, de Poliazamacrocíclicos de Gadolínio (III), de modo a contribuir para o melhoramento da técnica Imagem por Ressonância Magnética.

Foram estudadas as formações dos complexos de inclusão, entre a a-ciclodextrina e o GdDOTP-MB, utilizando técnicas de modelação e simulação moleculares no Laboratório de Química Teórica do Departamento de Química da Faculdade de Ciências do Porto e, entre a a-ciclodextrina e o GdDTPAHpA2, a a-ciclodextrina e o GdDOTPMB, a y-ciclodextrina e o GdDOTP e, entre a y-ciclodextrina e o GdDOTA, efectuando estudos de relaxometria de interacções, no Departamento de Bioquímica da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.

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ABSTRACT

Magnetic Resonance Imaging (M.R.I.) is a recent powerful diagnostic tool in clinical practice. The contrast between the several tissues of the human body (normal and patogenic) is created as a function of the number of atoms of hydrogen in a certain tissue and of the medium where they exist. The administration of suitable M.R.I, contrast agents (CA) in Magnetic Resonance Imaging is a way to enhance the M.R.I, contrast. In this sense, paramagnetic metal complexes are used, and polyazamacrocycles (DOTA-, DOTP- and DTPA-like) of Gadolinium (Gd) and Thulium (Tm) trivalent cations were early recognized to be able to act as CA in M.R.I., because they induce relaxation rate enhancements.

Cyclodextrins are torus-shaped molecules formed by a-1,4 linkages of glucopyranose units. The interior of Cyclodextrins is fairly nonpolar due to the glycosidic oxygen and hydrogens lining the walls of the cavity. Cyclodextrins are of particular interest due to their ability to form host-guest species. This can lead to advantageous changes in the chemical and physical properties of the guest molecule, such as the improvement of its stability and solubility in water or in the physiological medium.

The purpose of this study is the micro-encapsulation, in solution, by Cyclodextrins of some Gadolinium (III) Polyazamacrocycles, in an aim to improve Magnetic Resonance Imaging.

In the present work, the formations of the inclusion complexes, between the a-cyclodextrin and GdDOTP-MB were studied by computer simulations and molecular modelling techniques, at the Laboratório de Química Teórica do Departamento de Química da Faculdade de Ciências do Porto and, between the a-cyclodextrin and the GdDTPAHpÀ2, the a-cyclodextrin and GdDOTPMB, the y-cyclodextrin and GdDOTP and, between the y-cyclodextrin and GdDOTA, by relaxometric studies of interactions, at the Departamento de Bioquímica da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.

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ABREVIATURAS

GdDOTA

{l,4,7,10-tetraazaciclododecano-l,4,7,10-tetraacetato} de gadolínio (III)

GdDOTP

{1,4,7,10-tetraazaciclododecano- 1,4,7,10-tetraquis (metilenofosfonato)} de

gadolínio (III)

GdDOTPMB

{1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1.4.7.10-tetraquis (metilenofosfonato mono-

butil ester} de gadolínio (III)

GdDTPA-HPA2

{1,11-Bis (n-heptilamida)-l,l l-dioxo-3,6,9-triaaza-3,6,9-tris

(carboximetil)undecano} de gadolínio (III)

ÍNDICE

Resumo 5

Abstract 6

Abreviaturas 7

índice 8

Capitulo 1 - Introdução

1.1 Imagem por Ressonância Magnética (I.R.M.) 12

1.2 Ciclodextrinas 17

1.2.1 Introdução 17

1.2.2 Produção de ciclodextrinas naturais 19

1.2.3 Estrutura e propriedades físico-químicas de ciclodextrinas naturais.22

1.2.4 Complexos de inclusão 27

1.3 Poliazamacrocíclos de Lantanídeos (III) 29

Referências -Capítulo 1 34

Capitulo 2 - Modelação Molecular

2.1 Introdução 39

2.2 Campo de forças 41

2.2.1 Parametrização 44

2.3 Minimização de Energia 45

2.4 Método da Dinâmica Molecular (MD) 47

2.4.1 Integração das equações de movimento 48

2.4.2 Simulações a Temperatura Constante 51

2.4.3 Condições Periódicas de Fronteira 53

2.4.4 Passos de simulação 55

Referências -Capítulo2 57

- 8 -

Capitulo 3 - Ressonância Magnética Nuclear (R.M.N.) 3.1 Princípios 60 3.2 Aplicações 67 Referências -Capítulo 3 68

Capitulo 4 - Resultados e Discussão 4.1 Estudos Teóricos 71

4.1.1. Geometrias iniciais 71 4.1.2 Parametrização 75 4.1.3. Análise Conformacional 77

4.1.4 Minimização de Energia 80 4.1.5. Dinâmica molecular 82

4.1.5.1 Condições da simulação 82 4.1.5.2 Resultados obtidos 84

4.3 Estudos Relaxométricos 88 4.3.1 Determinação da relaxividade do Complexos de Gd3+ 89

4.3.1.1 Determinação da relaxividade do GdDOTP 89 4.3.1.2 Determinação da relaxividade do GdDOTA 90 4.3.1.3 Relaxometria do GdDTPAHpA2 91

4.3.2 Interacção dos Complexos de Gd3+com Ciclodextrinas 92

4.3.2.1 Interacção entre a y-ciclodextrina e o GdDOTP 94

4.3.2.2 Interacção entre Gd(DOTA) e y-ciclodextrina 96

4.3.2.3 Interacção entre GdDTPAHpA2 e a-ciclodextrina 97

4.3.2.4 Interacção entre GdDOTPMB e a-ciclodextrina 98 Referências -Capítulo4 99

Capitulo 5 - Conclusões 100 Anexos 102

Capítulo 1 Introdução

Capítulo 1

A Imagem por Ressonância Magnética (I.R.M.) é uma técnica

importante como meio de diagnóstico em prática clínica [1]. O contraste numa

imagem de I.R.M. é o resultado de um complexo conjunto de factores: tempos

de relaxação longitudinal (Ti) e transversal (T2), densidade protónica dos

tecidos analisados e parâmetros instrumentais [2]. A administração de

adequados agentes de contraste (AC) em Imagem por Ressonância Magnética é

um modo de melhorar o contraste I.R.M. [3]. Agentes de contraste, são

compostos que dispõem da capacidade de alterar significativamente as

propriedades magnéticas da região onde são distribuídos de modo a melhorar a

detecção e a caracterização de lesões, e para contribuir para a intensidade do

sinal de I.R.M. A escolha destes agentes depende de vários parâmetros como: a

elevada relaxividade, serem quimicamente inertes, terem baixa toxicidade in

vivo, possuírem boa distribuição corporal, e pela rápida e completa excreção

após o exame médico.

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O Gadolínio (Gd) tem a particularidade de gerar o mais curto tempo de

relaxação longitudinal para as águas de coordenação [4], sendo conhecidas

importantes e bem sucedidas aplicações clínicas de complexos de Gadolínio

como agentes de contraste de I.R.M. [5], devido à sua grande estabilidade

cinética e termodinâmica [6]. Neste sentido, complexos de metais

paramagnéticos são utilizados [3] entre os quais, poliazamacrocíclos (DOTA-,

DOTP- e DTPA- e derivados) [7,8] de catiões trivalentes de Gadolínio (Gd).

Estes foram recentemente reconhecidos como capazes de actuar como agentes

de contraste para I.R.M, uma vez que induzem aumentos na velocidade de

relaxação da água. Além disso, sabe-se que o benefício provocado na relaxação

dos protões da água aumenta quando são conjugados com macromoléculas

como, por exemplo, a Albumina [6,7].

Outra aplicação destes complexos paramagnéticos em biomedicina é a

sua utilização como reagentes de desvio para a separação de sinais de R.M.N.

de espécies presentes nos compartimentos intra e extracelulares [65].

As Ciclodextrinas (CD), são compostos cíclicos com a forma de cones

truncados, constituídos por unidades de D-glucose, ligadas entre si por unidades

a-(l-4). O interior das CD é praticamente não polar devido aos oxigénios e

hidrogénios glicosídicos alinhados na parede da sua cavidade. As

Ciclodextrinas têm particular interesse no que concerne à sua capacidade em

formar complexos de inclusão, o que conduz a consideráveis alterações nas

propriedades físicas e químicas da molécula "hóspede" como por exemplo, no

melhoramento da sua estabilidade e solubilidade em água ou no meio

fisiológico [9,10]. Esta propriedade sugere que os poliazamacrocíclos de

lantanídeos possam igualmente formar complexos de inclusão com as CD,

possibilitando um mecanismo alternativo pelo qual as velocidades de relaxação

dos protões do solvente e a biodistribuição destes reagentes de desvio seja

alterada in vivo.

- 1 1 -


1.1 Imagem por Ressonância Magnética (LR.M.)

A Imagem por Ressonância Magnética (LR.M.) é uma técnica usada

principalmente em aplicações médicas para produzir imagens de alta qualidade

do interior do corpo humano. A LR.M. está baseada nos princípios de

Ressonância Magnética Nuclear (R.M.N.).

O efeito de R.M.N. foi descoberto e explicado por Felix Bloch e

colaboradores [11], e por Edward Purcell e colaboradores [12], em 1945-1946

[13]. Estes estudos conduziram à atribuição conjunta do Prémio Nobel da

Física, em 1952, tendo aberto caminho para uma enorme variedade de novas

técnicas extremamente informativas (tabela 1.1).

1946 Fenómeno de R.M.N. - Bloch & Purcell

1970 1973 1975 1980 1986

1988 1989 1991

Prémio Nobel da Física - Bloch & Purcell

R.M.N. desenvolvida como técnica analítica

Técnica de projecção de LR.M. - Lauterbur LR.M. utilizando Transformações de Fourier - Ernst

Demonstração de I.RM. - Edelstein 'Gradient Echo Imaging"

Microscópio R.M.N. Angiografia - Dumoulin "Echo-Planar Imaging" Prémio Nobel - Ernst

Tabela 1.1- Cronograma do avanço científico na área da R.M.N. [14]

A LR.M. é uma técnica recente, com cerca de 20 anos, que permite ao

médico visualizar o interior de um corpo sem cirurgia ou radiações que o

-12-


prejudiquem. Este método permite não só a visualização dos ossos mas também

dos tecidos moles e órgãos em qualquer parte do corpo.

Para a execução desta técnica são utilizados um campo magnético e

ondas de radiofreqüência semelhantes às ondas de rádio de FM. Para fazer um

exame, o paciente é colocado no interior de um tubo (Figura 1.1) que cria um

campo magnético. Este campo faz com que os núcleos de hidrogénio da água

(que constituem cerca de 70% do seu corpo) se alinhem como pequenos ímans.

As ondas de rádio ligadas momentaneamente perturbam os núcleos de

hidrogénio, que emitem por sua vez outras ondas que são detectadas e

processadas pelo computador para serem transformadas em imagens.

Figura 1.1-Aparelho de Ressonância Magnética Nuclear.

Embora o corpo humano contenha vários núcleos que em teoria possam

ser usados em I.R.M., só os núcleos de hidrogénio são suficientemente

concentrados para dar sinais úteis. A maior parte dos sinais provém dos

hidrogénios da água, e os restantes vêm maioritariamente dos hidrogénios das

gorduras.

Para os químicos, a técnica ^-R.M.N. é usada para obter informação

sobre os desvios químicos, integração e constantes de acoplamento. Em I.R.M.,

- 1 3 -


três tipos de informações podem ser obtidas: densidade protónica, tempo de relaxação longitudinal (Ti) e tempo de relaxação transversal (T2).

Na Espectroscopia de R.M.N., a energia sob a forma de radiação de radiofreqüência é absorvida pelos núcleos, na amostra. O tempo de relaxação é a velocidade com que cada núcleo liberta a sua energia e relaxa até ao estado fundamental. A energia pode ser dispendida pelos núcleos de dois modos:

- Numa relaxação T2, um núcleo cede a sua energia a outro núcleo, num processo que não causa perda de energia nos núcleos à sua volta;

- Numa relaxação Ti, um núcleo cede a sua energia à sua vizinhança. Para grandes quantidades de energia, a relaxação Ti leva a que haja um aquecimento da vizinhança.

Em 1971, descobriu-se que o tempo de relaxação Ti da água em certas células cancerosas é muito maior que o tempo de relaxação Ti da água nas células normais. Sendo assim, se uma imagem de relaxação Ti do corpo humano for obtida é possível identificar tumores numa fase inicial.

Outra aplicação importante de I.R.M. é o exame do cérebro e da coluna vertebral. As matérias branca e cinzenta são facilmente distinguidas por esta técnica, sendo determinante no estudo de muitas doenças como a esclerose múltipla. As imagens de ressonância magnética e de raios X são em muitos casos complementares. A camada exterior dos ossos é essencialmente invisível em I.R.M., mas surge bem nítida nas imagens de raios X.

O mais importante para qualquer técnica médica de imagem é saber qual parte do corpo produz o sinal obtido. Em I.R.M., a informação espacial pode ser codificada usando gradientes de campos magnéticos, existindo uma relação linear entre a frequência a que um núcleo sofre ressonância e o campo magnético. Nesta técnica, todos os sinais devidos aos protões têm mais ou menos os mesmos desvios químicos e, num campo magnético homogéneo, vão absorver à mesma frequência.

-14-


Em I.R.M., o doente é colocado num gradiente de campo magnético

que pode ser variado de sítio para sítio. Os núcleos num corpo magnético fraco

absorvem a uma frequência menor e vice-versa.

Num campo magnético variável, existe uma correlação entre a

frequência de absorção de um núcleo e sua posição no gradiente do espaço ao

longo de uma imagem de um eixo simples num plano.

O exame de Ressonância magnética é feito numa sala especialmente

protegida contra ondas de radiofreqüências exteriores. O tempo de duração do

exame depende da parte do corpo a examinar e da informação que o médico

precisa, sendo geralmente de 20 a 45 minutos.

Para a grande maioria das pessoas não existe perigo associado ao

exame de I.R.M. Contudo, para pessoas cuja anatomia contenha um ou mais

dos seguintes itens, é importante ter em consideração que a I.R.M. pode acusar

lesões sérias ou morte:

- "Pacemakers";

- Bombas de insulina implantadas;

- Válvulas do coração;

- Implantes auditivos;

- Diafragmas anticoncepcionais; etc.

As imagens de RM são semelhantes a imagens anatómicas e podem ser

obtidas em qualquer plano (Figura 1.2). As imagens do computador são

transferidas para uma película e estudadas por um radiologista (médico

especialista em diagnóstico por imagem).

-15-


Figura 1.2- Imagem por Ressonância Magnética do Cérebro Humano [4].

- 1 6 -


1.2 Ciclodextrinas

1.2.1 Introdução

As ciclodextrinas, também denominadas por dextrinas de Schardinger,

cicloamiloses, ciclomalto-oligossacarídeos ou ciclomaltoses, são substâncias

conhecidas há mais de um século, depois de identificadas por Villiers em 1891

[15]. Foram produzidas a partir da degradação do amido, na presença do

bacillus de amilobacter [16]. Frank Schardinger [17,18], entre 1903 e 1911,

descreveu com algum pormenor a sua preparação, separação e propriedades

[19]. Em 1938, Freudenberg e colaboradores [20] explicaram que as

ciclodextrinas eram constituídas por unidades de D-glucose unidas por ligações

cc-(l-4).

Ciclodextrinas são oligossacarídeos cíclicos formadas por, pelo menos

6 unidades de glicose, sendo as mais conhecidas a a-ciclodextrina (6 unidades),

a (3-ciclodextrina (7 unidades), e a y-ciclodextrina (8 unidades).

Freudenberg e Cramer [21] foram os primeiros investigadores a

reconhecer e a estudar a propriedade mais notável das ciclodextrinas - a

capacidade de formarem complexos de inclusão, ou seja, compostos que

contêm no seu interior outras espécies, sem que se formem ligações covalentes

entre elas (espécie encapsulada e espécie que inclui). A grafite, os zeólitos, a

ureia, a hidroquinona, biomacromoléculas como o amido e as enzimas, éteres

de coroa e as ciclodextrinas; são exemplos de compostos que podem incluir no

seu interior outras espécies.

As ciclodextrinas, por terem uma origem biológica, são também usadas

como modelo da estrutura tridimensional detalhada do amido, que apesar de ser

umas das mais abundantes moléculas biológicas, ainda não foi determinada

-17-


experimentalmente devido à inexistência de uma estrutura globular molecular

bem definida [22]. A partir do estudo das interacções na forma complexada da

ciclodextrina com poliiodeto foi também possível determinar que a cor azul,

característica do complexo iodo:amido, se deve a fenómenos de transferência

de carga na cadeia de iodo à semelhança do que se observa nos complexos da

ciclodextrina [23].

Sendo constituídas por unidades de D-glucose, as ciclodextrinas

apresentam também propriedades ópticas, sendo conhecidos apenas

enantiómeros dextra-rotatórios. Assim, em muitos casos a inclusão de

compostos quirais na cavidade das ciclodextrinas permite a resolução de

racematos (separação de pares de enantiómeros), sendo muito utilizadas como

fase estacionária na cromatografia líquida e gasosa [24].

Tal como as enzimas, as ciclodextrinas possuem propriedades

catalíticas. Esta descoberta levou a um estudo intensivo das ciclodextrinas

como modelos enzimáticos, cujos resultados se encontram compilados na

literatura [25,26].

A aplicação das ciclodextrinas é estudada com crescente interesse não

só ao nível da investigação científica, mas também na indústria. De facto, como

uma inclusão reflecte um microencapsulamento [27], este fenómeno contribui,

em particular, para a estabilização de substâncias tóxicas melhorando o seu

manuseamento e dosagem, dada a sua baixa toxicidade. Para além das

aplicações farmacêuticas, estão descritas, em vários artigos de revisão,

aplicações em alimentos, cosméticos, pesticidas, tecnologia química e química

analítica [28-34].

Estas são algumas considerações, muito gerais, sobre a vasta

aplicabilidade e versatilidade das ciclodextrinas quer na investigação, quer na

química industrial, justificando uma abordagem mais profunda a algumas

características destes compostos.

-18-


1.2.2 Produção de ciclodextrinas naturais

As ciclodextrinas são obtidas a partir do amido por acção da enzima

ciclodextrina-glicosil-transferase (CGTase). O mecanismo de formação das

ciclodextrinas foi proposto em 1939 por Freudenberg e colaboradores [16],

tendo por base a estrutura helicoidal do amido:

G *\ f -. V

enzima CGTase o O <■ " 0 *„^oo

Figura 1.3- Formação de dextrinas cíclicas e acíclicas a partir do amido.

A preparação das ciclodextrinas está amplamente descrita em diversos

trabalhos de investigação e em diversas patentes [35].

Neste trabalho de revisão, efectua-se apenas a abordagem de alguns

aspectos que se consideram mais relevantes para o esclarecimento do processo

de produção das ciclodextrinas, que poderá ser esquematizado nas seguintes

fases principais [35]:

- Cultura de microrganismos que produzam a enzima ciclodextrina-

glicosil-transferase;

,- Separação da enzima do meio, sua concentração e purificação;

-19-


- Conversão enzimática do amido pré-hidrolisado (mistura de dextrinas

acíclicas) numa mistura de dextrinas cíclicas e acíclicas;

- Separação das ciclodextrinas da mistura anterior, sua purificação e

cristalização.

A enzima pode ser produzida por diferentes microrganismos, como

Bacillus macérons, Bacillus megaterium, Bacillus circulons, Bacillus

stearothermophilus, Bacillus alcalojîlico, Micrococcus varions, Micrococcus

Iuteus, Klebsiella pneumoniae e Bacillus subtiis [35-37].

A ciclodextrina-glicosil-transferase, um tipo de amilase, provoca a

clivagem da estrutura do amido, originando uma mistura de dextrinas cíclicas e

lineares. Como a clivagem do amido não produz segmentos específicos da

cadeia do amido, resulta uma mistura de ciclodextrinas que contêm 6 a 12

unidades de glicose. As ciclodextrinas que se obtêm em maiores percentagens

são: a-ciclodextrina, |3-ciclodextrina e a y-ciclodextrina; as suas quantidades

relativas dependem do tipo de microrganismo que produz a enzima e das

condições de reacção [27].

A enzima ciclodextrina-glicosil-transferase desenvolvida pelo Bacillus

macérons e pela Klebsiella pneumoniae produz preferencialmente a-

ciclodextrina, enquanto que a proveniente do Bacillus alcalofilico produz

principalmente (3-ciclodextrina. Quando a conversão enzimática do amido se

processa na presença de tolueno e em determinadas condições de pH,

temperatura e de tempo de reacção, o principal produto obtido é a (3-

ciclodextrina. A adição de decanol tem revelado ser o agente mais indicado

para aumentar a produção de a-ciclodextrina enquanto que a presença de ct-

naftol e de metiletilcetona conduz a um melhor rendimento na obtenção de y-

ciclodextrina [38].

-20-


A imobilização da enzima num suporte inerte e insolúvel permite o uso contínuo da enzima e possibilita o desenvolvimento de um processo de produção de ciclodextrinas mais eficiente [39]

A separação das ciclodextrinas da mistura de conversão pode ser conseguida através da adição de solventes orgânicos adequados que permitam a precipitação de apenas uma determinada ciclodextrina [35, 40-42]. Existem, no entanto, outros métodos de separação que não apresentam os inconvenientes do uso dos solventes orgânicos, dos quais se destacam os que recorrem à adsorção em amberlite, à ultrafiltração e à cromatografia [36, 37, 43]. O método que utiliza solventes orgânicos proporciona cerca do dobro do rendimento daquele que os não utiliza.

-21-


1.2.3 Estrutura e propriedades físico-químicas de

ciclodextrinas naturais

As unidades de glicose que constituem as ciclodextrinas encontram-se

unidas por ligações a-(l -4):

Figura 1.4- Detalhe da ligação oc-(l,4) entre duas unidades de glicose de uma molécula de ciclodextrina.

A formação de Ciclodextrinas com menos de 6 unidades não é possível por razões estereoquímicas [44,45]. Embora tenham sido identificados homólogos com mais de 8 unidades de glicose, o rendimento extremamente baixo da sua produção e as propriedades complexantes pouco significativas que apresentam, relativamente às mais conhecidas, fazem com que sejam muito pouco utilizadas.

O anel das ciclodextrinas com um elevado número de unidades de glicose torna-se bastante flexível, o que provoca um aumento do diâmetro da cavidade apolar, permitindo que um número cada vez maior de moléculas possa ser acomodado no seu interior. Isto significa que, em solução aquosa, aquelas moléculas de água complexadas irão ter energeticamente uma diferenciação cada vez menor em relação às moléculas de água do solvente. Assim, a complexação neste tipo de sistema não resulta num ganho significativo de energia [38].

- 2 2 -


A estrutura e as dimensões moleculares das principais ciclodextrinas

naturais estão indicadas na Figura 1.5.

o-co 0-co rco

Figura 1.5 - Estruturas da a-, (3 e y-ciclodextrina e suas dimensões moleculares.

Estas moléculas têm uma estrutura em forma de cone truncado. Como

consequência da conformação Cl das unidades de glicose (em forma de

cadeira), os grupos hidroxilo secundários, ligados aos átomos 02 e C3 das

unidades de glicose, estão localizados no topo do lado mais largo da estrutura,

enquanto que os grupos hidroxilo primários, ligados a 06, estão posicionados

no lado oposto. Como os grupos hidroxilo estão orientados para o exterior da

molécula, tornam-na relativamente hidrófila; por outro lado, a cavidade da

molécula apresenta-se hidrófoba devido ao carácter apolar determinado pelos

dois anéis dos grupos C-H (H3 e H5) e pelo anel de átomos de oxigénio

incluídos nas ligações glicosídicas (04 e 04')-

- 2 3 -


Os pares de electrões livres do oxigénio são dirigidos para o interior da

cavidade, conferindo-lhe uma elevada densidade electrónica, o que torna as

ciclodextrinas com carácter de base de Lewis [25,45].

Resulta assim, uma molécula com uma superfície exterior polar e uma

cavidade apolar. Dado o carácter hidrófilo da superfície exterior, as

ciclodextrinas podem dissolver-se na água, ao mesmo tempo que

disponibilizam uma cavidade apolar (hidrófoba) capaz de formar complexos de

inclusão com vários tipos de moléculas hóspede; ou seja, em solução aquosa, a

cavidade apolar das ciclodextrinas contém moléculas de água que se organizam

num agregado molecular (cluster).

Estas moléculas podem ser substituídas com relativa facilidade por

outras que, em solução, sejam menos polares que a água e possuam o tamanho

adequado para se adaptarem ao interior das ciclodextrinas.

As ciclodextrinas actuam como uma molécula hospedeiro, e um dos

factores que favorecem a formação dos complexos de inclusão é a substituição

das moléculas de água de elevada entalpia de hidratação por uma molécula

hóspede adequada [46].

Entre as principais ciclodextrinas naturais, a P-ciclodextrina é a que

apresenta menor solubilidade, facto que se deve ao elevado número de ligações

hidrogénio intramolecular entre os grupos hidroxilo secundários existentes na

molécula; estas interacções tornam a estrutura rígida e impedem a sua

hidratação pelas moléculas de água [47].

Na a-ciclodextrina só quatro das suas seis possíveis ligações de

hidrogénio podem ser estabelecidas, em virtude de uma unidade de glicose se

encontrar em posição distorcida.

A y-CD, por ser uma molécula não-coplanar, de estrutura mais flexível,

é a mais solúvel das três.

Nas Tabelas 1.2 e 1.3 estão indicadas as solubilidades das referidas

ciclodextrinas, quer em água, quer em alguns solventes orgânicos.

-24-


Temperaturas (°C) a-CD P-CD y-CD

20 9,0 1,64 18.5

25 12,7 1,85 25,6

30 16,5 2.28 32,0

35 20,4 2,83 39,0

40 24,2 3,49 46,0

45 28,2 4,40 58,5

50 34,7 5,27 -

60 - 7,49 -

70 - 12,03 -

80 - 19,66 -

Tabela 1.2 Solubilidades (g/100 ml) das ciclodextrinas naturais em água a diferentes temperaturas [38]

Solvente Orgânico a-CD P-CD y-CD

Éter dietílico Insolúvel Insolúvel Insolúvel

Clorofórmio Insolúvel Insolúvel Insolúvel

Isopropanol Insolúvel Insolúvel 32,0

Acetona Insolúvel Insolúvel 39,0

Etanol Insolúvel Insolúvel 46,0

Metanol Insolúvel Insolúvel 58,5

Glicerina Insolúvel 4,3 -

Propilenoglicol 1 2 -

Dimetilsulfóxido 2 35 -

Piridina 7 37 -

Erilenoglicol 9 21 -

Dimetilformamida 54 32 -

Tabela 1.3 Solubilidades (g/100 ml) das ciclodextrinas naturais em solventes orgânicos [38]

-25-


As ciclodextrinas são bastante estáveis em meio alcalino, mas

hidrolisam-se em meio fortemente ácido. São completamente resistentes à

degradação enzimática pela (3-amilase, mas são susceptíveis de ser atacadas

pela a-amilase. Esta enzima, contrariamente à p-amilase, não necessita de

grupos terminais para a sua acção, embora a velocidade de hidrólise seja

normalmente baixa [38].

As ciclodextrinas formam vários hidratos estáveis. A estabilidade das

ciclodextrinas é idêntica à da sucrose ou amido, podendo ser armazenadas

durante anos sem deterioração [38].

Na Tabela 1.4 estão sumariadas outras características importantes das

ciclodextrinas.

Características a-CD P-CD y-CD

N.° de Unidades de glicose 6 7 8

Peso Molecular 972 1135 1297

Solubilidade aquosa (g/100 ml) 14.5 1.85 23.2

[a] 25, D 150 162.5 177.4

Volume da cavidade (Â) 174 262 427

Formas dos cristais Lâminas Paralelogramos Prismas

hexagonais monoclínicos quadráticos

Constante de difusão, a 40°C

(m2/sec) 3.443 3.224 3,000

Hidrólise por A. Oryaze a-

amilase desprezável lenta rápida

pKa por potenciometria, a 25°C 12.332 12.202 12.081

Tabela 1.4 Características das ciclodextrinas naturais [38] #

-26-


1.2.4 Complexos de inclusão

A propriedade mais apreciável das ciclodextrinas é, como já foi referido, a sua disposição para formarem complexos de inclusão, dado possuírem uma cavidade hidrofóbica na qual vários tipos de moléculas (moléculas "hóspede") podem ser encaixadas formando complexos de inclusão tanto na fase aquosa como sólida, uma vez que a sua estrutura inerte é estável em ambas as fases.

Devido aos diferentes diâmetros da cavidade, cada ciclodextrina apresenta um grau de formação de complexos de inclusão diferente e com moléculas "hóspede" de diferentes tamanhos.

Um complexo de inclusão é um complexo químico o qual uma molécula é introduzida numa outra, ou num agregado de outras moléculas. Este tipo de complexos foi observado pela primeira vez por Mylius em 1886 [49], que propôs que dois componentes interactuavam na ausência de ligações químicas comuns e sugeriu que uma molécula cercava a outra. O único critério consistia no facto de que a molécula "hóspede" possuísse tamanho e forma adequados de modo a ajustar-se na cavidade. A estereoquímica e, possivelmente, a polaridade do "hóspede" e da molécula onde é introduzido o hóspede determinariam se a inclusão podesse ocorrer [49].

A formação de um complexo em solução entre uma ciclodextrina (CD) e um "hóspede" (H) é um processo de equilíbrio dinâmico que pode ser representado por:

CD +H o CD:H

-27-


A estabilidade do complexo de inclusão pode ser descrita em termos da

constante de formação (Kf) ou pela constante de dissociação (IQ):

Kf = [CD:H] / [CD][H] Kj = [CD][H] / [CD:H]

Tem-se verificado que os valores de IQ, se encontram próximos de

10" mol/dm", característicos das interacções intermoleculares fracas, em

complexos, como por exemplo o EDTA que tem uma constante de dissociação

da ordem dos IO"10 mol/dm"3.

De um modo geral, tem sido aceite a ideia de que as forças envolvidas

na formação do complexo, são entre outras [50]:

- Interacções de van der Walls entre a parte hidrofóbica da molécula

"hóspede" e a cavidade da ciclodextrina;

- Ligações de hidrogénio entre grupos funcionais polares da molécula

"hóspede" e os grupos hidróxilo da ciclodextrina [50].

-28-


1.3 Poliazamacrocíclos de Lantanídeos (IH)

A química da complexação, em solução, de lantanídeos tem sido

objecto de um renovado interesse nos últimos anos [51]. Devido às suas

configurações peculiares Af, os iões dos lantanídeos exibem propriedades

espectroscópicas e magnéticas semelhantes às dos átomos nos seus quelatos,

tornando-os apropriados para aplicações em biomedicina [52] como provas

para "time-resolved assays" [53, 55], para a rotulagem de DNA [56, 57], como

agentes de contraste para Imagem por Ressonância Magnética (I.R.M.) [3, 58,

59] e como reagentes de desvio em espectroscopia de R.M.N. [60, 61].

Como foi referido anteriormente, a maior parte destes estudos incidem

nos quelatos de Gadolínio (III), que são usados como agentes de contraste

(AC) conjuntamemente com a técnica de I.R.M. [2, 62].

Na figura 1.6 são apresentados exemplos da adição de compostos de

poliazamacrocíclos de lantanídeos (III).

a)

-29-


b) c) Figura 1.6

a) Imagens transversais de R.M.N. (0.6 T, 24 MHz) de um cérebro de um paciente antes (à esquerda) e após 3 minutos (à direita) a injecção intravenosa de [Gd(DTPA)(H20)]2" (dimeglumine salt; Schering/Berlex) numa dose de 0.1 mmoles/kg. Um intenso anel característico de um tumor é observado na imagem pós-injecção [3]

b) Imagem por RM de um peito sem adição de agente de contraste .

c) Imagem por RM de um peito depois da adição de 0.1 mmol kg- [Gd(DTPA)] "

Esta imagem mostra claramente um fibroadenoma (área brilhante) que

não é visível numa mamografía por raios-X) *

cortesia R.Weisskoff, EPIX Medicai, Cambridge MA

Os catiões trivalentes de Gadolínio, com sete electrões não

emparelhados (4f) [63] possuem um elevado momento magnético, p,

produzindo uma maior redução nos tempos de relaxação Ti da água dos tecidos

do que qualquer outro lantanídeo paramagnético ou metal da primeira série de

transição. Contudo, devido à toxidade do ião livre, só são utilizados sob a forma

de complexos altamente estáveis e hidrossolúveis de modo a permitir a sua

administração através de soluções concentradas. A utilização de agentes de

contraste baseados em gadolínio faz actualmente parte do protocolo diagnóstico

para I.R.M. [2, 64].

Outra aplicação em biomedicina de quelatos paramagnéticos de

lantanídeos é a sua utilização como reagentes de desvio para separação de

-30-


sinais de R.M.N. de espécies presentes nos compartimentos intra e extracelulares [65] dadas as suas propriedades de boa capacidade de desvio, interferência mínima de outras espécies (H*, Ca2+, etc.), de serem impermeáveis às membranas, de possuírem estabilidade química e bioquímica, e de não serem tóxicos.

Um exemplo típico dessa utilização é a quantificação relativa de iões Na+ e K+ dentro e fora das células vermelhas do sangue através do uso de complexos de Dy (III) e Tm (III) dotados de carga negativa residual elevada que não permite que eles atravessem a membrana celular. Isto leva a que esta perturbação paramagnética se restrinja ao ambiente extracelular resultando numa alteração da força do campo magnético local, que por sua vez causa um desvio significativo na frequência de ressonância dos iões Na+ e K+ presentes neste compartimento (figura 1.7) [2].

-31-


*W

. « nj 11 f i n ■ i "r ^ > ■ ■ — w p » i M m * * i w » B * r « * * ™ » * p * w »

»

■' t^W—WÉJ»

I I I p r ■ »

;; - "^ um* « m»mm*p*+m+

20 10 ■*—r

0 ppm

l ■ P — I — f — I l ■ D

-10 -ao

23> Figura 1.7- Espectro de Na R.M.N. do sangue humano antes (a) e depois (b) da adição de 5 mM de Dy(DOTP)5" (39 °C, 2.1 T) [2].

Outro exemplo da utilização de poliazamacrociclos de lantanídeos (III),

como reagentes de desvio (figura 1.8), é a formação de complexos de inclusão

com ciclodextrinas possibilitando o desenvolvimento de um mecanismo por

meio do qual a biodistribuição destes reagentes seja alterada in vivo. Esta linha

de investigação está agora a ser explorada [8, 66, 67] sendo os desvios devidos

aos lantanídeos paramagnéticos (LIS) e os aumentos da velocidade de relaxação

-32-


spin-rede nas ressonâncias dos protões (LIR) das ciclodextrinas, usados para

definir a posição do hóspede dentro da cavidade (hospedeiro) sendo igualmente

calculadas as constantes de associação para os complexos de inclusão [68].

Figura 1.8- Estrutura calculada para a melhor posição para o complexo de inclusão 5̂-y-CD-TmDOTP ": em cima- vista do topo; em baixo- vista de lado[8].

Este trabalho insere-se neste tipo de estudos, onde técnicas de mecânica

e dinâmica moleculares foram executadas simultaneamente com estudos de

relaxometria, como será discutido no capítulo 4.

-33-


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-37-

Capítulo 2 Modelação Molecular

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-38-


Capítulo!

2.1 Introdução

Nas últimas décadas, com a ascendente evolução dos recursos

informáticos, a simulação computacional tornou-se numa técnica importante

para a investigação das propriedades estruturais, energéticas e dinâmicas de

moléculas biológicas complexas como proteínas e ácidos nucléicos, a um nível

atómico.

O método da simulação computacional por dinâmica molecular foi

introduzido nos finais dos anos cinquenta por Aider e Wainwright [1,2] para

estudar as interacções entre esferas duras. Desses estudos saíram importantes

conclusões sobre o comportamento de líquidos simples. O maior avanço foi em

1964, quando Rahman efectou a primeira simulação usando um potencial

-39-


realístico para o árgon líquido [3]. Rahman e Stillinger trataram a água líquida

em 1974 [4].

As simulações de dinâmica molecular de proteínas apareceram em

1977, com a simulação do BPTI (Bovine Pancreatic Trypsin Inhibitor) [5].

Actualmente, o número de técnicas de simulação tem vindo a expandir-se

constantemente sendo, com frequência, usadas em procedimentos

experimentais tais como a cristalografia de raios X e a determinação estrutural

por Ressonância Magnética Nuclear (R.M.N.).

A maior parte dos estudos de simulação computacional utilizam um

modelo matemático que representa uma superfície de energia potencial para as

moléculas em estudo. Esta superfície descreve a energia de um sistema como

função da sua estrutura tridimensional, ou das coordenadas atómicas das

moléculas [6]. Contudo, a validade destes resultados de simulação molecular é

limitada pela exactidão dos modelos matemáticos usados para descrever a

superfície de energia potencial, isto é, da qualidade do campo de forças, e pela

precisão da técnica de simulação.

Se o campo de forças usado e o procedimento escolhido para a

simulação forem razoavelmente precisos, as simulações computacionais podem

ser utilizadas na determinação de propriedades para as quais os estudos

experimentais tenham custos muito elevados, sejam muito lentos ou até

inexequíveis. Os estudos de simulação são constantemente comparados com

resultados experimentais, caso existam, para assegurar a validade e a fiabilidade

dos modelos de simulação, e para corrigir ou modificar modelos de simulação

quando necessário para melhor representar o comportamento e as propriedades

das moléculas de interesse.

Para a realização deste trabalho recorreu-se, dentro dos vários

programas de simulação computacional disponíveis no Laboratório, ao

programa comercial QUANTA/CHARMM [7].

-40-


As justificações desta escolha prendem-se essencialmente com o facto de os campos de forças serem muito simplistas e pelo facto do CHARMM já conter resíduos pré-definidos para as ciclodextrinas.

Existem, actualmente, muitos programas de grafismo molecular que permitem a visualização, a modelação, manipulação, refinamento e análise de sistemas químicos. Entre estes, encontra-se o QUANTA [8], que dispõe de uma interface com o CHARMM [9], programa de mecânica/dinâmica molecular baseado no campo de forças CHARMM22 [10]. Este programa possibilita a minimização de energia, simulações por dinâmica molecular e a análise das propriedades estruturais, dinâmicas e termodinâmicas obtidas nesses cálculos.

2.2 Campo de forças

Quando se faz uma simulação computacional de qualquer sistema molecular, é necessária a elaboração ou escolha de um campo de forças adequado a esse sistema.

A determinação desse campo de forças, idealmente, seria através de um método quântico rigoroso, porém, para o tratamento de estruturas com centenas ou milhares de átomos, tal é impraticável, mesmo com a utilização dos mais poderosos computadores. Pode então, ser utilizado um campo de forcas composto de termos para as interacções em cada conjunto de dois, três e quatro átomos. Esses termos descrevem as ligações químicas, os ângulos entre as ligações e as rotações destas de uma maneira bastante simplificada.

A partir de um campo de forças é possível obter uma estrutura tridimensional de um sistema por métodos de optimização de geometria. É

-41-


também possível avaliar os seus movimentos e as suas mudanças conformacionais.

Actualmente já existem campos de forças baseados no CHARMM adequados para várias simulações macromoleculares, como por exemplo, para proteínas [10], para ácidos nucléicos [11], lípidos [12] e para hidrocarbonetos [13].

O CHARMM usa potenciais empíricos de energia que são uma soma de vários termos individuais de energia. As funções de energia são baseadas em termos da interacção de coordenadas internas inseparáveis e em termos de interacções não ligantes [14]. O campo de forças do CHARMM pode ser representado pela seguinte expressão:

V ^ V . + V e + V ^ + V . + V ^ + V , , , 2.1

Nesta equação, os primeiros quatro termos são denominados de termos ligantes.

O primeiro e o segundo termo representam, respectivamente, a energia devida à deformação dos comprimentos de ligação (estiramento) e a energia devida à variação dos ângulos de ligação (vibrações):

V ^ X k . O - O 2 2.2

V e=2ke(0-9o)2 2.3

São potenciais quadráticos, nos quais os somatórios são estendidos, na

devida ordem, a todos os comprimentos e ângulos de ligação do sistema

molecular, ki e ke são as constantes de força, r0 e 90 são os parâmetros

- 4 2 -


estruturais de referência para os comprimentos e ângulos de ligação, r e 6

respectivamente.

O terceiro termo de energia é devido à variação dos ângulos diedros

impróprios e o quarto relaciona-se com ângulos diedros de torção.

V„=5X(a>-a>0)2 2.4

v* = E M 1 + cos(nO -Ô)), sendo n = 1,2,4,6 2.5

O potencial de torção imprópria é caracterizado por uma série de

Fourier truncada e alargada a todos os ângulos de torção no sistema, em que ko

é uma constante de força e O um parâmetro estrutural. O potencial de torção

corresponde à energia associada à variação de um ângulo diedro ABCD

(rotação em torno da ligação BC). kffi é a constante de força e co0 o parâmetro

estrutural de referência.

O quinto e sexto termos correspondem às interacções não ligantes de Van der Waals e às electrostáticas, respectivamente.

y vdW Z - i Kj

A, B

vrü 2.6

>j J

V. elect i<j

q . q j

v4 7 t eoe rr l j y

2.7

As interacções de van der Waals são descritas por um potencial de Lennard-Jones, onde Ay e By são parâmetros para a interacção entre os átomos i e j . Um potencial de Coulomb descreve as interacções electrostáticas, qi e cy são as cargas parciais dos átomos i e j , s0 é a constante dieléctrica relativa, ry é a

- 4 3 -


distância entre os átomos i e j . Em relação à constante dieléctrica, o CHARMM permite que esta seja função da distância entre os átomos, er = ry, de forma a simular quer efeitos de polarização, quer a presença de um solvente (quando este não é declaradamente incluído). Se o solvente for incluído de modo explícito, considerar sr = 1 é o mais apropriado.

O CHARMM possibilita, também, a inclusão de diferentes tipos de restrições à energia que se manipula, quer na minimização quer na dinâmica.

A fixação da posição de certos átomos e a não inclusão dos termos de energia que envolvam estes átomos (é uma forma eficaz para o estudo de pequenas partes de grandes sistemas), constitui uma opção possível. Outra hipótese é a aplicação de correcções geométricas que diminuem o número de graus de liberdade nomeadamente o algoritmo SHAKE [30], vulgarmente utilizado para fixar comprimentos de ligação de modo a acautelar grandes deslocamentos dos átomos, mas ainda assim, permitir que a estrutura relaxe.

2.2.1 Parametrização

A validade dos cálculos da mecânica molecular depende das equações da energia potencial e dos valores numéricos dos parâmetros introduzidos nessas equações. A escolha de parâmetros é um ponto de grande importância, dado que dela depende a exactidão e validade do resultado.

O campo de forças CHARMM, que inclui parâmetros para os oligossacarídeos (por exemplo, para as ciclodextrinas) não possui parâmetros para compostos de lantanídeos com um número de coordenação alto.

Entre outros, a representação precisa do termo electrostático que é de fundamental importância para um campo de forças com aplicação a sistemas

- 4 4 -


com interacções intermoleculares complexas. Existem várias aproximações para a obtenção das cargas parciais, entre as quais o uso de um potencial electrostático de mecânica quântica. As cargas derivadas são muitas vezes dependentes de uma função de base, sendo uma função 6-31G* uma escolha consensual, sobrestimando uniformemente a polaridade molecular tal que gere as cargas adequadas para o uso de modelos de água empíricos como TIP3P, com efeitos de polarização implícitos incluídos. Estas cargas parciais não são habitualmente transferíveis e são dependentes da conformação molecular. O uso de cargas RESP [15] é uma saída possível para o problema, já que apresentam uma menor variabilidade na conformação do que os ESP padrão e o ajuste pode ser feito com uma metodologia de múltipla conformação [16].

Os parâmetros ligantes e de Van der Waals são normalmente resultantes dos dados experimentais disponíveis (raios-X e de R.M.N.) e por analogia com alguns parâmetros similares existentes no campo de forças.

2.3 Minimização de Energia

O objectivo de uma minimização de energia é a determinação de um conjunto de coordenadas representativas de uma conformação molecular, tal que a energia potencial do sistema corresponda a um mínimo, local ou global. Contudo, para sistemas macromoleculares, o número de mínimos locais é tão grande que essa tarefa se torna particularmente difícil ou impossível. Noutras situações, a minimização serve para fazer o refinamento de estruturas obtidas experimentais.

- 4 5 -


Todos os métodos de minimização levam a estrutura molecular em

estudo até um mínimo local na superfície de energia potencial, embora não

hajam garantias de que se trata de um mínimo global.

O CHARMM [10] contém vários algoritmos de minimização [17,18]: o

Steepest Descent (SD) [19], Gradiente Conjugado (CONJ) [20], Powell (PWE)

[21,22], Newton-Raphson (NRAP), Adopted Basis-set Newton-Raphson

(ABNR) [23], embora os mais usados neste trabalho tenham sido o SD, o

CONJ e o ABNR.

Dos métodos referidos o mais simples é o Steepest Descent. Neste

algoritmo a coordenadas dos átomos sofrem um deslocamento no sentido

contrário ao gradiente de energia potencial. Essa deslocação aumenta se a

energia do sistema diminui e reciprocamente diminui se a energia do sistema

aumenta. Apesar de ser de difícil convergência, os átomos sofrem apenas

deslocamentos suaves, sendo adequado para a remoção de "maus contactos",

como por exemplo, a sobreposição dos átomos.

O Gradiente Conjugado é apropriado para sistemas moleculares com

uma conformação inicial razoável. Além de efectuar o passo da minimização

como no método anterior, utiliza também o actual gradiente para a

determinação do próximo passo. Apresenta, relativamente ao Steepest Descent,

uma mais valia nas propriedades de convergência com o uso de um menor

número de passos pois possibilita maiores deslocamentos nas coordenadas.

Relativamente ao método ABNR, este apresenta um comportamento

muito semelhante ao do CONJ, embora o cálculo de energia seja reduzido em

cerca de duas a três vezes devido a empregar não só o gradiente da energia

potencial como também a segunda derivada em ordem às coordenadas dos

átomos. Devido à necessidade de armazenamento de informação e do número

de passos efectuados, este algoritmo é o mais conveniente para a maior parte

dos sistemas macromoleculares. Como cada um dos métodos apresenta

vantagens e desvantagens, geralmente conjugam-se os gradientes anteriores.

-46-


A minimização de energia embora não se trate de uma técnica eficiente

para explorar o elevado número de possíveis conformações de baixa energia, é

correntemente aplicada no refinamento de estruturas.

2.4 Método da Dinâmica Molecular (MD)

Presentemente, a técnica mais utilizada nas simulações de macromoléculas é a dinâmica molecular. É uma técnica de simulação dos movimentos moleculares que podem oscilar em torno de um mínimo, ou corresponder à passagem de um mínimo para outro, dependendo da energia do sistema. Neste trabalho, a energia do sistema é determinada pelo mesmo campo de forças aplicado na minimização, o CHARMM.

Este método é baseado na segunda lei de movimento de Newton ao longo do tempo, sendo cada átomo considerado como uma partícula que obedece a esta lei (N=n° de átomos):

Fi(t) = m ia i(t) = mi dt2 i=LN 2.8

sendo Fi (t) a força actuante no átomo i no instante t, que é dada pelo gradiente negativo da função de energia potencial:

E = - Vto1al(ii,r2,...,rN) ;i=\,N 2.9

-47-


ai é a aceleração do átomo i no instante t e ri a posição do átomo i no instante t. A integração sucessiva da equação [2.8] em função do tempo conduz à determinação da trajectória do átomo, que descreve as posições, as velocidades e as acelerações das partículas ao longo do tempo.

Todavia, para um sistema com muitas partículas e campos de força complexos a resolução da equação de movimento torna-se difícil, podendo mesmo não ter uma solução exacta. Para efectuar a integração das equações do movimento têm de ser usados vários algoritmos aproximados. Os algoritmos mais utilizados para este efeito são os de Runge-Kuíía [24], Gear [25], Beeman [26], Verlet [27], leap-frog [28].

2.4.1 Integração das equações de movimento

Para sistemas moleculares o método mais comum de integração é o

algoritmo de Verlet [27]. Este método permite a determinação das novas

posições dos átomos a partir das posições e acelerações dos passos anteriores.

Assim após um dado intervalo de tempo, At, as novas coordenadas dos átomos

são dadas por:

ri(t + At) = 2r i(t)-r j(t-At) + [F,(t)/mi](At)2+0[(At)4J 2.10

onde a última parcela é um termo de correcção de quarta ordem. De notar que apesar das velocidades atómicas não surgirem explicitamente neste algoritmo, estas podem ser calculadas pela expressão:

-48-


v. (t) = [r, (t + At) - r. (t - At)]/2At + o[(At)3 J 2.11

Outros métodos de integração frequentemente utilizados incluem os esquemas de modificações ao algoritmo de Verlet, no sentido de incluir as velocidades dos átomos de forma a permitir o acoplamento de um banho térmico (ver 2.4.2.) conduziram ao chamado algoritmo leap-frog [28]:

r, (t + At) = r, (t) + V; (t + At/2) At + O(At)3 2.12

v,(t + At/2) = Vj(t- At/2) + Sffl At + 0(At)3 2.13 m.

i

Sendo assim as novas coordenadas são determinadas a partir das posições e acelerações das etapas precedentes, bem como das velocidades nos tempos (t ± At/2); no primeiro passo da simulação o valor para (t-At/2) não existe. Em geral, para obter esse valor geram-se velocidades aleatórias para o sistema de acordo com a distribuição de Maxwell-Boltzmann a uma determinada temperatura, sendo possível o cálculo da temperatura do sistema em qualquer instante t usando a seguinte expressão [29]:

1 N , ,2 T = Y m v. , i=l,]V 2.14

(3N-n)kBtr i1 ''

onde A^éo número de átomos, (3N - n ) é o número de graus de liberdade não sujeitos a restrições, ABéa constante de Boltzmann e Vj (t) é a velocidade do átomo i no instante t.

Por conseguinte é possível então gerar uma trajectória, isto é, a história do movimento ao longo de um período de tempo, para sistemas moleculares

-49-


através da integração das equações do movimento de um modo iterativo até

atingir o desejado intervalo de tempo. O passo de integração, At, deve ser cerca

de uma ordem de magnitude menor que a maior frequência de movimento do

sistema (geralmente, as deformações dos comprimentos das ligações 1À

envolvendo átomos de hidrogénio são aproximadamente da ordem dos 10" s); At fica assim circunscrito a um intervalo de 0.5 a 2 fentosegundos (lfs = 10" s), sendo 0.5 fs o valor geralmente utilizado.

Para se conseguir uma maior amostragem do espaço conformacional (em tempo de simulação praticável, é habitual limitar os comprimentos de ligação aos seus valores de equilíbrio, sem que isso altere significativamente a dinâmica do sistema. O procedimento restritivo mais vulgar, é o processo SHAKE [30], que permite passos de integração maiores, no qual não existem forças mas restrições geométricas dado que não é aplicado nenhum potencial. Assim, quando se restringem apenas os comprimentos de ligação envolvendo átomos de hidrogénio ou quando se restringem todos os comprimentos de ligação, é recomendado utilizar em valores para At de 1 e 2 fs, respectivamente.

-50-


2.4.2 Simulações a Temperatura Constante

Quando as equações de movimento de Newton são integradas a energia

total do sistema é conservada. Se o volume se mantiver constante a simulação é

efectuada no denominado ensemble microcanónico (N,V,E - número de

partículas, volume e energia total constantes). Neste contexto, um ensemble não

é mais que um conjunto muito grande de réplicas imaginárias de um

determinado sistema e que formam o sistema global macroscópico. Os

ensembles permitem estudar apenas as características de uma das réplicas.

Porém, tem por vezes especial interesse simular sistemas que se

encontram a temperatura constante, ensemble canónico (N, V, T) e não a

energia total constante. Por outro lado, a maioria dos sistemas a estudar não

estão isolados, podendo portanto ocorrer trocas de energia sob a forma de calor

com o exterior. Para esse efeito pode acoplar-se um banho térmico externo

"fictício" à temperatura de referência T0 ao sistema em estudo. Tal pode ser

efectuado modificando as equações clássicas do movimento. Este processo foi

proposto por Berendsen e colaboradores [32]. O acoplamento do sistema a um

banho térmico que se encontra à temperatura de referência T0 é conseguido por

aplicação de forças dissipativas de Langevin ao sistema. A equação de

movimento toma então a seguinte forma:

m ^ =F, +miY[(T/T(t) -l)] ; i=l,...,N 2.15

em que o termo adicional diz respeito ao acoplamento ao banho térmico. T(t) é

a temperatura do sistema no instante t e y está relacionado com o inverso do

denominado tempo de relaxação xT de acordo com a equação xT = 1 / 2y.

- 5 1 -


Assim, as velocidades são ajustadas em cada passo de modo a que, durante a simulação, a variação de temperatura do sistema seja dada por:

AT = (T0/T(t))At/TT 2.16

O ajuste das velocidades atómicas em cada passo de integração é feito à

custa de um factor X tal que Vj(t +At/2) => X [v(t +Àt/2)], sendo:

^ = [l + At/iT((T0-T)-l)]1 / 2 2.17

Este método tem a vantagem de permitir um acoplamento, mais ou menos forte, que pode ser controlado pelo valor escolhido para TT. Quanto menor for xx (acoplamento mais forte ao banho térmico) maior será a rapidez com que a temperatura do sistema atinge o valor de referência. No entanto, tempos de relaxação muito baixos (acoplamentos demasiado fortes) provocam perturbações no sistema; valores entre 0.1 e 0.4 ps são recomendados.

Existem vários métodos para um acoplamento de um termostato. A diferença entre eles consiste essencialmente no modo como é estabelecido o contacto entre o sistema em estudo e o banho térmico com o qual se encontra em equilíbrio. Os mais utilizados são o de Berendsen [31] e o de Nosé-Hoover [32], embora o último seja o único que gera trajectórias no ensemble canónico e por essa razão foi escolhido para a realização deste trabalho.

-52-


2.4.3 Condições Periódicas de Fronteira

Os recursos computacionais actualmente disponíveis apenas permitem efectuar a simulação de um número limitado de partículas; contudo, os sistemas biomacromoleculares não são constituídos apenas por uma molécula, mas por moles de átomos e moléculas rodeados por água (solvente biológico por excelência).

Uma maneira de ultrapassar esta questão é executar essa simulação em vácuo, não incluindo explicitamente o solvente. Este método despreza as interacções soluto-solvente, o que para espécies iónicas, em que essas interacções são muito fortes, é claramente uma aproximação não apropriada. Para sistemas covalentes, em geral, este método não conduz a erros significativos.

Em relação às simulações em solução, uma forma de estudar o soluto rodeado por moléculas de solvente e simultaneamente o sistema com dimensões aceitáveis possibilitando a execução da simulação em tempo útil, consiste na imposição de condições fronteira periódicas [33]. Deste modo, a caixa cúbica central, de raio r e contendo N partículas é tratada como a célula original de uma rede infinita de células idênticas.

-53-


A molécula a solvatar é imersa numa caixa cúbica de água. Para

eliminar efeitos de superfície essa caixa é rodeada em todas as direcções por

réplicas, de tal modo que, sempre que uma partícula é movida, todas as réplicas

da partícula (imagens) se movem de forma idêntica, tal como se mostra na fig.

2.1.

\ O \

^^

o

1 * ~ O

\ o ^^

o

1 * ~ ^ W " " ' \ o \

o -o— r\ ' çfc —£j

o o -o— SBf̂ *

o

\

o— O

Figura 2.1 Representação esquemática das aproximações da imagem mínima e do corte esférico para uma rede periódica cúbica [34]

Para anular fenómenos de interacção de uma partícula com mais do que

uma imagem da mesma partícula, ou seja, de forma a assegurar uma imagem

mínima (a interacção entre um par de partículas é considerada apenas entre as

imagens mais próximas) são consideradas apenas as interacções a distâncias

inferiores a um limite definido desde o início. Para isso utilizam-se raios de

interacção (cutoff) menores que metade do lado da caixa.

-54-


È de realçar que outras formas geométricas de caixas, para além da

cúbica, podem ser consideradas, nomeadamente dodecaedros rômbicos e

octaedros truncados. Estas caixas, cuja estrutura se aproxima de uma esfera,

têm a vantagem (no caso de solutos esféricos ou de forma próxima) de

permitirem uma solvatação mais eficiente do que a caixa cúbica, por

diminuição do número de moléculas de solvente envolvidas. Contudo, o

CHARMM ainda não permite a implementação de outras formas de solvatação,

com condições periódicas, para além da caixa cúbica.

2.4.4 Passos de simulação

A simulação por dinâmica molecular consiste, genericamente, em

quatro ou cinco passos que são descritos sucintamente em seguida [35]:

1) Inicialização (Minimização)

Para uma simulação por dinâmica molecular é necessária uma estrutura

inicial do sistema, com todas as coordenadas definidas. Essa estrutura pode ser

obtida experimentalmente ou gerada num programa de desenho/grafismo

molecular, como por exemplo, o QUANTA. Antes de se iniciar a simulação é

necessário minimizar a energia do sistema de forma a relaxar a conformação da

estrutura e remover possíveis maus contactos por sobreposição de átomos, que

originariam problemas na integração numérica das equações de movimento.

2) Aquecimento

De um modo geral, as simulações são realizadas à temperatura

ambiente (298-300 K). Conquanto, a estrutura resultante da minimização

-55-


representa o sistema a 0 K. O aquecimento até à temperatura desejada é obtido

ajustando aleatoriamente as velocidades (segundo uma distribuição gaussiana)

de cada átomo em intervalos de tempo pré-determinados.

3) Equilibração

Quando o sistema atingir a temperatura à qual se pretende simular a

trajectória, é fundamental equilibrar o sistema. No decurso deste processo, as

velocidades dos átomos são periodicamente ajustadas para que a temperatura se

mantenha constante. Geralmente este procedimento é continuado até que as

propriedades estatísticas a serem calculadas se tornem independentes do tempo.

4) Produção

Depois do período de equilibração, o sistema deverá manter-se a

temperatura constante; guarda-se então a trajectória dos átomos ao longo de um

dado intervalo de tempo, de forma a poder avaliar-se o valor médio das

propriedades a estudar.

5) Arrefecimento

Este passo opcional leva a molécula desde a temperatura de

equilibração até zero. É uma forma de minimização, usando dinâmica

molecular para lentamente remover toda a energia cinética do sistema.

A simulação por dinâmica molecular gera assim um conjunto de

coordenadas e velocidades que representam as trajectórias dos átomos ao longo

do tempo. Essas trajectórias podem dar propriedades instantâneas ou médias ao

longo do tempo, dependendo das informações que se pretendem alcançar.

-56-



[I] Aider, B.J., Wainwright, T.E., J. Chem. Phys., 27, 1208 (1957).

[2] Aider, B.J., Wainwright, T.E., J. Chem. Phys., 31,459 (1959).

[3] Rahman, A., Phys. Rev., A136, 405 (1) (1964).

[4] Stillinger, F.H., Rahman, A., J. Chem. Phys., 60, 1545 (1974).

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[9] B.R. Brooks, R.E. Bruccoleri, B.D. Olfson, D.J. States, S. Swaminathan e

M. Karplus, J. Comp. Chem., 4, No 2, 187-217 (1983).

[10] A. D. MacKerell Jr., B. Brooks, C. L. Ill Brooks, L. Nilsson, B. Roux, Y.

Won, M. Karplus em The Encyclopedia of Computacional Chemistryl; P. v. R.

Schleyer e colaboradores, Eds.; John & Sons, Chichester, 1998,1, 271-277.

[II] A. D. MacKerell Jr., J. Wiórkiewicz-Kuczera e M. Karplus, J. Am. Chem.

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[12] M. Schlenkrich, J. Brickmann, A.D. MacKerell Jr e M. Karplus, K. M.

Merz Jr. E B. Roux editors (Birkhauser), 31-81 (1996).

-57-


[13] S. N. Ha, A. Giammona, M. Field, J. W. Brady, Carbohydr. Res., 180(2),

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[14] W. F. van Gunsteren, H. Berendsen, Angew. Chem. Int. Ed. Engl, 29, 992-

1023 (1990).

[15] C.I. Bayly, P. Cieplak, W.D. Cornell e P.A. Kollman, J. Phys. Chem.,

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[16] E. S. Henriques, M. Bastos, C. F. G. C. Geraldes e M. J. Ramos, Int. J.

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[17] R. Fletcher (ed.), Optimizattion, Academic Press, Nova Iorque e Londres.

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[18] W.H. Press, B.P. Flannery, S.A. Teukolshy e W.T Vetrrling, Numerical

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[19] B.R. Gelin, Ph.D. Thesis, Harvard University , Cambridge, MA (1976).

[20] R. Fletcher, C. M. Reeves, The Comput. Journ., 7, 149 ( 1964).

[21] M.J.D. Powell, Mathematical Programming, 12,241 (1977).

[22] W.F. Gunsteren e M. Karplus, J. Comp. Chem., 1, 266 (1980).

[23] B. Brooks, M. Karplus, Proc. Natl Acad. Sci., 80, 6571 (1983).

[24] W. H. Press, B. P. Flannery, S. A. Teukolsky e W. T. Vetterling,

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[25] C. W. Gear, Numerical Initial Value Problems in Ordinary Differential

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[26] D. Beeman, J. Comp. Phys., 20, 130 (1976).

[27] L. Verlet, Phys. Rev., 159, 98 (1967).

-58-


[28] W. van Gunsteren e H. J. C. Berendsen, Angew. Chem. Int. Ed. Engl, 29,

98. (1990).

[29] T. P. Lybrand, Reviews in Comp. Chem., 295-320, K. B. Kipkowitz e D. B.

Boyd eds., VCH Publishers Inc., New York (1990).

[30] J. P. Ryckaert, G. Ciccoti e H. J. C. Berendsen, J. Comp. Phys., 23, 327

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[31] H. J. C. Berendsen, J. P. M. Postma, W. F. van Gunsteren, A. DiNola e J.

R. Haak, J. Chem. Phys., 81, 3684 (1984).

[32] W. G. Hoover, Phys. Rev. A, A31, 1695 (1985).

[33] M. P. Allen e D. J. Tildesley, Computer Simulation of Liquids, Oxford

University Press, Oxford (1990).

[34] André Alberto de Sousa Melo, Tese de Doutoramento, Departamento de

Química - Faculdade de Ciências do Porto, Portugal, 1999.

[35] Maria Helena Monteiro Caçote, Tese de Mestrado, Departamento de

Química - Faculdade de Ciências do Porto, Portugal, 1996.

-59-

Capítulo 3 Ressonância Magnética Nuclear

Capítulo 3

>* A ♦

ssonancia Magnética ) * A . ^ *

Neste capítulo são apresentados de um modo sucinto alguns dos

princípios e aplicações da técnica de R.M.N., embora o trabalho experimental

se limitasse à relaxometria de interacções entre as ciclodextrinas e ligandos

paramagnéticos de Gadolínio (III).

3.1 Princípios

A Ressonância Magnética Nuclear é uma das técnicas espectroscópicas

mais importantes no estudo de sistemas biológicos, e na física e química do

-60-


estado sólido em geral. A sua importância advém do sucesso da sua aplicação

numa grande variedade de problemas, inclusive tecnológicos, como por

exemplo, na concepção de imagens de interesse médico de alta resolução

(I.R.M.) [1].

Esta técnica, constitui um exemplo de interacção da matéria com

radiação electromagnética, em que a energia é absorvida ou emitida segundo a

condição de frequência de Bohr |AE| = hv, sendo AE a diferença de energia

entre o estado final e o inicial da matéria em estudo, h a constante de Planck e v

a frequência da radiação [2].

São os núcleos dos átomos da amostra material que possuem um

momento magnético que intervêm neste fenómeno: ÁE diz respeito a estados

magnéticos nucleares que têm energia diferente quando a amostra é sujeita a

um campo magnético externo. Como os valores de AE relativos às transições

magnéticas nucleares são muito pequenos, a frequência v encontra-se dentro

dos valores típicos das radiofreqüências [2].

O núcleo de um átomo possui carga positiva. Quando os spins dos

protões e neutrões constituintes do núcleo não estão emparelhados, o spin total

do núcleo gera um dipolo magnético à volta de um eixo. A magnitude

intrínseca desse dipolo é uma importante propriedade nuclear chamada

momento magnético, JJ,:

y ih \x = — 3.1

271

y é denominada por relação magnetogírica e é uma constante para cada

nuclídeo; h é a constante de Planck.

- 6 1 -


HlXttor nwjpíjx.

Spwrtinj a ' * » *

Figura 3.1- Momento Magnético, u [3]

Se um núcleo com um spin igual a 1/2 for colocado sob a influência de

um campo magnético externo, o momento magnético do núcleo vai-se alinhar,

tanto na direcção como contra esse campo magnético.

O campo magnético aplicado produz um desdobramento dos níveis

degenerados de energia do spin nuclear, de forma que podem ser induzidas

transições entre eles como consequência da absorção de uma radiação

electromagnética apropriada:

-62-


a)

b)

H f

Figura 3.2- Níveis de energia a) antes, b) depois da aplicação de um determinado campo magnético B0 e c) com o aumento da intensidade do campo magnético a diferença de energia também aumenta.

A energia de um determinado estado energético é dada por:

E yh mB 3.2 m

onde Béa intensidade do campo magnético no núcleo.

-63 -


A diferença de energia entre os níveis (energia de transição) é então

representada pela expressão:

yhB A£ = - 3.3

2%

Isto significa que se o campo magnético, B, aumentar, também aumenta

AE:

Figura 3.2- Representação do aumento da diferença de energia entre os dois estados com o aumento da intensidade do campo magnético.

As experiências de R.M.N. são efectuadas com qualquer valor do

momento angular, mas geralmente usam as propriedades de núcleos com spin

igual a 1/2, como 'H, 15N, 13C, 19F e 31P.

-64-


Imagine-se um núcleo (com spin igual a 1/2) num campo magnético.

Este núcleo encontra-se no nível de energia mais baixo (isto é, o seu momento

magnético não se opõe ao campo magnético aplicado). O núcleo possui um

movimento de rotação em torno do seu eixo. Na presença de um campo

magnético, este eixo de rotação vai efectuar um movimento de precessão à

volta do campo magnético:

A frequência de precessão é designada por frequência de Larmor,

sendo idêntica à frequência de transição e a energia potencial de um núcleo que

sofreu precessão é dada por:

E = -fiBO 3.4

onde 0 é ângulo entre a direcção do campo magnético aplicado e o eixo de

rotação nuclear.

Se a energia é absorvida pelo núcleo, então o ângulo de precessão, 9,

mudará. Para um núcleo de spin 111, a absorção de radiação "sacode" o

momento magnético de forma que ele se oponha ao campo aplicado (o estado

de energia mais alto).

-65 -


f

(' - \ )

A . i - , v 3 *

* ' * - — ■*" ■* * *

Figura 3.3- Mudança de orientação do momento magnético nuclear.

É importante perceber que só uma pequena proporção do núcleo se

encontra no estado de energia mais baixo e pode absorver radiação. Existe a

possibilidade de ao excitar estes núcleos, a população do estado de energia mais

alto e mais baixo se torne igual. Deixa-se de detectar, então, absorção de

energia e diz-se que se produz saturação do estado de maior energia [1].

Existem mecanismos de relaxação pelos quais o sistema de spins

nucleares permuta com o meio circundante, permitindo o regresso de núcleos

ao estado de energia mais baixo.

Os processos de relaxação não implicam radiação espontânea, uma vez

que a probabilidade de isso ocorrer é muito pequena para níveis de energia

muito próximos. Tratam-se de transições induzidas por campos magnéticos

flutuantes, de apropriada frequência, que têm origem na agitação térmica do

meio. O tempo de relaxação é a velocidade com que cada núcleo liberta a sua

energia e relaxa até ao estado fundamental. A energia pode ser dispendida pelos

núcleos de dois modos: - numa relaxação T2, também chamada de relaxação

spin-spin, em que um núcleo cede a sua energia a outro núcleo, num processo

que não causa perda de energia nos núcleos à sua volta; - numa relaxação Ti, ou

relaxação spin-rede, na qual um núcleo cede a sua energia à sua vizinhança.

Para grandes quantidades de energia, a relaxação Ti leva a que haja um

aquecimento da vizinhança [4]

-66-

,-'"V'--\ \


3.2 Aplicações

Actualmente, a ressonância magnética nuclear encontra aplicações tão

variadas como na identificação de misturas e na elucidação estrutural de

substâncias, incluindo macromoléculas como polímeros e biopolímeros; no

estudo da mobilidade e flexibilidade de moléculas; na determinação de

constantes de associação de complexos; em cinéticas das reacções químicas; na

determinação tridimensional de moléculas com interesse biológico como

aminoácidos, proteínas; polissacarídeos (13C R.M.N. ), lípidos, enzimas,

RNA/DNA, etc, ou no estudo de processos de biossíntese e metabolismo; no

esclarecimento da estrutura de superfícies de sólidos especialmente na actuação

como catalisadores, e na caracterização estrutural de sólidos [2]. Muito

importantes são as aplicações in vivo, como por exemplo na determinação do

pH intra e extracelular.

A obtenção de imagens internas de amostras intactas (nomeadamente

do corpo humano), como já referenciado no primeiro capítulo, é outra aplicação

do fenómeno R.M.N. Sendo assim, a ressonância magnética nuclear passou a

ser motivo de atenção não apenas para bioquímicos, biólogos moleculares,

físicos e químicos, mas também para toda a comunidade médica.

-67-



[1] C.P.Slichter, Principles of Magnetic Resonance, Springer Verlag, Berlin,

(1996) [2] V. M. S. Gil e C. F. G. C. Geraldes, Ressonância Magnética Nuclear Fundamentos e aplicações> Fundação Calouste Gulbenkian, Lisboa (1987) [3] F. W. Wehrli, D. Shaw e J. B. Kneeland, Biomedical Magnetic Resonance Imaging, Principles Methodology and Applications, VCH Publishers New York

(1988) [4] R.Chang, Princípios Básicos de Espectroscopia, Ed. AC, Madrid (1971)

- 6 8 -

Capítulo 4 Resultados e Discussão

Capítulo 4

scussao

O trabalho realizado divide-se essencialmente em duas partes:

• Estudo de Modelação Molecular (Secção 4.1), no qual se construiu e

optimizou o modelo computacional do possível complexo de

inclusão entre a a-ciclodextrina e o GdDOTPMB.

• Estudos Relaxométricos (Secção 4.2), aos quais foram submetidos

complexos de poliazamacrociclos contendo o ião metálico Gd3+.

Avaliou-se a interacção entre estes complexos de Gd3+ e as

ciclodextrinas a e y, medindo a velocidade de relaxação dos protões

das suas soluções durante titulações.

-69-


A figura 4.1 reporta a estrutura esquemática dos quatro ligandos que se

coordenam com o gadolínio (III) e que foram estudados neste trabalho: o

DOTA, o DOTP, o DOTPMB e o DTPAHpA2.

O I

HO-C

R \ / \ / R

/ N N

\

R

N N / \ / \ R

a) DOTA: R = CH2COO DOTP: R = CH2P03

2

DOTPMB: R = CH2P02(OCH2CH2CH2CH3)

N N

C-OH I O

O I C-OH

C-R I O

b) DTPA-HPA2: RI = R2 = NHC7H15

Figura 4.1- Fórmulas estruturais do DOTA, do DOTP, do DOTPMB e do DTPAHpA2.

-70-


4*1 Estudos Teóricos

4.1.1. Geometrias iniciais

Para a a-ciclodextrina na forma não complexada foram já efectuados

vários estudos experimentais, nomeadamente cristalografia de raios-X e

difracção de neutrões, tendo-se concluído que esta ciclodextrina cristaliza sob

três formas diferentes: a-CD.6H20 (forma I e II), em água pura, e (a-

CD.2.57).5H20 (forma III), numa solução 1.2 M de BaCl2. Neste estudo,

considerou-se como estrutura representativa da a-ciclodextrina, não

complexada, a forma I [1], uma vez que esta é considerada preferencial (Figura

4.2).

Figura 4.2- Estrutura da a-ciclodextrina na forma I [1]

- 7 1 -


Para fazer o modelação do complexo GdDOTPMB, considerou-se o

modelo do TmDOTP (Anexo A) [2], no qual se efectuaram mutações num dos

oxigénios do grupo P034" acrescentando a este mais uma ligação a um grupo

butil. É de realçar que, por razões computacionais, só se efectuou a modificação

para um dos oxigénios. Como anexo, é apresentado o ficheiro de topologia

resultante (GdDOTPMB.RTF) (Anexo B).

Na figura 4.3 é representada a estrutura do complexo GdDOTPMB:

Figura 4.3- Estrutura do complexo GdDOTPMB completo (neste trabalho só se considerou uma das "pontas").

- 7 2 -


Como a cavidade da a-ciclodextrina é pequena comparativamente às

congéneres (3 e Y_cicl°dextrinas, julga-se que a parte incluída na a-

ciclodextrina será o grupo butilo do complexo GdDOTPMB. Seguindo esta

linha de pensamento, realizou-se uma pesquisa (Cambridge Database) de

estruturas cristalográficas de complexos de inclusão entre a a-ciclodextrma e

estruturas semelhantes ao grupo butilo com vista não só a esclarecer o

mecanismo de inclusão, como também a inferir, por analogia, possíveis

características de um complexo entre a a-ciclodextrina e o GdDOTPMB.

Seleccionou-se dentro das estruturas encontradas e disponíveis através

de coordenadas cristalográficas, o complexo de inclusão entre a a-ciclodextrina

e o ácido 3-iodopropanoíco pentahiidratado [3] (Figura 4.4).

Figura 4.4 Estrutura cristalográfica do complexo de inclusão entre a a-ciclodextrina e o ácido 3-iodopropanoíco pentahiidratado [3]

- 7 3 -


De seguida foram sobrepostas as três estruturas: a a-ciclodextrina

inicial com remoção das moléculas interiores, o modelo computacional do

GdDOTPMB e o complexo de inclusão considerado e fez-se uma analogia com

as posições determinadas experimentalmente. A partir daqui foi possível

construir um modelo inicial para a estrutura de um possível complexo de

inclusão do GdDOTPMB no interior da cavidade da a-ciclodextrina (Figura

4.5).

Figura 4.5 Modelo computacional inicial do complexo de inclusão entre a a-ciclodextrina e o GdDOTPMB.

- 74 -


4.1.2 Parametrização

Como já foi referido no capítulo dois, a representação correcta de todos os parâmetros, particularmente o termo electrostático é de crucial importância para um campo de forças aplicado a sistemas com interacções intermoleculares complexas.

No sistema estudado, a parametrização da a-ciclodextrina não apresentou quaisquer problemas dado que o campo de forças CHARMM está parametrizado para oligossacarídeos [4].

Contudo, para compostos de lantanídeos com alto número de coordenação, o CHARMM não possui parâmetros. Relativamente aos parâmetros internos dos ligandos admite-se que sejam transferíveis dos que existem no campo de forças CHARMM e das estruturas experimentais disponíveis com a excepção daqueles que estejam envolvidos com os átomos doadores. Então, Henriques e colaboradores [2] desenvolveram um conjunto de parâmetros consistentes com o campo de forças CHARMM e testados em simulações de dinâmica molecular de vários quelatos DOTA- e DOTP-Ln(III).

Como o complexo estudado GdDOTPMB é estruturalmente semelhante a um dos complexos (TmDOTP) para o qual se testaram o conjunto de parâmetros atrás referidos, com a excepção de ter um dos oxigénios do grupo P03

4" substituído com um grupo butilo (C4H9), fez-se uma aproximação que consistiu na utilização dos parâmetros obtidos para o TmDOTP, aos quais se acrescentou uma proposta de distribuição de carga para o grupo mutado. Esta distribuição de carga foi feita utilizando cálculos ab initio a nível Hartree-Fock [12] com uma base 6-31G*. A partir daí obtiveram-se as cargas atómicas que reproduzem os potenciais electrostáticos moleculares.

- 7 5 -


Na tabela 4.1 apresenta-se as cargas finais consideradas:

Átomo Tipo DOTPMB * * *

GD MGD 2.068 N* NT -0.242 Oi OS -0.700

Oil, 02/ OC -0.750 Pï P03 0.919 Ci C —

CU,C2i CT -0.029 C3i CT -0.410 H/7 HA 0.004

H5Í, H61 HA 0.104 T» 5|» fC 5jî SjC îjC

P3 P03 0.556 04 0 -0,641

011 OS -0,331 C13 CT -0,331 C14 CT 0,381 C15 CT -0,302 C16 CT 0,067 H25 HA 0,067 H26 HA 0,070 H27 HA 0,070 H28 HA -0,057 H29 HA -0,069

H30 HA 0,092 H31 HA 0,072 H32 HA 0,156 H33 HA 0,093

* a partir de [2] ** novas cargas calculadas neste trabalho

ij=l to 4

Tabela 4.1 Cargas obtidas para o complexo GdDOTPMB

-76-


4.1.3. Análise Conformacional

De modo a descobrir qual será a melhor posição da molécula hóspede no interior da cavidade da molécula hospedeira e para prever qual a melhor posição relativamente à ligação do butano ao oxigénio, se ligado ao 06 ou ao Ou, executou-se uma análise sistemática apropriada utilizando a técnica de mecânica molecular para minimizar a energia das resultantes estruturas conformacionais diferentes.

A estrutura inicial do GdDOTPMB foi ajustada, colocando o último carbono do butano a uma distância de 1.001 Á do plano formado pelos átomos de oxigénio anoméricos das unidades de glucose da molécula de a-ciclodextrina e a rotação escolhida foi em torno da ligação entre o oxigénio do grupo fosfato e o primeiro carbono do butano. Esta distância foi então incrementada em passos de cerca de 0.3 Á até 12.41 Â, distância na qual as energias de interacção se tornaram desprezáveis.

Note-se que se fez este estudo para duas estruturas diferentes, representativas da posição onde o grupo butilo se vai ligar: o 06 e o 011

As Figuras 4.6 e 4.7 representam respectivamente, a representação esquemática da energia das estruturas mínimas resultantes da análise conformacional para as duas posições consideradas e a representação da energia intermolecular em função da distância.

-77-


7 9

Distância (Â) H 13

8 34U - * w 320 (0 o 300 <ü ^ õ g CL E 280 CO O) 260 i _ CD c 240 LU

220

200

'11

10

Distância (A)

Figura 4.6 Representação esquemática da energia das estruturas mínimas

resultantes da análise conformacional para as duas posições consideradas:

ligação (VButano ou On-Butano.

- 7 8 -


Para o 0 6 :

30

25

20

a is

i - - 10

§

1 °

-10

-15

E.Electrostática LVan der Waals

E. Intermolecular

3,5 4,5 5,5 6,5 7,5 8,5 9,5

Distância / À 10,5 11,5 12,5 13,5

Para o Ou:

5 !

\ 3

S í

•» -3

I < "3

-9 i £ -11 • S - ! 3 w

-15

£ ~ > ^

3,5 4,5 5,5 6,5 7,5 8,5 9,5

Distância / Â 10,5 11,5 12,5 13,5

Figura 4.7 Energia intermolecular (kcalmol" )

- 7 9 -


4.1.4 Minimização de Energia

A estrutura modelada anteriormente foi então optimizada, de forma a

minorar possíveis impedimentos estereoquímicos e a refinar as interacções intra

e intermoleculares. Para tal, utilizou-se como técnica de minimização, o método

Steepest Descents, nos primeiros mil passos, para eliminar contactos

estereoquímicos desfavoráveis. Finalizados esses mil passos iniciais recorreu-se

a um método que permite uma melhor convergência no valor da energia, o

Adopted Basis-set Newton-Raphson (ABNR), através de dez mil passos de

minimização.

MODELO a C D GdDOTPMB aCD:GdDOTPMB

ENERGIA TOTAL 64.2578 175.8638 135.5455

CONTRIBUIÇÕES INDIVIDUAIS DOS TERMOS DE:

Comprimentos de 2.7437 100.07919 7.7742 ligação

Ângulos de ligação 21.3441 70.6315 132.0832

Ângulos diedros 137.9370 0 207.0865

van der Waals -26.5619 -12.8589 -54.2068

Electrostático -71.2050 15.3194 -157.1916

Tabela 4.2 Energia (kcal mol"1) para as estruturas optimizadas.

-80-


Dos dados obtidos na tabela anterior pode-se inferir na possibilidade de

formação do complexo de inclusão. Efectivamente, como a energia do

complexo a-CD:GdDOTPMB é mais baixa do que a soma das energias de cada

um dos monómeros existe a possibilidade de a formação do complexo de

inclusão ser estável.

cc-CD +GdDOTPMB <̂> ct-CD:GdDOTPMB

Após se equacionar a melhor estrutura considerou-se essa geometria para as simulações de dinâmica molecular realizadas em solução (Figura 4.8).

Figura 4.8 Modelo computacional optimizado do complexo de inclusão entre a a-ciclodextrina e o GdDOTPMB, utilizado para as simulações de DM.

- 8 1 -


4.1.5. Dinâmica molecular

4.1.5.1 Condições da simulação

Todas as simulações de dinâmica molecular foram realizadas utilizando

o programa computacional CHARMM num processador alpha-digital EV (600

MHz).

O sistema em estudo foi centrado numa caixa cúbica com 40.355925 Á

de lado contendo inicialmente 2197 moléculas de água equilibradas (TIP3P).

Destas, todas as moléculas que distem 2.6 Â de átomos do soluto (que não

sejam hidrogénio) foram removidas (Figura 4.9).

A caixa foi depois sujeita a condições periódicas de fronteira (imagem

mínima), As interacções ocorridas a distâncias maiores que 15 Â foram

truncadas.

O complexo de inclusão a-CD:GdDOTPMB foi estudado uma

ensemble canónico, utilizando o Termostato de Nosé-Hoover, a uma

temperatura igual a 300 K com uma constante inerte de acoplamento térmica de

100 kcal.s e um tempo de integração de 1 fs. De modo a restringir todas as

ligações contendo hidrogénios utilizou-se o processo restritivo SHAKE [5]

fixando também a posição do Gadolínio. O tempo total da simulação foi igual a

500 ps e as trajectórias foram gravadas em intervalos de 0.02 ps.

-82-


Figura 4.9 Figura exemplificativa da solvatação.

- 8 3 -


4.1.5.2 Resultados obtidos

Atendendo à técnica utilizada na simulação (dinâmica molecular), as

propriedades calculadas reflectem, como já foi referido no capítulo 3, a

evolução do sistema equilibrado durante a produção. A validade dos resultados

assim obtidos é determinada pela equilibração da temperatura a 300 K

(temperatura de produção) e pela variação da energia potencial em torno de um

valor médio durante os 500 ps de produção.

Nas figuras seguintes apresentam-se gráficos de monitorização destes

parâmetros (Temperatura, Energia potencial média) em função do tempo de

simulação.

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450

Tempo de simulação, ps

Figura 4.9 Representação gráfica da variação da Temperatura média ao longo dos 500 ps de simulação.

-84-


-1.8

-1.9

-2

-2.1

-2.2

x10 Total

ù^Mtmm^^

-1.95 x10

-2 -

-2.05

-2.1

-2.15

I I I I Electrostática

I I I i

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500

Tempo de simulação, ps

Figura 4.10 Representação gráfica da energia potencial média ao longo dos

500 ps de simulação.

- 8 5 -


Das representações gráficas anteriores pode-se concluir que os sistema,

aquando da produção, se encontra realmente equilibrado. Sendo assim, as

propriedades energéticas e estruturais médias, determinadas durante esse

período correspondem de facto a sistemas equilibrados.

Estas simulações mostram também uma fraca associação entre o

GdDOTPMB e a a-CD.

A estrutura média final obtida é a seguinte:

Figura 4.11 Estrutura média obtida após a simulação.

-86-


Pelos resultados obtidos verifica-se que o GdDOTPMB não tem

tendência para se incluir na cavidade da a-CD, talvez por razões

estereoquímicas devido ao tamanho do complexo de gadolínio (III), existindo

portanto uma associação fraca entre os dois sistemas estudados.

Como não se verificou uma modificação conformacional importante no

decorrer da dinâmica molecular pode-se considerar como satisfatório o modelo

considerado.

Teria especial interesse prosseguir este estudo com análises mais

detalhadas que deverão ser comparadas com dados experimentais (R.M.N, e

cristalográficos) quando disponíveis.

Na secção seguinte é feito um estudo da relaxividade do GdDOTPMB,

entre outros, e do incremento desta na presença da a-ciclodextrina.

-87-


4.3 Estudos Relaxométricos

Como já referido, os lantanídeos têm a capacidade de induzir relaxação

nos protões vizinhos. Os iões paramagnéticos alteram as propriedades dos

diferentes tecidos incrementando as velocidades normais de relaxação (1/Ti e

1/T2) dos protões da água, que por sua vez são factores determinantes no

contraste em I.R.M.. O metal paramagnético é transportado e protegido pelo

ligando orgânico com o qual forma um quelato estável e cineticamente inerte.

Esta quelatação reduz em grande escala a toxicidade, enquanto o centro

paramagnético mantém as suas propriedades de relaxação [6].

Neste trabalho, utilizou-se como técnica de caracterização, a

relaxometria. Foram executada medições das velocidades de relaxação

longitudinais dos protões do solvente (l/Ti ou Ri), a 20 °C, utilizando um

relaxómetro MRS-4 (Joseph Stefan Institute, Ljubbliana, Slovenia) operando a

9 mHz. Os valores de Ti foram medidos utilizando o método da inversão-

recuperação [7], que como o nome indica procede-se à inversão da

magnetização, através de um impulso de 180°, e deixa-se de seguida recuperar

durante um período de tempo T .

90"

P — i !

>

1»°:. soi-

Figura 4.12 Comportamento do vector magnetização numa experiência de inversão-recuperação [8].

-88-


4.3.1 Determinação da relaxividade do Complexos de Gd

A relaxividade induzida pelo ião paramagnético nos protões da água é

característica para cada quelato, a uma determinada temperatura e frequência.

As velocidades de relaxação dos protões do solvente (Ri) aumentam

linearmente com a concentração da espécie paramagnética [GdL]. Assim,

representando o Ri em função da [GdL], obtém-se uma recta cujo declive será a

relaxividade do quelato paramagnético e a ordenada na origem representa a

relaxividade da água.

4.3.1.1 Determinação da relaxividade do GdDOTP

A relaxividade do GdDOTP foi obtida medindo, a 9 MHz e a 298 K, as

velocidades de relaxação longitudinal dos protões do solvente (Rlob8) de soluções

aquosas do quelato de Gd (111) a diferentes concentrações (Figura 4.13).

Relaxividade do GdDOTP

80 60

t 40 20 0

0 5 10 15 20 25 [GdDOTP], mM

Figura 4.13 Representação gráfica do Ri0bS em função da concentração de GdDOTP (a 9 MHz e a 298 K)

y = 3,2274x+ 1,734 R2 = 0,9983

-89-


Representando Ri0bs em função da concentração de GdDOTP, obteve-

se uma recta cuja ordenada na origem representa a relaxividade da água a esta

temperatura e sob influência deste campo magnético, e cujo declive (RO é igual

ao valor da relaxividade do quelato, segundo a seguinte equação:

Ri obs = R. d + Ri [GdDOTP] [4.1]

O valor de Rj obtido foi de 3.23 s"1, que está próximo do encontrado na

literatura [9].

4.3.1.2 Determinação da relaxividade do GdDOTA

Determinou-se a relaxividade dos complexos de Gd31 estudando os

tempos de relaxação de soluções a diferentes concentrações de quelato,

partindo de uma solução preparada previamente.

Relaxividade do GdDOTA

10 15 [GdDOTA], mM

20 25

Figura 4.14 Representação gráfica do Ri0bS em função da concentração de GdDOTA (a 9 MHz e a 298 K)

- 9 0 -


Ao representar os valores de Ri0t,s em função da concentração do

quelato, obteve-se uma recta de equação:

Ri obs = 2,0044 + 3,9837 [GdDOTA] [4.2]

f-i ~-i Assim a relaxividade de GdDOTA seria 3.98 mM" .s", mas o valor de

relaxividade publicado [9] para este quelato é de 7.2 (a 23° C e 10 MHz), razão

pela qual se fez um reajuste das soluções a utilizar.

4.3.1.3 Relaxometria do GdDTPAHpA2

Efectuaram-se, da mesma forma que para os quelatos anteriores, medições da relaxividade do GdDTPAHpA2 em função da diferentes concentrações:

Relaxividade do GdDTPAHpA2

150 -

^ 100

* 50

0 H

(

y = 7,7915x-3,8976 ^ ^ > R2 = 0,9916 ^ - ^ " ^

*

150 -

^ 100

* 50

0 H

( ) 5 10 15 20

[GdDTPAHpA2], ntifí

! 25

Figura 4.15 Representação gráfica do Ri0b3 em função da concentração de GdDOTA (a 9 MHz e a 298 K)

R, obs = 7,7915 [GdDTPAHpA2] - 3.8976 [4.3]

O valor obtido para a relaxividade é 7.79 mM_1.s ' vaior próximo do obtido na literatura [10].

- 9 1 -


4.3.2 Interacção dos Complexos de Gd com Ciclodextrinas

Normalmente empregam-se em I.R.M. campos magnéticos de 0.5-1.5 T

(correspondentes a frequências de Larmor de protão de 20-60 MHz). Nestas

condições, a capacidade dos quelatos de Gd3+ para aumentar a velocidade de

relaxação longitudinal dos protões do solvente é determinada fundamentalmente

pelo seu tempo de reorientação molecular, TR. Assim, aumentando este parâmetro

consegue-se incrementar a velocidade de relaxação dos protões da água.

Uma forma de obter valores longos de TR consiste em formar conjugados

covalentes entre o complexo paramagnético e substratos poliméricos que sofrem

difusão rotacional lenta, como a albumina, a polilisina, o dextrano e os

dendrímeros. Uma hipótese alternativa para aumentar o valor de xR é através da

formação de interacções hospedeiro-hóspede entre os quelatos paramagnéticos e

macromoléculas que rodam lentamente.

Assim, a formação de uma estrutura supramolecular de inclusão de um

agente de contraste no interior de uma ciclodextrina dará lugar por um lado a um

possível aumento da sua relaxividade e por outro a uma alteração da sua

biodistribuição in vivo. Sherry e colaboradores [11] estudaram por Espectroscopia de R.M.N, a

formação em solução aquosa de um complexo hospedeiro-hóspede muito fraco

entre y-ciclodextrina e o complexo macrocíclico Tm(DOTP)5". Mais recentemente,

Geraldes e colaboradores estudaram as interacções entre a a-, (3- e y-ciclodextrinas

e os quelatos formados pelos poliazamacrociclos DOTA e NOTA e o ião O i

lantanídeo Tm . Só observaram interacções entre a y-ciclodextrina e o Tm(DOTA)".

Os dados obtidos por estudos relaxométricos de compostos paramagnéticos têm uma grande sensibilidade para reflectir a formação de

- 9 2 -


compostos de inclusão, assim como para a determinação das suas constantes de

equilíbrio.

A interacção entre um complexo paramagnético (M) com uma

macromolécula (A) é descrito pelo equilíbrio:

M + nA <r> MA [4.3]

A constante de dissociação, KD, é

KD = [MT][«AT]/[MA] [4.4]

O incremento observado na velocidade de relaxação dos protões da água

(ARP- Aumento na relaxação dos protões ou 8*), devido à ligação não covalente

do complexo metálico à macromolécula é o resultado de um tempo de

reorientação, xR, mais longo para as espécies MA. O valor de c é dado pela

equação

8* = Rlp*/Rlp [4.5]

onde o asterisco indica a presença da macromolécula em solução.

O aumento na relaxação dos protões da forma ligada eB, relaciona-se

com o aumento observado s , segundo

£* = XBeB + (l-XB) [4.6]

onde XB é a fracção molar da forma ligada, que se relaciona com a constante de

dissociação, KD, segundo a equação

- 9 3 -


a = (8 - 1 ) / (sB - 1 ) = [nA]T / (KD + [nA]T) [4.7]

Os parâmetros n, KD e SB, determinam-se experimentalmente por R.M.N. .

Titulando uma solução de M com quantidades variáveis de A podemos obter KD/W

e sB. De facto, da Equação 3.7 obtemos

l/(e*-l) = 1/[«A]F x KD/(8B - 1) + 1/(8B - 1) [4.8]

e para situações onde A está em excesso, pode-se supor que [A]F « [A]T . Assim,

representando l/(s -1) em função de 1/[«A]T, obter-se-á uma linha recta, cujo

declive será K D /«( £ B - !)•

4.3.2.1 Interacção entre a y-ciclodextrina e o GdDOTP

A interacção entre o complexo de GdDOTP e a y-ciclodextrina foi

investigada medindo a velocidade de relaxação dos protões das suas soluções.

Foi feita uma titulação de uma solução de GdDOTP (1 mM) e y-CD (5

mM); aumenta-se a concentração da y-CD mantendo constante a concentração

do quelato, 1 mM.

-94-


Titulação de GdDOTP com a y-CD

10 -,

.r» 8 -IA

v" 6 -S JE 4 -

IA v" 6 -S JE 4 - ■-*""* £ 2 -

n

0 0,1 0,25 0,5 0,75 1 2 3 5

p ■ [y-CD]/[GdDOTP]

Figura 4.16 Representação gráfica da relaxividade observada em função da p ([y-

CD]/[GdDOTP]) (a 9 MHz e a 298 K)

A y-CD possui uma cavidade hidrofóbiea, razão pela qual não é esperada

qualquer observação de nenhum tipo de interacção forte (Coulomb) entre o quelato

e o oligossacarídeo para além de uma possível inclusão tipo hóspede-hospedeiro.

Tal interacção poderia ter como consequência uma diminuição da dinâmica

rotacional do composto (xR mais longo), do que derivaria um incremento na

velocidade de relaxação das moléculas de água.

Dos dados obtidos (Figura 4.16) observa-se que não há qualquer

interacção forte, já que não se vê nenhum incremento importante na velocidade de

relaxação dos protões da água, quando a razão molar de y-CD/GdDOTP aumenta,

tendendo a fazer variar a fracção de GdDOTP ligada à y -CD. Assim, a interacção,

a existir, é muito fraca. Este resultado está de acordo com aqueles obtidos por

Geraldes e colaboradores [11], que estudaram por R.M.N. os desvios induzidos

pelo Tm(DOTP)5" quando este está em presença de ciclodextrinas com diferentes

tamanhos (a, (3, e y), observando-se só interacção com a maior delas, a y.

-95-


4.3.2.2 Interacção entre Gd(DOTA) e y-ciclodextrina

O Gd(DOTA)", tem uma carga efectiva muito pequena, assim sendo, e se

for estereoquimicamente possível, poderá entrar no interior da cavidade

hidrofóbica da y -ciclodextrina.

Titulação de GdDOTA com a y-CD

- . 10 -"w 8 -i ;■

* i-

i ;■

* i-0 0,1 0,25 0,5 0,75 1 2 3 5

p = [y-CD]/[GdDOTA]

Figura 4.17 Representação gráfica da relaxividade em função de p = [y -

CD]/[GdDOTA) (a 9 MHz e 298 K)

Representando a relaxividade em função de p ([y-CD]/[GdDOTA) nota-se

que não existe interacção forte entre o quelato de Gd3+ e a y-CD, embora se

verifique um ligeiro incremento no valor da relaxividade até alcançar um valor

máximo, ponto onde possivelmente terá uma interacção um pouco mais forte.

Estes dados indicam-nos a possibilidade da formação de um complexo

com estequiometria 1:1.

-96-


4.3.2.3 Interacção entre GdDTPAHpA2 e a-ciclodextrina

Foi preparada uma solução mistura de GdDTPAHpA2 (lmM) (5mM) e a-

CD (5 mM) e estudou-se o tempo de relaxação dos protões da água das suas

soluções.

Titulação de GdDTPAHpA2 com a a-CD

12 íp 10 ^ 8 -à e 1 4 £ 2-

0

B : , :: m :: : : ::

12 íp 10 ^ 8 -à e 1 4 £ 2-

0 i i i i' i i i

0 0,1 0,25 0,5 0,75 1 2 3 5

p = [g-CD]/[GdDTPAHpA2]

Figura 4.18 Representação gráfica da relaxividade em função p = [y -

CD]/[GdDTPAHpA2] (a 9 MHz e 298 K)

Representando a relaxividade em função de p ([y -CD]/[GdDTPAHpA2])

deduz-se que não há interacção forte entre o quelato de Gd e a y-CD, pois não é

observado nenhum incremento apreciável no valor da relaxividade à medida que a

concentração de CD aumenta.

-97-


4.3.2.4 Interacção entre GdDOTPMB e a-ciclodextrina

O procedimento experimental da titulação foi o mesmo que aquele

empregado no casos anteriores.

-S0.8 Í.0,6 f 0,4 •=•0,2 * 0

0 0,1 0,25 0,5 0,75 1 2 p ■ [a-CD]/[GdDOTPMB]

Figura 4.19 Representação gráfica da relaxividade em função do pH de uma

solução mistura de GdDOTPMB (lmM) e a-CD (5mM)

Representando a relaxividade em função de p ([y -CD]/[GdDOTPMB]) O i

deduz-se que não há interacção forte entre o quelato de Gd' e a a-CD, pois não é

observado nenhum incremento apreciável no valor da relaxividade à medida que a

concentração de CD aumenta. Pelo contrário, nota-se um ligeiro decréscimo na

relaxividade.

-98-



[I] B. Klar, B. Hingerty e W. Saenger, Acta Crystallogr., 94, 8881 (1980)

[2] ] E. S. Henriques, M. Bastos, C. F. G. C. Geraldes e M. J. Ramos, Int. J.

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Soe. Jpn., 1, 173 (1983)

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M.J. Field, S. Fischer, J. Gao, H. Guo, S. Há, D. Joseph-McCarthy, L. Kuchnir,

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9620(1993

-99-

Capítulo 5 Conclusões

Capítulo

Conclusões

Com este trabalho procurou-se estudar a possível interacção, em

solução, entre vários quelatos paramagnéticos de gadolínio (III) com

ciclodextrinas de modo a melhorar a relaxividade daqueles complexos.

Dos estudos teóricos conclui-se que o GddOTPMB não tem tendência

para se incluir na cavidade da ct-ciclodextrina, provavelmente devido a razões

estereoquímicas, existindo apenas uma associação fraca.

O estudo inicial no qual se optimizou o sistema modelo constituído

pela ct-ciclodextrina e o GdDOTPMB, apontou para uma interacção

energeticamente mais favorável quando o grupo butilo do GdDOTPMB se

encontra no interior da cavidade da ciclodextrina junto da sua base mais larga.

Nas simulações efectuadas confirmou-se esta observação com a

diferença da inclusão não ser tão profunda, isto é, existe uma fraca interacção

-100-

Capítulo 5 Conclusões

entre as duas moléculas. O grupo butilo não entra por completo na cavidade da

a-ciclodextrina e adopta uma conformação equatorial, junto da base mais larga,

optimizando a interacção entre os grupos hidróxilo.

Um estudo mais aprofundado sobre o modelo completo seria, sem

dúvida, de todo o interesse para esclarecer algumas dúvidas inerentes a este

trabalho.

Dos estudos de relaxometria, confirma-se a fraca associação, em

solução, entre as várias ciclodextrinas e os quelatos de Gadolínio (III)

estudados, com a ligeira excepção da associação entre o GdDOTA e a y -

ciclodextrina, que apresenta um incremento no valor da relaxividade.

Conclui-se que a adição, em solução, de ciclodextrinas a todos os

quelatos macrocíclos de gadolínio (III) provoca um pequeno melhoramento na

velocidade de relaxação dos protões do solvente (Ri). Dado que o incremento

em Ri não é muito significativo prevê-se que a interacção entre os

poliazamacrocíclos de Gd e as ciclodextrinas estudadas seja fraca.

Teria grande interesse o estudo destes sistemas pela técnica conhecida

como D.R.M.N. (dispersão da relaxação magnética nuclear), que consiste na

investigação da dependência das velocidades de relaxação dos protões do

solvente face à intensidade do campo magnético externo (B0) aplicado à

amostra (ou da respectiva frequência de Larmor, ©i). É de esperar que as

diferenças no valor da relaxividade, Ri? entre o quelato e o complexo de

inclusão sejam diferentes para as distintas frequências. A caracterização das

moléculas "hóspede", "hospedeiro" e dos respectivos complexos de inclusão

por R.M.N. e da influência do pH revelar-se-iam, com toda a certeza, como um

importante complemento a esta investigação

-101-

Anexos

-102-

Anexo A

-103-

014

011

022

DOTP

Anexo B

-105 -

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22 0

UTOGENERATE ANGLES DIHE EFA FIRS NONE LAST NONE

.ESI D 2 7 9 - 4 . 0 0 0 1ROUP TOM C13 CT - 0 . 3 3 1 LTOM C 1 4 CT 0 . 3 8 1 .TOM H2 5 HA 0 . 0 67 TOM H26 HA 0 . 0 7 0 LTOM H27 HA 0 . 0 7 0 ,T0M C 1 5 CT - 0 . 3 02 LTOM H2 8 HA - 0 . 0 5 7 ^TOM H29 HA - 0 . 0 6 9 ÍLTOM C16 CT 0 . 0 6 7 ^TOM H3 0 HA 0 . 0 9 2 iTOM H 3 1 HA 0 . 0 7 2 iTOM H32 HA 0 . 1 5 8 VTOM H3 3 HA 0 . 0 9 3 VTOM GDI MGD 2 . 0 6 8 VTOM N l NT - 0 . 2 42 VTOM N2 NT - 0 . 2 4 2 VTOM N3 NT - 0 . 2 4 2 VTOM N4 NT - 0 . 2 42 VTOM 0 1 OS - 0 . 7 0 0 VTOM 0 3 OS - 0 . 7 0 0 VTOM 0 5 OS - 0 . 1 7 6 VTOM 0 7 OS - 0 . 7 0 0 VTOM C I CT - 0 . 0 2 9 VTOM C2 CT - 0 . 0 2 9 VTOM C3 CT - 0 . 0 2 9 VTOM C4 CT - 0 . 0 2 9 VTOM C5 CT - 0 . 0 2 9 VTOM C6 CT - 0 . 0 2 9 \TOM C7 CT - 0 . 0 2 9 ÎVTOM C8 CT - 0 . 0 2 9 ?VTOM P I P 0 3 0 . 9 1 9 ÎVTOM C9 CT - 0 . 4 1 0 ATOM P4 P 0 3 0 . 9 1 9 iVTOM C10 CT - 0 . 4 1 0 ATOM P3 P 0 3 0 . 5 5 6 ATOM C l l CT - 0 . 4 1 0 ATOM P2 P 0 3 0 . 9 1 9 ATOM C12 CT - 0 . 4 1 0 ATOM 0 2 O - 0 . 7 50 ATOM 0 4 0 - 0 . 7 50 ATOM 0 6 O - 0 . 3 3 1 ATOM 0 8 0 - 0 . 7 5 0 ATOM H I HA 0 . 0 0 4 ATOM H2 HA 0 . 0 0 4

VTOM H3 HA 0 . 0 0 4 .TOM H4 HA 0 . 0 0 4 TOM H5 HA 0 . 0 0 4 TOM H6 HA 0 . 0 0 4 TOM H7 HA 0 . 0 0 4 TOM H8 HA 0 . 0 0 4 TOM H9 HA 0 . 0 0 4 TOM H10 HA 0 . 0 0 4 TOM H l l HA 0 . 0 0 4 TOM H12 HA 0 . 0 0 4 TOM H13 HA 0 . 0 04 TOM H14 HA 0 . 0 0 4 TOM H15 HA 0 . 0 0 4 TOM H16 HA 0 . 0 0 4 TOM H17 HA 0 . 1 0 4 TOM H18 HA 0 . 1 0 4 TOM H19 HA 0 . 1 0 4 TOM H2 0 HA 0 . 1 0 4 TOM H 2 1 HA 0 . 1 0 4 TOM H22 HA 0 . 1 0 4 TOM H23 HA 0 . 1 0 4 TOM H2 4 HA 0 . 1 0 4 TOM 0 9 O - 0 . 7 5 0 ,TOM O10 O - 0 . 7 5 0 LTOM O i l OS - 0 . 6 4 1 .TOM 0 1 2 O - 0 . 7 5 0 !OND C13 C 1 4 SOND C 1 3 H2 5 SOND C13 H2 6 SOND C 1 3 H27 SOND C14 C 1 5 SOND C14 H2 8 iOND C14 H2 9 SOND C15 C16 ÎOND C 1 5 H3 0 iOND C15 H 3 1 SOND C16 H32 30ND C16 H33 30ND C16 O i l SOND GDI 0 3 30ND GDI 0 5 30ND GDI 0 7 30ND GDI 0 1 30ND GDI N2 30ND GDI N l 30ND GDI N3 30ND GDI N4 30ND N I C I 30ND N i C8 30ND N I C9 30ND N2 C2 30ND N2 C3 30ND N2 C10 30ND N3 C4 30ND N3 C5

BOND N3 C l l BOND N4 C6 BOND N4 C7 BOND N4 C12 BOND 0 1 P I BOND 0 3 P4 BOND 0 5 P3 BOND 0 7 P2 BOND C l C2 BOND C I H I BOND C l H2

OND C2 H3 OND C2 H4 OND C3 C4 OND C3 H5 OND C3 H6 OND C4 H7 OND C4 H8 OND C5 C6 OND C5 H9 OND C5 H10 OND C6 Hll OND C6 H12 OND C7 C8 OND Cl H13 OND C7 HI4 OND C8 HI5 OND C8 HI6 OND PI C9 OND PI 02 OND PI 09 OND C9 H17 OND C9 HI8 OND P4 CIO OND P4 04 OND P4 012 OND CIO H19 OND CIO H20 OND P3 Cll OND P3 06 OND P3 Oil ,OND Cil H21 ;OND Cil H22 CND P2 C12 CND P2 08 íOND P2 010 lOND C12 H2 3 ÍOND C12 H2 4 C H25 C13 C14 C15 1.09 110.91 -179.98 112.31 1.53 C H26 C13 C14 C15 1.09 111.12 60.11 112.31 1.53 C H27 C13 C14 C15 1.09 111.12 -60.09 112.31 1.53 C H25 C13 C14 H28 1.09 110.91 58.09 109.31 1.09 C H25 C13 C14 H29 1.09 110.91 -58.07 109.33 1.09 C C13 C14 C15 C16 1.53 112.31 -180.00 112.34 1.53 C H28 C14 C15 C16 1.09 109.65 -58.26 112.34 1.53 C H29 C14 C15 C16 1.09 109.62 58.26 112.34 1.53 C C13 C14 C15 H30 1.53 112.31 58.22 109.67 1.09 C C13 C14 C15 H31 1.53 112.31 -58.26 109.62 1.09 C C14 C15 C16 H32 1.53 112.34 148.03 108.06 1.09 C H30 C15 C16 H32 1.09 109.32 -89.99 108.06 1.09 C H31 C15 C16 H32 1.09 109.31 26.12 108.06 1.09 C C14 C15 C16 H33 1.53 112.34 31.61 111.82 1.09 -C C14 C15 C16 Oil 1.53 112.34 -90.00 109.31 1.42 "C C15 C16 Oil P3 1.53 109.31 -108.37 109.47 1.45 ic H32 C16 Oil P3 1.09 111.88 11.27 109.47 1.45 CC H33 C16 Oil P3 1.09 109.65 128.73 109.47 1.45 C C16 Oil P3 05 1.42 109.47 -51.65 109.47 1.45 C C16 Oil P3 Cll 1.42 109.47 -171.63 109.50 1.82 IC C16 Oil P3 06 1.42 109.47 68.24 109.51 1.45 IC Cll P3 05 GDI 1.82 109.44 -34.40 118.91 2.33 IC 06 P3 05 GDI 1.45 109.36 85.59 118.91 2.33 IC Oil P3 05 GDI 1.45 109.47 -154.42 118.91 2.33 IC P3 05 GDI 03 1.45 118.91 -129.86 78.26 2.30 IC P3 05 GDI 07 1.45 118.91 95.40 74.35 2.26 IC P3 05 GDI 01 1.45 118.91 166.29 119.09 2.25 IC P3 05 GDI N2 1.45 118.91 -54.99 82.99 2.70 IC P3 05 GDI Nl 1.45 118.91 -82.40 147.31 2.63

: P3 05 : P3 05 I 05 GDI : 07 GDI : 01 GDI N2 GDI Nl GDI N3 GDI N4 GDI GDI 03 GDI 03 GDI 03 03 P4 04 P4 012 P4 03 P4 03 P4 P4 CIO H19 CIO H20 CIO P4 CIO P4 CIO C2 N2 C3 N2 CIO N2 C2 N2 C2 N2 C2 N2 C2 N2 C2 N2 C2 N2 GDI N2 C3 N2 CIO N2 GDI N2 GDI N2 N2 C2 H3 C2 H4 C2 N2 C2 N2 C2 C2 CI

C HI CI H2 CI C2 CI C2 CI Cl Nl C8 Nl C9 Nl CI Nl CI Nl CI Nl CI Nl CI Nl CI Nl

t GDI Nl C CI Nl

C9 Nl GDI Nl GDI Nl NI C8

C H15 C8 C H16 C8 C NI C8 :c Nl C8 :c C8 C7

GDI N3 GDI N4 03 P4 03 P4 03 P4 03 P4 03 P4 03 P4 03 P4 P4 CIO P4 04 P4 012

CIO N2 CIO N2 CIO N2 CIO H19 CIO H20 N2 GDI N2 GDI N2 GDI N2 C2 N2 C3 GDI 03 GDI 03 GDI 03 GDI 05 GDI 07 GDI 01 GDI Nl GDI N3 GDI N4 C2 CI C2 CI C2 CI C2 H3 C2 H4 CI Nl CI Nl CI Nl CI HI Cl H2 Nl GDI Nl GDI Nl GDI NI C8 NI C9 GDI 03 GDI 03 GDI 03 GDI 05 GDI 07 GDI 01 GDI N2 GDI N3 GDI N4 C8 C7 C8 C7 C8 C7 C8 H15 C8 H16 C7 N4 C7 N4 C7 N4 C7 H13 C7 H14 N4 GDI

1.45 118.91 1.45 118.91 2.33 78.26

2.70 2.63

13.09 75.69 49.55 136.14 81.12 125.03

2.26 127.50 140.68 125.03 2.25 73.85 -153.63 125.03

73.83 -4.89 125.03 79.26 -74.99 125.03

2.66 134.99 25.48 125.03 2.64 145.59 -98.17 125.03 2.30 125.03 -11.96 109.60 2.30 125.03 -131.84 109.57 2.30 125.03 108.07 109.52 1.45 109.60 35.52 113.85 1.45 109.26 155.60 113'. 85 1.45 109.41 -84.58 113.85 1.45 109.60 156.15 108.36 1.45 109.60 -85.40 108.50 1.82 113.85 -36.85 105.55 1.09 108.36 -157.48 105.5 1.09 108.51 84.07 105.55

1.82 113.85 83.40 109.66 1.82 113.85 -157.84 109.24 1.48 111.52 -95.03 1.51 112.33 142.94 1.48 105.55 23.99 1.48 111.52 -174.80 48 111.52 133.08 142.94 48 111.52 -49.88 135.33

10.34 68.09 111.52 107.81 67.10 111.52 49.21 105.12

38.11 111.98 1.51 108.48 162.33 111.98 1.48 109.66 -78.43 111.98 2.70 111.52 -82.26 108.84 2.70 111.52 158.63 108.91

2.66 2.64 1.45 1.45 1.45 1.45 1.45 1.45 1.45 1.82 1.45 1.45 1.48 1.48

73.83 73 .83 73.83 82.99

1. 1. 1.48 111.52 1.48 1.48 2.70 111.52

2. 2. 2. 2 1

48 111.98 -58.74 112.60 09 108.84 61.63 112.60 09 108.91 -179.25 112.60 48 111.98 61.72 108.68 .48 111.98 -179.38 108.77 1.53 112.60 46.67 110.84 1.09 108.68 -73.79 110.84 1.09 108.78 167.31 110.84 1.53 112.60 -78.99 112.39 1.53 112.60 164.90 109.94 1.50 110.84 58.33 79.26 1.43 111.61 1.50 107.12

50 110.84 50 110.84 50 110.84 134.15 50 110.84 -18.41

175.57 79.26 61.60 79.26 11.08 147.31 165.73 138.31

76.25 68.09

50 110.84 -75.62 104.95 50 110.84 -135.44 69.10 63 111.61 33.93 117.98

1.50 112.39 159.17 117.98 1.50 104.63 -81.58 117.98 2.63 111.61 -87.22 107.27 2.63 111.61 155.69 107.55

1.43 117.98 -50.16 113.74 1.09 107.27 70.98 113.74 1.09 107.56 -171.92 113.74 1.43 117.98 70.45 108.39 1.43 117.98 -171.05 108.52 1.51 113.74 36.74 110.67

48 09 09 70 2.70 2.70

1.48 1.51

2.30 2.30 2.30 2.33 2.26

25 63 66 64 53

1.53 1.53 1.09 1.09 1.50 1.50 1.50 1.09 1.09 2.63 2.63 2.63 1.43 1.50 2.30 2.30 2.30 2 .33 2.26 2.25 2.70 2.66 2.64 1.51 1.51 1.51

1.09 1.09

1.48 1.48 1.48 1.09 1.09

2.64

c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c c :c :c :c *c tc EC EC C EC EC EC EC EC EC

H13 C7 H14 C7 C8 C7 C8 C7 C6 N4 C7 N4 C12 N4 C6 N4 C6 N4 C6 N4 C6 N4 C6 N4 C6 N4 GDI N4 C7 N4 C12 N4 GDI N4 GDI N4 N4 C6 Hll C6 H12 C6 N4 C6 N4 C6 C6 C5 H9 C5 H10 C5 C6 C5 C6 C5 C4 N3 C5 N3 Cil N3 C4 N3 C4 N3 C4 N3 C4 N3 C4 N3 C4 N3 GDI N3 C5 N3 Cil N3 GDI N3 GDI N3 N3 C4 H7 C4 H8 C4 N3 C4 N3 C4 C4 C3 H5 C3 H6 C3 C4 C3 C4 C3 GDI N3 C4 N3 C5 N3 GDI N3 GDI N3 N3 Cll H21 Cll H22 Cll N3 Cll N3 Cll GDI N4 C6 N4 C7 N4 GDI N4

N4 GDI N4 GDI N4 C6 N4 C12 GDI 03 GDI 03 GDI 03 GDI 05 GDI 07 GDI 01 GDI N2 GDI Nl GDI N3 C6 C5 C6 C5 C6 C5 C6 Hll C6 H12 C5 N3 C5 N3 C5 N3 C5 H9 C5 H10 N3 GDI N3 GDI N3 GDI N3 C4 N3 Cll GDI 03 GDI 03 GDI 03 GDI 05 GDI 07 GDI 01 GDI N2 GDI Nl GDI N4 C4 C3 C4 C3 C4 C3 C4 H7 C4 H8

C3 N2 C3 N2 C3 N2 C3 H5 C3 H6 N2 GDI N2 GDI N2 GDI N2 C2 N2 CIO Cll P3 Cll P3 Cll P3 Cll H21 Cll H22 P3 05 P3 05 P3 05 P3 06 P3 Oil C12 P2 C12 P2 C12 P2 C12 H23

1.50 111.04 2.64 111.04

1.09 108.39 -83.88 110.67 2.64 1.09 108.52 157.62 110.67 2.64

1.51 113.74 -85.88 109.33 1.50 1.51 113.74 153.64 109.91 1.50 111.04 131.63 145.59 1.48 110.67 10.01 145.59 1.49 106.13 -109.19 145.59 1.50 111.04 -47.36 136.14 1.50 111.04 -93.22 74.32 1.50 111.04 -175.84 85.51 1.50 111.04 48.29 105.12 1.50 111.04 107.17 69.10

-9.21 68.79 37.52 113'.91

1.48 109.33 159.91 113.91 1.49 109.71 -79.49 113.91 2.64 111.04 -83.12 108.34 2.64 111.04 158.45 108.47

1.50 113.91 -58.38 111.66 1.09 108.34 62.26 111.66 1.09 108.50 -179.29 111.66 1.50 113.91 61.95 108.92 1.50 113.91 -178.82 108.99 1.52 111.66 46.05 110.13 1.09 108.92 -74.27 110.13 1.09 108.98 166.50 110.13

1.52 111.66 -77.44 109.52 1.52 111.66 162.98 110.02 1.50 111.92 -46.62 134.99 1.49 110.13 -168.71 134.99 1.48 106.35 72.11 134.99 1.50 111.92 -103.14 75.69 1.50 111.92 -179.61 78.96 1.50 111.92 131.61 151.15 1.50 111.92 1.50 111.92 1.50 111.92 103.08 2.66 111.92 44.18 1.49 109.52 166.62 113.24 1.48 108.83 -73.07 113.24 2.66 111.92 -76.36 108.51 2.66 111.92 164.98 108.64 1.50 113.24 -58.75 110.24 1.09 108.51 61.79 110.24 1.09 108.64 -179.54 110.24 1.50 113.24 61.36 109.28 1.50 113.24 -178.89 109.31 1.51 110.24 41.83 112.33 1.09 109.28 -78.29 112.33 1.09 109.28 161.98 112.33 1.51 110.24 -81.91 108.48 1.51 110.24 158.59 109.24 2.66 106.35 -35.67 111.90 1.50 108.83 85.08 111.90 1.49 110.02 -154.92 111.90 2.66 106.35 -156.02 108.8 2.66 106.35 84.84 108.93

1.48 111.90 48.70 109.44 1.09 108.86 169.06 109.44 1.09 108.94 -71.80 109.44 1.48 111.90 -71.19 109.55 1.48 111.90 168.69 109.50 2.64 106.13 -37.71 112.28 1.50 109.71 82.34 112.28 1.48 109.91 -157.42 112.28 2.64 106.13 -158.13 108.7

-14.81 67.10 43.05 104.95

68.79 113.24

49 30 30 2.30 33 26 2.25 2.70 2.63 2.66 1.52 1.52 1.52 1.09 1.09

1.49 1.49 1.49

1.09 1.09

2.66 2.66 2.66

1.50 1.48 2.30 2 .30 2.30 2.33 2.26 2.25 2.70 2.63 2.64 1.51 1.51 1.51 1.09 1.09 1.51 1.51 1.51 1.09 1.09 2.70 2.70 2.^0 1.48 1.48 1.82 1.82 1.82

6 1.09 1.09

1.45 1.45 1.45 1.45 1.45 1.82 1.82 1.82

6 1.09

!C GDI N4 C N4 C12 C H23 C12 C H24 C12 C N4 C12 C N4 C12 C C12 P2 C 08 P2 C O10 P2 C P2 07 C P2 07 C P2 07 C P2 07

P2 07 P2 07

C P2 07 C GDI Nl C Cl Nl C C8 Nl C GDI Nl C GDI Nl C NI C9 C H17 C9 C H18 C9 C NI C9 C NI C9 C C9 PI C 02 PI C 09 PI C PI 01 C PI 01 C PI 01 :c PI oi C PI 01 :c PI oi :c PI oi

C12 H24 P2 07 P2 07 P2 07 P2 08 P2 O10 07 GDI 07 GDI 07 GDI

GDI 03 GDI 05 GDI 01 GDI N2 GDI Nl GDI N3 GDI N4 C9 PI C9 PI C9 PI C9 H17 C9 H18 PI 01 PI 01 PI 01 PI 02 PI 09 01 GDI 01 GDI 01 GDI GDI 03 GDI 05 GDI 07 GDI N2 GDI Nl GDI N3 GDI N4

2.64 106.13 82.88 108.84 1.49 112.28 34.45 109.49 1.09 108.76 154.86 109.49 1.09 108.86 -86.13 109.49

1.49 112.28 154.30 109.41 1.49 112.28 -85.69 109.47 1.82 109.49 -9.71 125.10

1.45 109.38 -129.58 125.10 1.45 109.58 110.37 125.10 1.45 125.10 142.54 127.50 1.45 125.10 -156.22 74.35

80.33 81.70 101.77 142.94 21.99 138.31

1.45 125.10 1.45 125.10 1.45 125.10 1.45 125.10 -78.16 1.45 125.10 -7.31 2.63 107.12 1.50 109.94

78.96 74.32

27.95 114.36 148.45 114.36

1.43 104.63 90.65 114.36 2.63 107.12 -148.64 108.22 2.63 107.12 93.06 108.39

1.50 114.36 33.51 109.50 1.09 108.22 154.21 109.50 1.09 108.37 -87.50 109.50 1.50 114.36 153.34 109.40 1.50 114.36 -86.62 109.47

20.95 124.08 140.81 124.08 99.13 124.08 88.30 73.85

45 124.08 154.51 119.09 45 124.08 -138.65 81.70

43.15 135.33 5.70 76.25

1.82 109.50 1.45 109.35 1.45 109.57 1.45 124.08 1, 1 1 1 1.45 124.08 -90.39 151.15 1.45 124.08 -63.86 85.51

45 124.08 .45 124.08

1.09 1.45 1.45 1.45

1.45 1.45 2.26 2.26 2.26 2.30 2.33 2.25 2.70 2.63 2.66 2 .64 1.82 1.82 1.82

1.09 1.09

1.45 1.45 1.45 1.45 1.45 2.25 2.25 2.25 2.30 2.33 2.26 2 .70 2 .63 2 .66 2 .64

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Estudos de Modelação Molecular e de Ressonância · PDF file2.2 Campo de...

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