ESTUDIO QUÍMICO DE FRUTOS DE Pernettya prostrata (CAVAN ...

ESTUDIO QUÍMICO DE FRUTOS DE Pernettya prostrata (CAVAN) SLEUMER

Y SU EVALUACIÓN EN LA PRODUCCIÓN DE HIPERCALCEMIA

CORTES CASAS JOSE YESID

TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial

Para optar al título de

Biólogo

Director: Julio Pedrozo

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE BIOLOGIA

Bogotá, D. C.

Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946

“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.




APROBADO

________________________ JULIO PEDROZO Director Asesor ______________________ ________________________ JORGE ROBLES NOHEMI TELLEZ Jurado Jurado




APROBADO ________________________ ________________________ DR. INGRID SCHULER DR. ANDREA FORERO Decana Académica Director de Carrera de Biología

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Agradezco a mis padres por todo el apoyo que me brindaron durante toda la carrera, a los integrantes del grupo de investigación de fitoquímica GIFUJ y sus colaboradores Jorge Arturo Narvaez y Jaime Enrique Gonzales que me brindaron toda su ayuda, a Fabio Muñoz y Angelica Pinzon que se encargaron de explicarme y ayudarme con el manejo de las ratas durante la fase experimental de este trabajo.

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TABLA DE CONTENIDOS

Resumen

1. Introducción………………………………………………………………14

2. Marco teórico……………………………………………………………..17

2.1 Generalidades de Pernettya prostrata………………………….18

2.2 Generalidades de la andromedotoxina…………………………21

2.3 Métodos de purificación de andromedotoxina………………....24

2.4 Fisiología del calcio……………………………………………..25

2.5 Ingesta de calcio………………………………………………...29

2.6 Metabolismo del calcio………………………………………….30

2.7 Absorción de calcio intestinal…………………………………...30

2.8 Intercambio mineral óseo………………………………………..31

2.9 Manejo renal de calcio…………………………………………..31

2.10 Calcemia en ratas………………………………………………..32

2.11 Causas de hipercalcemia………………………………………...34

3. Formulación del problema y justificación………………………………39

4. Objetivos…………………………………………………………………...41

5. Metodología………………………………………………………………..42

5.1 Recolección de material………………………………………….42

5.2 Métodos de extracción…………………………………………...42

5.3 Pruebas químicas preliminares……………………………………44

5.4 Metodos cromatogáfícos………………………………………....46

5.5 Cromatografía en capa delgada (CCD)…………………………..47

5.6 Cromatografía en papel (CP)……………………………………..49

5.7 Cromatografía en columna (CC)…………………………………50

vii

5.8 Mantenimiento de las ratas……………………………………….51

5.9 Obtención de suero de las ratas…………………………………..51

5.10 Determinación de calcio sérico…………………………………...52

6. Experimentación……………………………………………………………54

6.1 Recolección de material vegetal………………………………......54

6.2 Técnicas de extracción…………………………………………….55

6.3 Pruebas químicas preliminares……………………………………..60

6.4 Cromatografias…………………………………………………….60

6.5 Organización de la población experimental de ratas………………61

6.6 Manejo de los animales experimentales…………………………....61

6.7 Medición de la calcemia prelimina……….………………………...62

6.8 Selección del tiempo de sangrado………………………………….62

6.9 Cuantificación de calcio en el alimento para ratas (Rodentina)…....62

6.10 Cuantificación de calcio en los frutos de Pernettya prostrata……..64

6.11 Cuantificación de calcio en suero…………………………………..65

6.12 Elaboración de pastillas de alimento…………………………….....66

6.13 Administración de las dosis experimentales………………………..68

6.14 Analisis de datos…………………………………………………....69

7. Resultados…………………………………………………………………….70

8. Discusión……………………………………………………………………...88

9. Conclusiones………………………………………………………………….92

10. Recomendaciones…………………………………………………………….93

11. Bibliografía……………………………………………………………………94

viii

Indice de figuras

Figura No 1. Pernettya prostrata en periodo de floración ………………….19

Figura No 2. Formulación química de la grayanotoxina …...……………….22

Figura No 3. Determinacion taxonómica de la planta Pernettya prostrata….55

Figura No 4. Orden de extracciones y fraccionamientos del fruto Pernettya prostrata………………………………………………………………………59

Figura No 5. Fracciones y extractos obtenidos del fruto Pernettya prostrata.60

Figura No 6. Jaulas de rata……………………………………………….…..61

Figura No 7. Extracción de sangre mediante sangrado ocular.........................65

Figura No 8. Elaboración de pastilla de alimento en prensa de jeringas.….....66

Figura No 9. Prueba de cloruro férrico al extracto cloroformo (A) y la fracciones clorofórmicas del residuo acuoso (I) y extracto etanólico (B1)...……………...71

Figura No 10. Prueba de Liberman Buchard al extracto cloroformo (A) y la fracciones clorofórmicas del residuo acuoso (I) y extracto etanólico (B1)…...71

Figura No 11. Cromatograma bidimensional de la fracción en acetato de etilo obtenida del extracto en etanol. Los solventes: ácido acético(15%) y BAW. Se observaron las sustancias A y B………………………………………………72

Figura No 12. Cromatograma bidimensional de la fracción en acetato de etilo obtenida del residuo acuoso. Los solventes: ácido acético (15%) y BAW. Se observaron cuatro sustancias: A, B, C y D……………………………………73

Figura No 13. Cromatogramas en capa delgada de: a) fracción cloroformo de extracto etanólico, b) fracción cloroformo residuo acuoso y c) extracto clorofórmico. Fase estacionaria: Sílica. Solventes, en su orden: A) cloroformo, B) cloroformo-acetato de etilo 9.5: 0.5 y C) cloroformo-metanol 9.5:0.5.………………...…75

Figura No 14. Cromatograma en capa delgada de extracto etnólico fracción cloroformo, eluída con cloroformo-metanol 9.5:0.5, en placas de sílica. A) bajo luz UV onda larga y B) revelado con vainillina/H2SO4 en caliente………………76

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Figura No 15. Selección de los solventes para correr las cromatografias bidimensionales de la fraccion cloroformo del extracto etanolico. Fase estacionaria silica. Solventes (A) eter de petroleo-acetona 7:3 y (B) cloroformo-metanol 9.5:0.5…………………………………………………………………...……77

Figura No 16. Cromatograma bidimensional en silica gel, obtenido para la fracción cloroformo del extracto etanólico. A) bajo luz UV y B) revelado con vainillina/H2SO4 en caliente. Patrones: a) escopoletina, b) ácido grandiflorénico y c) amirina...78

Figura No 17. Monitoreo de las sub-fracciones obtenidas de la fracción clorofórmica del extracto etanólico. Cromatogramas revelados con luz UV ………………79

Figura No 18. Monitoreo de las sub-fracciones eluídas con cloroformo, obtenidas de la fracción clorofórmica del extracto etanólico. Cromatogramas revelados con vainillina/H2SO4. ……………………………………………………………..80

Figura No 19. Promedio de concentraciones de calcio en ratas Vs tiempos de sangrado en los grupos o tratamientos rodentina (control) y rodentina + CaCO3 para la selección de la hora de sangrado …………………………………..…………83

Figura No 20. Grafica promedio de concentraciones de calcio(eje Y) en ratas Vs tiempos de sangrado (eje X) en los grupos o tratamientos Rodentina (control), Rodentina + CaCO3, y Rodentina + CaCO3 + fruto de Pernettya prostrata….86

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Índice de tablas

Tabla No 1. Contenido nutricional de los frutos de Pernettya prostrata ………….20

Tabla No 2. Niveles de toxicidad encontrados para Pernettya prostrata (Cavanilles) Sleumer, en ratones de experimentación……………………..……….…………….21

Tabla No 3. Necesidades diarias de calcio en humanos.………………..………….29

Tabla No 4. Concentración de diferentes elementos presentes en la sangre de la rata …………………………………………………………………………………...….33

Tabla No 5. Concentraciones de calcio y fosfato excretados por la orina durante el día y por kg de animal ………………………………………………………..…….33

Tabla No 6. Gramos de concentrado y calcio suministrados a cada rata en el piloto del bioensayo ……………………………………………………………………….62

Tabla No 7. Concentración de calcio en alimento para ratas (Rodentina)…...…….63

Tabla No 8. Concentración de calcio en frutos de Pernettya prostrata ……….….64

Tabla No 9. Especificación de cantidades de calcio en pastilla de 1.7 gramos en cada uno de los tres grupos de ratas ……………………………………………………...67

Tabla No 10. Pesos específicos de cada componente para que una patilla de 1.7 g presentara las concentraciones de calcio requeridas dentro de cada grupo ………...68

Tabla No 11. Concentraciones de calcio en gramos de tratamientos para cada rata y para cada grupo ……………………………………………………………..…….....69

Tabla No 12. Resultados de pruebas químicas preliminares realizadas a los extractos y fracciones obtenidas de los frutos de Pernettya prostrata ……………..……….....70

Tabla No 13. Sustancias observadas en el cromatograma de la figura No 11: Sus Rfs en los dos solventes; sus colores a la luz visible, bajo la luz UV y, bajo la luz UV después de tratar el cromatograma con vapores de NH3………………………….....73

Tabla No 14. Sustancias observadas en el cromatograma de la figura No 12: Sus Rfs en los dos solventes; sus colores a la luz visible, bajo la luz UV y, bajo la luz UV después de tratar el cromatograma con vapores de NH3……….................................74

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Tabla No 15. Sustancias observadas en el cromatograma de mejor resolución (figura No 13). Se muestran los colores de las ocho sustancias observadas: a la luz VIS, a la luz UV de onda larga y de onda corta y, con el revelador vainillina/H2SO4 en caliente…………………………………………………………………………….....75

Tabla No 16. Valores de Rf de las sustancias observadas en el cromatograma bidimensional en silica gel de extracto etanólico fracción cloroformo. Solventes: éter de petróleo-acetona 7:3 (solvente 1) y cloroformo-metanol 9.5:0.5 (solvente 2)…....78

Tabla No 17. Valores normales de calcio en suero de ratas macho. Valor promedio =

10.27 mg de calcio por 100 mL de suero ………………………………...……….....81

Tabla No 18. Prueba de tiempos para sangrado de ratas del grupo que se suministro Rodentina ……………………………………………………………...………….....82

Tabla No 19. Prueba de tiempos para sangrado de ratas del grupo que se suministro Rodentina + CaCO3.………………............................................................................82

Tabla No 20. Promedios de concentraciones de calcio en sangre de ratas por hora de sangrado del grupo control (Rodentina)…………………………………………......82

Tabla No 21. Promedios de concentraciones de calcio en sangre de ratas por hora de sangrado del grupo Rodentina +CaCO3…………………………………………......83

Tabla No 22. Concentraciones de calcio serico en ratas alimentadas con Rodentina a diferentes horas ………………………………………………………………….......84

Tabla No 23. Concentraciones de calcio sérico en ratas tratadas con Rodentina y CaCO3 a diferentes horas ………………………………………………...…………84

Tabla No 24. Concentraciones de calcio sérico en ratas tratadas con Rodentina, CaCO3 y fruto de Pernettya prostrata a diferentes horas ……………..……………84

Tabla No 25. Promedios de concentraciones de calcio en sangre de ratas por hora de sangrado del grupo Rodentina ……………………………………………………...85

Tabla No 26. Promedios de concentraciones de calcio en sangre de ratas por hora de sangrado del grupo Rodentina + CaCO3…………………………………………...85

Tabla No 27. Promedios de concentraciones de calcio en sangre de ratas por hora de sangrado del grupo Rodentina + CaCO3 + fruto de Pernettya prostrata …..………85

xii

Tabla No 28. Análisis de varianza de los tratamientos Rodentina (control), Rodentina + CaCO3, y Rodentina + CaCO3 + fruto de Pernettya prostrata …….…………….87

13

RESUMEN

Se obtuvieron extractos acuosos y en cloroformo de fruto Pernettya prostrata los

cuales se fraccionaron en cloroformo, acetato de etilo y butanol con el fin de

encontrar sustancias del tipo andromedotoxina; también se suministró el fruto seco a

ratas de experimentacion, para evaluar su efecto en el aumento de calcio en sangre.

Se seleccionaron 18 ratas macho de la cepa wistar entre los cinco y seis meses de

vida, con un peso aproximado entre 250 y 300 g. Se dividieron en tres grupos: al

primer grupo se le suministró alimento para ratas (Rodentina) y Carbonato de calcio;

al segundo grupo alimento para ratas (Rodentina) y fruto; y el tercer grupo se tuvo

como control (Rodentina)

Se tomaron 4 muestras de sangre por cuatro veces, durante un periodo de diez horas

para cuantificarles el calcio por espectrofotometría de absorción atómica.

Los frutos de Pernettya prostrata mostraron dos diterpenos que posiblemente son del

tipo grayanotoxina y además produjo un aumento de calcio en 13.86 mg/100mL en

suero sangineo lo que lleva a pensar que es efecto de la misma posible toxina.

14

1. INTRODUCCION

Durante los fuertes periodos de verano que se presentan en los páramos y sub

páramos Cundiboyacenses las áreas de pastizales son afectadas por completo

quedando totalmente quemadas; esto conlleva a que el ganado y animales domésticos

(cabras, ovejas, mulas, etc) presentes en estas zonas se vean obligados a alimentarse

de la vegetación arbustiva que llega a resistir dichos periodos de sol, pero que pueden

resultar altamente peligrosas.

La mayoría de los frutos presentes en los páramos y en especial los arbustos, no son,

habitualmente, consumibles por los humanos; los habitantes de estas zonas consumen

ocasionalmente bayas pequeñas (uva de monte), algunas de las cuales resultan ser

tóxicas al ser ingeridas en grandes cantidades (Camargo, 1979).

Entre los frutos paramunos consumidos se encuentran los de Pernettya prostrata,

planta perteneciente a la familia Ericaceae, y que prospera abundantemente en estas

zonas andinas.

Estudios realizados en especies de Ericaceae europeas reportan la presencia de

sustancias tóxicas como las grayanotoxinas, también llamada andromedotoxinas o

rodotoxinas, principalmente de los géneros Rhododendron y Kalmia. Estas sustancias

son diterpenos cíclicos polihidroxilados que no contienen nitrógeno en sus estructuras

(Koca & Koca, 2007).

Las grayanotoxinas son neurotóxinas que interfieren con la transmisión del potencial

de acción, por bloqueo de los canales de sodio y potasio en la membrana celular.

Estos compuestos previenen la inactivación de dichos canales; así, las células

excitables se mantienen en el estado de despolarización, durante el cual la entrada del

calcio en las células puede ser facilitada. Todas las respuestas observadas de los

músculos esqueléticos y de corazón, de los nervios, y del sistema nervioso central se

relacionan con los efectos de la membrana (Koca & Koca, 2007).

15

En plantas colombianas no se ha logrado detectar dicha sustancia, aunque cuadros

toxicológicos reportados por el consumo de frutos de Pernettya coriácea, una especie

Costarricense, parece indicar que las especies del género Pernettya también son

portadoras de dichas toxinas (Ramírez & Cuenca, 1987)

Se ha reportado que habitantes de la región paramuna colombiana, sobre todo la

población infantil, han presentado síntomas de intoxicación al ingerir frutos de

Pernettya. El cuadro toxicológico incluye vómito, diarrea, malestar estomacal y

cólico; atribuido a las toxinas supuestamente presente en estos frutos (Neira, 1990)

Al mismo tiempo, los animales domésticos de estas regiones frías colombianas, que

no solo consumen el fruto sino toda la planta en tiempos de sequía, han presentado

también cuadros de intoxicación.

Resulta de gran importancia, pues, valorar el poder hipercalcémico o hipocalcémico

que posiblemente ocasionarían los frutos y hojas de Pernettya spp.

El calcio es esencial en humanos y mamíferos para el transcurso normal de las

contracciones del músculo cardíaco y de la musculatura lisa y estriada, así como para

el funcionamiento del sistema nervioso. Además el calcio desempeña un papel

importante en la coagulación sanguínea. Por esto un aumento en el nivel de calcio

sanguíneo por encima de los 10.5 mg/dL produce una hipercalcemia afectando los

órganos y sistemas mencionados (Piñeros, 1991)

En trabajos anteriores, realizados por el Grupo de Investigación en Fitoquímica de la

Universidad Javeriana (GIFUJ) utilizando frutos de Pernettya prostrata, se hicieron

comparaciones entre ratas que consumieron frutos de esta planta y ratas tratados con

carbonato de calcio, observándose que los niveles de calcio en la orina disminuían en

ambos grupos de ratas. Esto llevó a pensar que los frutos de esta especie vegetal

presentan actividad hipercalcémica (Neira & Solis, 1990).

El propósito de este trabajo fue el de corroborar esta acción hipercalcémica producida

por frutos de Pernettya prostrata en ratas de experimentación; se alimentaron asi,

16

ratas machos con los frutos de Pernettya prostrata para luego cuantificarles el calcio

sanguíneo mediante el uso de la técnica conocida como absorción atómica

17

2. MARCO TEORICO

Desde la década de los 80’s se han venido documentando cuadros aislados de

intoxicaciones en animales domésticos como vacas y ovejas, por consumo de

arbustos pertenecientes a la familia Ericaceae, especialmente de los géneros

Rhodondendron y Kalmia, en países como Estados Unidos, España y el Reino Unido.

En la actualidad estos registros se han incrementado por consumo de miel

envenenada producida a partir de estas plantas, primordialmente en Turkía

(Humphrest & Stodulski, 1986) (Gunduz et al., 2006).

Las intoxicaciones por consumo de miel envenenada han sido registradas desde el

año 401 AC por Xenofon, pasando por el siglo XVIII en el cual se presentaron en

Alemania y Estados Unidos.

Las intoxicaciones tanto por miel como por consumo directamente de la planta

producen bradicardia, hipotensión, depresión respiratoria, estado mental alterado,

tambaleo, parálisis de extremidades progresiva y vómito (Mezey, 1943) (Gunduz et

al., 2006) (Lampe, 1988).

En la región de subpáramo (3.200 y 3.600 m. s. m.) del área andina es característico

encontrar matorrales en los cuales predominan especies de las familias Asteraceae,

Hypericaceae y Ericaceae; esta última contiene 125 géneros y 4.500 especies de los

cuales en Colombia encontramos 22 géneros y cerca de 270 especies, donde la

mayoría se presentan entre los 1.000 y 2.000 m de altitud (Pedraza et al., 2004)

(Kron et al., 2002) (Luteyn, 1989).

Dentro de las Ericaceas que crecen principalmente en páramos y tepuyes, como

plantas pioneras y formando frecuentemente un tipo de vegetación característico de

ambientes de subpáramo conocido como “el cinturón de ericáceas”, encontramos a la

Pernettya prostrata popularmente llamada “reventadera”, “maíz de perro” o

“mortiño venenoso”, la cual es consumida por animales silvestres y domésticos,

habitantes de la región, especialmente niños que la confunden con el “mortiño”

18

(Hesperomeles goudotiana), pero que según pobladores de la región e investigaciones

botánicas, ésta resulta ser tóxica (Luteyn, 2002) (Perez, 1996) (Anonimo, 1990)

De acuerdo con las investigaciones realizadas a la Pernettya prostrata y otras

especies de la familia Ericaceae, especialmente pertenecientes al género

Rhododendron, se cree que las responsables de las intoxicaciones observadas son la

sustancias diterpénicas llamadas andromedotoxinas o grayanotoxinas presentes en

casi todas las especies de Ericaceas. Esto por presentar una semejanza en la actitud

biológica, al efecto producido y a la composición y propiedades químicas de la

toxina. (Mezey 1943)(Anonimo, 1990)

2.1 Generalidades de Pernettya prostrata.

Pertenece a la familia Ericaceae, la cual contiene cerca de 125 géneros y 4500

especies a nivel mundial. Colombia es el país americano más diverso en Ericáceas,

con 22 géneros y cerca de 270 especies (Luteyn, 2002).

En ambientes muy inestables como los páramos, las Ericáceas son muy importantes

para la dinámica natural, especialmente comportándose como plantas pioneras y

formando parte de los llamados “cinturones de Ericáceas” típico de ambientes de

subpáramo (3200-3600 m.s.n.m.) (Luteyn, 2002).

La Pernettya prostrata es también llamada “chirreadera”, “reventadera, “maíz de

perro” o “mortiño venenoso”. Arbusto pequeño, erecto o subpostrado, de hasta 50 cm

de alto. Hojas simples, alternas, elípticas, coriáceas, con la margen crenada y

ligeramente revoluta, lámina aproximadamente de 0.7-1.7 x 0.3-0.7 cm con la haz

lustrosa, envés verde claro, glabra, base redondeada a cuneada, ápice obtuso a

subagudo, a veces mucronado.

Flores axilares, solitarias tendiendo a agruparse al final de las ramas, pequeñas,

hermafroditas, tubulares, globosas y de color rosado-encendido a rosado blanquecino

19

como muestra la figura No 1, ovario súpero, pedicelos glabrescentes o con pelos

glandulares rojos. Cáliz de 2-36 mm de largo, verde claro; corola 5.6-6.8 mm de largo

urceolada – cilíndrica. Tiene 10 estambres. Fruto en baya, pequeña, subglobosa,

carnosa y de color morado al madurar (Garcia et al., 1999)(Pedraza et al., 2004)

(Camargo, 1979)

Figura No 1. Pernettya prostrata en periodo de floración.

Observando estudios del contenido nutricional de los frutos de la Pernettya prostrata

se ha encontrado un análisis proximal del calcio, hierro, sodio, potasio, fósforo, ácido

ascórbico, tiamina y riboflavina como se muestra en la tabla No 1 (Gutiérrez, 1989).

En un estudio farmacodinámico y toxicológico elaborado por Mezey en 1943, se

llegó a la conclusión que la naturaleza química de la sustancia activa de la planta era

bien soluble en agua fría y caliente, menos soluble en alcohol, no se precipitaba en

sales metálicas, ni dió reacción de alcaloides ni glucósidos. Esta actitud química, más

el efecto tóxico (salivación, vómito, tambaleo, convulsiones y parálisis progresiva) y

el mecanismo farmacodinámico se parecían al de la andromedotoxina, el veneno

común de una gran número de plantas de la familia Ericaceae, lo cual permitió

concluir que el principio tóxico de la Pernettya prostrata era este tipo de sustancia.

En estudios químicos realizados por el Grupo de Investigación Fitoquímica de la

Universidad Javeriana, en las hojas de Pernettya prostrata se aislaron dos triterpenos:

amirina y ácido ursólico (de los frutos, se aisló además el uvaol) y, dos ácidos

20

cinámicos: el cafeico y el ferúlico. De la fracción acetato de etilo, del extracto

etanólico de hojas, se aislaron dos flavonoides identificados como quercetina y 3-

ramnosilquercetina. En las fracciones butanólicas de los extractos etanólicos de hojas

y frutos se detectaron por técnicas cromatográficas, diterpenos glicosilados

relacionados con la andromedotoxina o con el acetilandromedol (Pedrozo, 1990).

FRUTOS 100 g

HUMEDAD 83.36% LIPIDOS 0.45 g FIBRA CRUDA 2.80 g CENIZAS 0.50 g CARBOHIDRATOS 11.11 mg CALCIO 100.00 mg SODIO 1.54 mg POTASIO 1.61 mg FOSFORO 42.22 mg HIERRO 0.90 mg TIAMINA 1.10 mg RIBOFLAVINA 0.82 mg ACIDO ASCORBICO 186.20 mg Tabla No 1. Contenido nutricional de los frutos de Pernettya prostrata.

En ensayos de toxicidad realizados a los frutos de Pernettya prostrata en ratones

(observaciones no mayores a un mes) se encontró que en dosis de 0.33 g/día de fruto

seco (25%) en un lapso de 12-15 días ocasionaban la muerte de los animales como se

ve en la tabla No 2. Los síntomas de la intoxicación son: salivación, vomito, cólicos,

depresión de la respiración, debilidad, paso vacilante, colapso y la muerte (Gutierrez,

1989)

21

Porcentaje de toxicidad por kg de animal 25%

Dosis letal 4.992 mg

Tiempo de administración 15 dias

Consumo diario 0.33 g

Efecto Muerte

Porcentaje de letalidad 100%

Tabla No 2. Niveles de toxicidad encontrados para Pernettya prostrata (Cavanilles)

Sleumer, en ratones de experimentación.

2.2 Generalidades de la andromedotoxina.

Las grayanotoxinas son diterpenos cíclicos polihdroxilados que no contiene

nitrógeno. Estas se encuentran en el polen, néctar y otras partes de la planta de

algunos miembros de la familia Ericaceae, como el Rhododendron L. (Lampe, 1988)

El género Rhododendron es bien conocido en Turkía, ya que presenta dos especies

tóxicas Rhododendron luteum L. y R. ponticum L que producen envenenamiento por

consumo de miel de abejas elaborada a partir del polen de sus flores que contienen la

grayanotoxina. (Stevens, 1978) (Lampe, 1988)

En Estados Unidos sobre la parte oeste también se han encontrado especies de

Rhododendron tóxicas como R. macrophyllum y R. albiflorum; hacia el lado este, el

laurel de montaña (Kalmia latifolia L.) y el laurel de oveja (Kalmia angustifolia L)

también han reportado fuentes de grayanotoxina (Lampe, 1988)

En total por lo menos se han identificado 60 diferentes tipos de grayanotoxinas, pero

los compuestos tóxicos primarios son las grayanotoxinas I y III. La estructura común

de la grayanotoxina se presenta en la figura No 2 (Terai et al., 2003).

22

Figura No 2. Formulación química de la grayanotoxina.

El isómero tóxico principal en Rhododendron spp es la grayanotoxina III aunque

otras grayanotoxinas I y II están presentes en bajas cantidades. La grayanotoxina I es

también tóxica y la grayanotoxina II es menos tóxica, el punto de fusión es de 199-

200°C y la rotación óptica es de α D28 ‐41.88° (Wong et al., 2002)

A nivel celular las grayanotoxinas actúan en células nerviosas y musculares

interfiriendo con la transmisión del potencial de acción por su ligamiento a los

canales de sodio en la membrana celular, produciendo un bloqueo de éstos en estado

abierto, volviéndose incapaces de inactivarse, provocando un cambio en la activación

del potencial en dirección de la hiperpolarización (Maejima et al., 2003)

Otras investigaciones informan que el ligamiento de las grayanotoxinas a los canales

de sodio y su posterior bloqueo provoca un estado de despolarización, durante el cual

la entrada de calcio a las células nerviosas y musculares puede ser facilitada. Las

respuestas observadas de los músculos esqueléticos y cardiacos, nervios y sistema

nervioso central se relacionan con los efectos de la membrana celular (Gunduz et al.,

2006)

23

Se cree que la forma en que entran las grayanotoxinas, en especial la tipo II, a la

célula es por medio de difusión simple, pues al tener baja polaridad entra por la

bicapa lipídica fácilmente y desde el interior abre los canales de calcio, sugiriendo

que los receptores de las grayanotoxinas no están presentes en la cara externa de la

membrana sino en su parte interna (Masutani et al., 1981) (Narahashi & Seyama,

1974) (Issei et al., 1988).

Los efectos tóxicos de las grayanotoxinas son raramente fatales y no duran mas de 24

horas, exceptuando los casos experimentales con animales (ratones) provocándoseles

la muerte con dosis altas (Gunduz et al., 2006) (Gutierrez, 1989).

La sintomatología producida por una intoxicación ligera es de mareo, debilidad,

excesiva transpiración, hipersalivación, náusea, vómito y adormecimiento de los

músculos. Cuando la intoxicación es severa se presenta complicaciones cardíacas

como un bloqueo completo atrioventricular (Ergun et al., 2005).

Los síntomas del envenenamiento ocurren a los pocos minutos de consumir la toxina

y finalizan después de dos o más horas, ya que las grayanotoxinas son metabolizadas

y excretadas rápidamente; la severidad de la intoxicación depende de la cantidad

ingerida, por ejemplo, para la miel envenenada se ha reportado una dosis entre 5 y 30

gramos (Gunduz et al., 2006).

En ratas inyectadas con 50 mg de miel envenenada por kg de peso del animal

intracerebroventicularmente (i.c.v.), reportaron una marcada bradicardia y una

depresión en la tasa respiratoria, pero estos efectos no se dieron en ratas tratadas con

50 mg por vía intraperitoneal (i.p). Esto sugiere que los sitos de acción cardiaca y

respiratoria de las grayanotoxinas están dentro del sistema nervioso central; la

bradicardia es mediada por la estimulación del nervio vago hacia la periferia (Onat et

al., 1991).

A nivel hepático y renal los efectos de las grayanotoxinas producen una

nefrotoxicidad caracterizada por una hematuria y proteinuria junto con la reducción

24

proteica en sangre y hepatoxicidad que ocurre en alta dosis representada por cambios

en la dilatación de la vena central hepática, congestión, necrosis focal, infiltración de

las células inflamatorias en la triada del portal hepático (Ascioglu et al., 2000).

Las grayanotoxinas también causan descensos en los niveles de glucosa y lípidos en

la sangre por medio de la estimulación de los nervios parasimpáticos que hacen que el

páncreas secrete insulina (Oztasan et al., 2005).

2.3 Métodos de purificación de andromedotoxina.

Según los métodos planteados por Humphreyst y Stodulski en 1986, se toma

aproximadamente 100 g del material fresco del que se quiere aislar la

andromedotoxina (hojas, frutos, flores o corteza) y se homogenizan con 200 mL de

metanol para hacer una extracción por reflujo a una temperatura de 70°C. El bagazo

obtenido es lavado varias veces con metanol caliente, seguidamente se reúnen todas

las extracciones metanólicas en un sola.

El extracto metanólico se le ajusta el pH a 7 adicionándosele una solución de

bicarbonato de sodio y se extrae varias veces con cloroformo. A esta fracción

clorofórmica se le adicionó sulfato de sodio anhídrido para sacarle toda el agua

presente, y se llevó a sequedad.

La andromedotoxina es purificada al diluir la fracción clorofórmica en 5 ml del

mismo solvente y es pasada por una columna de alúmina neutral añadiéndosele

matanol/cloroformo 1:9. Se colectan alícuotas de 5 mL en las cuales se determina la

distribución de la andromedotoxina humedeciéndolas en papel filtro y dejándolo

sacar para finalmente aplicarle el reactivo de Godin (mezcla de volúmenes iguales de

soluciones A y B; solución A: vainillina en etanol + ácido perclórico al 3%, solución

B: ácido sulfúrico al 10% en etanol). Las alícuotas que den positivo se dejan secar y

se lavan con n-hexano seguido por una mezcla de n-hexano/acetato de etilo (95:5).

Finalmente el residuo es disuelto en una mínima cantidad de metanol/agua (1:1).

25

2.4 Fisiología del calcio.

El calcio es el ión más importante que interviene en el metabolismo mineral. El 99%

se localiza en el hueso y sólo un 1% es extra óseo, siendo este último de gran

importancia fisiológica (Ortíz & Sánchez, 2001).

El calcio es partícipe directo del tejido conjuntivo diferenciado óseo, ofreciéndole la

matriz orgánica y configurándole la rigidez y firmeza necesaria para desempeñar sus

funciones de sostén esquelético (Berne & Levy, 2006).

El calcio es esencial para el transcurso normal de las contracciones del músculo

cardiaco y de la musculatura lisa y estriada, así como para el funcionamiento del

sistema nervioso. Además el calcio desempeña un papel importante en la coagulación

sanguínea (Berne & Levy, 2006).

El calcio de la sangre se halla por entero en el plasma. Lo mejor para efectuar las

determinaciones consiste en emplear suero, el cual contiene de 8,5 a 11,5 mg por 100

cc; algunos autores admiten la cifra de 12 mg como el límite superior máximo de la

normalidad. Este calcio sérico total existe bajo dos formas: una fracción no difusible

que representa un 50% del cual el 40% esta unido a proteínas, mientras que el 10% se

halla unido a aniones inorgánicos como el citrato, y una fracción difusible que

representa el otro 50% del calcio que es fisiológicamente activo en estado ionizable y

constituye aproximadamente la mitad del calcio sérico total; parece ser que el estado

del equilibrio ácido básico tiene importancia determinando el grado de ionización

(Kolmer, 1954) (Piñeros, 1991).

La determinación del nivel de calcio en suero es de gran importancia para los

diagnósticos prácticos. En condiciones fisiológicas la concentración de calcio en

suero se mantiene gracias a la dirección endocrina de las glándulas paratiroideas.

La hormona paratiroidea (PTH), es una hormona peptídica que controla minuto a

minuto el nivel de calcio ionizado en la sangre y en los fluidos extracelulares. Está

compuesta por 84 aminoácidos (Bernard et al, 1988).

26

La PTH secretada es rápidamente metabolizada por el hígado (70%) y por los riñones

(20%) y desaparece de la circulación con una vida media de 2 minutos. Menos del

1% de la hormona secretada no encuentra su camino a los receptores para la PTH en

los órganos blanco. (Bernard et al, 1988).

Las glándulas paratiroideas están íntimamente involucradas en la regulación de los

niveles de calcio en la sangre, ya que la administración de su hormona produce un

aumento de ambas fracciones cálcicas y séricas, la difusible y la no difusible.

(Kolmer, 1954).

La actividad de las glándulas paratiroideas está controlada mas por los niveles de

calcio libre (ionizado) de la sangre que por las hormonas tróficas secretadas por el

hipotálamo y la hipófisis. Normalmente, el descenso de los niveles de calcio libre

estimula la síntesis y secreción de PTH (hormona paratiroidea).

La hormona paratiroidea tiene los siguientes efectos: Aumenta la absorción de calcio

en las vellosidades intestinales; estimula la actividad osteoclástica con la liberación

de calcio; aumenta la reabsorción de calcio en los túbulos renales disminuyendo al

tiempo la reabsorción de fosfato a este nivel; aumenta la reabsorción ósea con

movilización de calcio y fósforo del hueso y, promueve la formación renal del

metabolito de vitamina D (Piñeros, 1991).

La calcitonina es una hormona peptídica producida y secretada por células C

especializadas. Esta hormona opera en sentido contrario a la paratiroidea, por lo cual

lleva a la disminución del calcio en la sangre (Piñeros, 1991).

La secreción es estimulada por un incremento en la concentración de calcio iónico.

La calcitonina reduce la secreción de gastrina y jugo gástrico e incrementa la

secreción por el intestino delgado de sodio, agua, potasio y cloruro (Kolmer, 1954)

Otros mecanismos fisiológicos están relacionados con las concentraciones de calcio

en la sangre, entre éstos están la vitamina D y los cambios ácidos-básicos.

27

La vitamina D y los rayos ultravioleta aumentan también la cantidad de calcio sérico,

por favorecer su absorción, e influyen sobre el metabolismo intermediario del calcio y

del fósforo. En condiciones normales, el efecto de la vitamina D parece depender de

la existencia de una cantidad normal de hormona paratiroidea; sin embargo, faltando

ésta, la deficiencia puede compensarse ampliamente por la administración de dosis

extraordinariamente elevadas de calcio, empleando una dieta adecuada. Dicho en

otras palabras, la vitamina D parece tener sobre el calcio sérico el mismo efecto que

la hormona paratiroidea. Algunos observadores admiten que estimula la producción

de hormona, pero al parecer, la acción de ambas substancias no es fundamentalmente

la misma (Kolmer, 1954).

Los cambios ácidos-básicos alteran la absorción de calcio, así la acidemia aumenta la

movilización ósea del calcio y reduce la reabsorción tubular del mismo dando como

resultado el aumento de la calciuria (Piñeros, 1991).

El porcentaje de calcio de la dieta absorbido por el intestino aumenta cuando

disminuye su ingestión y se reduce cuando el calcio de la dieta es mayor. El

metabolismo depende de la vitamina D, es decir la vitamina D y sus metabolitos

aumentan la reabsorción tubular de calcio (Piñeros, 1991).

Los déficits del ion calcio por pérdidas o a un aporte deficiente, se compensan con

una liberación incrementada procedente del los huesos (Piñeros, 1991).

Por lo cual, muchas hipocalcemias o hipercalcemias son producto de una alteración

en la transformación de la sustancia ósea. Desde la patogénesis son las afecciones de

tiroides y de las paratiroides así como tumores de los huesos los que están en un

primer plano (Piñeros, 1991).

El calcio funciona como mensajero iónico, transmitiendo las señales recibidas en la

superficie celular a los procesos intracelulares. También está implicado en otros

procesos tales como transporte de sales y agua por el epitelio intestinal, control del

28

metabolismo del glucógeno en el hígado y regulación de secreción de hormonas,

enzimas digestivas y neurotransmisores (Piñeros, 1991).

Realmente, el ión solo puede cumplir su función de mensajero intracelular a

concentraciones muy bajas y estrechamente controladas; las altas concentraciones van

en detrimento del normal funcionamiento de las células (Piñeros, 1991).

Las células poseen un conjunto de mecanismos por lo que regulan la concentración

intracelular de calcio. Estos mecanismos funcionan mediante el control del

movimiento de los iones de calcio a través de tres membranas: la plasmática, la

mitocondrial y la de los compartimientos que almacenan calcio, denominados

retículos sarcoplasmáticos en las células musculares y calcisomas en células no

musculares (Piñeros, 1991).

La concentración de calcio en el medio extracelular tiende a ser unas 10.000 veces

superior a la intracelular. El mantenimiento de esta diferencia de concentración

depende de la baja permeabilidad al calcio de la membrana plasmática y que esta

presenta “bombas” que translocan los iones al exterior de la célula en contra del

gradiente de concentración (Fox, 2004).

El calcio en forma iónica presenta otras dos funciones importantes: favorece la

coagulación sanguina y disminuye la irritabilidad muscular. La coagulación precisa

del calcio para que se lleve acabo la cascada de los trece factores (Fox, 2004).

El calcio también reduce la irritabilidad muscular pues el músculo siempre se

encuentra listo a responder al impulso nervioso, y el contacto de iones sodio y potasio

con las miofibrillas aumenta la reactividad potencial de éstas, de forma inversa actúan

al contacto con los iones calcio, magnesio e hidrogeno pues disminuye la reactividad

potencial produciendo que un impulso nervioso condicione una débil contracción

(Fox, 2004).

El depósito y la extracción de calcio del hueso están regulados por la glándulas

paratiroides de la siguiente manera: el estimulo útil para la secreción de la

29

paratiroides es una disminución del nivel de calcio en el hueso. La hormona

paratiroidea actúa en la eliminación de fosfatos por el riñón, de esta manera los

fosfatos disminuyen en el plasma, lo cual es el estimulo útil para la liberación de

calcio en los huesos. Entonces se aumenta el nivel de calcio en la sangre y se

suspende la acción de las paratiroides (Fox, 2004)

Cuando hay un exceso permanente de la hormona paratiroidea se eliminan altas

cantidades de fosfato por los riñones y se desprende calcio de los huesos aumentando

los niveles de calcio en la sangre produciéndose en los huesos descalcificación,

debilidad y fracturas. En el caso contrario ósea cuando la hormona paratiroidea es

insuficiente, se excretan muy pocos fosfatos y no se desprende calcio de los huesos,

disminuyéndose los niveles del ion calcio en la sangre produciendo los trastornos

concernientes al déficit del calcio como ion, el más notable es el aumento de la

irritabilidad muscular que en su máximo grado produce la patología denominada

tetania (Fox, 2004).

2.5 Ingesta de calcio.

El calcio entra al organismo por medio de los alimentos que se ingieren. Las

necesidades de este ión se ven en la tabla No 3.abla

Necesidades diarias de calcio por grupos de edad. Segúel panel de consenso del NIH de Adolescentes 10-25 años 1200-1500 mg/día Varones 26-65 años 1000 mg/día

Mayores de 65 años 1500 mg/día Mujeres 25-50 1000 mg/día

Menopáusica 1000-1500 mg/día Mayores de 65 años 1500 mg/día

Edad fértil en la mujer Embarazo y lactancia 1200-1500 mg/día Tabla No 3. Necesidades diarias de calcio en humanos.

El calcio es absorbido por el tubo digestivo, se distribuye por el plasma, e ingresa a

los tejidos, especialmente al óseo (Fox, 2004).

30

Los túbulos renales son los encargados de reabsorber y eliminar el calcio adecuado,

de esta manera se conserva los niveles favorables de calcio en el organismo.

2.6 Metabolismo del calcio.

El calcio además de conferir al tejido conectivo diferenciado del hueso sus

características de rigidez y resistencia, también se encuentra en el líquido intersticial

y otros órganos interviniendo en la transmisión, excitabilidad nerviosa y la

concentración muscular (Fox, 2004).

A nivel de la membrana celular los gradientes de los iones de calcio (Ca2-) permiten o

no el paso de iones de Na+ y K+, para efectuar los procesos de despolarización y su

efecto revés, la repolarización.

En el sistema hematopoyético es necesaria su presencia para la actividad plena de la

cascada de los trece factores que la constituyen que producen la reacción de

coagulación (Fox, 2004).

A nivel hormonal tiene una acción directa sobre la estimulación de la producción y

eliminación tanto de hormona paratiroidea como de la calcitonina (Fox, 2004).

2.7 Absorción de calcio intestinal.

El calcio se absorbe fundamentalmente en el duodeno y el yeyuno. Un escaso

porcentaje se absorbe por difusión simple, paracelular y no saturable, y la mayor parte

mediante un proceso de absorción transcelular fisiológicamente regulado por la forma

activa de la vitamina D, el calcitrol, que estimula su paso tanto mediante acciones

genómicas (síntesis de proteínas transportadoras) como no genómicas (Piñeros,

1991).

31

La solubilidad de este mineral en el estómago es alta por el medio ácido, pero al pasar

al intestino delgado, el medio alcalino de esta parte del tubo digestivo hace muy poco

soluble el calcio no permitiéndose una buena absorción (Piñeros, 1991).

En circunstancias normales se absorbe aproximadamente un 30% del calcio que entra,

eliminándose entre el 60 y 70% del ingerido, ósea solo se tiene una absorción de 1/3

de la cantidad ingerida (Piñeros, 1991)

Las dietas pobres en calcio, el déficit de vitamina D y la falta de respuesta intestinal a

la misma (exceso de glucocorticoides o de hormona tiroidea, síndromes de mal

absorción) son las causas más frecuentes del déficit de absorción del calcio. (Piñeros,

1991)

2.8 Intercambio mineral óseo.

El componente inorgánico de la matriz ósea está constituido en su mayor parte por

fosfato cálcico en forma de cristales de hidroxiapatita. El intercambio de minerales se

produce en el medio interno y el hueso, así cuando el calcio desciende en el medio

interno se presenta paso de minerales desde el hueso al medio interno. De manera

contraria cuando el medio interno presenta alto calcio se presenta el paso de este ión

hacia el hueso. Lo anterior tiene como objeto mantener los valores y cantidades

normales de calcio en la porción ósea y en la plasmática (Torres & Cannata, 2003).

2.9 Manejo renal del calcio.

El riñón es el órgano principal por el cual se excreta la mayor cantidad de calcio

sobrenadante del organismo.

32

El calcio filtrado a nivel glomerular es el ultra filtrable del plasma que es

aproximadamente el 60% (ionizable) del calcio total. Aproximadamente el 60 a 70 %

del calcio filtrado es reabsorbido en el túbulo proximal, 20 % en el asa gruesa

ascendente de Henle, el 5 a 10 % en el túbulo contorneado distal y menos del 5 % en

el túbulo colector (Torres & Cannata, 2003).

Para mantener neutro el balance de calcio es necesario que los túbulos reabsorban el

98 a 99 % de la carga filtrada, dejando una excreción obligada de calcio de 150 a 200

mg por día que es aproximadamente igual a la absorción intestinal (Torres &

Cannata, 2003)

El principal regulador de la excreción de calcio es la PTH, que disminuye la filtración

y aumenta la reabsorción tubular, aunque por sus efectos a otros niveles la PTH puede

aumentar los valores de calcio en la orina denominado calciuria (Torres & Cannata,

2003)

El calcitriol que se produce en el riñón, actúa en el túbulo distal promoviendo un

aumento en la reabsorción de calcio (Torres & Cannata, 2003)

La calcitonina fisiológicamente estimula la reabsorción tubular del calcio y a dosis

supra fisiológicas la inhibe.

2.10 Calcemia en ratas.

El volumen de plasma en una rata es de 31.3 mL/kg de peso del animal y su volumen

de sangre es de 57.5mL/kg de peso.

El porcentaje de agua en el plasma es de 92.9% y el porcentaje total de sólidos es de

18.4%; en el plasma el porcentaje de agua es de 81.6% y el de sólidos totales es de

18.4%. (Anonimo, 1961)

33

El valor de calcio en el suero sanguíneo o plasma es de 6.2 (5.4-7.2) meq/L como

muestra la tabla No 4.

Bicarbonato 20.9 (16.1-25.3) meq/L

Calcio 6.2 (5.4-7.2) meq/L

Cloruro 118 meq/L

Cobre 320 ug/100 ml

Yodo 3.4 (3.3-3.5) ug/100 ml

hierro 143 ug/100 ml

Magnesio 1.6 mg/100 ml

Fosfato 7.0 (5.8-8.2) meq/L

Potasio 5.9 meq/L

Sodio 152 meq/L

Tabla No 4. Concentración de diferentes elementos presentes en la sangre de la rata.

Las concentraciones de calcio y fosfato en la orina diaria de la rata se muestran en la

tabla No 5.

Tasa de excrecion

meq/dia meq/kg/dia

Calcio 0.09 (0.02-0.16) 0.26 (0.08-0.46)

Fosfato 0.5 (0.27-0.55) 3.3 (0.8-3.6)

Tabla No 5. Concentraciones de calcio y fosfato excretados por la orina durante el día y por kg de animal.

34

En el hombre el valor de calcio en la sangre es de 9.7mg/100mL, en los eritrocitos es

de (0.6-1.4) meq/L, en el plasma o suero sanguíneo es de 9.8 (8.4-11.2) mg/100mg.

(Anonimo, 1961)

2.11 Causas de hipercalcemia.

La hipercalcemia humoral maligna (HHM) desarrolla una calcificación sistemática

principalmente afectando la disfunción de algunos órganos. Los tumores humanos

que han sido reportados como desarrollo de la HMM incluye carcinomas de células

squamous, adenocarcinomas pulmonares, carcinomas de células renales, carcinomas

de ovarios y pechos (Nakanishi et al., 2002).

La proteína relacionada con la hormona paratiroides (PTHrP) ha sido considerada

como el mayor factor de acusa para la patogénesis de (HHM). Desde PTHrP y los

receptores de la parte de la hormona paratiroides en el hueso y los riñones, la PTHrP

tiene la misma función biológica que la PTH. (Nakanishi et al., 2002).

En pacientes con cáncer se ha especulado que la PTHrP es producida en exceso por la

las células neoplásicas que estimulan la resorción osteoclástica del hueso y la

absorción renal del calcio produciendo HHM (Nakanishi et al., 2002).

En investigaciones hechas con ratas sanas, en las que se han trasplantado tumores

pulmonares con hipercalcemia maligna de ratas enfermas, se ha observado que hay un

desarrollo de calcificación en varios grados en el riñón, pulmón y corazón por la

producción de PTHrP por parte de las células cancerígenas. La PTHrP puede expresar

estas funciones biológicas por encuadernación de los receptores de PTHrP/PTH. Sin

embargo, se ha especulado que desde que los osteoclastos no tengan receptores de

PTHrP/PTH la función de los osteoclastos puede ser controlada a través de varios

factores principalmente por los osteoblastos con receptores de PTHrP/PTH capaces

35

de encuadernar la PTHrP. En este experimento se sugiere que la acción de la PTHrP

primero es en los osteoclastos ( Nakanishi et al 2002).

Los osteoclastos están implicados en enfermedades como la de Paget, la

hipercalcemia y la osteoporosis, ya que estas son células multinucleadas encargadas

de la resorción ósea, derivadas del sistema hematopoyético que ésta altamente

relacionada con factores locales de crecimiento y con hormonas sistémicas como la

PTH, la calcitonina y la vitamina D. (Ballesteros et al., 1999).

El osteoclasto se localiza en la superficie del endósteo del sistema de Havers y en la

superficie del periostio, posee un borde rugoso que consiste en una serie de

proyecciones citoplasmáticas finas adyacentes al hueso; allí se lleva a cabo la

resorción ósea. Los osteoclastos se encuentran en el hueso, pero se han detectado en

intestino, riñón y pulmón. (Ballesteros et al., 1999)

El osteoclasto posee una proteína llamada 121F, la cual se encuentra en la superficie

de la célula para protegerla contra la acción de los radicales superóxido, también

recientemente se ha descubierto la presencia del receptor para la calcitonina en el

osteoclasto. (Ballesteros et al., 1999)

En la vida joven la formación de hueso supera la resorción logrando ganancia de

tejido óseo, pero en las etapas tardías de la vida sucede lo contrario. Durante ciertos

eventos patológicos estos eventos se ven alterados provocando desequilibrios entre la

formación y la resorción. (Ballesteros et al., 1999)

Dentro de los factores que afectan las funciones y la formación de los osteoclastos se

encuentran las hormonas sistémicas.

En las hormonas sistémicas están la PTH, Calcitriol, prostaglandinas y la calcitonina.

La primera induce la resorción ósea, incrementa la formación de hueso y modula la

función del osteoclasto actuando directamente sobre él o por medio del osteoblasto

(secreción de IL-6).

36

El calcitrol estimula a los metabolitos de la vitamina D que son potentes estimulantes

de la resorción y de la formación de osteoclastos. También inducen la secreción de

IL-1 y 6 (Interleukinas 1 y 6) por parte de los osteoblastos. Por otra parte estimula la

absorción de calcio en el intestino y la reabsorción renal.

La prostaglandinas inhiben la formación de osteoclastos y la resorción de hueso;

estudios recientes la muestran como segundo mensajero de citoquinas estimulantes de

resorción (Ballesteros et al., 1999).

La calcitonina es un potente inhibidor de resorción ósea. Su receptor aparece como

marcador diferencial de osteoclastos maduros. (Ballesteros et al., 1999)

Dentro de otros factores que afectan la función y la formación de los osteoclastos

están las interlukinas, ya que estas se diferencian en el sentido que la IL-1 mejora el

crecimiento y la diferenciación, pero sobre todo la resorción mientras que las IL-6 y

11 inducen la formación de osteoclastos. (Ballesteros et al., 1999)

En cuanto a inhibidores esta el factor TGF-Β es un factor autocrino que no solo

inhibe la resorción sino que aumenta la formación de hueso. Los bisfosfonatos son

derivados de los pirofosfatos que retardan la disolución de cristales de calcio por

iones fosfatos.

También evidencias recientes sugieren que los osteoclastos secretan sustancias que

estimulan su propia formación y actividad como la IL-6 y la IL-1. Además de las

interlukinas se ha implicado la Anexina II (inhibidor intracelular de la fosfolipasa

A2), y el OSF-1 (factor estimulante de los osteoclastos). (Ballesteros et al., 1999).

Para que los osteoclastos lleven a cabo la resorción ósea, éstos tiene que adherirse a la

superficie ósea, esto lo hace por medio de las moléculas de la familia de las asesinas

llamadas integrinas dentro de las que se encuentra el receptor de la vitronectina.

(Ballesteros et al., 1999)

37

Para la resorción ósea el osteoclasto se vale de proteasas del tipo Anhidrasa

Carbónica, Hidrolasas lisosomales de pH ácido, MMP-9(Metaloproteinasa de matriz

o Colagenasa I) y Catepsina O que es otra colagenasa. También se necesita la

secreción ácida regulada por la PTH, la PgE2 y la calcitonina. (Ballesteros et al.,

1999)

La PTH y la vitamina D también son inhibidores de la apoptosis de los osteoclastos

que es inducida por las hormonas sexuales, los Bisfosfonatos y el TGF. (Ballesteros

et al., 1999)

Las alteraciones de las paratiroides incluyen tanto la hiperfunción como la

hipofunción. Dentro la hiperfunción se presenta el hipertiroidismo, éste se presenta de

dos formas, primario y secundario, y con menos frecuencia terciario. El primero se

debe a la producción excesiva, espontánea y autónoma de PTH, mientras que las otras

dos formas son fenómenos secundarios típicos de los pacientes con insuficiencia renal

crónica (Robbins & Cotra, 2005).

Investigaciones hechas recientemente comienzan a aportar conocimientos

moleculares sobre la patogenia del hiperparatiroidismo primario. En más del 95% de

los casos se debe a adenomas esporádicos o a hiperplasias esporádicas de las

paratiroides. Aunque los síndromes familiares son la segunda causa a considerar

(Robbins & Cotra, 2005).

El hiperparatiroidismo primario se manifiesta de cualquiera de las siguientes dos

formas: puede ser asintomático, de forma que solo se identifica mediante un análisis

bioquímico rutinario, o sintomático.

En el asintomático la manifestación mas frecuente del hiperparatiroidismo primario

es el ascenso del nivel del calcio iónico sérico; de hecho, el hipertiroidismo primario

es la causa mas frecuente de hipercalcemia asintomática. En pacientes con

hiperparatiroidismo primario, las concentraciones séricas de PTH son

exageradamente altas en relación con las de calcio sérico, mientras que en la

38

hipercalcemia producida por enfermedades no paratifoideas los niveles de PTH son

bajos o indetectables (Robbins & Cotra, 2005).

El hiperparatiroidismo primario sintomático los signos y síntomas reflejan los efectos

combinados del aumento de la secreción de PTH, tales son dolores óseos, cálculos

renales, trastornos gastrointestinales que consisten en estreñimiento, náuseas, úlceras

pépticas, alteraciones del sistema nervioso central que consisten en depresión, letargia

y eventualmente convulsiones, anomalías neuromusculares incluyen sensación de

debilidad y fatiga y manifestaciones cardiacas consisten en calcificaciones de las

válvulas aórtica, mitral o ambas (Robbins & Cotra, 2005).

El hiperparatiroidismo secundario aparece en cualquier trastorno que produzca un

descenso crónico del calcio sérico, ya que esta hipocalcemia inducirá la

hiperactividad compensadora de las glándulas paratiroides. Con diferencia, la

insuficiencia renal es la causa mas frecuente de hiperparatiroidismo secundario,

aunque otras situaciones, como la ingestión insuficiente de calcio en la dieta, la

esteatorrea y el déficit de vitamina D, también pueden provocarla (Robbins & Cotra,

2005).

39

3. PLANTEAMINTO DEL PROBLEMA

La hipercalcemia es el aumento de la cantidad total de calcio en el suero sanguíneo,

se produce principalmente por hiperparatiroidismo o exceso de producción de

hormona paratiroidea, que es la hormona que extrae el calcio de los osteoclastos y

regula la absorción de calcio en los huesos produciendo el aumento de calcio en la

sangre. Los síntomas producidos son desórdenes mentales, dificultades cognitivas,

ansiedad, depresión, confusión, estupor, fatiga o cansancio muscular, estos síntomas

se van presentando en aumento según aumenta el nivel de calcio en la sangre (Potts

2001) (Kolmer 1954).

Uno de los compuestos más importantes de la mayoria de géneros de la familia

Ericaceae a la cual pertenece la Pernettya prostrata es la andromedotoxina que como

su nombre lo indica es una toxina que produce vómito, diarrea y mareos, aun no se ha

detectado la presencia de la toxina en esta planta por falta de estudios de esa índole,

pero se cree que la posee por producir los mismos efectos al ser consumidos sus

frutos (Anonimo, 1990).

En comparaciones hechas entre ratas tratadas con fruto de Pernettya prostrata sin

toxinas y ratas tratados con carbonato de calcio se observó que los niveles úreos de

calcio disminuían en ambos grupos de ratas, esto llevó a pensar que los frutos de esta

planta presentan actividad hipercalcémica (Neira & Soliz, 1990).

Estos resultados no son fiables ya que para medir efectivamente los niveles de calcio

sérico se hace por medio del suero sanguíneo y se cuantifica en un espectrofotómetro

de absorción atómica, el cual es muy sensible y especifico (Neira & Solis, 1990).

Por lo anterior es necesario ratificar los resultados obtenidos en las investigaciones

pasadas mediante técnicas efectivas para medir los niveles de calcio en el plasma

sanguíneo, ya que la Pernettya prostrata es consumida por habitantes de la región

40

Cundíboyacense sobre todo por la población infantil y animales como el ganado han

presentado síntomas de afección al ingerir dicho fruto (Anonimo. 1990).

41

4. OBJETIVOS

General.

Corroborar mediante la técnica de medición de calcio sérico cuantificado por

espectrofotometría de absorción atómica a partir de la sangre obtenida de los ojos de

ratas, el aumento de iones de calcio ocasionada por la presencia de potenciales

sustancias químicas responsables de la acción hipercalémica de los frutos de

Pernettya prostrata.

Objetivos específicos.

• Probar la acción del fruto seco de Pernettya prostrata en el aumento de calcio

en la sangre.

• Realizar la búsqueda en los extractos de los frutos de Pernettya prostrata de

sustancias tipo andromedotoxina, por medio de fraccionamientos de éstos en

diferentes solventes.

Hipotesis.

• Las ratas que consumen fruto de Pernettya prostrata se les aumentará la

concentración de calcio en la sangre.

Ho: No hay diferencias significativas entre los tratamientos: Rodentina,

Rodentina +CaCO3 y Rodentina +CaCO3 + fruto.

H1: Hay diferencias significativas entre los tratamientos: Rodentina,

Rodentina +CaCO3 y Rodentina +CaCO3 + fruto

42

5. METODOLOGIA

5.1 Recolección de material.

Al recoger material vegetal para un análisis fitoquímico se deben tener en cuenta los

siguientes aspectos:

1. Tomar el material directamente de la planta, no recoger material muerto o

caído.

2. Llenar la ficha de campo, anotando lugar, hora y fecha de recolección;

características del medio y el estado vegetativo de la planta.

3. Realizar la identificación botánica en un herbario reconocido.

4. El material seco se debe pulverizar para romper los tejidos celulares y permitir

una mayor superficie de contacto material-solvente (Pedrozo, 1999).

5.2 Métodos de extracción.

La forma más precisa de extracción depende naturalmente de la textura y del

contenido acuoso del material vegetal a extraer, y el tipo de sustancia que se va a

aislar. Los metabolitos secundarios pueden ser volátiles (aceites esenciales),

oleoresinosos, reinosos y sólidos; termolábiles (alcaloides, lactonas, heterósidos) o

resistentes al calor (termoestables); lipofílicos e hidrofílicos (Pedrozo, 1999).

Para el caso especifico de este trabajo se realizaron extracciones de constituyentes no

volátiles, en las cuales se incluye la mayoría de los productos naturales vegetales.

Para la extracción de estos tipos de compuestos se utilizan muchos métodos pero se

pueden resumir en maceración, percolación y extracción continua en Soxhlet

(Pedrozo, 1999).

43

La maceración consiste en dejar el material vegetal triturado en un frasco de vidrio o

de acero inoxidable con solvente frio durante un tiempo de ocho días. Este método es

recomendable para extraer sustancias termolábiles, pero si el proceso se realiza a

temperaturas mas altas a la del ambiente pero por debajo del punto de ebullición del

solvente se llama digestión, y si la temperatura es mayor a la del punto de ebullición

del solvente se conoce como decocción (Pedrozo, 1999).

En la percolación se pasa varias veces repetidamente el solvente frio o caliente sobre

el material finamente triturado. Este procedimiento se recomienda para cuando la

concentración del compuesto a extraer es baja.

La extracción continua en Soxhlet se basa en un balón de vidrio donde se coloca el

solvente y es calentado mediante una manta eléctrica, un extractor donde se introduce

el material vegetal y un refrigerante. Al ebullir el solvente, sus vapores ascienden

hasta la parte superior del extractor, se condensan cuando llegan al condensador y

caen sobre la muestra gota a gota; el condensado baja por el sifón hasta el balón, para

volver así al inicio del ciclo. Las sustancias arrastradas se acumulan en el solvente

contenido en el balón. Este procedimiento es ideal para análisis a gran escala

(Pedrozo, 1999).

Los extractos son concentrados al vacío en un rotaevaporador hasta un mínimo

volumen a temperaturas entre 30 y 40 °C. Los extractos acuosos o alcohólicos

deberán liofilizarse siempre que sea posible, como precaución estos extractos deberán

ser guardados en el refrigerador y adicionarles unas gotas de benceno para evitar los

hongos.

Hay dos tipos de extracción: Las continuas y las discontinuas. Las extracciones

continuas se pueden llevar a cabo de dos maneras diferentes.

Extracciones continuas líquido – líquido que son las que se basan en la distribución

de una sustancia entre dos fases líquidas inmiscibles; dichas sustancias no deben

reaccionar, asociarse o disociarse.

44

Existen dos tipos de extractores a escala de laboratorio, uno para los solventes menos

densos que el agua y otro para los más densos que el agua.

Extracciones continuas de sólidos son las que utiliza un sistema tipo Soxhlet, la

mezcla finalmente dividida se coloca en el cartucho de extracción y se hace pasar en

disolvente puro, el material extraído se acumula en el matraz de destilación del

disolvente (Pedrozo, 1999).

El otro tipo de extracción es la discontinua o en batch que utiliza un embudo de

decantación en la que se coloca un líquido a extraer y el solvente de fragmentación

(extracción discontinua líquido – líquido), se tapa y se agita, la eficacia de la

extracción se aumenta repitiendo dicho procedimiento varias veces, agregándole una

porción nueva de solvente cada vez (Pedrozo, 1999).

5.3 Pruebas químicas preliminares.

Estas pruebas se hacen a los extractos para determinar la presencia de diferentes

sustancias.

Las pruebas de Lieberman-Burchad y de Salkowski se hacen en extracto de éter de

petróleo (compuestos menos polares) y se utiliza para observar si hay presencia de

terpenos y esteroides.

Libermann-Buchard: Es la prueba más utilizada en el análisis de esteroides. Un

método dispendioso consiste en someter el extracto etéreo de la planta a una

cromatografía bidimensional en capa delgada de sílica con solvente adecuado para

separar los carotenos y xantofilas de los esteroles, y emplear como revelador el

reactivo de Liberman-Buchard, asi se pueden separar las manchas de los carotenos y

xantofilas de las producidas por esteroides y/o triterpenoides (Bilbao, 1997).

En la práctica consiste en someter la muestra a la acción del anhídrido acético en

cloroformo y ácido sulfúrico concentrado, empleando gotas en placa excavada. Las

45

gotas de ácido deben agregarse por el borde de la cavidad, muy lentamente para

apreciar los cambios de color (Bilbao, 1997).

Los esteroles dan un color azul verdoso que alcanza su máxima intensidad a los 30

minutos. Los estenoles dan color similar al minuto y medio pero con menor

coloración (Bilbao, 1997).

Salkowski: Se usa para observar la presencia de colesterol. En una placa excavada se

disuelve la muestra en cloroformo y se agrega una gota de H2SO4 concentrado, dando

como positivo el color rojo (Bilbao, 1997).

Las Pruebas de Baljet y de Hidroxomato férrico se hacen en extracto de

diclorometano (compuestos medianamente polares) y se utilizan para probar si hay

Terpenos, sequiterpenlactonas y esteroles (Bilbao, 1997).

Baljet: Se usa para observar la presencia de agliconas cardiotónicos, se realiza

tomando 0.5 mL del extracto etanólico y agregándosele 0.5 mL del reactivo Baljet, la

prueba positiva da tonalidad de anaranjado a rojo oscuro (Bilbao, 1997).

Hidroxamato férrico: su usa para mirar la presencia de sesquiterpelactonas, el

procedimiento es tomando la muestra diluida en CHCl3 mas dos gotas de solución

dos normal en MeOH de Clorhidrato de hidroxilamina y se agrega dos gotas de

solución en MeOH dos normal de KOH. Seguidamente se calienta en baño maría y se

acidula con HCl 0.5 normal y finalmente se agrega FeCl3 al tres por ciento, el color

café o violeta indica positivo (Bilbao, 1997).

Las siguientes pruebas se hacen en extracto de acetato de etilo y/o etanólico: Shinoda

para observar flavonoides y fenoles, la prueba del cloruro férrico para mirar

flavonoides y fenoles, prueba de Antrona para Glicósidos de flavonoides o de

terpenos, prueba de Dragendroff para alcaloides.

Shinoda: Se hace para probar la presencia de flavonoides. Se toma un mililitro de

extracto etanólico en un tubo de ensayo o placa excavada, se le agrega magnesio en

46

polvo y gotas de acido clorhídrico, el resultado positivo son los colores rosado,

anaranjado o fresa, pero ocasionalmente los flavonoles, flavononas y flavononoles,

dan colores verde a azul (Bilbao, 1997).

Cloruro férrico: Se usa para ver si se encuentran flavonoides y fenoles. Se disuelve la

muestra en etanol y se le agrega FeCl3, el cambio a color verde intenso significa

positivo (Bilbao, 1997).

Antrona: Sirve para observar si hay glicósidos de flavonoides y se realiza en un tubo

de ensayo agregándole una gota de agua, uno a tres miligramos de muestra o del

extracto y por la pared se deja resbalar una antrona, si aparece un anillo azul verdoso

o azul en la interfase, la prueba es positiva (Bilbao, 1997).

Dragendroff: Analiza la presencia de alcaloides, se realiza tomando la muestra

disuelta en metanol, se le agrega HCl y reactio Dragendroff que es yoduro de

bismuto, si es positivo se observa un precipitado naranja (Bilbao, 1997).

5.4 Métodos cromatograficos.

Es la técnica de separación de los compuestos de una mezcla o extracto en una

distribución desigual entre dos fases, una estacionaria y la otra móvil.

En esta técnica se dan varios fenómenos físicos tales son adsorción, reparto,

intercambio iónico y filtración molecular (Pedrozo, 1999).

La fase móvil puede ser un líquido o un gas, pero la fase estacionaria solo puede ser

un líquido o un sólido. Cuando la separación envuelve dos fases líquidas, una

estacionaria y la otra móvil, se denomina cromatografía líquido-líquido (CLL), si se

involucra un sólido en la fase estacionaria y un líquido en la móvil se llama

cromatografía líquido-sólido (CLS), si se cambia la fase móvil a un gas se llama gas-

líquida (CGL), o gas-sólido (CGS) si la fase estacionaria es un sólido (Pedrozo,

1999).

47

Cuando la cromatografía usa como fase móvil un líquido solo se puede llevar a cabo

de tres maneras establecidas: cromatografía en papel (CP), en capa delgada (CD) o en

columna (CC) (Pedrozo, 1999).

Además de las fases móvil y estacionaria la cromatografía necesita de reveladores

que son los que permiten visualizar a los solutos incoloros, pudiendo ser luz

ultravioleta o un reactivo químico especifico (Pedrozo, 1999).

El fenómeno de adsorción es la retención selectiva de una sustancia en la superficie

de un sólido por fuerzas fisicoquímicas como las de van der Waals y enlaces

reversibles tipo puente hidrogeno, también la fuerza de adsorción depende de la

polaridad de la molécula, de la actividad del adsorbente y de la polaridad de la fase

líquida móvil (Pedrozo, 1999).

En las cromatografías líquido-líquido o gas-líquido se presenta el fenómeno de

reparto, muy diferente al de adsorción que se da en las cromatografías que tienen una

fase móvil y otra estacionaria, éste se basa en la distribución de una sustancia (soluto)

entre dos fases líquidas inmiscibles entre sí, de manera que las sustancias que son

solubles solo en un solvente migran con éste y las otras migran en el otro solvente. La

relación de la distribución del soluto en cada una de las dos fases se llama coeficiente

de reparto (K). Este tipo de cromatografías utiliza como soporte de la fase

estacionaria papel de celulosa o gel de sílice (Pedrozo, 1999).

En todas las cromatografías se puede calcular el Rf que es un valor obtenido por

medición de la distancia desde el origen al centro de la mancha producida por la

sustancia, y dividiendo ésta por la distancia entre el origen y el frente del solvente

(Pedrozo, 1999).

5.5 Cromatografía en capa delgada (CCD).

Es la técnica más utilizada para separar las diferentes mezclas de los extractos

naturales por diferencia de gradiente de polaridad. Este tipo de cromatografía consta

48

de dos fases, la primera es la fase estacionaria o parte adsorbente que realiza la

adsorción y tiene una alta afinidad por los compuestos polares y está representada por

una lámina de sílica, la segunda fase es la móvil representada por los solventes y

realiza el arrastre del extracto a separar, dependiendo la polaridad de estos solventes,

los compuestos de los extractos o mezclas se van a separar acorde a su polaridad

relativa (Cannell, 1998).

La separación de los extractos a través de la lámina de sílica se da porque algunos

componentes son más fuertemente absorbidos por el adsorbente (sílica) que otros

Los compuestos que son mas solubles en la fase móvil migran arriba de la placa a

grandes distancias de los que son mas solubles en la fase estacionaria (Cannell, 1998).

La fuerza de los solventes es medida en términos de polaridad y en constante

dieléctrica. Una alta constante dieléctrica indica un solvente polar con fuerte poder de

elución, y una baja constante dieléctrica indica un solvente no polar con baja

habilidad para elucionar un componente del adsorbente (Cannell, 1998).

La polaridad está relacionada con el tipo y número de grupos funcionales presentes en

una molécula, capaces de ligar hidrógenos.

Al realizar la cromatografía en capa delgada se pone en la placa de sílica un punto de

los extractos que se deseen separar a 5 mm de la base, luego se lleva la placa a un

frasco con una mínima cantidad de solvente para que solo moje por debajo de los

puntos de extracto. El frente del solvente migra arriba de la placa a través del

adsorbente por acción de la capilaridad. Seguidamente se lleva a la cámara de rayos

UV para detectar compuestos que solo se ven a ciertas ondas de luz determinadas,

ondas corta (254 nm) y ondas largas (366 nm), y finalmente se revelan con vainillina

(Cannell, 1998).

La detección de compuestos que absorben ondas de 254 nm o 366 nm se ven como

manchas negras o de colores como el amarillo, azul, morado. Los rayos UV de onda

49

corta producen en la placa un color verde ya que ésta tiene silicato de zinc activado,

bajo los rayos UV de onda larga la placa toma un color purpura (Cannell, 1998).

5.6 Cromatografía en papel (CP).

Se usa para separar compuestos hidrófilos tales como ácidos orgánicos, ácidos

nucleicos, compuestos fenólicos, aminoácidos, carbohidratos y glicósidos.

En este tipo de cromatografía se presenta una combinación de los fenómenos de

adsorción y de reparto, puesto que el medio es una matriz de celulosa empapada en

agua; el papel retiene el agua (fase estacionaria) sirviendo al mismo tiempo tanto de

medio de separación como de soporte. Una ventaja de esta cromatografía es su

reproducibilidad de los valores de Rf muy importantes en la descripción y distinción,

de los diferentes metabolitos (Pedrozo, 1999).

En la CP los compuestos son distribuidos entre una gran porción de agua y un

solvente alcohólico inmiscible en ella. Los solventes más utilizados comúnmente son

BAW (butanol-ácido acético–agua 4:1:5 o 6:1:2) y el FORESTAL (ácido acético-

ácido clorhídrico-agua 10:30:3) (Pedrozo, 1999).

Para separar sustancias no muy solubles en agua se baja la polaridad de la mezcla del

solvente utilizando butanol o acetato de etilo y para enriquecer la parte orgánica con

agua se adiciona ácido acético o pirimidina, según el caso (Pedrozo, 1999).

La CP puede ser ascendente, circular o descendente, uní o bidimensional (puede

emplearse en sentido ascendente o descendente).

Los compuestos son usualmente detectados con coloraciones o manchas al UV, o con

un posterior revelador usado en forma de spray o por inmersión. El revelador no debe

tener ácidos concentrados que dañen la celulosa, puede ser universal como los

50

vapores o soluciones de yodo que indican la presencia de casi todas sustancias

(Pedrozo, 1999).

5.7 Cromatografía en columna (CC)

En esta técnica se introduce la fase estacionaria en un cilindro largo de vidrio,

previsto de una llave de paso en su parte inferior.

Para el llenado de la fase estacionaria se puede hacer por medio de dos técnicas: la de

columna seca o la de columna húmeda. En la primera el adsorbente o fase

estacionaria es compactada en seco, introduciéndolo en el cilindro con la ayuda de

movimientos vibratorios, previamente es tapado en la parte inferior el cilindro con un

filtro de lana para retener el adsorbente (Pedrozo, 1999).

La segunda técnica tiene dos variantes: en una se deja caer el adsorbente suavemente

sobre la superficie de la fase móvil puesta con anterioridad en el tubo de vidrio, en la

otra se hace una suspensión uniforme del adsorbente en la fase móvil, la cual se

agrega a una capa de fase móvil puesta en la columna de vidrio, con salida simultanea

de la misma por la llave inferior. En cualquiera de las dos variantes se ayuda

golpeando la parte externa del tubo para obtener una compactación más uniforme

(Pedrozo, 1999).

La columna con el adsorbente no se debe dejar secar, por ende se le debe estar

agregando constantemente porciones de la fase móvil que sale por llave inferior en

forma de gotas. La CC puede ser eluída con una mezcla de solventes manteniendo la

misma concentración o comenzando por la elución con la porción menos polar e

incrementar su polaridad (Pedrozo, 1999).

Los componentes de la mezcla sacados en la columna por la fase móvil o solvente,

son colectados en recipientes independientes, tomando fracciones de volúmenes

51

diferentes dependientes de color o tamaño de la columna. A cada fracción se le

realiza una CCD para determinar su composición (Pedrozo, 1999).

5.8 Mantenimiento de las ratas en el bioterio.

Las ratas se mantienen en un bioterio o recinto para animales de experimentación

bajo condiciones especiales de temperatura y humedad, él cual debe estar dotado de

un sistema de ventilación y calefacción propias. Las ratas deben ser guardadas en

jaulas o cajas plásticas con aserrín para que se absorban las orinas de las ratas y no se

produzca infecciones (Anonimo, 1996)

En cada jaula promedio se pueden albergar como máximo siete ratas, pero deben ser

del mismo sexo si no se quiere tener cria (Anonimo, 1996).

Cada rata diariamente se come de siete a diez gramos de concentrado y bebe de 10 a

15 mililitros de agua (Anonimo, 1996).

5.9 Obtención del suero de ratas.

La sangre de la rata generalmente proviene del corte de la punta de la cola,

puncionando un vaso de ella o del corazón llamado punción cardiaca, pero también es

frecuente realizar el sangrado ocular que consiste en introducir un capilar en el

extremo interno del ojo, este método se utiliza cuando se tienen que realizar más de

un sangrado en el día (Schalm et al., 1981).

La sangre se colecta en frascos ependor para poder ser pasados por la centrifuga, la

cual decanta la hemoglobina y deja suspendido el suero listo para ser trabajado

(Schalm et al., 1981).

Para poder medir el calcio en el suero se llevan a cabo los siguientes procedimientos:

a un mililitro de suero se le adiciona un mililitro de ácido tricloroacético para romper

52

las posibles proteínas que queden, seguidamente se pasa nuevamente por la centrifuga

y se toma el líquido sobrenadante para llevarlo a un balón de 100 mL con agua

desionizada y dos gotas de lantano, de esta manera la muestra de suero queda lista

para ser leídas en un equipo de absorción atómica (Anonimo, 1987).

5.10 Determinación de calcio sérico.

La cuantificación del calcio presente en suero frecuentemente se mide por medio de

un espectrofotómetro de absorción atómica, ya que este método ha sido el más

ampliamente utilizado durante casi más de medio siglo para la determinación de

elementos quimicos en muestras analíticas; pero también existen otros métodos como

los químicos que utilizan reactivos quelónicos y los indicadores metal cromáticos,

que son menos precisos ya que la lectura de la intensidad de la emisión del color varia

constantemente y la cual es proporcional a la concentración de calcio. (Skoog, 2001)

En la espectrofotometría de la absorción atómica el primer procedimiento que se debe

realizar es la atomización de la muestra, lo cual se hace generalmente con una llama,

pero también se puede realizar de una forma electrotérmica. La atomización con

llama que es la más habitual la disolución de la muestra es nebulizada mediante un

flujo de gas oxidante, mezclado con el gas combustible, y se transporta a una llama

donde se produce la atomización (Skoog, 2001).

En la llama se dan una serie de procesos complejos, el primero es la desvolatisación,

en el que se evapora el disolvente hasta producir un aerosol molecular sólido

finamente dividido. Luego la disociación de la mayoría de estas moléculas produce

un gas atómico. La mayoría de los átomos así formados se ionizan originando

cationes y electrones. Una fracción de las moléculas, átomos e iones también se

excitan por el calor de llama, produciéndose así espectros de emisión molecular,

atómicos e iónicos (Skoog, 2001).

53

Debido a la naturaleza crítica de la etapa de atomización, es importante comprender

las características de las llamas y las variables que la afectan, por ello cuando se

utiliza el aire como oxidante se obtiene temperaturas de 1.700 a 2.400 ºC con varios

combustibles. A estas temperaturas solo las muestras que se descomponen fácilmente

se atomizan. Para la mayoría de las muestras refractarias se debe emplear oxígeno u

óxido nitroso como oxidante. Estos oxidantes producen temperaturas de 2.500 a

3.100ºC con los combustibles habituales (Skoog, 2001).

Para regular el combustible y el oxidante por lo general se combinan

aproximadamente en una proporción estequiométrica. Sin embargo, en la

determinación de metales que forman óxidos estables es más conveniente el uso de

una llama que contenga un exceso de combustible. Los caudales se controlan, por lo

general, por medio de reguladores de presión de doble diafragma seguidos de

válvulas de aguja situadas en el instrumento (Skoog, 2001).

Los instrumentos utilizados para espectrometría de absorción atómica consisten en

una fuente de radiación, una zona de muestra, un selector de longitud de onda, un

detector y un procesador de la señal y de la lectura de salida. La zona donde se

encuentra la muestra es el atomizador que contiene la muestra gaseosa atomizada

(Skoog, 2001).

54

6. EXPERIMENTACION

En los laboratorios de química de la Universidad Javeriana, se realizó el estudio

químico del fruto de Pernettya prostata. Por expresión se obtuvo un residuo acuoso y

un marco I que se extrajo, posteriormente, con etanol y cloroformo. Los extractos se

fraccionaron en solventes de orden de menor a mayor polaridad, los cuales fueron

cloroformo, acetato de etilo y butanol. Tanto a extractos como a fracciones se les

realizaron pruebas químicas preliminares y cromatografías en capa delgada, en papel

y en columna siguiendo el protocolo establecido por Humphreyst y Stodulski en 1986

para encontrar sustancias del tipo andromedotoxina.

Además, en estos laboratorios de química se elaboraron las pastillas para ser

administradas a las ratas experimentales.

El alojamiento de los animales experimentales se realizó luego en el bioterio de la

Facultad de Ciencias de la Universidad Javeriana, para proporcionar las medidas

óptimas de mantenimiento durante la experimentación.

En este mismo lugar también se recolectaron las muestras respectivas de sangre de 1,

3, 5 y 7 horas en el bioensayo piloto, que arrojaron como resultado los tiempos de

toma de muestra definitivos de 3, 6, 9 y 10 horas

El análisis de calcio en sangre se realizó en el espectrofotómetro de absorción

atómica en los laboratorios de química de la Universidad Javeriana.

6.1 Recolección de material vegetal

Los frutos frescos se colectaron en el páramo de Guasca (Cundinamarca), en fincas

ubicadas en la vereda “el moladero”.

Las muestras de los frutos fueron tomadas de un número mayor de 40 plantas.

55

Dichas muestras se componían aproximadamente de 547 gramos. Posteriormente un

ejemplar se envió para su determinación al Herbario de la Universidad Nacional, y su

número de radicación correspondió al COL-520394 como muestra la Figura No 3.

Figura No 3. Determinacion taxonómica de la planta Pernettya prostrata.

6.2 Técnicas de extracción.

Para la búsqueda de las sustancias tipo andromedotoxina, según el protocolo

propuesto por Humphreyst y Stodulski, se hicieron extracciones a partir de un peso

56

aproximado de 575 g de fruto fresco y, mediante expresión, se obtuvo un residuo

acuoso y un marco 1.

Obtención del residuo acuoso

Extracción No 1

Este residuo acuoso fue extraído por extracción continua liquido – liquido con

cloroformo durante dos días.

La fracción clorofórmica obtenida en esta extracción se concentró en un

rotaevaporador, posteriormente se llevó a un vaso para ser secada a temperatura

ambiente.

Extracción No2

Al residuo acuoso obtenido de la extracción anterior se le hizo seguidamente una

extracción continua líquido – líquido con acetato de etilo durante cuatro días.

La fracción acetato de etilo obtenida en esta extracción se concentró en un

rotaevaporador, luego se llevó a un vaso para su sequedad al ambiente.

Extracción No 3

Al residuo acuoso obtenido de la segunda extracción se le hizo finalmente una

extracción discontinua en Batch con Butanol. La fracción butanólica obtenida en esta

extracción se concentró en un rotaevaporador y se llevó posteriormente a un vaso

para que se secara al ambiente.

El residuo acuoso resultante fue desechado.

57

Marco No 1

Extracción No 1

El marco 1 obtenido de la expresión de los frutos frescos se llevó a maceración en

frio con cloroformo en un recipiente de vidrio de cinco litros durante 7 días y luego se

volvió a repetir la extracción dos veces mas.

Cada extracto se concentro en el rotaevaporador y posteriormente se reunieron los

tres concentrados para hacerles una última concentración; seguidamente el

concentrado final se llevó a un vaso para su secado a temperatura ambiente.

Extracción del Marco No 2

El marco 2 obtenido de la extracción anterior se extrajo con etanol en el mismo

recipiente utilizado anteriormente, repitiéndose el mismo procedimiento de

concentrado y secado de la primera extracción.

Fraccionamiento No 1

El extracto en etanol obtenido anteriormente se llevó a fraccionamiento liquido-

liquido con cloroformo durante dos días.

La fracción clorofórmica del extracto etanólico obtenida se concentró en un

rotaevapoador durante un día y posteriormente se llevó a un frasco para que se secara

al ambiente.


El residuo acuoso obtenido del fraccionamiento anterior a su vez se fraccionó con

acetato de etilo.

58

A la fracción acetato de etilo del extracto etanólico obtenida se le realizaron los

mismos procedimientos de concentración y secado al ambiente.


El residuo acuoso obtenido del fraccionamiento con acetato de etilo se llevo de nuevo

a un último fraccionamiento con Butanol por medio de una extracción discontinua en

Batch.

La fracción butanólica obtenida se llevó a concentración por medio del

rotaevaporador y posteriormente se pasó a un vaso de vidrio para su secado a

temperatura ambiente.

El residuo acuoso resultante finalmente fue desechado.

El orden de las extracciones y sus posteriores fraccionamientos se muestran en el

esquema de la figura No 4.

59

Figura No 4. Orden de extracciones y fraccionamientos del fruto Pernettya prostrata.

Expresión

Extracción con Cloroformo Extracción L/L Cloroformo

Extracción con etanol Extracción L/L Acetato de etilo

Fraccionamiento L/L Cloroformo Extracción L/L Butanol

Fraccionamiento L/L Acetato de etilo

Fraccionamiento L/L Butanol

60

Todas las fracciones y extractos secos obtenidos se muestran en la figura No 5.

Figura No 5. Fracciones y extractos obtenidos del fruto Pernettya prostrata.

6.3 Pruebas químicas preliminares.

A todas las fracciones obtenidas se le realizaron las siguientes pruebas: Liberman-

Buchard, Salkowski, Baljet, Shinoda, cloruro férrico, Antrona y Dragendroff

6.4 Cromatografías.

Se hicieron dos cromatografías bidimensionales en papel de celulosa a las fracciónes

acetato de etilo de los extracto acuoso y etanólico, con la fase móvil butanol-acido

acético-agua 6:1:2 (B. A. W.) y acido acético al 15% para observar la presencia de

flavonoides; seguidamente se revelaron en una cámara de vapores de amoniaco y se

observaron bajo luz ultravioleta de onda larga.

Seguidamente se realizaron cromatografías en capa delgada de silica gel al extracto y

fracciones clorofórmicas utilizándose como fase móvil los solventes cloroformo,

cloroformo-acetato de etilo 9.5:0.5 y cloroformo-metanol 9.7:03. Con esta variedad

de solventes se observó en cual corrían mejor las tres muestras, para hacer la

comparación de los compuestos presentes en éstas.

61

A las fracciones en cloroformo se les realizaron los procedimientos de

fraccionamientos descritos por Humphreyst y Stodulski en 1986 para aislar la

andromedotoxina, que consistían en pasar estas fracciones por una columna de silica

gel corriéndola con matanol/cloroformo 1:9, y a las subfracciones obtenidas aplicarle

el reactivo de Godin (mezcla de volúmenes iguales de soluciones A y B; solución A:

vainillina en etanol + ácido perclórico al 3%, solución B: ácido sulfúrico al 10% en

etanol).

6.5 Organización de la población experimental de ratas.

Se trabajo con 33 ratas machos de la cepa wistar entre los cinco y seis meses de vida,

con un peso aproximado entre 250 y 300 g suministradas por el laboratorio de

Neurobioquimica de la Universidad Javeriana.

6.6 Manejo de los animales experimentales.

Se usaron jaulas de plástico de 40 cm de ancho por 20 cm de alto donde se

proporcionó el espacio suficiente para el movimiento de los animales, dotando de

alimento, agua asequible y aserrín para asegurar la higiene y salubridad como muestra

la figura No 6.

Figura No 6. Jaulas de ratas.

62

El agua se suministró utilizando botellas de vidrio, para una correcta dosificación.

6.7 Medición de la calcemia preliminar.

Se tomó un grupo de cinco ratas macho y se sangraron en ayunas para cuantificarles

el calcio en suero sanguíneo; ésto se hizo para observar los valores de calcio sérico

normales que manejaba el grupo de ratas con que se iba a trabajar.

6.8 Selección de los tiempos de sangrado

Se tomó un grupo de 10 ratas y se dividió en dos grupos de cinco, al primero se le

suministró una concentración alta de carbonato de calcio en el concentrado (115.29

mg de calcio a cada animal) y al segundo se le dio concentrado normal ya que era el

grupo control (98.82 mg de calcio para cada rata) como muestra la tabla No 6, para

posteriormente sangrarlos a los siguientes tiempos después de ponerles la comida: 2,

4, 6 y 8 horas.

Grupos Gramos de concentrado suministrado

Gramos de calcio en concentrado suministrado

Concentrado + CaCO3 7 0.115

Control 7 0.098

Tabla No 6. Gramos de concentrado y calcio suministrados a cada rata en el piloto del bioensayo.

6.9 Cuantificación de calcio en el alimento para ratas (Rodentina)

Se maceraron aproximadamente 5 gramos de Rodentina en crisol de porcelana; se

hizo tres pesadas de 1 gramo cada una en su crisol de porcelana respectivo utilizando

la balanza analítica. Cada crisol se llevó a un horno evaporador a 100 °C por dos

63

horas y media. Seguidamente los tres crisoles se llevaron a una mufla a 450 °C para

calcinar durante cuatro horas, luego se le adicionó 1mL de ácido clorhídrico al 10%

en agua desionizada a cada crisol; las soluciones obtenidas en los tres crisoles se

llevaron a tres balones de 50 mL respectivamente con agua desionizada.

Posteriormente se cuantificó calcio por espectrofotometría de absorción atómica y se

promediaron los valores obtenidos como muestra la tabla No 7.

Muestras de un gramo alimento Rodentina

Calcio en mg/g

1 15 2 13.5 3 13.8

PROMEDIO 14.1 Tabla No 7. Concentración de calcio en alimento para ratas (Rodentina).

Los cálculos realizados para obtener las concentraciones de calcio en las muestras de

Rodentina se muestran a continuación:

Co= Concentración mas concentrada (mg/L) o concentración de calcio en Rodentina

seca que se usó para hacer la cuantificación, las lecturas se realizaron en

espectrofotómetro de absorción atómica.

Fd= factor de dilución.

Cd= Concentración diluida o concentración de calcio (mg/L) en el volumen de agua

en que se hizo la disolución.

Cd(mg/L)= Co(mg/L) X Fd

Cd (mg) / peso de Rodentina seca (mg) a la que se le hizo la cuantificación de calcio

= concentración de calcio en peso de Rodentina seca.

Concentración de calcio en peso de Rodentina que se utilizó para hacer la

cuantificación X 100 mg = mg de calcio en 100 mg de Rodentina seca.

64

6.10 Cuantificación de calcio en los frutos de Pernettya prostrata.

Se realizaron tres pesadas de aproximadamente un gramo de fruto seco, y se trató de

la misma manera que el alimento Rodentina, obteniéndose los valores de

concentración que muestra la tabla No 8.

Muestras de un gramo de fruto

seco de Pernettya prostrata

Calcio en mg/g

Muestra 1 2.3

Muestra 2 2.1

Muestra 3 2.0

Promedio 2.1

Tabla No 8. Concentración de calcio en frutos de Pernettya prostrata.

Para determinar la humedad del fruto se pesó en su totalidad; posteriormente se llevó

a sequedad en la estufa a 40 °C, por 48 horas. Nuevamente se pesó y luego se maceró

en crisol de porcelana.

Los cálculos hechos para obtener la concentración de calcio en las muestras de fruto

seco de Pernettya prostrata fueron los siguientes:

Co= Concentración más concentrada (mg /L) o concentración de calcio en fruto seco

de Pernettya prostrata que se usó para hacer la cuantificación, las lecturas fueron

obtenidas en espectrofotómetro de absorción atómica.

Fd= factor de dilución.

Cd = Concentración diluida o concentración de calcio (mg/L) en el volumen de agua

en que se hizo la disolución.

Cd(mg/L)= Co(mg/L) X Fd

65

Cd (mg/L) / peso de fruto seco de Pernettya prostrata (mg) al que se le hizo la

cuantificación de calcio = concentración de calcio en peso de fruto seco de Pernettya

prostrata.

Concentración de calcio en fruto seco de Pernettya prostrata que se utilizó para hacer

la cuantificación X 100 mg = mg de calcio en 100 mg de fruto seco de Pernettya

prostrata.

6.11 Cuantificación de calcio en suero

El suero se obtuvo mediante sangrado ocular, con tubos capilares y posterior

centrifugación como muestra la figura No 7. El calcio se cuantifico tomando 300

microlitros de suero, agregándole 0.5 mL de acido tricloroacético, se llevó a una

segunda centrifugación y se obtuvo el sobrenadante, éste se llevó a un balón de 25

mLy se le agregó 1 mL de lantano, y por último se completó con agua desionizada

hasta el afore. La cuantificación de calcio se hizo por espectrofotometría de absorción

atómica.

Figura No 7. Extracción de sangre mediante sangrado ocular.

Los cálculos realizados para obtener la concentración de calcio en las muestras de

suero fueron los siguientes:

66

Co = Concentración mas concentrada (mg/L) o concentración de calcio en suero,

leída en el espectrofotómetro de absorción atómica.

Cd = Concentración diluida o concentración de calcio (mg) en el volumen de agua en

que se hizo la disolución.

Fd = factor de dilución

Cd (mg/L) = Co (mg/L) Fd

Cd (mg)/volumen de suero inicial (mL) = concentración de calcio en volumen de

suero inicial.

Concentración de calcio en volumen de suero inicial X 100 mL = mg de calcio en 100

mL de suero.

6.12 Elaboración de pastillas de alimento

Se utilizó una jeringa como muestra la figura No 8 como sistema de prensa para la

fabricación de cada pastilla, posteriormente se llevó a la estufa a 40 °C. por cuatro

días.

Figura No 8. Elaboración de pastilla de alimento en prensa de jeringas.

67

Para la selección de los tiempos de sangrado a utilizar en el bioensayo se prepararon

pastillas con el alimento para ratas ( Rodentina) y con carbonato de calcio, de un 1.7

gramos aproximadamente; de tal manera que en el segundo grupo quedara con una

concentración de 4 mg de calcio adicionales.

El porcentaje de calcio en Rodentina es de 1.41%; esto quiere decir que en 100 mg o

100 kg de Rodentina hay 1.41 mg o kg de calcio respectivamente, por lo tanto pastilla

de un gramo contiene 14.1 mg. Ca y una de 1.7 gramos tiene 23.97 mg de calcio.

Las pastillas tratadas con carbonato de calcio contenían cuatro mg. de calcio

adicionales para un total 27.97 mg. de calcio, las cuales se suministraron al

tratamiento de sobredosis de calcio.

En el bioensayo, además de utilizar las pastillas de 1.7 gramos tratadas con carbonato

de calcio y las del control, también se hicieron unas pastillas que contenían fruto de

Pernettya prostrata, Rodentina y carbonato de calcio. Estas últimas pastillas y las que

tenían carbonato de calcio tenían en total la misma cantidad de calcio a diferencia del

control que tenía menos, todo esto se puede ver en la siguiente tabla No 9.

Pastillas g de Ca en Rodentina

g de Ca en CaCO3

g de Ca en frutos

Total de calcio en gramos

Control (Rodentina)

0.024 0.024

Fruto + Rodentina + CaCO3

0.024 0.002 0.002 0.028

Rodentina + CaCO3

0.024 0.004 0.028

Tabla No 9. Especificación de cantidades de calcio en pastilla de 1.7 gramos en cada uno de los tres grupos de ratas.

68

Como se ve en la tabla anterior la fabricación de pastillas de 1.7 g dentro de cada

tratamiento requirió de diferentes concentraciones de calcio de cada componente

(Rodentina, CaCO3 y fruto seco de Pernettya prostrata), por ello de cada compuesto

se tomaron los siguientes pesos específicos que muestra la tabla No 10.

Grupos Rodentina (g) CaCO3 (g) Fruto Pernettya p. (g) Control (Rodentina)

1.7

Fruto + Rodentina + CaCO3

1.7 0.005 0.93

Rodentina + CaCO3

1.7 0.01

Tabla No 10. Pesos específicos de cada componente para que una patilla de 1.7 g presentara las concentraciones de calcio requeridas dentro de cada grupo.

6.13 Administración de las dosis experimentales

Una población total de 18 ratas machos se dividió en tres grupos equitativamente:

Grupo No 1. Alimento para ratas (Rodentina) y Carbonato de calcio

Grupo No 2. Alimento para ratas (Rodentina) y fruto

Grupo No 3. Control (Rodentina)

Se hicieron los sangrados a los tiempos de dos y media, seis, nueve y diez horas

después de suministrada la comida.

A cada rata y grupo se suministro las concentraciones de calcio que se muestran en la

tabla No 11 (de sus respectivos tratamientos dosificados en pastillas de alimento de

1.7 gramos).

69

Grupos Gramos de alimento por Grupo

Gramos de alimento por rata

Gramos de calcio en alimento por rata

Fruto + CaCO3 + Rodentina

13.11 2.18 0.036

CaCO3 + Rodentina

20.79 3.46 0.057

Control 23.64 3.94 0.055

Tabla No 11. Concentraciones de calcio en gramos de tratamientos para cada rata y para cada grupo.

6.14 Análisis de datos.

En el ensayo de la selección de hora de sangrado a cada grupo o tratamiento se les

promediaron las concentraciones de calcio de las ratas por cada tiempo de sangrado,

para realizar una grafica de concentración Vs tiempo. Esta grafica nos probara si

estaban bien distribuidos los tiempos elegidos presentando diferencias de

concentración de calcio o si por el contrario arrojaban datos iguales, lo que indica que

los tiempos no eran adecuados.

En el experimento con los tres grupos Rodentina, Rodentina + CaCO3, y Rodentina +

CaCO3 + fruto de Pernettya prostrata, se les promediaron las concentraciones de

calcio por tiempo de sangrado, realizando una gráfica para observar los efectos de los

tratamientos en el nivel de calcio sérico a través del tiempo.

Finalmente a estos tres grupos se les realizó Anova de dos vías para mirar si había

diferencia en la concentración de calcio entre los tratamientos, horas de sangrado y si

había interacción entre estos dos factores.

70

7. RESULTADOS

Los 575 g de frutos frescos de Pernettya prostrata colectados fueron exprimidos para

así obtener un residuo acuoso y un Marco 1. Ya que el interés de esta investigación

es la búsqueda de sustancias del tipo andromedotoxinas, sólo se estudiaron aquellos

extractos o fracciones en donde sean detectadas este tipo de sustancias.

Del residuo acuoso, y mediante extracciones líquido/líquido sucesivas, se obtuvieron

tres fracciones, en su orden: fracción en cloroformo que pesó 2,29 g, fracción en

acetato de etilo que pesó 4,51 g y, fracción en butanol que pesó 0,91 g.

El Marco 1 se extrajo por maceración en frio con cloroformo obteniendo un extracto

clorofórmico que pesó 2,73 g y un Marco 2. Este último se extrajo, finalmente, por

maceración en frio con etanol obteniéndose un extracto en etanol y un Marco 3 que

fue desechado; el extracto etanólico fue extraído líquido/líquido para obtener tres

fracciones, en su orden: fracción en cloroformo que pesó 0,89 g, fracción en acetato

de etilo que pesó 0,89 g y fracción en butanol que pesó 1,06 g.,

A los extractos y fracciones resultantes se les realizaron pruebas químicas

preliminares, con el objeto de identificar la presencia en ellos de sustancias

diterpénicas, tanto en la forma de agliconas como de glicósidos. Estos resultados se

muestran en la Tabla No 12.

Pruebas químicas Preliminares

Extracto Etanol total

Extracto en Cloroformo

Fracciones en

cloroformo

Fracciones en acetato

de etilo

Fracciones en butanol

Antrona + ‐ ‐ + + Dragendorff - ‐ ‐ ‐ ‐ Cloruro férrico + + + + + Libermann-Burchard + + + ‐ ‐ Hidroxamato férrico + + + ‐ ‐ Shinoda + ‐ ‐ + +

Tabla No 12. Resultados de pruebas químicas preliminares realizadas a los extractos y fracciones obtenidas de los frutos de Pernettya prostrata.

71

Las pruebas químicas preliminares realizadas a los extractos y fracciones obtenidos

(tabla No. 12), mostraron la posible presencia de fenoles, lactonas, diterpenos,

tritepenos y esteroles en el extracto y fracciones en cloroformo y, de flavonoides y

glicósidos de flavonoides, en las de acetato de etilo y butanol. Ninguna de las

porciones monitoreadas mostró la presencia de alcaloides.

Las fracciones en butanol no se siguieron estudiando debido a que no presentaron

sustancias del tipo terpénico (pruebas de Liebermann-Burchard y del hidroxamato

férrico negativas).

Figura No 9. Prueba de cloruro férrico al extracto cloroformo (A) y la fracciones clorofórmicas del residuo acuoso (I) y extracto etanólico (B1).

Figura No 10. Prueba de Liberman Buchard al extracto cloroformo (A) y la fracciones clorofórmicas del residuo acuoso (I) y extracto etanólico (B1).

72

A las fracciones en acetato de etilo también se le analizó cromatográficamente. Se

corrieron cromatografías bidimensionales en papel de celulosa, utilizando como

solvente base (solvente 1) al ácido acético 15% y como solvente 2, BAW (butanol-

ácido acético-agua 6:1:2). Los perfiles cromatográficos o cromatogramas resultantes

se muestran en las figuras No 11 y No 12.

En el análisis de estos cromatogramas se tuvo en cuenta los valores de Rf en los dos

solventes, de cada sustancia observada. Así como su color a la luz visible y a la luz

ultravioleta; además, el cambio de color producido en estas sustancias por el efecto de

vapores de amoníaco.

Figura No 11. Cromatograma bidimensional de la fracción en acetato de etilo

obtenida del extracto en etanol. Los solventes: ácido acético(15%) y BAW. Se

observaron las sustancias A y B.

73

Figura No 12. Cromatograma bidimensional de la fracción en acetato de etilo

obtenida del residuo acuoso. Los solventes: ácido acético (15%) y BAW. Se

observaron cuatro sustancias: A, B, C y D.

Los resultados obtenidos en estos cromatogramas, se encuentran organizados en las

tablas No 13 y No 14.

Sustancia Rf

Ácido acético Rf

BAW Color visible

Color UV

Color NH3/UV

A 0.05 0.71 Amarillo

tenue Amarillo Amarillo intenso

B 0.44 0.84 Amarillo

tenue Amaillo Amarillo intenso Tabla No 13. Sustancias observadas en el cromatograma de la figura No 11: Sus Rfs

en los dos solventes; sus colores a la luz visible, bajo la luz UV y, bajo la luz UV después de tratar el cromatograma con vapores de NH3.

74

Sustancia Rf

Ácido acético Rf

BAWColor visible

Color UV

Color NH3/UV

A 0.05 0.70 Amarillo


B 0.38 0.89 Amarillo


C 0.51 0.85 Incoloro Azul

pálido Azul intenso

D 0.66 0.82 Incoloro Azul

pálido Azul intenso Tabla No 14. Sustancias observadas en el cromatograma de la figura No 12: Sus Rfs

en los dos solventes; sus colores a la luz visible, bajo la luz UV y, bajo la luz UV después de tratar el cromatograma con vapores de NH3.

En ambas fracciones en acetato de etilo se detectaron las sustancias A y B, que por su

posición en el cromatograma, y sus colores bajo la luz UV, se pudieron caracterizar

como flavonas y/o flavonoles hidroxilados (Harborne, 1973).

Las sustancias C y D presentes en el cromatograma de la figura No 12, se

identificaron como fenoles simples de menor polaridad, los cuales debieron ser

removidos previamente al fraccionar los extractos con cloroformo.

En estos cromatogramas no se observaron sustancias del tipo terpenoide, ya como

agliconas o ya como glicósidos, razón por la cual las fracciones en acetato de etilo

tampoco fueron estudiadas.

Análisis químico de extractos y fracciones en cloroformo

Las pruebas químicas preliminares en el extracto y fracciones en cloroformo

mostraron la posible presencia de fenoles, lactonas, diterpenos, tritepenos y esteroles

Para realizar el análisis cromatográfico se seleccionaron los solventes de mejor

resolución: se corrieron cromatografías en Sílica con varias mezclas de solvente. Los

reveladores utilizados fueron luz VIS, luz UV y vainillina/H2SO4. Los solventes

75

escogidos fueron las mezclas éter de petróleo - actona (7:3) y cloroformo - metanol

(9.7:0.3). Algunos de los cromatogramas obtenidos se muestran en la figura No 13.

A B C

Figura No 13. Cromatogramas en capa delgada de: a) fracción cloroformo de extracto etanólico, b) fracción cloroformo residuo acuoso y c) extracto clorofórmico.

Fase estacionaria: Sílica. Solventes, en su orden: A) cloroformo, B) cloroformo-acetato de etilo 9.5: 0.5 y C) cloroformo-metanol 9.5:0.5.

Como muestra la grafica No 13 la fase móvil cloroformo-metanol 9.5:0.5 fue la de

mejor resolución; se analizó la fracción en cloroformo del residuo acuoso (b de los

cromatogramas). Se pudieron observar ocho sustancias cuyas características se

resumen en la tabla No 15.

Tabla No 15. Sustancias observadas en el cromatograma de mejor resolución (figura No 13). Se muestran los colores de las ocho sustancias observadas: a la luz VIS, a la

luz UV de onda larga y de onda corta y, con el revelador vainillina/H2SO4 en caliente.

Mancha Luz VIS Luz UV onda larga

Luz UV onda corta

vainillina/H2SO4

1 Azul claro Anaranjado 2 Amarillo Mancha oscura Anaranjado 3 Amarillo Anaranjado Mancha oscura Anaranjado 4 Mancha oscura Rojizo claro 5 Amarillo Amarillo suave 6 Amarillo

tenue Mancha oscura

7 Mancha oscura 8 Azul Violeta suave

76

Según la bibliografía consultada (Humphreyst y Stodulski, 1986), la

andromedotoxina se obtiene del extracto etanólico fraccionado en cloroformo y

separado, posteriormente, por una cromatografía en columna empacada con sílica y

utilizando como fase móvil una mezcla de cloroformo-metanol 9:1. Todos estos

resultados permitieron seleccionar a la fracción clorofórmica del extracto etanólico,

como posible fuente de andromedotoxinas.

Cromatogramas sobre sílica gel de la fracción clorofórmica del extracto etanólico,

corridos con una mezcla cloroformo-metanol 9.5:0.5, mostraron bajo la luz UV y

posterior revelado con vainillina/H2SO4 en caliente, cuatro grupos de sustancias

(figura No 14).

A B

Figura No 14. Cromatograma en capa delgada de extracto etnólico fracción cloroformo, eluída con cloroformo-metanol 9.5:0.5, en placas de sílica. A) bajo luz

UV onda larga y B) revelado con vainillina/H2SO4 en caliente.

La sustancia numerada en el cromatograma de la figura 14 con el numero 2 y que a la

luz UV muestra una fluoresencia de color azul, es posiblemente una cumarina.

Para buscar una mejor resolución en los cromatogramas del extracto etanólico

fracción cloroformo y asi poder identificar algunas de las sustancias presentes, se

77

decidió correr cromatografías bidimensionales utilizando como solventes mezclas de

cloroformo–metanol 9.5:0.5 y de éter de petróleo–acetona 7:3

Figura No 15. Selección de los solventes para correr las cromatografias bidimensionales de la fraccion cloroformo del extracto etanolico. Fase estacionaria

silica. Solventes (A) eter de petroleo-acetona 7:3 y (B) cloroformo-metanol 9.5:0.5.

Como patrones y marcadores se utilizaron la escopoletina, una cumarina obtenida de

Pentacalia vaccinioides; la amirina, un triterpeno aislado de Cavendishia bracteata y,

el ácido grandiflorénico un diterpeno de Espeletia argentea. Estos patrones fueron

suministrados por el Grupo de investigación en fitoquímica (GIFUJ).

Uno de estos cromatogramas bidimensionales se muestra en la figura No 16. Este

cromatograma fue revelado primero con luz UV y luego con vainillina/H2SO4 en

caliente. Los valores de Rf de en ambos solventes se muestran en la tabla No 16.

78

A B

Figura No 16. Cromatograma bidimensional en silica gel, obtenido para la fracción cloroformo del extracto etanólico. A) bajo luz UV y B) revelado con vainillina/H2SO4

en caliente. Patrones: a) escopoletina, b) ácido grandiflorénico y c) amirina.

Sustancias

Rf Petrol-Me2CO

7:3

Rf CHCl3-MeOH

9.5:0.5 1 0.12 0 2 0.15 0.13 3 0.12 0.47 4 0.26 0.43 5 0.46 0.64 6 0.61 0.75

Tabla No 16. Valores de Rf de las sustancias observadas en el cromatograma bidimensional en silica gel de extracto etanólico fracción cloroformo. Solventes: éter

de petróleo-acetona 7:3 (solvente 1) y cloroformo-metanol 9.5:0.5 (solvente 2).

En la figura No 16 de la cromatografía bidimensional se observaron seis sustancias

numeradas de 1-6. La sustancia 3 corresponde al patrón a, razón por la cual a esta

sustancia se le identificó como la escopoletina; la sustancia 6 coincidió con el patrón

c, identificándose como la amirina. El patrón b de ácido grandiflorénico no coincidió

con ninguna sustancia de la fracción clorofórmica, pero las sustancias que más se le

79

aproximaron fueron las número 4 y 5. Las sustancias 1 y 2 hasta este momento no se

pueden identificar.

Siguiendo el protocolo de Humphreyst y Stodulski (1986) la fracción cloroformo del

extracto etanólico fue percolada a través de una columna empacada con Sílica. Se

colectaron en total 39 fracciones de 50 mL cada una. Las primeras tres fracciones

fueron eluídas con éter de petróleo-acetona 8:2; las siguientes 21 fracciones se

eluyeron con cloroformo; las siguientes 10 fracciones se eluyeron con cloroformo-

metanol 9:1 y, las últimas 5 fracciones se corrieron con cloroformo-metanol 8:2.

Estas fracciones fueron monitoreadas mediante cromatografía en capa delgada

utilizando Sílica como fase estacionaria y una mezcla cloroformo-metanol 9.5:0.5

como fase móvil (ver figuras 17 y 18).

Figura No 17. Monitoreo de las sub-fracciones obtenidas de la fracción clorofórmica del extracto etanólico. Cromatogramas revelados con luz UV.

80

Figura No 18. Monitoreo de las sub-fracciones eluídas con cloroformo, obtenidas de la fracción clorofórmica del extracto etanólico. Cromatogramas revelados con

vainillina/H2SO4.

Las 39 sub-fracciones obtenidas fueron reunidas en cuatro grupos: el primero grupo

incluye las fracciones 8-15; el segundo grupo las fracciones 16-21, el tercer grupo las

fracciones 22-32 y, el cuarto grupo las fracciones 32-39.

El primer grupo contiene la sustancia 6 (amirina); el segundo grupo las sustancias 5

(posible derivado de grayanotoxina), el tercer grupo las sustancias 4 (posible derivado

de grayanotoxina) y 3 (escopoletina) y, el cuarto grupo a las sustancias 2 y 1. Este

último grupo dio positiva la prueba del cloruro férrico razón por la cual se las

caracterizó como sustancias fenólicas.

De la solución conformada por las sub-fracciones del segundo grupo precipitó un

sólido numerado como 5 en el cromatograma bidimensional de la figura No 16 que

mostró un punto de fusión de 187 oC, cercano al reportado para las sustancias tipo

andromedotoxina. Además, dio positivo la prueba con el reactivo de Godin.

De la solución conformada por las sub-fracciones del tercer grupo precipito otro

solido (numerado como 6 en el cromatograma bidimensional de la figura 16). Este

solido también dio positivo para la prueba con el reactivo de Godin

81

Análisis de la acción hipercalcémica

Los experimentos realizados permitieron establecer los siguientes valores:

o Alimento para ratas (Rodentina) contiene un promedio de 1.41 mg de calcio

por gramo de alimento.

o Frutos de Pernettya prostrata contiene un promedio de 2.1 mg de calcio por

gramo de fruto seco.

o Las ratas (ratas machos) mostraron un valor normal de 10.27 mg de calcio por

100 mL de suero, en ayunas.

El grupo de cinco ratas macho al que se les realizó el sangrado en ayunas para

observar las concentraciones de calcio normales en suero sanguíneo, mostraron los

resultados que se observan en la tabla No 17.

Ratas machos mg de calcio en 100 mL de suero

1 10.768

2 10.215

3 9.883

4 10.067

5 10.405

Tabla No 17. Valores normales de calcio en suero de ratas macho. Valor promedio =

10.27 mg de calcio por 100 mL de suero.

El grupo de diez ratas macho que se empleó para obtener y seleccionar los tiempos de

sangrado que en este caso eran a las dos, cuatro, seis y ocho horas después de

habérseles suministrado el tratamiento con CaCO3 al grupo uno y Rodentina (control)

al grupo dos, tomando como referencia la disminución o normalización de los valores

82

de calcio en el suero sanguíneo, mostraron los valores que se muestran en las tablas

No 18 y 19.

mg de calcio en 100 mL suero a diferentes horas

después de suministrar Rodentina Ratas 2 4 6 8

1 10.35 10.21 10.42 10.76 2 9.77 10.02 10.26 10.43 3 10.23 10.12 10.31 10.65 4 11.21 11.31 10.97 11.06 5 9.87 9.69 10.11 10.30

Tabla No 18. Prueba de tiempos para sangrado de ratas del grupo que se suministro Rodentina.

mg de calcio en 100 mL suero a diferentes horas después de suministrar

Rodentina +CaCO3

Ratas 2 4 6 8 1 10.49 10.10 10.53 10.51 2 11.13 11.09 11.23 11.21 3 10.30 10.54 10.55 10.77 4 11.23 11.18 11.41 11.55 5 10.66 11.02 10.81 10.69

Tabla No 19. Prueba de tiempos para sangrado de ratas del grupo que se suministro Rodentina + CaCO3.

Los valores promedios resultados de los datos indicados en estas dos tablas son

incluidos en las tablas No 20 y 21.

Horas despues de sumistrar Rodentina 2 4 6 8

Concentracion Ca mg/100 ml

suero 10.28 10.27 10,414 10,64Tabla No 20. Promedios de concentraciones de calcio en sangre de ratas por hora de

sangrado del grupo control (Rodentina).

83

Horas despues de suministrar Rodentina

+CaCO3 2 4 6 8 Concentracion Ca mg/100 ml

suero 10,76 10,78 10,91 10,95Tabla No 21. Promedios de concentraciones de calcio en sangre de ratas por hora de

sangrado del grupo Rodentina +CaCO3.

Estos valores promedios fueron llevadas a grafico hora de sangrado Vs concentración de calcio serico como muestra la figura No 19.

Figura No 19. Promedio de concentraciones de calcio en ratas Vs tiempos de sangrado en los grupos o tratamientos rodentina (control) y rodentina + CaCO3 para la selección de la hora de sangrado.

En esta grafica se muestran observan valores promedio mayores para el grupo tratado con una dieta rica en calcio.

Para el bioensayo y tomando en cuenta los resultados anteriores, se propuso un periodo de sangrado algo mas extenso: 2.5 h, 6 h, 9 h y 11 h.

Las concentraciones de calcio serico obtenidas en el experimento con los tres grupos;

Rodentina, Rodentina + CaCO3, y Rodentina + CaCO3 + fruto de Pernettya prostrata,

se observan en las tablas No 22, 23 y 24.

84

mg de calcio en 100 mL suero a diferentes horas después de alimentadas con Rodentina

Ratas 2,5 h 6 h 9 h 11 h 1 9.44 10.38 10.52 10.08 2 10.25 11.09 10 10.44 3 9.86 9.68 9.76 9.77 4 10.53 11.14 10.48 10.40 5 10.41 10.49 10.71 9.85 6 11.13 10.77 10.49 10.47

Tabla No 22. Concentraciones de calcio serico en ratas alimentadas con Rodentina a diferentes horas.

mg de calcio en 100 mL suero a diferentes horas después de suministrar CaCO3 + Rodentina

Ratas 2,5 h 6 h 9 h 11 h 1 11,02 11,76 10,154 10. 155 2 10.49 10.98 9.899 9.769 3 11.28 11.89 10.634 10.698 4 10.89 10.65 10.435 10.221 5 11.24 11.12 10.001 9.889 6 11.31 11.64 9.774 9.802

Tabla No 23. Concentraciones de calcio sérico en ratas tratadas con Rodentina y CaCO3 a diferentes horas.

mg de calcio en 100 mL suero a diferentes horas después de suministrar Rodentina + CaCO3 + Fruto

Ratas 2,5 h 6 h 9 h 11 h 1 12.02 13.68 13.54 12.55 2 11.77 14.34 13.95 13.02 3 11.58 13.53 13.46 11.88 4 12.38 14.05 13.91 12.56 5 12,74 13.82 12.88 13.22 6 12.81 13.79 13.61 12.45

Tabla No 24. Concentraciones de calcio sérico en ratas tratadas con Rodentina, CaCO3 y fruto de Pernettya prostrata a diferentes horas.

85

Para observar mejor los efectos de los tratamientos en la concentración de calcio en

las ratas a través de los tiempos de sangrado se promediaron las concentraciones de

calcio de las ratas por cada hora de sangrado.

Los promedios de los grupos Rodentina, Rodentina + CaCO3, y Rodentina + CaCO3

+ Fruto se muestran en las tablas No 25, 26 y 27 respectivamente.

Horas despues de sumistrar Rodentina 2.5 6 9 11 Concentracion Ca mg/100

mL suero 10.27 10.60 10.32 10.16 Tabla No 25. Promedios de concentraciones de calcio en sangre de ratas por hora de

sangrado del grupo Rodentina.

Horas despues de suministrar Rodentina

+CaCO3 2 1/2 6 9 11 Concentracion Ca mg/100


sangrado del grupo Rodentina + CaCO3.

Horas después de suministrar Rodentina

+CaCO3 + fruto. 2 1/2 6 9 11 Concentración Ca mg/100


sangrado del grupo Rodentina + CaCO3 + fruto de Pernettya prostrata.

La compararon de los promedios de las concentraciones de calcio por cada tiempo de

sangrado entre los tres grupos se ve en la figura No 20.

86

Figura No 20. Grafica promedio de concentraciones de calcio(eje Y) en ratas Vs tiempos de sangrado (eje X) en los grupos o tratamientos Rodentina (control),

Rodentina + CaCO3, y Rodentina + CaCO3 + fruto de Pernettya prostrata

Los valores obtenidos y las graficas resultantes nos muestran una moderada

hipercalcemia de las ratas que ingirieron el fruto de Pernettya prostrata.

La prueba Anova de dos vías que se realizó para observar si habían diferencias en las

concentraciones de calcio entre los tratamientos, las horas de sangrado y si

presentaban interacción entre estos dos factores, mostraron en primer lugar que hay

diferencia entre los tratamientos, pues la probabilidad (4,1933E-32) como se ve en la

tabla No 28 fue menor de 0.05 y por ello se rechazó la hipótesis nula que decía que no

habían diferencias entre los tratamientos, aceptándose la alternativa que afirmaba que

habían diferencia entre los tratamientos.

87

Origen de

las variaciones

Suma de cuadrados

Grados de

libertad

Promedio de los

cuadrados F Probabilidad Valor crítico

para F Muestra 105,7200083 2 52,86000417 303,454 4,1933E-32 3,150411311Tiempos de sangrado 9,463294444 3 3,154431481 18,10868 1,748E-08 2,758078316Interacción 8,505580556 6 1,417596759 8,138014 1,888E-06 2,25405301Dentro del grupo 10,45166667 60 0,174194444 Total 134,14055 71 Tabla No 28. Análisis de varianza de los tratamientos Rodentina (control), Rodentina

+ CaCO3, y Rodentina + CaCO3 + fruto de Pernettya prostrata.

En cuanto a los tiempos de sangrado la Anova concluyo que también se presentaban

diferencias entre éstos como se ve en la tabla anterior, pues la probabilidad fue menor

de 0.05 aceptándose la hipótesis alternativa que afirmaba la diferencia de

concentración de calcio en sangre entre las horas de sangrado.

Finalmente Anova también demostró que hubo interacción entre los tres tratamientos

y los cuatro tiempos de sangrado.

88

8. DISCUSIÓN

Siguiendo los procedimientos de Humphreyst y Stodulski para aislamiento de la

andromedotoxina, se obtuvieron cuatro sub fracciones pues la columna se corrio con

los solventes éter de petróleo-acetona 8:2, cloroformo, cloroformo –metanol 9:1 y

cloroformo-metanol 8:2, se compararon con unos patrones de diterpenos, triterpenos

y cumarina mediante una cromatografía de capa delgada mostrando que en la primera

y segunda sub fraccion aparecieron el triterpeno, los diterpenos y la cumarina, y en la

ultima sub fraccion floreció un diterpeno purificado.

Esta ultima sub fracción correspondió a la unión de sub fracciones obtenidas de la

cromatografía en columna corrida con cloroformo –metanol 9:1 y cloroformo-

metanol 8:2, solventes usados Humphreyst y Stodulski en la parte de la cromatografía

en columna. Esto indica posiblemente que el diterpeno aislado es la

andromedotoxina.

Los datos de concentración sanguínea obtenidos de las cinco ratas en ayunas para

determinar las concentraciones séricas normales coinciden con lo citado por

Federation of American Societies for Experimental Biology 1961, el cual presenta

que los rangos normales de calcemia para ratas van de 10.8 mg/100 mL a 13.6

mg/100 mL, y en el ensayo el promedio de las concentraciones de calcio de las ratas

sangradas fue de 10,26 mg/100 mL teniéndose niveles que iban desde 9,88

mg/100mL hasta 10.76 mg/100 mL, esto demuestra que la población de ratas con que

se hicieron los ensayos de elección de hora de sangrado y el posterior bioensayo con

los tres grupos para observación de aumento de calcio en sangre por consumo de

Pernettya prostrata estaban normales respecto a los valores de calcio, crucial para

este trabajo.

En el bioensayo de selección de la hora de sangrado de las ratas se obtuvieron valores

promediados de concentración de calcio en sangre por cada uno de los tiempos de

sangrado escojidos intuitivamente que indicaban que éstos no eran los adecuados,

pues como se vio en la figura No 19 tanto para el grupo Rodentina (control) como

89

para el grupo Rodentina +CaCO3 los tiempos de dos y cuatro horas no cambiaron de

forma significativa los valores de las concentraciones de calcio, por eso a estos dos

tiempos se les sacó un intermedio que fue a las dos horas y media para el primer

sangrado. El tiempo de las seis horas presentaba concentraciones diferentes a los dos

tiempos anteriores, razón por la que se dejó ese tiempo. Finalmente los tiempos 9 y

11 horas después del sangrado se eligieron para ampliar el rango de tiempo en que se

puede estabilizar el calcio sérico.

La Anova hecha al bioensayo de observación de niveles de calcio en sangre por

consumo de Pernettya prostrata, donde se trabajaron con los tres taramientos

Rodentina, Rodentina + CaCO3, y Rodentina + CaCO3 + fruto de Pernettya

prostrata, mostró que si hubo diferencia entre los tratamientos, horas de sangrado y

relación entre estos dos factores.

Los promedios hechos a las concentraciones de calcio de las seis ratas de cada

tratamiento por tiempo de sangrado ratificaron lo mostrado por la Anova y además

señaló que el grupo Rodentina + CaCO3 + fruto de Pernettya prostrata fue el que

tuvo la mayor concetracion de calcio durante los cuatro tiempos de sangrado (dos y

media, seis, nueve y once horas) iniciando con 12.24 mg/100 mL, siguiendo con el

dato mas alto de concentración registrado que fue 13.86 mg/100 mL, descendiendo

después a 13.55 mg/100 mL y finalmente en el cuarto tiempo 12.61 mg/100 mL.

Las concentraciones normales de calcio en sangre mostradas en Federation of

American Societies for Experimental Biology 1961, van de 10.8 mg/100 ml a 13.6

mg/100, indican que en el grupo control (Rodentina) y en el Rodentina + CaCO3 no

se presentaron valores de hipercalcemia, a pesar que a este último grupo se le había

dado una sobredosis de calcio de 0.04 mg, representada en 0.01 g de peso de CaCO3

tuvo como promedio más alto de concentración de calcio en sangre 11.36 mg/100mL

que es un valor normal, indicando que la sobredosis dada a este grupo no es suficiente

para producir una hipercalcemia, pero que si generó pequeñas diferencias respecto al

grupo control donde el promedio de calcio en sangre más alto fue de 10.68 mg/100

90

mL dando a entender que la sobredosis si hizo efecto dentro de los valores normales

de calcio en sangre presentes en nuestra población de ratas, los cuales se obtuvieron

del grupo en ayunas que promedió una concentración de 10,26 mg/100 mL y de los

grupos control de los dos ensayos (primero para escoger tiempo de sangrado y el

segundo para observar el efecto del fruto en la concentración de calcio serico) que

dentro de sus promedios los mas altos fueron de 10.60 mg/100 mL y 10.64 mg/100

mL respectivamente.

Por medio de los promedios sacados a las concentraciones de calcio en suero por

cada tiempo de sangrado de los tres tratamientos (Rodentina, Rodenta + CaCO3, y

Rodentina + CaCO3 + fruto de Pernettya prostrata) del ensayo para observar el

efecto del fruto en la concentración de calcio sérico, se vio que el tiempo donde más

aumento el calcio en sangre fue al segundo tiempo que a las seis horas después de

haberles suministrado los tratamientos, dándose a entender que la hora en que se

empieza a estabilizar el calcio en el organismo es a partir de la sexta hora

Lo anterior demuestra que la hipercalcemia producida por consumo de fruto de

Pernettya prostrata no se debe a la presencia de calcio en el fruto pues su cantidad es

infima. Según Gutierrez 1989, que cuantifico 100 mg de calcio en 100 g de fruto seco

de Pernettya prostrata significando que en un gramo de fruto seco hay un miligramo

de calcio valores que concuerdan con lo encontrado en este trabajo al obtener el valor

de 2.1 mg de calcio por gramo de fruto resultado de cuantificar calcio en un gramo de

fruto seco por medio de espectrofotometría de absorción atómica. Con los bajos

niveles de calcio en el fruto no es posible hagan subir los niveles séricos de calcio.

La hipercalcemia producida por el fruto de Pernettya prostrata posiblemente se

produce porque la andromedotoxina presente en el fruto se liga a los canales de sodio

de las células nerviosas y musculares bloqueándolos en estado abierto, volviéndose

incapaces de inactivarse provocando un estado de despolarización, durante el cual la

entrada de calcio a las células nerviosas y musculares puede ser facilitada,

provocando un descenso en el calcio citoplasmático el cual es interpretado por la PTH

91

(hormona paratiroidea) como un mensaje para que libere calcio de los huesos en el

torrente sanguíneo, además de aumentar la reabsorción de calcio en los túbulos

renales y en las vellosidades intestinales, provocando todo esto un aumento de calcio

en la sangre. Es de aclarar que la PTH actua con retroalimentación negativa osea que

cuando los niveles de calcio iónico en la sangre son bajos aparece ésta estimulando la

liberación de calcio de los huesos en el sistema circulatorio estabilizando los niveles

de calcio, y desaparece cuando los niveles de calcio están en quilibrio o más altos de

lo normal. (Piñeros 1991) (Maejima et al., 2003) (Gunduz et al., 2006).

Como ya se dijo más arriba a la sexta hora empieza a estabilizarse el calcio en la

sangre después de haberse consumido, indicándose que la andromedotoxina presente

en el fruto no afecta demorando o retardando la absorción de calcio en el intestino

delgado.

Según Gunduz et al 2006, los efectos de la andromedotoxina no duran mas de 24

horas y su intensidad va relacionada proporcionalmente con la cantidad ingerida de la

toxina, por ende se puede decir que la cantidad de fruto de Pernettya prostrata

suministrada a las ratas fue poca ya que no se presentaron valores altos de

hipercalcemia y además el efecto de la grayanotoxina en los canales de sodio

comenzó a desaparecer a las seis horas de suminitrado.

Al comparar estos resultados con los obtenidos por Neira en 1990, se concluye con

mas veracidad el efecto hipercalcémico de la andromedotoxina al verse en ese trabajo

los valores bajos de calcio en úrea efecto de la PTH al actuar en los túbulos renales,

pero no se puede comparar la calcemia en si pues los únicos reportes de calcio en

sangre validos fueron obtenidos de un sangrado general de los ratones presentes en

los grupos después de habérseles suministrado su respectivo tratamiento, volviéndose

datos inservibles si no se les hacían un seguimiento a través del tiempo como se hizo

en este trabajo.

92

9. CONCLUSIONES.

En la fraccion cloroformo del extracto etanólico se obtuvo un terpeno posiblemente

del tipo grayanotoxina al ser comparado con el patrón diterpeno, y al dar positivo la

prueba de Godin.

El consumo de fruto de Pernettya prostrata produjo aumento de calcio en suero

sanguíneo en las ratas utilizadas, pensándose que es producto de la posible

grayanotoxina presente en el fruto.

93

10. RECOMENDACIONES.

En próximos trabajos que complementen este se recomienda tomar el diterpeno

aislado que es la posible andromedotoxina e identificarlo por métodos de

espectroscopia para determinar su verdadera composición y confirmar o no la

presencia de la toxina en el fruto de la Pernettya prostrata.

Se deben realizar estudios que cuantifiquen la cantidad de antocianinas presentes en

los frutos de la Pernettya prostrata, ya que esta sustancia es un antioxidante natural,

pues sustancias de este tipo son consumidas en plantas como el Vacinium meridionale

o agras que es perteneciente también a la familia ericaceae como la Pernettya

prostrata.

En cuanto a la selección del animal se aconseja trabajar con conejos pues al trabajar

con ratas no se pueden obtener buenas cantidades de suero para hacer una buena

cuantificación de calcio en el espectrofotómetro de absorción atómica, ya que las

cantidades de sangre obtenidas por sangrada es baja, además es muy estresante para

la rata hacérsele mas de un sangrado al día pues su cantidad de sangre total es muy

baja y es un animal muy nervioso.

94

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