Estudio comparativo del efecto tripanomicida de los...
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1. INTRODUCCIÓN
1.1 Epidemiología Desde que fue descubierta en Brasil (1909) por Carlos Chagas, la enfermedad que lleva el
nombre de su descubridor, se ha demostrado su presencia en casi toda Latinoamérica, por
lo cual también es conocida como tripanosomiasis americana.
Las zonas endémicas más importantes son Brasil, Argentina y Colombia. Según el informe
de la OMS (2002), entre 16-18 millones de personas se encuentran afectadas por este
padecimiento y más de 100 millones están en riesgo de contraer la infección.
La enfermedad de Chagas ha sido catalogada como una de las enfermedades causadas
por parásitos más serias de Latinoamérica, teniendo un impacto socio-económico
considerablemente mayor que el causado en conjunto por otro tipo de parásitos (OMS,
1991). La fase crónica de la enfermedad puede durar años, pues los parásitos invaden los
órganos internos y provocan lesiones irreversibles del corazón y los intestinos. La
enfermedad es muy difícil de tratar con los medicamentos existentes. En algunas partes de
América Latina es la principal causa de defunción cardiaca en los adultos jóvenes. En
Santa Cruz (Bolivia) se han reportado tasas de seroprevalencia del 50% de la sangre en
los bancos (OMS, 1999).
En México existen también regiones endémicas como son los estados de: Morelos,
Oaxaca, Nayarit, Yucatán y Chiapas, en este último estado se han presentado reportes de
comunidades con hasta el 30% de la población infectada (Guzmán, 2001).
En términos globales, la literatura reporta casos de infección en todos los Estados de la
República. En distintas encuestas epidemiológicas que se han realizado hasta el 2004 a lo
largo del territorio nacional, de una muestra total de 288,634 personas, se han encontrado
16,979 seropositivos, lo que representa una tasa de prevalencia de 5.8%, (Figura1, Cruz y
Pickering, 2005).
Figura 1. Casos de reportados de la enfermedad de Chagas en la Republica Mexicana hasta el 2004 (Cruz y Pickering, 2005).
Estudio comparativo del efecto tripanomicida de los ésteres etílico y bencílico del ácido N-propil oxámico.
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1.2 Enfermedad de Chagas o tripanosomiasis americana La enfermedad de Chagas es una enzootia cuyo agente etiológico es Trypanosoma
(Schizotrypanum) cruzi, un protozoario hematoflagelado (familia Trypanosomatidae, orden
Kinetoplastida); los organismos que entran dentro de esta clasificación son uniflagelados y
presentan un pequeño cinetoplasto que corresponde a una red fibrilar de DNA contenido
dentro de un único mitocondrion (Tyler y Engman, 2001). El análisis de isoenzimas, la
actividad del promotor del RNA ribosomal y secuencia de genes mini-exon han
proporcionado evidencias de que T. cruzi no pertenece a una sola especie, sino que
corresponde a dos subgrupos genéticos altamente divergentes, designados el linaje I y II
(Briones et al., 1999). El linaje I se encuentra predominantemente relacionado al ciclo de
vida doméstico, mientras que el linaje II esta relacionado al ciclo de vida salvaje. El ciclo de
vida del parásito, involucra el paso de un insecto de las familias Reduvidae y Hemiptera
(conocidas comúnmente como chiches hociconas), como Triatoma infestans, Rhodinus
prolixus, Pastronylus megistus (Zeledón, 1997), y un vertebrado que generalmente es un
mamífero, presentando diferentes estadios en ambos huéspedes:
El tripomastigote (la forma circulante flagelada que penetra a las células del huésped) es
ingerido por el insecto vector. Éste se diferencia en su forma proliferativa de epimastigote
al llegar al intestino y más tarde se transforma a tripomastigote metacíclico (Hoare y
Wallace, 1966). Esta última es la forma infectiva transmitida al vertebrado con la
consecuente diferenciación a amastigote, el cual es intracelular y de forma esférica que
mediante varios ciclos reproductivos se convierte de nuevo en tripomastigote; la forma
responsable de la diseminación de la infección (CDC, 2004).
1.2.1 Transmisión La transmisión de la enfermedad ocurre en la mayoría de los casos mediante el vector (80-
90%), en menor proporción por transfusión sanguínea (5-20%); en México entre 1994 y
1996 se detectó una prevalencia de infección chagásica en los centros estatales de
transfusión de México igual a 1.5% (Guzmán et al., 1998) y por ruta congénita (0.5-8%)
(Días, 2000).
Se han colectado ejemplares de 30 especies de triatominos (comprendidas en 7 géneros)
de vectores en todos los Estados de la República Mexicana. De estas especies, al menos
en 21 se ha identificado la infección por T. cruzi, la figura 2 muestra la distribución
geográfica de las especies de triatominos que se han reportado hasta 2004 a lo largo de la
Republica Mexicana (Cruz y Pickering, 2005).
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Figura 2. Distribución geográfica de las especies de vectores transmisores de la enfermedad
de Chagas, reportados en la República Mexicana (Cruz y Pickering, 2005).
1.2.2 Manifestaciones clínicas
En humanos después de la infección y un subsiguiente período de incubación empiezan a
presentarse las manifestaciones clínicas. Se distinguen tres fases de la enfermedad bien
diferenciadas:
a) Fase aguda cuya duración es de 2-4 meses y aproximadamente sólo el 5% de los
infectados manifiestan sintomatología. La mortalidad durante esta fase de la
infección está entre un 10-20% en su mayoría de niños y ancianos
b) Fase indeterminada o infección subclínica, se distingue porque los pacientes
cursan asintomáticos, lo que hace difícil el diagnóstico durante esta fase. Se
presenta en un 50-60% de los casos y progresa durante periodos largos, e incluso
el paciente puede permanecer en esta fase durante toda su vida (Cruz y Pickering,
2005).
c) Fase crónica afecta sobre todo la calidad de vida del paciente debido al deterioro
en el funcionamiento de los tejidos afectados por la infección como son: corazón,
intestino y sistema nervioso central; se presenta en un periodo de 10-20 años
después de la infección. Aproximadamente 30-40% de los casos presentan esta
fase, de los cuales un 60-70% mueren repentinamente (Brain, 1992; Becerril,
1999).
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Después de la inoculación del parásito son frecuentes el signo de Romaña (inflamación de
los párpados de un ojo) y el chagoma de inoculación (edema o roncha en la piel). El
parásito invade al huésped y destruye las células de tejido muscular cardiáco, fibra
muscular lisa y células del sistema fagocitario mononuclear (macrófagos). El periodo inicial
de infección está caracterizado por parasitemia intensa; los signos y síntomas son
transitorios debido a la respuesta inmune del huésped y por un cuadro febril (Tay et al.,
1993). En la fase aguda, los síntomas pueden ser moderados o ausentes, se observan
más en los niños que en los adultos; dos o tres semanas después se presenta linfadenitis y
edema generalizado, dolor muscular, vómito y diarrea, bronquitis y miocarditis de
intensidad variable: La fiebre es alta (intermitente, remitente o continua), puede haber
hepato-esplenomegalia, mialgias y rash eritematoso (Cruz y Pickering, 2005).
Los exámenes de laboratorio muestran anemia, linfocitosis, monocitosis e incremento de
los niveles de anticuerpos IgM. La fase aguda de la Enfermedad de Chagas termina en
pocas semanas con la recuperación del paciente, o bien comienza con el estado crónico
de la infección e inclusive la muerte. La fase indeterminada se caracteriza por positividad
serológica, en individuos asintomáticos con electrocardiograma (ECG) y radiología normal
para corazón, esófago y colon, aunque pueden presentarse periodos variables de
remisión, exacerbación marcada por la fiebre y la aparición de tripomastigotes en la
sangre. La forma clínica en la fase crónica se caracteriza por cardiopatía, formación de
“megas”: megaesófago (esofagopatía) y megacolon (colopatía), se presentan alteraciones
del sistema nervioso central y bronquioectasias (dilatación crónica de los bronquios). La
glomerulonefritis por T. cruzi, es el resultado de depósitos de complejos inmunes en las
membranas basales de los túbulos renales (Cruz y Pickering, 2005).
No se sabe que T. cruzi produzca toxinas o factores citotóxicos por lo que la mayoría de
las consecuencias de la infección se deben a la reacción inmunitaria del huésped. (Stein et
al., 1992)
1.2.3 Mecanismos de evasión del sistema inmunológico empleados por Trypanosoma cruzi.
El sistema inmunológico del huésped, juega un papel muy importante en la protección
contra enfermedades parasitarias. Sin embargo, para T. cruzi se han reportado
mecanismos generales que les confieren a estos parásitos, la capacidad de evadir los
efectos letales del sistema inmunológico del huésped (Hall y Joiner, 1991).
1. Los tripomastigotes de T. cruzi producen moléculas que regulan la fijación del
complemento. Estos parásitos producen una proteína (Complement regulatory
protein; CRP) que mimetiza el efecto de una familia de proteínas CRP que emplea
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el huésped para prevenir la lisis de sus propias células por la fijación del
complemento (Hall y Joiner, 1991). T. cruzi ha desarrollado este mecanismo que
les confiere la capacidad de evitar la lisis (muerte) mediada por fijación del
complemento (Fuhram y Joiner, 1989). Lo anterior se ha demostrado plenamente
ya que la transfección de epimastigotes (sensibles a la lisis por fijación del
complemento) utilizando un plásmido conteniendo el gen específico para CRP
presente en tripomastigotes, les confiere resistencia a la lisis por fijación del
complemento (Norris, 1998). Esto demuestra que CRP es uno de los factores
responsables de la virulencia de T. cruzi.
2. Otro factor que contribuye a la disminución de la respuesta inmune por los
tripomastigotes es la liberación de proteínas, especialmente, una trans-sialidasa
(TS) la cual tiene la capacidad de matar las células del sistema inmunológico,
activando o acelerando su mecanismo de muerte celular programada o apoptosis.
(Leguizamon et al., 1999).
3. La infección de ratones con T. cruzi conduce a una infección aguda, caracterizada
por una severa depresión del sistema inmunológico, (Ouaissi y Ouaissi, 2005),
debido a que estos parásitos liberan al medio moléculas solubles que actúan como
inmunosupresores que les permiten sobrevivir y proliferar (Ouaissi y Ouaissi, 2005).
Afortunadamente esta depresión del sistema inmunológico decrece notablemente
cuando el huésped pasa a la fase crónica, ya que esta depresión inmunológica
pone en riesgo al paciente de otras infecciones oportunistas.
Es muy probable que esta inmunosupresión temporal ayude al parásito para entrar
a las células y alcanzar los compartimentos celulares, lo cual permite el
establecimiento de la fase crónica, tanto en animales como en humanos (Hall y
Joiner, 1991). En el caso de T. cruzi, esta fase se caracteriza por la diferenciación
de los tripomastigotes en amastigotes, la cual es la fase replicativa en el huésped
vertebrado.
1.2.4 Diagnóstico
El diagnóstico en: a) la fase aguda se establece por la alta parasitemia, incrementos de
anticuerpos, anti T. cruzi tipo IgM detectados por inmunofluorescencia, detección del
parásito en sangre en un frotis de gota gruesa, búsqueda de amastigotes en ganglios y
músculo estriado, xenodiagnóstico, entre otros; b) el diagnóstico en la fase indeterminada
se establece solamente por serología positiva, de cuando menos dos técnicas:
hemaglutinación indirecta, ELISA, Western blot, inmunofluorescencia y PCR; y c) la fase
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crónica se diagnostica, mediante las técnicas mencionadas aunadas a estudios
electrocardiográficos, radiológicos y ecografía para demostrar cardiopatía, colopatía y
esofagopatía (Cruz y Pickering, 2005).
1.2.5 Quimioterapia
Se han probado numerosos fármacos para el tratamiento de la enfermedad de Chagas,
pero hasta ahora ninguno ha resultado absolutamente eficaz. Estos fármacos se pueden
clasificar en los siguientes grupos:
a) fármacos con utilidad clínica reconocida: Nifurtimox y Benznidazol; b) fármacos
efectivos en modelos experimentales in vivo, sin aplicación clínica generalizada:
Ketoconazol, itraconazol, alopurinol; c) fármacos efectivos en modelos experimentales
con actividad clínica previsible: inhibidores de las vías bioquímicas del T. cruzi d)
tripanomicidas in vitro: cristal violeta (Stoppani, 1999).
1.2.5.1 Nifurtimox y Benznidazol
El Nifurtimox ó 5–nifurtan (3-metil-4-(5’-nitrofurfuril idenamino)tetrahidro-4H-1,4-tiazida-
1,1dióxido y el Benznidazol (N-bencil-2-nitroimidazol acetamida), son comercializados con
los nombres de Lampit y Radanil, respectivamente.
El mecanismo de acción del Nifurtimox implica la generación del radical nitro-anión
mediante la acción de nitro-reductasas que en presencia de oxígeno promueven la
formación de intermediarios reactivos (como H2O2 y radicales libres) para los cuales el
sistema de detoxificación de T. cruzi es ineficiente (DoCampo y Moreno, 1986). Por otro
lado, el efecto del Benznidazol está más bien relacionado con la unión covalente o algunas
otras interacciones de los intermediarios de la nitroreducción (que no se encuentran en
concentraciones lo suficientemente altas como para matar al parásito) con componentes
del parásito como DNA, lípidos y proteínas (Diaz de Toranzo et al., 1988). Las estructuras
químicas del Benznidazol y del Nifurtimox se muestran en la figura 3.
A B
N
N
O2NO
NH
OO2NN O
O
SN
CH3 Figura 3. Estructuras química del Benznidazol (A) y Nifurtimox (B).
Los resultados obtenidos con ambos medicamentos varían de acuerdo a la fase de la
enfermedad, el periodo de tratamiento, la dosis, edad y el origen geográfico de los
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pacientes. Sin embargo, se han mostrado resultados favorables en la fase aguda de la
infección o en la fase crónica temprana (OMS, 2002). Algunos de los efectos colaterales
del tratamiento con Nifurtimox son la anorexia, la pérdida de peso, náusea, vómito, cólicos
intestinales y diarrea. La comercialización de Nifurtimox fue descontinuada en Brasil y
Argentina desde los años 90´s por presentar efectos tóxicos sobre todo durante el
tratamiento crónico de la enfermedad (DoCampo, 1990).
Las reacciones adversas del Benznidazol pueden ser clasificadas en tres grupos: i)
hipersensibilidad, dermatitis y erupciones cutáneas, dolor articular y muscular; ii) púrpura
trombocitopénica y granulomatosis; iii) polineuropatía (Coura y de Castro, 2002).Existen
también reportes de actividad mutagénica y carcinogénica debido al Benznidazol, sobre
todo en tratamientos crónicos (Teixeira et al., 1994).
1.2.5.2 Fármacos sin utilidad clínica reconocida
Otros compuestos que han sido probados para el tratamiento de este padecimiento son el
alopurinol, el cual bloquea la síntesis de novo de nucleótidos de purina (Marr, 1991) debido
a que T. cruzi es incapaz se sintetizar estos nucleótidos, sino que debe utilizar purinas
preformadas en el organismo del huésped.
Los azoles que se utilizan como antimicóticos, los cuales modifican el contenido de
esteroles, en particular de ergosterol (esterol cuya presencia en T. cruzi es sobresaliente y
que es indispensable para la proliferación y viabilidad de este parásito), como el
ketoconazol, itraconazol y fuconazol (Brener et al., 1993) y antineoplásicos como el Taxol
(Dantas, 2000). Sin embargo aún no se han encontrado compuestos lo suficientemente
efectivos y selectivos contra el parásito. Además, el tratamiento de este padecimiento es
prolongado por lo que muchas cepas de T. cruzi se han hecho resistentes a los fármacos
(Andrade et al., 1985).
1.2.5.3 Blancos bioquímicos prometedores para la quimioterapia de la
enfermedad de Chagas
Como consecuencia en el incremento en el conocimiento de la bioquímica y fisiología del
agente etiológico de la enfermedad de Chagas, se han buscado blancos bioquímicos que
permitan el desarrollo de nuevos agentes quimioterapéuticos para el tratamiento de esta
enfermedad, dentro de los que se encuentran:
a) inhibidores de la tripanotiona reductasa, la cual representa el sistema único
presente en el orden Kinetoplastida para el balance redox de los grupos tiol dentro
de la célula (Fairlamb, 1999).
b) Inhibidores de cistein-proteasas. La cruzipaina es una catepsina (cistein-proteasa
de tipo L) responsable de la mayor actividad proteolítica en todos los estadios del
ciclo de vida de T. cruzi (Stoppani, 1999).
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c) Alquil-lisofosfolipidos (ALP): Estos compuestos bloquean selectivamente la
biosíntesis de fosfatidilcolina en estos parásitos, sin embargo, el mecanismo de
acción por el cual ejercen su actividad tripanomicida no ha sido completamente
elucidado (Lira et al., 2001).
d) Inhibidores del metabolismo del pirofosfato. Tanto el pirofosfato como los
polifosfatos son compuestos de alta energía y en T. cruzi son mas abundantes
incluso que el ATP, por lo que se sugiere que estos compuestos pueden jugar un
papel primordial en la sobrevivencia el parásito (Moreno et al., 2000).
e) Inhibidores de la α-hidroxiácido deshidrogenasa (α-HADH) isoenzima II. Los
inhibidores de esta enzima juegan un papel fundamental en el abatimiento del
metabolismo energético de T. cruzi (Elizondo, 2003), el cual se abordará a detalle
más adelante.
1.3 Trypanosoma cruzi.
1.3.1 Ciclo de vida.
Trypanosoma cruzi cambia de morfología durante su ciclo de vida y en la transmisión del
insecto al humano. Presenta tres formas generales, que pueden se identificables por
microscopia óptica en preparaciones teñidas con Giemsa: tripomastigote (metacíclico y
sanguíneo), amastigote y epimastigote (Figura 4). Debido a su cambio de forma, éste
parásito puede adecuarse a medios hostiles y evadir la respuesta inmunológica.
Los tripomastigotes metacíclicos son la forma infectiva que pasan del intestino del insecto
a través de la orina o materia fecal y atraviesan la piel o mucosas por medio de abrasiones
o soluciones de continuidad (Brener, 1973).
Figura 4. Ciclo de vida de T. cruzi incluyendo sus huéspedes y las fases en que es factible hacer un diagnóstico (CDC, 2004).
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La infección comienza con la penetración de los tripomastigotes metacíclicos en los
macrófagos que se encuentran en los tejidos subcutáneos y la dermis. El parásito
sobrevive a la fagocitosis de los macrófagos ya que escapa del fagosoma antes de la
fusión con el lisosoma (Lanzer et al., 1997). Dentro de las células, los tripomastigotes
pierden su flagelo y se redondean formando los amastigotes, también conocidos como
esferomastigotes o micromastigotes (Ley et al., 1990). Los amastigotes son el estadio
intracelular, esférico de 1.50 a 5 μm de diámetro donde el cinetoplasto se observa como un
cuerpo oscuro cercano al núcleo. Estos carecen de flagelo y se replican mediante fisión
binaria. Cuando los amastigotes casi llenan la célula toman una forma intermedia,
conocida como tripomastigote procíclico, en el cual el cinetoplasto se localiza en la parte
anterior al parásito y el flagelo se encuentra libre sin membrana ondulante. Los cuales al
lisarse la célula son liberados a los espacios intersticiales y al torrente sanguíneo (Tay et
al., 1993). Los tripomastigotes sanguíneos presentan el cinetoplasto posterior al núcleo
que usualmente ésta localizado en la zona más posterior del parásito, de aquí sale el
flagelo y se dobla hacia adelante a lo largo del cuerpo del parásito, formando una
membrana ondulante y emerge en forma libre en su extremo anterior. Su longitud oscila
entre 5-25 μm y 2 μm de ancho (Tay et al., 1993). Esta forma flagelada promueve la
infección de una célula a otra del huésped hasta colonizar músculo o el tejido neural donde
se enquistan y forman los amastigotes, repitiéndose indefinidamente el ciclo de infección
(Tay, 1993) como se representa en la figura 4. La forma de tripomastigote también puede
obtenerse de la fase estacionaria de crecimiento en cultivos axénicos y en la fase líquida
de cultivos celulares (Ley et al., 1990).
Los tripomastigotes circulantes son adquiridos por las chinches durante la ingestión por
sangre contaminada. Estos tripomastigotes viajan a través del intestino del insecto donde
se convierten en epimastigotes, los cuales, a diferencia de los tripomastigotes presentan
un flagelo unido a la parte central del cuerpo del parásito, un núcleo central y un
cinetoplasto (Hoare y Wallace, 1966). Estos miden entre 1-2 μm de longitud, pero
aumentan su tamaño hasta veinte veces más, conforme viajan a través del intestino del
insecto hasta que adoptan de nuevo la forma metacíclica de tripomastigote. Este cambio
de forma en el insecto tarda entre 16 -17 días y el parásito parece no causar un daño a la
chinche (Tyler y Engman, 2001). Los epimastigotes también se encuentran al final de la
fase intracelular, cuando el amastigote se transforma en tripomastigote o viceversa (Ley et
al., 1990). Las diferentes morfologías que toma T. cruzi durante su ciclo de vida, la
localización del núcleo y el cinetoplasto se muestran en la figura 5.
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Figura 5. Estadios morfológicos de Trypanosoma cruzi (Guzmán et al., 1998). Las letras significan; B: blefaroblasto, F: flagelo, M: mitocondrion, G: aparato de golgi, V: vacuola, Mo: membrana ondulante, I: inclusión limdica, K: cinetoplasto, C: citoplasma, R: ribosomas, N: núcleo, RE: retículo endoplásmico, Mt: microtubulos.
1.3.2 Metabolismo energético de T. cruzi.
La fuente principal para la obtención energía de los tripanosomas es la glucosa
(Opperdoes, 1985), por lo que la glicólisis juega un papel muy importante. El conjunto de
reacciones de esta ruta se muestra en la figura 6. El metabolismo anaeróbico de los
carbohidratos requiere de un balance de la coenzima NAD+ la cual actúa como agente
oxidante (en la ausencia de oxígeno), sin embargo la cantidad de NAD+ en cualquier célula
es limitado, por lo tanto el metabolismo se detendrá tan pronto como todo el NAD+ sea
reducido a NADH + H+. Sin embargo, existe un mecanismo para la reoxidación del
nucleótido de nicotinamida reducido. En la glicólisis, esta reoxidación ocurre cuando el
piruvato es reducido a lactato. El NAD+ transporta los electrones en ausencia de oxígeno
(Conn y Stumpf, 1976).
En consecuencia, el paso determinante para que la glicólisis pueda continuar de manera
ininterrumpida es la regeneración de NAD+ el cual es utilizado como cofactor por la enzima
gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, enzima involucrada en la conversión del
gliceraldehído-3-fosfafo en bisfosfoglicerato. El reciclaje de este cofactor oxidado se logra
mediante la acción de la enzima lactato deshidrogenasa que convierte el piruvato, último
intermediario de la ruta glicolítica en lactato, utilizando el NADH como cofactor, liberando
NAD+ (ambas reacciones se encuentran señaladas en la figura 6).
EPIMASTIGOTE TRIPOMASTIGOTE AMASTIGOTE
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Figura 6. Ruta glicolítica (Metzler, 2001).
Esto es lo que ocurre en mamíferos, pero en T. cruzi, no es la LDH la que realiza la
reoxidación del NADH sino la α-hidroxiácido deshidrogenasa isoenzima II (Coronel et al.,
1981).
1.3.3. α-hidroxiácido deshidrogenasa isoenzima II
T. cruzi posee un análogo de la lactato deshidrogenasa de humanos que puede utilizar
como sustrato a un gran número de α–cetoácidos además del piruvato, es por esta razón
que se le ha denominado como α-hidroxiacido deshidrogenasa (α-HADH). Esta enzima
presenta dos isoenzimas: la tipo I que utiliza como sustrato el piruvato y el butirato, y la tipo
II que utiliza como sustratos a una gran cantidad de α-cetoácidos. (Coronel et al., 1981)
En la figura 7 se muestra una representación de los aminoácidos involucrados en la unión
al sustrato así como el sitio de unión al cofactor NAD+ para una enzima similar a la α-
HADH de T. cruzi que utiliza α-cetoácidos como sustratos.
2 NAD+ 2 NADH +2H+
Figura 7. Sitio de unión al sustrato de la D-hidroxi-isocaproato deshidrogenasa (D-HicDH) de L. casei enzima similar a la α-HADH. (Chizuka et al., 2003).
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La α-hidroxiácido deshidrogenasa isoenzima II, puede localizarse tanto en el citoplasma
como en la mitocondria, lo que permite que los α-cetoácidos producidos por la
transaminación de algunos aminoácidos como la isoleucina, puedan ser reducidos por el
NADH utilizando su versión citoplasmática. Los α–hidroxiácidos formados penetran en la
mitocondria y son reoxidados por la α-hidroxiácido deshidrogenasa mitocondrial
transfiriendo los electrones al NAD+ y de aquí a la cadena respiratoria. Este mecanismo
actúa como una lanzadera donde se pueden reoxidar en la mitocondria equivalentes
reductores (NADH) generados en el citoplasma como se muestra en la figura 8 (Montamat
et al., 1987).
α-HADH α-HADH
Figura 8. Esquema del metabolismo energético de Trypanosoma cruzi (Gerez de Burgos et al., 1978). Indica el sito de la inhibición de la α-hidroxiácido deshidrogensa isoenzima II de T.cruzi (α-HADH). Proponemos entonces que la inhibición de esta enzima conducirá a una inhibición en el metabolismo energético de T. cruzi Por este motivo, un inhibidor de la α-HADH bloqueará tanto la glicólisis (evitando
reoxidación del NADH) como el mecanismo de lanzadera descrito. Así que esta enzima se
ha propuesto como un blanco prometedor para el diseño de nuevos fármacos con actividad
tripanomicida. Algunos de los α-hidroxiácidos que tienen gran afinidad y las reacciones
que cataliza la α-HADH, se muestran en la figura 9.
C H 3
C H 2
C H 2
C H 2
C O
C O O H
CH3
CH2
CH2
CH2
C
COOH
OHH
CH3
CH2
C
COOH
CH CH3
O
CH3
CH2
C
COOH
OH
CH CH3
H
α-cetocaproico α-hidroxicaproico α-cetoisocaproico α-hidroxi–isocaproico
Figura 9. Reacciones catalizadas por la α-hidroxiacido deshidrogenasa de Trypanosoma cruzi isoenzima II, utilizando como sustrato el α-cetocaproico (A) y α-cetoisocaproico (B).
NADH NAD+
α-HADH α-HADH
NADH NAD+
A B
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1.4 Antecedentes
En la búsqueda de compuestos análogos a estos sustratos que funcionen como
inhibidores de la α-hidroxiácido deshidrogenasa isoenzima II se han diseñado y sintetizado
derivados del ácido oxámico (Chena et al., 2004) como el ácido N-propil oxámico y el ácido
N-isopropil oxámico, con base en que los sustratos con mayor afinidad por esta enzima
son el ácido α-cetocaproico y el α-cetoisocaproico. Estos resultaron ser excelentes
inhibidores selectivos y competitivos de la α-hidroxiácido deshidrogenasa isoenzima II en
ensayos enzimáticos (Elizondo, 2003). Sin embargo, cuando se probaron estos oxamatos
N-sustituidos tanto in vitro sobre cultivos de T. cruzi, como in vivo, sobre la parasitemia en
animales de laboratorio, no resultaron tener actividad tripanomicida a pesar de presentar
un buen efecto inhibidor de la α-HADH isoenzima II de T. cruzi; en tanto que Nifurtimox y
Benznidazol si presentan efecto tripanomicida debido a que estas sustancias son poco
polares. Se consideró entonces que debido a la polaridad de los oxamatos N-sustituidos,
estos son incapaces de atravesar las membranas celulares e inhibir la enzima (Elizondo,
2003). Por esta razón se optó por la síntesis de los ésteres etílicos, de menor polaridad
que pudieran atravesar las membranas celulares y una vez dentro del tripanosoma fueran
hidrolizados por las carboxiesterasas intracelulares que ya se han reportado para T. cruzi
(Aldunate, 1987) y liberaran los oxamatos N-sustituidos con actividad biológica (Chena et
al., 2004). En la figura 10 se muestra la similitud estructural entre el ácido α-cetocaproico,
el ácido N-propil oxámico y ésteres derivados de este ácido.
O
O
OH
O
OHN
O
Ácido α-cetocaproico éster bencílico del NPOx
NOH
O
OH
O
OHN
O
Ácido N-propil oxámico éster etílico del NPOx
En el caso del éster bencílico del ácido N-propil oxámico (NPOx-B) el cual es el objeto de
estudio de este trabajo, el mecanismo que se propone para que ejerza el efecto
tripanomicida se esquematiza en la figura 11.
El NPOx-B al ser una sustancia altamente hidrofóbica, podrá atravesar las membranas
celulares con mayor facilidad que los ésteres etílicos y una vez dentro ser hidrolizado por
las carboxiesterasas presentes en T. cruzi, como producto de la hidrólisis se obtendrían el
Figura 10. Estructuras químicas del ácido α-cetocapróico, sustrato de la α-HADH-II de T. cruzi y sus análogos estructurales; el acido N-propil oxámico (NPOx), y sus ésteres bencílico y etílico
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N-propil oxamato y el alcohol bencílico. Este último podría potenciar la actividad
tripanomicida ya que presenta actividad microbicida (Karabit et al., 1986).
Figura 11. Mecanismo propuesto para el posible efecto inhibitorio que ejercerá el éster bencílico del ácido N-propil oxámico sobre la α-HADH isoenzima II de T. cruzi. Se espera que el efecto tripanomicida se vea incrementado por el efecto microbicida del alcohol bencílico.
2. JUSTIFICACIÓN La ausencia de una vacuna y de un tratamiento efectivo contra la enfermedad de Chagas
aunado a la falta de interés de los laboratorios farmacéuticos para producir fármacos
contra esta enfermedad, hace de gran interés el tratar de desarrollar nuevos agentes
tripanomicidas para el tratamiento de la enfermedad de Chagas.
La finalidad de este trabajo es sintetizar el éster bencílico el ácido N-propil oxámico como
profármaco para probar su efecto inhibidor sobre la α-hidroxiácido deshidrogenasa
isoenzima II de Trypanosoma cruzi. Se espera que este compuesto al ser hidrolizado por
las carboxiesterasas intracelulares liberará el ácido N-propil oxámico y alcohol bencílico.
Con este compuesto se pretende inhibir el metabolismo energético de Trypanosoma cruzi
ya que este parásito requiere una gran cantidad de energía para el funcionamiento de su
sistema motriz; movimiento de la membrana y flagelo. Por otro lado la baja polaridad del
compuesto y la presencia del alcohol bencílico (Prindle, 1983), el cual posee efecto
microbicida, probablemente incrementen el efecto tripanomicida del ácido N-propil
oxámico.
NPOx- B (Profármaco, no polar)
MEDIO EXTRACELULAR
MEDIO INTRACELULAR
NO
O
OH
-
OH NPOx -B N-propil alcohol oxamato bencílico
(Tripanomicida ) (Microbicida)
Esterasas
O
OHN
O
O
OHN
O
15
3. OBJETIVOS 3.1 Objetivo general
Sintetizar y estudiar el efecto tripanomicida ex vivo e in vitro del éster bencílico del ácido N-
propil oxámico.
3.2 Objetivos particulares
Sintetizar y caracterizar fisicoquímicamente el éster bencílico del ácido N-propil
oxámico (NPOx-B).
Determinar el efecto ex vivo en tripomastigotes sanguíneos e in vitro en cultivos de
epimastigotes, sobre la motilidad y sobrevivencia de las cepas INC-5 y NINOA de T.
cruzi.
Comparar el efecto tripanomicida del éster bencílico del ácido N-propil oxámico con el
éster etílico del ácido N-propil oxámico y los fármacos utilizados para el tratamiento de
este padecimiento, Nifurtimox y Benznidazol.
4. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1 Compuestos químicos El éster etílico del ácido N-propil oxámico fue sintetizado en el Laboratorio de Enzimología
del Depto. de Bioquímica de ENCB-IPN (Chena et al., 2004). Lampit ® (Nifurtimox)
BAYER. Lote 477580. Comprimidos de 120 mg. Rochagan ® (Benznidazol) ROCHE. Lote
110878. Comprimidos 100 mg.
4.2 Material biológico
a) T. cruzi cepa INC-5. Fue aislada en el año de 1997 a partir de una paciente de 58 años
de edad, con cuadro crónico de la enfermedad. La paciente era procedente de la localidad
Congregación del estado de Guanajuato, México.
b) T. cruzi cepa NINOA. Fue aislada en el año de 1986 a partir de una paciente de 8 años
de edad, con cuadro agudo de la enfermedad. La paciente era procedente del estado de
Oaxaca. Estas cepas han sido conservadas en el departamento de Parasitología de la
ENCB-IPN.
Los epimastigotes de la cepa INC-5 y NINOA fueron cultivados en medio BHI
suplementado con solución Locke (NaCl 0.7 M, KCl 0.05 M, Na2HPO4 0.4 M, glucosa 0.1
M) al 10%, hemina 50 mg/L, suero bovino fetal 1% y antibióticos (penicilina 100 UI/ml y
estreptomicina 100 μg/ml). Se utilizaron cultivos en la fase logarítmica de crecimiento para
los estudios del efecto de los compuestos sobre la viabilidad de epimastigotes.
16
Para el estudio del efecto de los compuestos sobre tripomastigotes sanguíneos se
inocularon ratones (hembras) de entre 18-20 g de peso de la cepa CD-1 y se determinó el
máximo de la parasitemia en sangre mediante el método de Filardi y Brener (el cual
considera como viables sólo a los parásitos móviles) (Filardi, 1984) combinado con el
reportado por Pizzi el cual se describe con detalle más adelante (Pizzi, 1957), para ambas
cepas las curvas obtenidas se muestran en las gráficas 1 y 2. Posteriormente, se extrajo la
mayor cantidad de sangre posible de los ratones por punción cardiaca utilizando como
anticoagulante EDTA 1%.
4.3 Método de Pizzi 1. Tomar 5 μl de sangre.
2. Depositar la sangre en un portaobjetos limpio, cuidando que no se extienda.
3. Colocar un cubreobjetos limpio y homogeneizar la muestra.
4. Contar los parásitos en 25 campos al microscopio con un aumento de 40X.
5. Determinar el número de tripomastigotes/ml.
4.4 Síntesis del éster bencílico del ácido N-propil oxámico
La formación de amidas secundarias se produce por la reacción entre un éster y una
amina primaria donde los grupos carbonilo del éster son susceptibles al ataque nucleofílico
de aminas para formar las amidas correspondientes. Por esta razón se plantea la siguiente
reacción para la obtención de éster bencílico del ácido N-propil oxámico:
O
C O
C O
O
C H2
C H2
CH3
CH2
CH2
NH2
CH3
CH2
CH2
NH
C
C
O
CH2
O
O
CH2-OH
Dibenciloxalato Propilamina éster bencílico del alcohol bencílico
ácido N-propil oxámico
17
Utilizando como reactivo el dibenciloxalato en presencia de propilamina se formó el éster
bencílico del ácido N-propil oxámico (figura 12), el cual posteriormente se sujetó a una
hidrólisis para obtener el ácido N-propil oxámico como se describe a continuación:
Se pesaron 5.9 g de propilamina correspondientes a 0.1 mol, se disolvieron en 50 ml de
éter etílico. A la solución anterior se le añadió, gota a gota y con agitación constante sobre
una solución de 29 g (0.1 mol más un exceso del 10%) de dibenciloxalato disueltos en 100
ml de éter etílico. Transcurridas dos horas se detuvo la agitación y la reacción se mantuvo
a temperatura ambiente durante 24 h. Del matraz de reacción se separó un producto
cristalino el cual fue sometido a filtración. El sobrenadante fue destilado a bajas
temperaturas y el residuo se fraccionó al vacío. Se pesó el producto obtenido y se
determinó el rendimiento de la reacción y el punto de fusión.
Posteriormente se pesó la cantidad correspondiente a 0.05 mol de N-propil oxamato de
bencilo y se agitó con 50ml de hidróxido de sodio (1N) durante 30 min. Se extrajo con éter,
la fase acuosa se separó y se acidificó con ácido clorhídrico (2N). Se extrajo con éter y se
recristalizó con cloroformo. Se pesó el producto obtenido y se determinó el rendimiento de
la reacción y el punto de fusión.
Figura 12. Esquema de la síntesis del éster bencílico del ácido N-propil oxámico (N-propiloxamato de bencilo).
CO
CO
NH CH2 CH2 CH3
CH2O
N-propiloxamato de bencilo
NH2
CH2CH2CH3
Propilamina
Dibenciloxalato
CO
CO
O
O
CH2
CH2
18
4.5 Caracterización fisicoquímica del éster bencílico del ácido N-propil oxámico. Al producto obtenido se le realizaron las determinaciones: punto de fusión, espectroscopía
en el infrarrojo, resonancia magnética nuclear de hidrógeno y resonancia magnética de
carbono, para confirmar su estructura química.
Para corroborar la estructura química del compuesto sintetizado en los espectros
obtenidos por resonancia magnética nuclear, fueron comparados con los obtenidos con el
programa ACD*predictor (Advanced Chemistry Development), este programa se encarga
de realizar el posible espectro o un espectro hipotético de RMN (de carbono o hidrógeno)
de una determinada estructura (Brian, 2005). Y al existir concordancia entre él y el
espectro obtenido podemos confirmar la estructura química del compuesto sintetizado.
4.6 Estudio del NPOx-B, NPO-Et, Nf y Bz sobre la viabilidad de tripomastigotes sanguíneos
Se parasitaron ratones CD-1 de entre 18-20 g de peso con 0.2 ml de sangre que contenían
1X106 tripomastigotes/ml. Se obtuvo la sangre de ratones infectados con tripomastigotes
en el máximo de la parasitemia. La sangre fue ajustada con solución salina isotónica (NaCl
0.85%) para ajustar a una concentración de 2X106 tripomastigotes/ml. Posteriormente, en
placas de 96 pozos se colocaron 195 μl de sangre y 5 μl del tratamiento, en cada uno de
los pozos. Los tratamientos consistían en un control negativo que contenía dimetil sulfóxido
(DMSO 2.5%) y los compuestos, NPOX-B, NPOX-Et, Benznidazol y Nifurtimox disueltos en
DMSO a las siguientes concentraciones; 0.25 mM, 0.5 mM, 1 mM, 2 mM, 4 mM y 8 mM.
Por último, se utilizó como control positivo de la lisis de los tripomastigotes, cristal violeta
(1mg/mL) y como testigo pozos que contenían 200 μl de sangre sin recibir algún
tratamiento. Cada concentración se probó por duplicado.
Una vez adicionados los compuestos tras ser homogenizado con la sangre, las placas se
incubaron a 4°C durante 24 h (Oliveira et al., 2003; Paveto et al., 2004). Transcurrido el
tiempo de incubación, se tomó una alícuota de 5 μl de cada pozo, se colocó entre un porta
y un cubreobjetos y se contaron los tripomastigotes viables utilizando el método de Brener
complementado con el de Pizzi (Brener ,1973; Pizzi, 1957).
Se realizó el calculó del número de tripomastigotes viables por ml de sangre y obtuvieron
los porcentajes de sobrevivencia tomando como 100% al control negativo.
Para comparar los resultados de viabilidad obtenidos con los diferentes compuestos a las
concentraciones probadas contra el control, se analizaron estadísticamente mediante
ANOVA y la prueba post-ANOVA para comparaciones múltiples de Dunnett, utilizando un
nivel de significancia (α) de 0.05.
19
4.7 Evaluación del daño citológico de los tripomastigotes sanguíneos después de la evaluación de la viabilidad.
Posterior a la evaluación ex vivo de la viabilidad de los tripomastigotes sanguíneos debida
a la presencia de los diferentes compuestos, se procedió a realizar frotis por triplicado de la
sangre tratada y homogenizada, dichos frotis se tiñeron con Giemsa (1:10 de la solución
madre) durante 60 min, posteriormente se eliminó el exceso de colorante, se secaron y se
observaron al microscopio en un aumento de 100X en la búsqueda de alteraciones
morfológicas.
4.8 Estudio in vitro del NPOx-B, NPO-Et, Nf y Bz sobre la viabilidad de epimastigotes en cultivo.
Para monitorear la viabilidad in vitro de epimastigotes se cosecharon por centrifugación a
3000g durante 5 min. El paquete celular se resuspendió en medio BHI suplementado para
obtener una suspensión de 2x106 epimastigotes/ml. Los epimastigotes fueron expuestos
por separado a los siguientes compuestos: NPOx-B, NPOx-Et, Nifurtimox y Benznidazol en
un rango de concentraciones de 0.25 - 8 mM utilizando un control negativo de DMSO
2.5% durante 60 min a temperatura ambiente La viabilidad se monitoreó por medio de una
tinción con diacetato de fluoresceína (FDA) y yoduro de propidio (PI). La solución patrón de
FDA se preparó al disolver 5 mg/mL de acetona. El FDA es un éster no polar que pasa a
través de las membranas celulares y es hidrolizado por esterasas intracelulares
produciendo fluorescencia. La fluoresceína es un compuesto polar que se acumula dentro
de las células, al pasar muy lentamente a través de la membrana de las células vivas y
exhibe una fluorescencia verde cuando es excitada por luz azul. Por otro lado, el PI se
intercala en los ácidos nucleicos para formar un complejo fluorescente rojo brillante (Jones
y Senft, 1985). La membrana no es permeable a este compuesto, por lo que el PI solo
puede atravesarla cuando ésta ha perdido su permeabilidad, es decir cuando la célula ya
no es viable. Así, los epimastigotes viables se observaron verdes y los muertos o no
viables, rojos.
La solución de trabajo de FDA se preparó en fresco al adicionar 0.04 mL de la solución
patrón en medio de cultivo BHI suplementado. Un miligramo de PI se disolvió en 50 mL de
BHI suplementado. Para teñir los epimastigotes, se adicionaron 0.1 mL de la solución de
trabajo de FDA (2 μg) y 0.03 mL (0.6 μg) de PI directamente a la suspensión de
epimastigotes. Las células fueron teñidas por 3 min a temperatura ambiente.
Posteriormente se tomó una alicuta de 5 μl y se colocó en un portaobjetos y cubreobjetos
limpios, para ser observado en el microscopio equipado con epi-fluorescencia, con lámpara
de halógeno de 100 W y filtro de excitación de 450-490 nm (azul). Este filtro permitió que
los epimastigotes con fluorescencia verde y roja pudieran ser vistos simultáneamente. Se
20
contó el número de epimastigotes viables y no viables en 25 campos, con una aumento de
40X para determinar el número de epimastigotes viables por ml y obtener el porcentaje de
viabilidad. Tomando como 100% el control de DMSO. Los resultados se analizaron
estadísticamente mediante ANOVA y la prueba post-ANOVA para comparaciones múltiples
de Dunnett, utilizando un nivel de significancia (α) de 0.05.
5. RESULTADOS
5.1 Síntesis y caracterización fisicoquímica del éster bencílico del ácido N-propil oxámico
De la síntesis del éster bencílico del ácido N-propil oxámico se obtuvo un producto puro
blanco cristalino con un punto de fusión de 50-55°C. La reacción presentó un rendimiento
del 85%. La hidrólisis posterior de este producto, produjo el ácido N-propil oxámico con un
rendimiento de 82% y un punto de fusión de 105-106 ºC.
El espectro de IR del éster bencílico del ácido N-propil oxámico muestra los grupos
funcionales del compuesto que corresponden a los picos más significativos. Los espectros
RNM de hidrógeno y de RMN de carbono fueron interpretados y para corroborar la
presencia del compuesto deseado se compararon con los espectros hipotéticos obtenidos
utilizando el software ACD/predictor. En estos últimos, podemos observar que a los
hidrógenos o carbonos presentes en la molécula se les asigna un número, los cuales nos
ayudan a visualizar sus picos representativos en el espectro.
Las comparaciones de ambos espectros pueden observarse en la tabla 1 y 2 las cuales
corresponden tanto al los espectros experimentales como hipotéticos obtenidos para
RMNH y RMNC, respectivamente. Como podemos observar en estas tablas, los espectros
obtenidos experimentalmente concuerdan en su totalidad con los hipotéticos, es decir,
presentan los picos representativos del compuesto en las mismas zonas del espectro, de
lo cual podemos concluir que el compuesto fue correctamente sintetizado y con alto grado
de pureza ya que no hay señales que nos indiquen la presencia de algún contaminante.
5.2 Determinación del máximo de parasitemia de las cepas INC-5 y NINOA de T. cruzi
La determinación del máximo de parasitemia se realizó con la finalidad de obtener el día
donde se presenta la concentración más alta de tripomastigotes sanguíneos para realizar
los ensayos de viabilidad y para la conservación de la cepa. Se monitoreó la concentración
de tripomastigotes sanguíneos tomando una alícuota de 5 μl de sangre a partir de la vena
caudal de la cola del ratón parasitado, cada 3 días durante 75 días. Se obtuvieron
diferentes comportamientos en la parasitemia para cada cepa. El máximo de la parasitemia
21
para la cepa NINOA se detectó a los 23 días (Gráfica 1) y para la cepa INC-5, el máximo
se presentó en el día 26 (Gráfica 2), es notorio que la cepa NINOA la cual proviene de un
caso en fase aguda los niveles de parasitema son aproximadamente del doble que la cepa
INC-5 que proviene de un aislado en fase crónica. La tabla 3 resume las características
que presenta cada cepa en su curva de parasitemia.
5.3 Estudio del NPOx-B, NPOx-Et, Nf y Bz sobre la viabilidad de tripomastigotes sanguíneos
El efecto del NPOx-B sobre la viabilidad de tripomastigotes sanguíneos para la cepa
NINOA y INC-5 se muestra en la gráfica 3 y 4, respectivamente, así como su comparación
con el efecto producido por el NPOx-Et y los fármacos de referencia Benznidazol y
Nifurtimox. Como podemos observar, la cepa que resultó más sensible a todos los
compuestos fue la cepa NINOA. El NPOx-B alcanza su mayor efecto tripanomicida a la
concentración más alta utilizada en este estudio (8 mM) produciendo la muerte de los
tripomastigotes en prácticamente un 100%. Este efecto es proporcional a la concentración
siendo de 64%, 42%,33 %, 21%, 14.3% para las concentraciones de 4m M ,2m M, 1m M,
0.5 mM, 0.25 mM respectivamente. Se observan prácticamente los mismos porcentajes de
viabilidad debido al efecto del NPOx-Et: 96%, 59%, 45%, 42%, 33% y 10% en un rango de
concentraciones de 0.25-8 mM, respectivamente. Resultados similares se obtuvieron para
la cepa INC-5, pero esta cepa resultó ser menos susceptible a los compuestos probados.
Se comparó el efecto de los compuestos a las diferentes concentraciones mediante un
análisis de varianza.
En lo que se refiere a la movilidad de los tripomastigotes, ésta se ve afectada, sobre todo
en aquellos tratados con la concentración 4 mM del NPOx-B, lo que no sucede en el caso
con el Benznidazol y Nifurtimox. Los tripomastigotes tratados con NPOx-B reducen
considerablemente la movilidad del flagelo en comparación con el control. Otro aspecto es
la morfología de los tripomastigotes, la cual se ve modificada sobre todo a la concentración
de 4 mM como se puede observar en la figura 13 junto con la aparición de vacuolas,
mientras que los tripomastigotes que fueron sometidos a los tratamientos con Nifurtimox y
Benznidazol no presentaron ningún cambio en su morfología (resultados no mostrados), se
obtuvieron resultados similares para ambas cepas y la figura 13 nos muestra fotografías
representativas de esta evaluación.
22
Tabla 1. Tabla comparativa de las señales obtenidas en el espectro de resonancia magnética nuclear de hidrógeno (RMNH) experimental y el obtenido por el programa ACD predictor, para la corroboración de la estructura química del éster bencílico del ácido N-propil oxámico. En la tabla se muestra el intervalo en el que aparecen las
señales y el grupo funcional al que pertenece cada una de estas señales. R corresponde al
fragmento restante de la estructura química del NPOx-B y R1 ≠ R2.
Rango de señales en el espectro de RMN de hidrógeno (ppm)
Espectro experimental
Espectro obtenido con el programa ACD/predictor
Protones correspondientes
7.32-7.37
7.32-7.38 H
HH
H
R
H
5.27
5.28 R
H
H
3.25-3.27
3.22-3.26 NH R2R1
H
H
1.51-1.56
1.48-1.56 CH3
H
HR
0.86-1.0
0.89-0.93 H
H
HR
23
Tabla 2. Tabla comparativa de las señales obtenidas en el espectro de resonancia magnética nuclear de carbono (RMNC) experimental y el obtenido por el programa ACD predictor, para la corroboración de la estructura química del éster bencílico del ácido N-propil oxámico. En la tabla se muestra el
intervalo en el que aparecen las señales y el grupo funcional al que pertenece cada
una de estas señales. R corresponde al fragmento restante de la estructura química
del NPOx-B y R1 ≠ R2.
Rango de señales en el espectro de RMN de carbono (ppm)
Espectro experimental
Espectro obtenido con el programa ACD/predictor
Carbonos correspondientes
156.4-160.7
157.4-159.9
R1R2
O
O
128.8-134.5
127.9-134.5 R
68.6
68.6 CH2
R
41.7
40.56 CH2
R2NH
R1
22.5 22.4
R1 CH2
R2
11.38 11.35
CH3
R
Tabla 3. Caracterización biológica de las cepas de T. cruzi empleadas en las pruebas de evaluación de los compuestos.
CARACTERISTICA NINOA INC-5
Curvas de
parasitemia en
ratón
Periodo prepatente 13 días 12 días
Pico máximo de parasitemia 23 días 26 días
Periodo patente 63 días 64 días
24
0 10 20 30 40 50 60 70 800.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Tiempo (días postinoculación)
Trip
omas
tigot
es s
angu
íneo
s/ m
l (X1
07 )(p
aras
item
ia)
Gráfica 1. Curva de parasitemia de ratones infectados con la cepa NINOA. El máximo de la parasitemia es el señalado por una flecha, el cual se encontró en el día 23. n=3
0 10 20 30 40 50 60 70 800.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
Trip
omas
tigot
es s
angu
íneo
s/m
l (X1
06 )(p
aras
item
ia)
Tiempo (días postinoculación)
Gráfica 2 Curva de parasitemia de ratones infectados con la cepa INC-5. El máximo de la parsitemia es el señalado por una flecha, el cual se encontró en el día 26. n=3.
25
a b c d0
20
40
60
80
100
(a) NPOx-B(b) NPOx-Et
(d) Bz(c) Nf
Control
****
**
**
***
a b c d a b c d a b c d a b c da b c d0.25 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0
Concentración (mM)
Via
bilid
ad±
DS
(%)
Grafica 3. Efecto de diferentes compuestos sobre la viabilidad de tripomastigotes sanguíneos de la cepa NINOA, después de 24 h de incubación * p < 0.05, **p < 0.001, n=4.
0
20
40
60
80
100(a) NPOx-B(b) NPOx-Et
(d) Bz(c) Nf
Control
**
****
**
* **
a b c d a b c d a b c d a b c d a b c d a b c d
0.25 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0
*
Concentración (mM)
Viab
ilida
d±
DS
(%)
Grafica 4. Efecto de diferentes compuestos sobre la viabilidad de tripomastigotes sanguíneos de la cepa INC-5 tras 24 h de incubación.* p < 0.05, **p < 0.001, n=4.
26
CONTROL NPOx-B 4mM Figura 13. Morfología de tripomastigotes sanguíneos de la cepa NINOA. Es notorio la perdida de la morfología característica acompañada de un incremento en el volumen y la formación de vacuolas (señaladas con flechas) en los tripomastigotes sanguíneos tratados con NPOx-B durante 24 h. Observación al microscopio óptico un aumento de 100X. Resultados similares se obtuvieron para ambas cepas.
5.6 Estudio in vitro NPOx-B, NPOx-Et, Nf y Bz del sobre la viabilidad de epimastigotes en cultivo.
Para la determinación de la viabilidad de epimastigotes sanguíneos después del
tratamiento con NPOx-B, NPOx-Et Nifurtimox y Benznidazol se utilizó la técnica de doble
tinción de FDA y PI que permite visualizar simultáneamente células viables (verde) y
células no viable (rojo). En la figura 14 se muestran algunas fotos representativas del
efecto del NPOx-B sobre la viabilidad de epimastigotes de la cepa INC-5, donde podemos
observar la doble tinción con FDA y PI. La figura 14A pertenece al control, los
epimastigotes que se observan en el campo sólo han sido teñidos por el FDA lo que indica
que se encuentran viables. En la figura 14B se pueden observar epimastigotes viables y
aquellos que han sido teñidos por el PI, los cuales son no viables, estos fueron sometidos
a un tratamiento con NPOx-B a una concentración de 1 mM. Por último, figura 14C cuyo
tratamiento fue de 8 mM de NPOx-B los epimastigotes que se observan en el campo se
encuentran no viables.
A B
CONTROL NPOx-B 1mM
C
27
NPOx-B 8mM Figura 14. Efecto del NPOx-B sobre la viabilidad de epimastigotes de la cepa INC-5 después 30 min. de tratamiento a temperatura ambiente. Se utilizó la tinción de diacetato de fluoresceína (FDA) / yoduro de propidio (PI). (A) control de DMSO, (B) tratamiento con NPOx-B 1mM y (C) tratamiento con NPOx-B 8 mM. Observaciones en el microscopio de epi-fluorescencia, con lámpara de halógeno de 100 W y filtro de excitación de 450-490 nm (azul), a un aumento de 40X Los resultados del efecto de los compuestos sobre la viabilidad de epimastigotes se
muestran en la gráfica 5 para la cepa NINOA y gráfica 6 para la cepa INC-5, como
podemos observar la viabilidad de los epimastigotes disminuye conforme aumenta la
concentración de los compuestos, siendo el compuesto más efectivo sobre ambas cepas el
NPOx-B y el que presentó un menor efecto el Benznidazol. Como sucedió con los
tripomastigotes sanguíneos, la cepa más susceptible sobre todo al NPOx-B fue la cepa
NINOA. Se comparó el efecto de los compuestos a las diferentes concentraciones. La cepa
INC-5 resultó menos sensible a los fármacos de referencia, pero no al NPOx-B un análisis
de varianza (ANOVA) y la prueba post-ANOVA de Dunnett para comparaciones múltiples
contra un control, tomando un α=0. 05.
0
20
40
60
80
100
Control(a) NPOx-B
(c)Nf(d)Bz
(b) NPOx-Et
** **** ** ** **
a b c d a b c d a b c d a b c d a b c d a b c d0.25 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0
Concentración (mM)
Viab
ilida
d±
DS
(%)
Grafica 5. Efecto de diferentes compuestos sobre la viabilidad de epimastigotes de la cepa NINOA tras 60 min de incubación. * p < 0.05, **p < 0.01, n=4.
28
0
20
40
60
80
100
Control(b)NPOx-B
(c)Nf(d)Bz
0.25 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0
*
** ** ** ****
(a)NPOx-Et
a b c d a b c d a b c d a b c d a b c d a b c d
Concentración (mM)
Via
bilid
ad±
DS
(%)
Grafica 6. Efecto de diferentes compuestos sobre la viabilidad de epimastigotes de la cepa INC-5 tras 60 min de incubación.* p < 0.05, **p < 0.01, n=4. 6. DISCUSIÓN
Los estudios sobre el posible efecto tripanomicida del NPOx-B se llevaron a cabo en forma
comparativa con el Nf, Bz y NPOx-Et un profármaco con efecto tripanomicida previamente
obtenido en nuestro laboratorio (Chena et al., 2004).
El efecto sobre la viabilidad de tripomastigotes sanguíneos fue proporcional a la
concentración del NPOx-B y NPOx-Et sobre las cepas INC-5 y NINOA en un intervalo de
concentraciones de 0.25 a 8 mM. La cepa NINOA fue la más sensible al tratamiento con
NPOx-B, NPOx-Et y Nf ya que con la concertación más alta (8 mM) el efecto tripanomicda
fue prácticamente del 100%. Por otro lado, la efectividad del Bz fue la más baja comparada
con los otros compuestos, incluso a la concentración más alta (8 mM).
Es importante mencionar que tanto el Nifurtimox como el Beznidazol presentan efectos
altamente tóxicos en periodos prolongados de administración (Teixeira et al., 1994),
además de la resistencia natural de algunas cepas a estos fármacos que se ha sugerido
como un factor importante para la baja efectividad de estos compuestos en un alto
porcentaje de pacientes chagásicos (Tsuhako et al., 1991). Algunos aspectos como
variaciones en la absorción y metabolismo de fármacos como el Bz y Nf están implicados
en la resistencia de algunas cepas de T. cruzi a los efectos quimioterapéuticos de estos
fármacos, de acuerdo con Brener la resistencia de este parásito a estos fármacos varia del
0% al 100% y la efectividad del tratamiento en pacientes chagásicos depende
primordialmente de la cepa (Brener, 1984). La cepa INC-5 fue menos sensible a los
compuestos utilizados, observándose que los efectos del Nifurtimox fueron los más bajos y
29
el compuesto más efectivo para la disminución en la viabilidad de los tripomastigotes
sanguíneos fue el NPOx-B, cabe señalar que los efectos terapéuticos del Nf y el Bz a las
infecciones chagásicas humanas, presentan diferencias notables, en gran parte, por la
existencia de cepas de T. cruzi con distinta susceptibilidad o resistencia a los fármacos.
(Neal y van Bueren, 1988)
En cuanto al efecto tripanomicida del NPOx-B, éste se ve también reflejado en la
disminución de la movilidad de los tripomastigotes lo que indica una reducción
considerable en la producción de energía debida a la inhibición de la α-HADH II. Esta
disminución en la movilidad de los tripomastigotes ya habían sido reportados para
Trypanosoma brucei al ser sometido a la presencia de un inhibidor de otra enzima de la
ruta glicolítica; la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, ya que al igual que T. cruzi, este
obtiene casi toda su energía de la glicólisis (Aronov et al., 1999). Las implicaciones que
presenta la disminución en la movilidad del parásito van desde la disminución en el grado
de invasión, la locomoción intracelular, la colonización de tejidos hospederos, la
diseminación del parasito dentro del hospedero, hasta la movilidad dentro del tracto
digestivo del vector para la proliferación del parásito (Hill, 2003) por lo que, un compuesto
que intervenga en la inhibición del metabolismo energético, presentaría un alto potencial
para el tratamiento de la enfermedad de Chagas.
Al tratar los tripomastigotes con NPOx-B también observamos cambios morfológicos como
aumento en el tamaño de los tripanosomas y una gran vacuolización, que se interpreta
como una evidencia de la entrada del NPOx-B, el cual al ser hidrolizado en el
correspondiente ácido, debido a la polaridad de este último tampoco podrá salir del
parásito, por lo tanto se acumulará, presentando un efecto osmótico con la consecuente
entrada de agua, que se ve reflejado en un aumento del volumen de los tripomastigotes.
Este tipo de fenómenos que se presentan cuando el parásito esta sujeto a un medio
hiposmótico han sido anteriormente descritos para T. cruzi particularmente en el paso del
parasito del insecto vector al hospedero vertebrado (Rohloff et al., 2003). Además este
efecto del NPOx-B pone de manifiesto la hidrólisis del compuesto por esterasas
previamente descritas en este parásito por otros investigadores (Aldunate et al., 1987),
Cabe mencionar que durante el tratamiento con NPOx-Et también se han informado
cambios de morfología de tripomastigotes sanguíneos (Zaragoza, 2005). De igual modo, al
inhibir una enzima crucial de la glicólisis en T, brucei se presentan también cambios
morfológicos evidentes en la forma circulante de T. brucei (Aronov et al., 1999)
Comparando el efecto tripanomicida del NPOx-B con el del NPOx-Et, es mayor el
producido por el éster bencílico sobre todo en la cepa INC-5 lo que puede deberse a que
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este producto por ser más hidrofóbico, probablemente atraviesa más fácilmente las
membranas por difusión simple y al existir más moléculas en el interior del parásito
aumentará el efecto tripanomicida. En cuanto a la polaridad de este compuesto también se
pueden mencionar algunas ventajas, ya que los compuestos menos polares son mas
difícilmente eliminados del organismo, con lo cual, aumentara la vida media del compuesto
(Goodman y Gilmans, 2001). Probablemente al disminuir la polaridad también sea mas
factible que el compuesto llegue a los amastigotes intracelulares que se presentan en la
fase crónica de la enfermedad de Chagas (Tanowitz et al., 1992) y que son uno de los
factores que impiden que la quimioterapia existente sea efectiva en esta fase, ya que los
fármacos han sido diseñados para ser mas efectivos sobre tripomastigotes sanguíneos
que sobre otros estadios (Urbina, 2002). Por otro lado existen reportes del efecto del
NPOx-Et sobre nidos de amastigotes en músculo cardiaco y esquelético en un modelo
murino (Zaragoza, 2005), en ese trabajo el compuesto se administró a los ratones por vía
oral y se presentó una reducción en la presencia de nidos de amastigotes en ambos tipos
de músculo, como el NPOx-B fue mejor agente tripanomicida que el NPOx-Et, se esperaría
que el NPOx-B, presente un mejor efecto tripanomicida sobre amastigotes intracelulares.
Es importante mencionar que las carboxiesterasas se clasifican en dos grandes grupos (A
y B). Las carboxiestrasas de tipo A presentan actividad preferentemente sobre ésteres
aromáticos, mientras que las de tipo B lo hacen sobre ésteres alifáticos (Bergmeyer, 1984).
Probablemente el NPOx-B se estén hidrolizando por ésterasas de tipo A y el NPOx-Et por
las de tipo B y la actividad de estas esterasas presentes en T. cruzi sea diferente, lo que
explicaría porque se obtiene resultados diferentes con estos dos compuestos sobre la
viabilidad de tripomastigotes sanguíneos.
En el caso de los epimastigotes podemos observar que el NPOx-B fue mas efectivo
reduciendo la viabilidad de los epimastigotes de ambas cepas, incluso fue mas potente que
sobre los tripomastigotes sanguíneos. En los epimastigotes el efecto tripanomicida de los
fármacos de referencia Bz y Nf fue muy limitado y este efecto no aumenta con la
concentración del compuesto sino que presenta un máximo, este efecto puede deberse a
que este compuesto que es capaz de atravesar la membrana por difusión simple en ambos
sentidos, sin embargo, este flujo depende del gradiente de concentración y en cuanto la
concentración intracelular del fármaco se nivela con la extracelular, el efecto tripanomicida
llegará a un máximo, mientras que en el caso de los ésteres derivados del ácido oxámico ,
al ser hidrolizados dentro del parásito recuperan su polaridad, la concentración intracelular
del ácido N-propil oxámico irá en aumento, con el consecuente aumento del efecto
tripanomicida, conforme aumenta la concentración del compuesto.
31
Las diferencias entre la disminución de la viabilidad en epimastigotes debida a la presencia
de algunos fármacos, comparada con la producida en tripomastigotes ya ha sido
ampliamente reportada, para una gran cantidad de compuestos y extractos o fracciones,
de plantas, aunque los datos son variables, la mayoría de los reportes sugiere que los
epimastigotes necesitan concentraciones mas altas de un determinado compuesto para
que se presente el mismo efecto tripanomicida (Jímenez et al., 2005; Faundez et al., 2005;
Abe et al., 2005).
Las diferentes respuestas de T. cruzi a los fármacos sugieren la existencia de diferencias
moleculares entre distintas cepas de este parásito, entre estas propiedades moleculares se
encuentran las dependientes de isoenzimas y marcadores genéticos (Nirde et al., 1995).
Se debe agregar que las poblaciones silvestres de T. cruzi pueden contener formas
susceptibles y resistentes a los quimioterapéuticos antichagásicos, de manera que la
destrucción de las formas susceptibles por los fármacos lleva a la producción de formas
resistentes (Murta et al., 1998). Los epimastigotes resistentes, transmiten esta propiedad a
su vez a los amastigotes, de esta manera la resistencia al fármaco se hace extensiva a
todos los parásitos infectantes (Nozaki et al., 1996).
Por otro lado las diferencias de polaridad entre los compuestos utilizados, sobre todo
NPOx-B y NPOx-Et, de los cuales el segundo es menos hidrofóbico que el primero,
aunado a las diferencia en la composición de lípidos de la membrana plasmática de los
parásitos en diferentes estadios del ciclo de vida de T. cruzi e incluso las diferencias en el
mismo estadio entre diferentes cepas (Kaneda et al., 1986; De Souza et al., 1978),
probablemente sea un factor determinante para las diferencias en la actividad
tripanomicida de estos compuestos entre epimastigotes y tripomastigotes o entre
diferentes cepas en un mismo estadio.
7. CONCLUSIONES • Los estudios in vitro sobre la viabilidad de tripomastigotes sanguíneos de la cepa INC-5
demuestran que el éster bencílico del ácido N-propil oxámico presenta un significativo
efecto tripanomicida, incluso mayor que los producidos por los fármacos de referencia,
Benznidazol y Nifurtimox y el éster etílico del ácido N-propil oxámico. • Los estudios in vitro del éster bencílico del ácido N-propil oxámico sobre la viabilidad
de tripomastigotes sanguíneos de la cepa NINOA demuestran que, esta cepa es más
sensible a este compuesto en comparación con la cepa INC-5 y la disminución en la
viabilidad de esta cepa es también mayor que la producida por Benznidazol.
• El efecto tripanomicida del NPOx-B se ve reflejado no sólo en la disminución de la
movilidad sino también en el aumento de tamaño y probablemente en la formación de
32
vacuolas de los tripomastigotes sanguíneos de la cepa INC-5 y NINOA, lo cual es un
indicio de que el profármaco penetra y es hidrolizado dentro del parásito
• En los epimastigotes el éster bencílico del ácido N-propil oxámico también mostró un
excelente efecto tripanomicida en las cepas estudiadas (INC-5 y NINOA), incluso
mayor que el producido el éster etílico del ácido N-propil oxámico y los producidos por
los fármacos de referencia, Nifurtimox y Benznidazol
• Las diferencias en el efecto tripanomicida encontrado para epimastigotes y
tripomastigotes debidas tanto al el éster bencílico del ácido N-propil oxámico, como el
el éster etílico del ácido N-propil oxámico, Nifurtimox y Benznidazol, se pueden deber a
factores tan diversos como propiedades fisicoquímimicas del compuesto, diferencias
en la composición de lípidos de membrana en cada uno de los estadios de T. cruzi,
hasta divergencia genética entre cepas.
• En virtud de los resultados obtenidos sobre el efecto tripanomicida in vitro el éster
bencílico del ácido N-propil oxámico, es imperativo continuar con los ensayos in vivo ya
que se perfila como un posible fármaco mas efectivo que los existentes para el
tratamiento de la enfermedad de Chagas.
8. REFERENCIAS Abe F., Nagafuji S., Okawa M., Kinjo J., Akahane H., Ogura T., Martinez M., Chilpa R. 2005.
Tryopanocidal constituents in Plants 5. Evaluation of some mexican plants for their trypanocidal activity and active Constituents in the seeds of Persea americana. Biol Pharm Bull 28(7):1314-1317.
Andrade S.G., Magalhães J.B., Pontes A.L. 1985. Evaluation of chemotherapy with benznidazole and nifurtimox in mice infected with Trypanosoma cruzi strains of different types. Bulletin of the World Health Organization. 63: 721-726,
Aldunate J., Repetto Y., Letelier M., Morello A. 1987. The carboxilesterases of Trypanosoma cruzi. Comp. Bichem. Physiol. 13:67-71.
Aronov M.A,, Suresh S., Buckner S.F., Van Voorhis C.W., Verlinde C.L., Opperdoes R. F., Hol G. W., Gelb H.M. 1999. Structure-based design of submicromolar, biologically active inhibitors of trypanosomatid glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Proc Natl. Academy Sci USA. 96:4273-4278.
Bakker B.M., Westerhoff H. V., Opperdoes F.R., Michaels P.M. 2000. Metabolic control analysis of glycolisis in trypanosomes as an approach to improve selectivity and effectiveness of drugs. Mol Biochem Pharmacol. 106:1-10.
Becerril F.A 1999. La clonalidad de Trypanosoma cruzi y su relación con la enfermedad de Chagas. Boletín de Educación Bioquímica .18:60-65.
Bergmeyer U. H. 1995. Methods of Enzymatic Análisis. Third edition. Vol. 3 Enzymes 1:Oxidoreductases, Transferase. Capitulo 2.
Brain L. 1992. The epidemiological significance of chagas disease in woman. Parasitology Today. 87:73-79.
Brian Pagenkopf. 2005. A Software Review J. Am. Chem. Soc 127(9), 3232-3232. Brener Z., Cançado J.R., Galvão L.M., da Luz Z.M., Filardi L.S., Pereira M.E., Santos L.M.,
Cançado C.B.1993. An experimental and clinical assay of ketoconazole in treatment of Chagas disease . Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 88:149-153.
Brener Z. 1973. Biology of Trypanosoma cruzi. Ann Rev Microbiol 27: 347-382.
33
Brener Z. 1984. Redent advances in chemotherapy of Chagas’ desease. Mem Inst Oswaldo Cruz. 79: 149-155.
Briones M.S., Souto R.P., Stolf B.S., Zingales B. 1999. The evolution of two Trypanosoma cruzi subgroups inferred from rRNA genes can be correlated with the interchange of American mammalian faunas in the Cenozoic and has implications to pathogenicity and host specificity. Biochem Parasitol.104:219-232
CDC. Centers for Disease Control and Prevention Actualizado el 21 de septiembre de 2004.http://www.cdc.gov.
Conn E. E. and Stumpf K.P.1976. Outlines of Biochemistry. 4°ed.John Wiley and Sons: 298pp. Coronel C.E., Roval L.E., Gerez de Burgos N.M., Burgos C., Blanco A. 1981. Properties of α-
hydroxyacid dehydrogenase isozymes from Trypanosoma cruzi. Mol Biochem Parasitol. 4:29-38
Coura R.J., de Castro L.S. 2002. A critical Review on Chagas Disease Chemotherapy. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro. 97(1):3-24.
Chena A.M., Elizondo J.S., Rodríguez P.L., Torres N.B., Baeza R.I., Wong R.C. 2004.Trypanosoma cruzi: Inhibition of α-hydroxyacid dehidrogenase isozyme II by N-allyl and N-propyl oxamates and their effects on intact epimastigotes. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro. 99 (8): 831-837.
Chena M.A, Elizondo S., Rodríguez L., Nogueda B, Baeza I., Wong C. 2005. Trypanocidalactivity of N-isopropyl oxamate on cultured epimastigotes and murine trypanosomiasis using different Trypanosoma cruzi strains. J. of Enzyme inhibition and medical chemistry. 20(2):189-197.
Chizuka T., Yoshiro I., Mayu S., Hiroyuki M., Shino T., Yusaku N., Yusuke T. Takeshi S., Kazuhito A.,Takahashi, and Hayao T. 2003. Conversion of Lactobacillus pentosus D-Lactate Dehydrogenase to a D-Hydroxyisocaproate Dehydrogenase through a Single Amino Acid Replacement. Journal of Bacteriology. 185(16). 5023–5026.
Cruz R. A., Pickering L.M. 2005. Presentación de la base de datos “CHAGMEX® 1928-2004”, sobre la Enfermedad de Chagas en México, con un enfoque biológico, geográfico y socioeconómico. 1-16.
Dantas A.P. 2000. Efeito de agentes anti-microtúbulos e de derivados de naftoquinonas sobre Trypanosoma cruzi. MSC Thesis. Instituto Oswaldo Cruz –Fiocruz. Rio de Janeiro , XIV:204 pp.
De Souza W., Martínez P., Gonzáles R. 1978. The cell surface of Trypanosoma cruzi cytochemestry and Freeze –fracture. J cell Sci . 33: 285-299.
Dias J. C. P. 2000. Epidemiología. In Z. Brener, Z. Andrade, M. Barral-Netto. Trypanosoma cruzi e Doença de Chagas. 2° ed., Guanbara Koogan. Rio de Janeiro: 48-74pp.
Diaz de Toranzo E.G. Castro J.A., Frank de Cazzulo B.M., Cazzulo J.J. 1988. Interaction of
benznidazole reactive metabolits with nuclear and kinetoplastic DNA, proteins and lipids from Trypanosoma cruzi. Experimentia 44:880-881.
Dixon M and Webb EC. 1979. Enzyme inhibitors and activation. Enzymes 3rd Longman Group. Ltd. London. pp. 332-381.
DoCampo R., Moreno S.J. 1986. Free radical metabolism of antiparasitic agents. Fed Proceed. 45:2471-2476.
DoCampo R. 1990. Sensitivity of Parasites to Free Radical Damage by Antiparasitic Drugs. Chem Biol Interactions 73(1): 27-30.
Elizondo J.S. 2003. Desarrollo de análogos del oxamato como inhibidores selectivos de la α-hidroxiácido deshidrogenasa de Trypanosoma cruzi con posible actividad tripanomicida. Tesis para obtener el grado de doctor en Ciencias. Escuela Nacional de Ciencias Biológicas. IPN.
Fairlamb A.H. 1999. Future prospects for the chemotherapy of Chagas' disease. Medicina. 59 (supl II):179-187.
Faundez M., Pino L., Letelier p., Ortiz c., López R., Seguel C., Ferreira J., Pavani M., Morello A., Maya J. 2005. Buthionine Sulfoximine Increases the Toxicity of Nifurtimox an Benznidazol to Trypanosoma cruzi. Antimicrobial agents an Chemotherapy. 49(1):126-130.
Filardi L.S., Brener Z. 1984. A rapid method for testing for testing in vivo de suseptibility of different strains of Trypanosoma cruzi to active chemotherapeutic agents. Mem Inst Oswaldo Cruz. 79:221-225
Fuhram S. A. and Joiner K. A. 1989. Complement evasion by parasites. Exp. Parasitol., 68, 474–481.
Goodman and Gilman’s. 2001. The Pharmacological Basis of Therapeutics. Tenth Ed. McGraw-Hill Cap1.
34
Guzmán B.C. 2001. Epydemiology of Chagas deisease in Mexico: an update Trens in Parasitol. 17:372-376.
Guzmán B. C, García G.L., Floriani V. J., Guerrero M.S., Torres C. M., Ramírez M. C. Velasco C. O. 1998. Riesgo de transmisión de Trypanosoma cruzi por transfusión de sangre en México. Rev Panam Salud Pública. 4(2): 94-99.
Gerez de Burgos N.M., Blanco A., Paulone I., Segura E. L. 1978. Actividad de la α-hidroxiácido deshidrogenasa de Tripanosoma cruzi. Acta Physiol Latinoam. 26:10-19.
Golotvin S.S., Vodopianov E., Lefebvre B.A., Williams A.J., Spitzer T.D. 2006. Automated structure verification based on 1H NMR prediction. Magn Reson Chem. 44(5):524-38.
Hall B. F. and Joiner K. A. 1991. Strategies of obligate intracellular parasites for evading host defences. Parasitol. Today, 12:A22–A27.
Hill L. K. 2003. Biology and Mechanism of Trypanosoma cell motility. Euckariotic Cell. 2(2): 200-208 Hoare C.A. y Wallace F.G. 1966. Development stage of trypanosomatid flagellates: A New
terminology. Nature. 244: 69-67. Jiménez V., Bregio S., Giordano O., Tonn C., Sánchez M., Burgos M., Sosa M. 2005. The
trypanocidal effect of sesquiterpene lactones helenalin and mexican on cultured epimastigotes. J. Parasitology 91(1):170-174.
Jones K.H. and Senft J.A. 1985. An Improved method to determine cell viability by simultaneous staining with fluorescein diacetate-propidium iodide. J Histochem Cytochem. 33: 77-79.
Kaneda Y., Nagakura K., Goutsu T. 1986. Lipid composition pf three morphological stages of T. Cruzi. Comp bichem Physiol. 83(3):533-536.
Karabit M.S., Juneskans O.T., Lundgren P. 1986. Studies on the evaluation of preservative efficacy--II The determination of antimicrobial characteristics of benzylalcohol. J Clin Hosp Pharm. Aug: 11(4):281-9.
Lanzer M., Gross U., Moll H. 1997. Mechanisms of parasite persistence and Immune evasion. Parasitology Today 13:1-3.
Leguizamon M.S., Mocetti E., Garcia Rivello H., Argibay P., Campetella O. 1999. Trans-sialidase from Trypanosoma cruzi induces apoptosis in cells from the immune system in vivo. J. Infect. Dis.180, 1398–1402.
Ley V., Andrews N. W., Robins E. S., Nussenzweig V. 1990. The exit of Trypanosoma cruzi from the phagosome is inhibited by raising the pH of acidic compartments. Journal of Exp Med. 171(2):401-13.
Lira R., Contreras L.M., Santa Rita R., Urbina J.A. 2001. Mechanism of action of anti-proliferative lysophospholipid analogues against the protozoan parasite Trypanosoma cruzi: potentiation of in vitro activity by the sterol biosynthesis inhibitor ketoconazole. J Antimicrob Chemother. 47(5):537-46.
Marr J.J. 1991. Purine analogs as chemotherapeutic agents in Leshmaniasis an American trypanosomiasis. J. Lab. Clin. Med. 118:11-119.
Metzler E.D. 2001. Biochemestry: The chemical Reactions of Living Cells. 2°ed. Harcourt Academic Press. U.S.A.pp 510.
Montamat E. E, Arauso S. S, Blanco A. 1987. Subcellular localization of leucine aminotransferase and α-hydroxiacid dehydrogenase in Trypanosoma cruzi. Mol Biochem Parasitol. 22:185-93.
Moreno B., Urbina J.A., Oldfield E., Bailey B.N., Rodrigues C,O., DoCampo R. 2000. 31P NMR spectroscopy of Trypanosoma brucei, trypanosoma cruzi, and leishmania major. Evidence for high levels of condensed inorganic phosphates. J Biol Chem. 275(37):28356-62.
Murta S.F., Gazzinelli R.T., Brener Z., Romanha A. J. 1998. Mollecular characterization of succeptible an naturally resistant strainds of Trypanosoma cruzi to benznidazole an nifurtimox . Mol Chem Prasitology. 93:203-214
Neal R.A., van Bueren J.1988. Comaparative studies of drug susceptibility of five strains of Trypanosoma cruzi in vivo and in vitro. Trans Soc Trop Med Hyg. 82: 709-714.
Nirdé P., Larroque C. Barnabé C. 1995. Drug resistant epimastigote of Trypanosoma cruzi and persintance of this phenotype after differentation into amastigotes. CRAcadSciParis, science de la vie. 318:1239-44
Norris K. A. 1998. Stable transfection of Trypanosoma cruzi epimastigotes with the trypomastigote-specific complement regulatory protein cDNA confers complement resistance. Infect. Immun. 66, 2460–2465.
Nozaki T., Engel J.C., Dvorak J.A. 2006. Cellular and molecular biological analyses of nifurtimox resistance in Trypanosoma cruzi. Am J Trop Med Hyg. 55(1):111-7.
35
OMS. Organización Mundial de la Salud (World –Health organization) 1991. Control of Chagas Disease. Geneva. Technical Report Series; 811: 95pp.
OMS. Organización Mundial de la Salud (World –Health organization). 2002. Report of the Scientific Working Group meeting on Insect Vectors and Human Health Geneva.
OMS. Organización Mundial de la Salud (World–Health organization). 1999. Informe sobre las enfermedades infecciosas Geneva.
Oliveira B. R., Passos F. A., Alves O. R., Romanha J.A., Prado F.M., Filho de S.J, Alves J.R. 2003. In vitro evaluation of the Activity of aromatic Nitrocompounds against Trypanosoma cruzi. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro. 98 (1):141-144.
Opperdoes F. R. 1985. Biochemical peculiarities of trypanosomes, African and South American. Br Med Bull. 41:130-136.
Ouaissi A., Ouaissi M. 2005. Molecular basis of Trypanosome cruzi and Leshmaniainteraction with their host(s): exploitation of immune and defense mechanisms by the parasite leadin to persistence and chronicity , features reminiscent of immune system evasion strategies in cancer disease. Arch immonol Ther Exp., 53,102-114.
Paveto C., Güida C. M., Esteva I.M., Martino V., Coussio J., Flawiá M. M., Torres N.H. 2004. Anti-Trypanosoma cruzi activity of green tea (Camellia sinensis) catenchis. Antimicrobial agents and chemotherapy. 48:69-74.
Pizzi T. 1957. Inmunología de la enfermedad de Chagas. Santiago, Universidad de Chile. Citado en Brener Z. 1962. Terapeutic activity and criterion of cure in mice experimentally infected with Tripanosoma cruzi. Rev. Ins. Med. Trop. Sao Paulo 4:389-396.
Prindle R.F. 1983 Phenolic compounds, p.197. S.S. Block ed. Disinfection, sterilization and preservation, 3rd ed. Lea & Febiger, Philadelphia.
Repetto Y, Aldunate J, Morello A. 1983. Trypanosoma cruzi: carboxylesterase activity on intact epimastigotes. Comp Biochem Physiol B.:76(1):61-4.
Rohloff P., Rodrigues C. O., Docampo R. 2003. Regulatory volume decrease in Trypanosoma cruzi involves amino acid efflux and changes in intracellular calcium. Mol. Biochem. Parasitol. 126(2): 219-230.
Stein H.J., Hutton J.J., Kohler O.P., O’Rouke A.R., Reynolds Y.H., Samuels A. M., Sande A. M., Trier S.J., Zxaifler J.N. 1992. Medicina Interna: enfermedades Infecciosas. 3°ed. Salvat. México. 1591-1592pp.
Stoppani O.M. 1999. Quimioterapia de la enfermedad de Chagas. Medicina (Buenos Aires). 59(2):147-165.
Tanowitz B. H., Kirchhoff L. V., Simon D., Morris S.A., Weiss L.M. and Winttner M. 1992. Chagas’ Disease. Clinical Microbiology Reviews. 5(4): 400-417
Tay J., Lara R., Velazco O., Gutierrez M. 1993. Parasitología Medica. Quinta Edicion, Mendez Editores. 203-227pp.
Teixeira A.R., Calixto M. A., Teixeira M.L. 1994. Carcinogenic activity of antitrypipanosomal nitroarenes in mice. Mut. Res. 305:189-195.
Tyler K.M. and Engman D.M. 2001. The cycle of Trypanosoma cruzi revisited. J. Parasitol. 31:472-481.
Tsuhako M.H., Alves M.J., Colli W., Filardi L.S., Brener Z., Augusto O. 1991. Comparative studies of drug resistente and suceptible strains of Trypanosoma cruzi. Comp Biochem Physiol C. 99:317-321.
Urbina J.A. 2002. Chemotherapy of Chagas disease. Current Pharmaceutical Design. 8: 287-295 Verlinde C. L., Hannaert V., Blonski C., Willson M, Perie J. J, Fothergill-Gilmore L. A,
Opperdoes F. R., Celb M. H., Hol W. G., Michels P. A. 2001. Glycolysis as a target for the design of new anti-trypanosome drugs. Drug Resist Update. 41:130-136.
Zaragoza M. F. 2005. Efecto tripanomicida de tres ésteres etílicos N-sustituidos del ácido oxámico sobre estadios de Trypanosoma cruzi presentes en el huésped vertebrado. Tesis para obtener el grado de Maestro en Ciencias Químico Biológicas.
Zeledon R. 1997. Infection of de Insect host by Trypanosoma cruzi in Atlas of Chagas disease vectors in Americas. Editora Fiocruz. 1:271-278.