ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA SONIA CRISTINA...

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA

SONIA CRISTINA MEDEIROS SANTOS

AVALIAÇÃO DO SISTEMA DESCONTÍNUO ALIMENTADO REPETIDO PARA A PRODUÇÃO DE

2,3-BUTANODIOL A PARTIR DE HIDROLISADO HEMICELULÓSICO DE EUCALIPTO

Lorena – SP

2007

SONIA CRISTINA MEDEIROS SANTOS

Avaliação do sistema descontínuo alimentado repetido para a produção de 2,3-butanodiol a partir de hidrolisado hemicelulósico de eucalipto

Tese apresentada à Escola de Engenharia de Lorena da

Universidade de São Paulo para obtenção do título de

Doutor em Biotecnologia Industrial.

Área de Concentração: Conversão de Biomassa

Orientador: Dr. Arnaldo Márcio Ramalho Prata

Lorena – SP

2007

AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

Catalogação na Publicação Biblioteca Universitária

Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo

Santos, Sonia Cristina Medeiros

Avaliação do sistema descontínuo alimentado repetido para a produção de 2,3-butanodiol a partir de hidrolisado hemicelulósico de eucalipto / Sonia Cristina Medeiros Santos ; orientador Arnaldo Márcio Ramalho Prata. -- 2007

130 f. : fig.

Tese (Doutorado – Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Industrial. Área de Concentração: Conversão de biomassa) – Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo

1. Biotecnologia 2. Hidrolisado hemicelulósico 3. Butanodiol 4. Sistema descontínuo alimentado repetido 5. Klebsiella pneumoniae 6. Inibidores microbianos 7. Fermentação. I. Título.

574.6 - CDU

Sonia Cristina Medeiros Santos

Avaliação do sistema descontínuo alimentado repetido para a produção de

2,3-butanodiol a partir de hidrolisado hemicelulósico de eucalipto.

Tese apresentada à Escola de Engenharia de

Lorena da Universidade de São Paulo para

obtenção de título de Doutor.

Área de Concentração: Conversão de Biomassa

Aprovado em:

Banca Examinadora

Prof. Dr.____________________________________________________________

Instituição:______________________Assinatura:___________________________

Prof. Dr.____________________________________________________________


Prof. Dr.____________________________________________________________


Prof. Dr.____________________________________________________________


Prof. Dr.____________________________________________________________


AGRADECIMENTOS

A Deus que está em tudo!

Ao Rodrigo meu marido e companheiro e as nossas famílias, pelo amor, dedicação,

apoio e força.

Ao meu Orientador Arnaldo Márcio Ramalho Prata, que acreditou no meu trabalho e

esteve sempre presente, pela orientação, amizade e confiança.

Ao meu Padrinho Eduardo Sales, Walter Dias, Ana Maria, Morena, Zé Brazão e a

todos que contribuíram em muito na minha jornada.

A Escola de Engenharia de Lorena/USP pela oportunidade da realização deste

trabalho.

Aos amigos Adriana, Andréa Doria, Andrezinho, Dani Borba, Dani Cortez, Daniel,

Denise, Fran, Gilvani, Júlio, Larissa, Lili, Marcos Paulo, Martica, Marton, Pérola,

Priscila, Priscila Brazil, Rita, Rogérios, Rodrigo (IC), Solange, Taís, Waltinho e a

todos os colegas pela amizade, brincadeiras e sugestões.

A todos os Professores e funcionários do Departamento de Biotecnologia, em

especial, Djalma, Fabrício, Jussara, Paulinho, Rita, Zé Cobrinha e Zé Moreira, pela

força, trabalho e amizade.

A todos os funcionários da EEL que colaboraram para a realização deste trabalho.

À CAPES, pelo apoio financeiro.

A todos aqueles que contribuíram direta ou indiretamente para a realização deste

trabalho. Pela força e amizade, muito obrigada!!!

RESUMO

SANTOS, S.C.M. Avaliação do Sistema Descontínuo Alimentado Repetido para a Produção de 2,3-Butanodiol a partir de Hidrolisado Hemicelulósico de Eucalipto. 2007. 130f. Tese (Doutorado em Biotecnologia Industrial) - Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de São Paulo, Lorena, São Paulo, 2007. Os materiais lignocelulósicos, como as aparas de eucalipto, são uma abundante e renovável fonte de celulose e hemicelulose que podem servir como matéria-prima para a produção de diversos compostos químicos. Esses materiais contêm açúcares polimerizados que podem ser liberados por hidrólise, e, subseqüentemente, fermentados por diversos microrganismos. O emprego desses materiais tem sido considerado de interesse na área de conversão de biomassa em combustíveis líquidos e substâncias químicas de interesse industrial, como é o caso do 2,3-butanodiol. Um dos principais problemas relativos à utilização de hidrolisados hemicelulósicos é a presença de vários compostos tóxicos, inibidores do metabolismo microbiano. Este trabalho teve como objetivo avaliar a estratégia de vazões crescentes de alimentação com meio preparado com hidrolisado hemicelulósico de eucalipto para produção fermentativa de 2,3-butanodiol em sistema descontínuo alimentado por Klebsiella pneumoniae, proporcionando, assim, uma maior adaptação da cultura aos inibidores, uma vez que estes serão adicionados progressivamente ao meio de fermentação. Além disso, avaliou-se o sistema descontínuo alimentado repetido, com a reutilização das células já adaptadas ao meio contendo hidrolisado e em fase de produção, visando um aumento de produtividade do processo. Avaliou-se este sistema empregando-se hidrolisado tratado com carvão ativo e hidrolisado tratado com resinas de troca iônica. O aumento da vazão foi realizado de forma a se preencher o biorreator com o meio em 3 tempos: 7, 10 e 13 horas, com diferentes valores de concentração de substrato (Si) no meio de alimentação: 100, 150 e 200 g/L. O aumento do tempo de adição de meio melhora os resultados, assim como com a diminuição de Si. Porém, a estratégia de vazão crescente não apresentou vantagem em relação aos parâmetros fermentativos avaliados, quando comparados aos encontrados na literatura que empregaram vazão constante. Os valores de vazão de alimentação constante e de Si iguais a 72 mL/h e 100 g/L, respectivamente, foram empregados tanto para o hidrolisado tratado com carvão ativo (HCA) quanto para o tratado com resina de troca iônica (HRI) para a realização do processo em sistema descontínuo alimentado repetido. Com o emprego deste sistema para o hidrolisado tratado com carvão obteve-se 14,84 g/L de produto, YP/S de 0,27 g/g e Qp de 0,62 g/h no 1o ciclo, enquanto que para o hidrolisado tratado com resina os valores foram de 30,4 g/L de produto, YP/S de 0,32 g/g e Qp de 1,22 g/h até o 4ociclo. Conclui-se que o tratamento com resinas de troca iônica para remoção dos compostos tóxicos é mais eficiente que o tratamento com carvão ativo, e a reutilização das células favorece o processo, por estarem com seu metabolismo em plena atividade produtiva no momento do corte, ou seja, para o próximo ciclo. Palavras-chave: Hidrolisado hemicelulósico. Butanodiol. Sistema descontínuo alimentado repetido. Klebsiella pneumoniae. Fermentação. Inibidores microbianos.

ABSTRACT SANTOS, S.C.M. Evaluation of the repeated fed-batch system for the 2,3-butanediol production from Eucalyptus hemicellulosic hydrolysate. 2007. 130f. Thesis (Doctoral in Industrial Biotechnology) – Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de São Paulo, Lorena, 2007.

Lignocellulosic materials, like eucalyptus chips, are an abundant and renewable cellulose and hemicellulose source that can serve as raw material for the production of several chemical compounds. These materials contain polymerized sugars that can be released by hydrolysis process, and, subsequently, fermented by several microorganisms. These materials has been converted, by biotechnological route, into liquid fuels and chemical substances of industrial interest, like 2,3-butanediol. One of the main problems related to the use of hemicellulosic hydrolysate is the presence of several toxic compounds, inhibitors of the microbial metabolism. This work aimed to evaluate the increasing feeding rate strategy with medium prepared with eucalyptus hemicellulosic hydrolysate for fermentative production of 2,3-butanodiol in fed-batch system by Klebsiella pneumoniae. This system provides higher adaptation of the culture to the inhibitors, wich will be added progressively to the fermentation medium. Besides, the repeated fed-batch system was evaluated with the recycle of the cells already adapted to the medium containing hydrolysate in order to increase the productivity of the process. This system was evaluated by using hydrolysate treated with active charcoal and hydrolysate treated with ionic exchange resins. The increase of the feeding rate was accomplished by filling out the biorreator with the medium at 3 times: 7, 10 and 13 hours, with different values of substrate concentration in the feeding medium (Si): 100, 150 and 200 g/L. The time increase of medium addition improves the results, as well as the decrease of Si. However, the strategy of increasing feeding rate did not present better results of the evaluated fermentative parameters, in relation to the values for constant feeding rate found in the literature. The 72 mL/h constant feeding rate and 100 g/L Si were used for the hydrolysate treated with active charcoal (HCA) as for that treated with ionic exchange resins (HRI) in order to accomplish the process in repeated fed-batch system. Using this system it was obtained 14,84 g/L of product, 0,27 g/g YP/S and 0,62 g/h Qp in the first cycle with the hydrolysate treated with active charcoal, while for the hydrolysate treated with resin the values were 30,4 g/L of product, 0,32 g/g YP/S and 1,22 g/h Qp until fourth cycle. The treatment with ionic exchange resins for the toxic compounds removal is more efficient than the treatment with actived charcoal, and the recycle of the cells favors the process, due to their metabolism be in productive activity at the moment of the cut, for the next cycle. Keywords: Eucalyptus hemicelullosic hydrolysate. 2,3-Butanodiol. Repeated fed-batch. Klebsiella pneumoniae. Fermentation. Microbial inhibitors.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 2.1 Reações que ocorreram durante a hidrólise do material lignocelulósico............................20 Figura 2.2 Classificação das principais bactérias produtoras de 2,3-butanodiol (MAGEE e

KOSARIC, 1987)...............................................................................................................37 Figura 2.3 Vias metabólicas de formação dos produtos da fermentação de carboidratos

por Klebsiella pneumoniae.................................................................................................39 Figura 3.1 Picador de madeira..............................................................................................................44 Figura 3.2 Reator de hidrólise (capacidade útil de 50L).......................................................................45 Figura 3.3 Evaporador a vácuo de coluna capacidade de 4L, operando a 70 ± 2oC...........................46 Figura 3.4 Sistema de 4 colunas de vidro encamisadas na seqüência A-180S; A-500, C-150 e

A103S.................................................................................................................................48

Figura 3.5 Variação exponencial do volume de meio no reator nos ensaios.......................................51 Figura 3.6 Variação linear da vazão de alimentação nos ensaios com adição do meio de

alimentação em 4, 7, 10 e 13 horas...................................................................................51 Figura 4.1 Aspecto do hidrolisado concentrado e sem tratamento (HC), e após tratamento

com resinas de troca iônica A860, A500, C150 e A103S.................................................61 Figura 4.2 Concentração de células (-■-), de substrato (-●-) e de produto (-▲-), em função do

tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado utilizando o tempo de alimentação de 4 horas (A), 7 horas (B) e 10 horas (C) com valor de Si=200 g/L....................................................................................................63

Figura 4.3 Massa de células formada Mxf (-■-), de substrato consumido Msc (-●-) e de

produto formado Mpf (-▲-), em função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado utilizando o tempo de alimentação de 4 horas (A), 7 horas (B) e 10 horas (C) com valor de Si=200 g/L.........................................64

Figura 4.4 Velocidades de formação de células (-■-), de consumo de substrato (-●-) e de

produto formado (-▲-), em função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado utilizando o tempo de alimentação de 4 horas (A), 7 horas (B) e 10 horas (C) com valor de Si=200 g/L...................................................65

Figura 4.5 Velocidades de específicas de formação de células (-■-), de consumo de substrato

(-●-) e de produto formado (-▲-), em função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado utilizando o tempo de alimentação de 4 horas (A), 7 horas (B) e 10 horas (C) com valor de Si=200 g/L.................................66

Figura 4.6 Concentração de células (-■-), de substrato (-●-) e de produto (-▲-), em função do

tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado utilizando o tempo de alimentação de 7 horas (A), 10 horas (B) e 13 horas (C) com Si=150 g/L............................................................................................................69

Figura 4.7 Massa de células formada Mxf (-■-), de substrato consumido Msc (-●-) e de

produto formado Mpf (-▲-), em função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado utilizando o tempo de alimentação de 7 horas (A), 10 horas (B) e 13 horas (C) com Si=150 g/L...............................................................70

Figura 4.8 Velocidades de formação de células (-■-), de consumo de substrato (-●-) e de produto formado (-▲-), em função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado utilizando o tempo de alimentação de 4 horas (A), 7 horas (B) e 10 horas (C) com Si=150 g/L.................................................................71

Figura 4.9 Velocidades de específicas de formação de células (-■-), de consumo de substrato (-●-) e de produto formado (-▲-), em função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado utilizando o tempo de alimentação de 7 horas (A), 10 horas (B) e 13 horas (C) com Si=150 g/L.............................................72

Figura 4.10 Concentração de células (-■-), de substrato (-●-) e de produto (-▲-), em

função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado utilizando o tempo de alimentação de 7 horas (A), 10 horas (B) e 13 horas (C) com Si=100 g/L.............................................................................................75

Figura 4.11 Massa de células formada Mxf (-■-), de substrato consumido Msc (-●-) e de produto formado Mpf (-▲-), em função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado utilizando o tempo de alimentação de 7 horas (A), 10 horas (B) e 13 horas (C) com Si=100 g/L...............................................................76


produto formado (-▲-), em função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado utilizando o tempo de alimentação de 4 horas (A), 7 horas (B) e 10 horas (C) com Si=100 g/L.................................................................77


(-●-) e de produto formado (-▲-), em função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado utilizando o tempo de alimentação de 7 horas (A), 10 horas (B) e 13 horas (C) com Si=100 g/L.............................................78

Figura 4.14 Concentrações de células (-■-), de substrato (-●-) e de produto (-▲-), em

função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado utilizando vazão de alimentação constante de 72 mL/h com Si=100 g/L........80

Figura 4.15 Massa de células formadas (-■-), de substrato consumido (-●-) e de produto formado (-▲-), em função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado utilizando vazão de alimentação constante de 72 mL/h com Si=100 g/L....................................................................................................81


produto formado (-▲-), em função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado utilizando vazão de alimentação constante de 72 mL/h com Si=100 g/L...............................................................................................81


(-●-) e de produto formado (-▲-), em função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado utilizando vazão de alimentação constante de 72 mL/h com Si=100 g/L..........................................................82


função do tempo, durante ensaio de fermentação TC/HCA em sistema descontínuo alimentado empregando Si=100 g/L e vazão de alimentação constante de 72 mL/h.........................................................................................................................86

Figura 4.19 Massa de células formadas (-■-), de substrato consumido (-●-) e de produto

formado (-▲-), em função do tempo, durante ensaio de fermentação TC/HCA em sistema descontínuo alimentado empregando Si=100 g/L e vazão de alimentação constante de 72 mL/h....................................................................................86

Figura 4.20 Velocidades de formação de células (-■-), de consumo de substrato (-●-) e de produto formado (-▲-), em função do tempo, durante ensaio de fermentação TC/HCA em sistema descontínuo alimentado empregando Si=100 g/L e vazão de alimentação constante de 72 mL/h...............................................................................87


(-●-) e de produto formado (-▲-), em função do tempo, durante ensaio de fermentação TC/HCA em sistema descontínuo alimentado empregando Si=100 g/L e vazão de alimentação constante de 72 mL/h...............................................87

Figura 4.22 Concentrações de células (-■-), de substrato (-●-) e de produto (-▲-), em função

do tempo, durante ensaio de fermentação TC/HRI em sistema descontínuo alimentado empregando Si=100 g/L e vazão de alimentação constante de 72 mL/h........89


formado (-▲-), em função do tempo, durante ensaio de fermentação TC/HRI em sistema descontínuo alimentado empregando Si=100 g/L e vazão de alimentação constante de 72 mL/h....................................................................................89


produto formado (-▲-), em função do tempo, durante ensaio de fermentação TC/HRI em sistema descontínuo alimentado empregando Si=100 g/L e vazão de alimentação constante de 72 mL/h.....................................................................90


(-●-) e de produto formado (-▲-), em função do tempo, durante ensaio de fermentação TC/HRI em sistema descontínuo alimentado empregando Si=100 g/L e vazão de alimentação constante de 72 mL/h...............................................90


função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado repetido para fermentação inicial Fi, R1 e R2, empregando hidrolisado HCA.................................................................................................................93


formado (-▲-), em função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado repetido para fermentação inicial Fi e R1, empregando hidrolisado HCA............................................................................................94


produto formado (-▲-), em função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado repetido para fermentação inicial Fi e R1, empregando hidrolisado HCA............................................................................................95


(-●-) e de produto formado (-▲-), em função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado repetido para fermentação inicial Fi e R1, empregando hidrolisado HCA.....................................................................96


função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado repetido para fermentação inicial Fi e os ciclos empregando hidrolisado HRI...................................................................................................................99


formado (-▲-), em função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado repetido para fermentação inicial Fi e os ciclos, empregando hidrolisado HRI............................................................................................101


produto formado (-▲-), em função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado repetido para fermentação inicial Fi e os ciclos, empregando hidrolisado HRI............................................................................................103


(-●-) e de produto formado (-▲-), em função do tempo, durante ensaio de fermentação em sistema descontínuo alimentado repetido para fermentação inicial Fi e os ciclos, empregando hidrolisado HRI.....................................................................105

LISTA DE TABELAS Tabela 2.1 Classificação das resinas de troca iônica em função do grupo funcional e da

força iônica.........................................................................................................................29 Tabela 2.2 Ordem de afinidade de diferentes resinas por íons em soluções diluídas

(HARLAND, 1994)..............................................................................................................30 Tabela 2.3 Aplicações do 2,3-butanodiol e alguns derivados...............................................................36 Tabela 3.1 Composição do meio empregado por Frazer e McCaskey, (1989).....................................49 Tabela 3.2 Valores de vazão e volume para os ensaios com adição do meio

750 mL de alimentação......................................................................................................52 Tabela 4.1 Composição do hidrolisado hemicelulósico de aparas de eucalipto...................................59 Tabela 4.2 Composição do hidrolisado hemicelulósico concentrado tratado com carvão

(HCA) e resina de troca iônica (HRI)..................................................................................60 Tabela 4.3 Parâmetros fermentativos dos ensaios para definição do tempo de adição do

meio de alimentação com Si=200 g/L: 7 horas (A), 10 horas (B) e 13 horas (C)..............62

Tabela 4.4 Parâmetros fermentativos dos ensaios para definição do tempo de adição do meio de alimentação com Si=150 g/L: 7 horas (A), 10 horas (B) e 13 horas (C).........68

Tabela 4.5 Parâmetros fermentativos dos ensaios para definição do tempo de adição do

meio de alimentação com Si=100 g/L: 7 horas (A), 10 horas (B) e 13 horas (C)..............79 Tabela 4.6 Parâmetros fermentativos dos ensaios com Si=100 g/L e vazão constante de 72 mL/h....82 Tabela 4.7 Parâmetros fermentativos dos melhores ensaios para definição do tempo de

adição do meio de alimentação..........................................................................................83 Tabela 4.8 Composição dos hidrolisados HCA e HRI...........................................................................85 Tabela 4.9 Parâmetros fermentativos dos ensaios para definição do tempo de corte (TC) para

adição do meio de alimentação para HCA e HRI..............................................................91 Tabela 4.10 Parâmetros fermentativos dos ensaios em sistema descontínuo alimentado

repetido, empregando hidrolisado HCA.............................................................................97 Tabela 4.11 Parâmetros fermentativos dos ensaios em sistema descontínuo alimentado

repetido, empregando hidrolisado HRI............................................................................107

SUMÁRIO

1 Introdução.................................................................................................................................13

2 Revisão Bibliográfica................................................................................................................15

2.1 Materiais Lignocelulósicos........................................................................................................15

2.1.1 Hidrolisados de biomassa vegetal............................................................................................17

2.1.2 Tratamento do hidrolisado........................................................................................................24

2.1.3 Adaptação do microrganismo...................................................................................................32

2.2 2,3-Butanodiol...........................................................................................................................35

2.2.1 Características e aplicações.....................................................................................................35

2.2.2 Microrganismos produtores......................................................................................................36

2.2.3 Fatores que influenciam a formação de 2,3-butanodiol............................................................38

2.2.4 Recuperação do produto..........................................................................................................42

3 Material e Métodos...................................................................................................................44

3.1 Obtenção do Hidrolisado Hemicelulósico.................................................................................44

3.2 Concentração do hidrolisado....................................................................................................45

3.3 Tratamento do hidrolisado........................................................................................................46

3.3.1 Precipitação e adsorção por carvão ativo (HCA)......................................................................46

3.3.2 Extração com resinas de troca iônica (HRI).............................................................................47

3.4 Fermentação.............................................................................................................................48

3.4.1 Microrganismo..........................................................................................................................48

3.4.2 Meio de preparo do inóculo......................................................................................................48

3.4.3 Meios de Fermentação.............................................................................................................49

3.4.3.1 Meio da Fase Descontínua.......................................................................................................49

3.4.3.2 Meio de Alimentação................................................................................................................49

3.4.4 Condições de fermentação.......................................................................................................50

3.5 Seqüência experimental...........................................................................................................50

3.5.1 Teste da vazão crescente de alimentação e do valor de Si, empregando hidrolisado tratado

com carvão ativo (HCA)............................................................................................................50

3.5.2 Definição da vazão de alimentação e do valor de Si para posterior utilização no

sistema descontínuo alimentado repetido................................................................................52

3.5.3 Definição do tempo de corte para os hidrolisados tratados HCA e HRI...................................52

3.5.4 Avaliação do sistema descontínuo alimentado repetido para os hidrolisados tratados

HCA e HRI................................................................................................................................53

3.6 Métodos analíticos....................................................................................................................53

3.6.1 Concentração de Açúcares e Ácido Acético.............................................................................53

3.6.2 Concentração de produtos........................................................................................................53

3.6.3 Concentração de Furfural e Hidroximetilfurfural.......................................................................54

3.6.4 Determinação de fenóis totais..................................................................................................54

3.6.5 Concentração celular................................................................................................................55

3.6.6 Coeficiente Volumétrico de Transferência de Oxigênio (kLa)...................................................55

3.7 Parâmetros Fermentativos........................................................................................................56

3.8 Metodologia de análise dos resultados.....................................................................................57

4 Resultados e Discussão...........................................................................................................58

4.1 Obtenção e Concentração do Hidrolisado................................................................................58

4.2 Tratamento com carvão ativo e resinas de troca iônica...........................................................59

4.3 Teste da vazão crescente de alimentação e do valor de Si, empregando hidrolisado tratado

com carvão ativo.......................................................................................................................61

4.4 Definição da vazão de alimentação e do valor de Si para posterior utilização no

sistema descontínuo alimentado repetido................................................................................83

4.5 Definição do tempo de corte para o hidrolisado HCA e HRI.....................................................84

4.6 Avaliação do sistema descontínuo alimentado repetido para hidrolisado tratado com

carvão ativo..............................................................................................................................92

4.7 Avaliação do sistema descontínuo alimentado repetido para hidrolisado tratado com

resina de troca iônica................................................................................................................97

5 Conclusões.............................................................................................................................108

6 Sugestões para Trabalhos Futuros.........................................................................................110

7 Referências Bibliográficas......................................................................................................111

8 Apêndices...............................................................................................................................123

13

1. INTRODUÇÃO Os materiais lignocelulósicos, como os resíduos agrícolas e florestais, são

uma abundante e renovável fonte de celulose e hemicelulose que pode servir como

matéria-prima para a produção de diversos compostos químicos.

Nas últimas décadas, o eucalipto tem sido o gênero florestal mais utilizado

para aumentar a área de plantações utilizadas com fins industriais no Brasil,

contribuindo assim para o desenvolvimento da indústria madeireira e de polpa e

papel. O Brasil é um dos líderes na plantação florestal, com uma área plantada de

6,7 milhões de hectares, os quais representam 22% do total mundial. Conforme

dados da literatura, somente 50% do peso seco total do eucalipto é aproveitado pela

indústria, permanecendo o restante no campo, na forma de folhas, galhos, e cascas

(BERNARDO et al, 1998).

Esses materiais contêm açúcares polimerizados que podem ser liberados por

hidrólise, e, subseqüentemente, fermentados por diversos microrganismos. O

emprego desses materiais para a produção de butanodiol tem sido considerado de

interesse na área de conversão de biomassa em combustíveis líquidos e

substâncias químicas de interesse industrial.

Um dos principais problemas relativos à utilização do hidrolisado

hemicelulósico é a presença de vários compostos tóxicos, normalmente formados

durante sua obtenção. Existe uma variedade de tratamentos cujo objetivo é reduzir

as concentrações dos compostos tóxicos presentes nos hidrolisados a níveis não

inibitórios ou até mesmo eliminá-los, visando a melhoria da fermentabilidade dos

hidrolisados. Outra forma de contornar o problema é a adaptação do microrganismo

ao meio que contém tais compostos.

A produção de butanodiol por via fermentativa se justifica por ser um

importante intermediário químico, podendo ser transformado em diversas

substâncias de interesse para a indústria. Entre essas destacam-se o 1,3-butadieno,

principal componente da borracha sintética, e a metil-etil-cetona (MEC), um solvente

amplamente empregado na indústria química. Pode ser também utilizado como

anticongelante, devido ao baixo ponto de congelamento e como crioprotetor. Suas

características físico-químicas conferem a este composto, um grande potencial como

combustível líquido, o qual tem despertado grande interesse nos últimos anos,

sobretudo por não ser proveniente do petróleo.

14

A maioria das substâncias nas quais o butanodiol pode ser convertido,

atualmente são obtidas a partir do petróleo. Porém, a atividade industrial baseada

nessa matéria-prima encontra-se sempre ameaçada por problemas de esgotamento

ou políticos. Assim, o desenvolvimento de uma tecnologia para produção de

butanodiol por fermentação, resultando num custo mais baixo para sua obtenção,

constitui uma alternativa estratégica para a obtenção dos compostos mencionados.

O desenvolvimento do processo de produção por via fermentativa, no que diz

respeito ao aumento da concentração final de produto, é fundamental não apenas

sob o aspecto comercial, como também sob o ponto de vista de recuperação do

produto do meio fermentado. A extração se torna mais viável economicamente à

medida que se obtém maiores concentrações de produto no meio.

Vários trabalhos realizados no Departamento de Biotecnologia da EEL/USP

empregaram hidrolisado de cavacos de eucalipto para a produção de butanodiol,

obtendo-se resultados considerados satisfatórios comparados aos encontrados na

literatura. Prata (1997) empregou o sistema descontínuo alimentado para produzir

2,3-butanodiol a partir de hidrolisado hemicelulósico de eucalipto, obtendo uma

produtividade e eficiência de 4 g/h e 80%, respectivamente, porém com uma

concentração relativamente baixa, comparando com os dados da literatura. Entende-

se que esta concentração pode ser aumentada fornecendo-se uma maior

quantidade de substrato, uma vez que a eficiência de conversão apresentou um

valor próximo do teórico. Além disso, com base nos resultados de Garcia (1999),

verificou-se que com uma vazão de 72,0 mL/h e uma concentração inicial de

substrato Si de 90 g/L não houve acúmulo de substrato durante a produção de

2,3-butanodiol por Klebsiella pneumoniae. Isso possibilita a utilização de uma vazão

de alimentação maior, o que resultaria em maiores valores de produtividade.

Assim, propõe-se neste trabalho estudar a produção fermentativa de

butanodiol utilizando como matéria-prima as aparas de eucalipto, consideradas

resíduos florestais, que são acumuladas na natureza durante o corte da madeira, e

testar um novo sistema de condução do processo, o descontínuo alimentado

repetido, com a reutilização das células já adaptadas ao meio contendo hidrolisado

em fase de produção, visando um aumento de produtividade do processo.

15

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 Materiais Lignocelulósicos

Os materiais lignocelulósicos são importantes fontes de substrato, uma vez

que grandes quantidades de resíduos florestais e agro-industriais são gerados e

acumulados na natureza, decorrentes de atividades industriais e agrícolas. Estes

resíduos constituem reservas naturais renováveis e representam uma importante

fonte de matérias primas de baixo custo que podem ser utilizadas para obtenção de

produtos de alto valor agregado, podendo ser convertidos em energia, produtos

químicos e alimentos (KERN et al., 1998; SHAN e LEE, 1994).

Os três maiores constituintes da biomassa lignocelulósica são a celulose, a

hemicelulose e a lignina, em proporções que variam de 40 a 50%, 15 a 30% e 10 a

30%, respectivamente (DEKKER, 1985). Como exemplo tem-se o eucalipto, com

cerca de 40 a 62% de celulose, 12 a 22% de hemicelulose e 15 a 22% de lignina

(VITAL, DELLA LUCIA, 1986). Garcia (2006) encontrou para o resíduo constituído

por folhas, cascas e galhos de eucalipto, os valores de 31,2% de celulose, 15,07%

de hemicelulose e 28,3% de lignina.

A celulose principal componente da parede celular da fibra vegetal é um

polímero linear formado por unidades de glicose unidas por ligações glicosídicas

β-1,4 com estrutura cristalina altamente ordenada e alta massa molecular (FAN et

al., 1982; KUHAD e SINGH,1993).

A hemicelulose é um polímero complexo, constituído das pentoses xilose e

arabinose, e das hexoses manose, glicose, galactose e ácidos urônicos (FENGEL e

WEGENER, 1989; KUHAD e SINGH,1993). O principal componente da fração

hemicelulósica dos resíduos agro-industriais é a xilana, polímero constituído por

unidades de xilose que pode ser hidrolisado usando-se ácidos minerais. A xilana

possui estrutura linear constituída de unidades xilopiranosídicas unidas por ligações

β-1,4, é encontrada em todas as plantas terrestres e compreende 30% do material

da parede celular (VILKARI, et al, 1993).

A lignina é composta de um conjunto de polímeros amorfos reticulares de alta

massa molecular, geralmente associados com a celulose e a hemicelulose. Tem

estrutura química fortemente aromática, composta por anéis de benzeno que contém

16

grupos fenólicos livres e metilados (FENGEL e WEGENER, 1989; KUHAD e

SINGH,1993).

Os constituintes menores da biomassa vegetal incluem extrativos e não

extrativos. As madeiras contêm 1-8% de extrativos, em base seca, que consistem de

gomas, alcalóides, amidos, graxas, gorduras, resinas e óleos essenciais, entre

outros. Os não extrativos compreendem a 0,2-0,8% da madeira, em base seca, e

incluem compostos inorgânicos como sílica, carbonatos e oxalatos (FENGEL,

WEGNER, 1989).

O emprego da biotecnologia é uma maneira de fazer com que a biomassa

agrícola e florestal, rica fonte de carboidratos (MOHANDAS et al., 1995) se torne um

substrato utilizado pelos microrganismos para a produção de insumos úteis como a

acetona, o ácido acético, o butanol e o ácido butírico (SADDLER et al., 1983), dentre

outros.

O eucalipto é originário da Austrália, pertence à família Myrtacea e é a

principal matéria-prima da indústria brasileira de papel e celulose. Nas últimas

décadas, o eucalipto tem sido o gênero florestal mais utilizado para aumentar a área

de plantações utilizadas com fins industriais no Brasil, contribuindo assim para o

desenvolvimento das indústrias madeireiras e de polpa e papel. O crescimento

rápido torna a madeira muito rentável, sendo utilizada para embalagens, fabricação

de postes de luz e telefonia e como combustível industrial (ENCARTA, 2001).

Segundo a FAO (2000) somente em 2000, foram plantados 2,96 milhões de

hectares, representando 59,5% da área total de plantações florestais no país.

As maiores áreas reflorestadas com eucalipto estão localizadas nos Estados

de Minas Gerais (51,8%), São Paulo (19,4%), Bahia (7,2%) e Espírito Santo (5,1%).

Segundo a Sociedade Brasileira de Silvicultura (SBS), o Brasil é atualmente

responsável por 2% do comércio mundial de papel (11º produtor mundial) e 5% do

comércio de celulose (7º produtor mundial), isto contabilizado os produtos obtidos de

outras espécies de madeira utilizadas, como pinus e araucária. (SELING et al.,

2001). De acordo com o Inventário Florestal das Áreas Reflorestadas do Estado de

São Paulo (2002) 79,4% da área média das plantações é de Eucalyptus, com

predominância das espécies E. grandis (26%) e E. saligna (15%). Segundo a SBS, a

produtividade média das plantações de Eucalyptus é de 34 m3/ha.ano (SELING et

al., 2001).

17

Uma grande quantidade de resíduos é gerada durante o corte da madeira,

geralmente esses resíduos não são aproveitados no momento da colheita. De 50 a

75% dos ramos, folhas e raízes das árvores ficam no campo e a isto são

adicionados os resíduos gerados em operações de polpação e moagem (SINGH e

MISHRA, 1995). De acordo com Dale (1987) o custo de vários produtos de fermentação

dependem do custo da fonte de carboidrato. Segundo este autor, a conversão de

materiais lignocelulósicos oferece potencial para a obtenção de açúcares

fermentescíveis de baixo custo. Para isto é de fundamental importância o uso

integrado de todos os componentes dos materiais lignocelulósicos e o

desenvolvimento de pré-tratamentos que possibilitem o aumento do rendimento da

hidrólise da celulose.

2.1.1 Hidrolisados de biomassa vegetal

Vários processos foram desenvolvidos e adaptados visando o fracionamento

da biomassa vegetal em seus principais constituintes, para a posterior utilização da

fração hemicelulósica, que apresenta como principal componente a xilose (GARCIA

et al., 2004; LARSSON et al., 1999; ROBERTO et al., 1991a; SILVA et al, 1998).

De acordo com McMillan (1992) citado por Kim et al. (2000), a hidrólise ácida

é um dos métodos mais utilizados para a separação da hemicelulose da biomassa

lignocelulósica. Normalmente a hidrólise ácida é realizada em temperaturas entre

120 e 200 oC, com a adição de pequenas quantidades de ácidos como H2SO4,

promovendo a separação de açúcares e da lignina (GRETHLEIN e CONVERSE,

1991; TOREGET e HSU, 1994), citados por Palmqvist e Hahn-Hägerdal (2000b).

Neste processo, a concentração de ácido e a temperatura são fatores cruciais

para formação de compostos tóxicos. Temperaturas moderadas (

18

Segundo Harris (1975) citado por Jeffries et al. (1984), a hemicelulose tal

como xilana tem mais ramificações, estrutura menos cristalina que a celulose, e as

ligações glicosídicas entre os resíduos anidro-D-xilose nas xilanas são menos

estáveis e mais rapidamente rompidas pelo ácido do que as ligações entre os

resíduos de D-glicose na celulose. Como conseqüência as pentoses podem ser mais

facilmente extraídas do material lignocelulósico através deste método de hidrólise.

O pré-tratamento empregado deve ser energeticamente e quimicamente

eficiente, ou seja, o processo de conversão de biomassa deve ser economicamente

vantajoso. Deve propiciar a conversão eficiente do carboidrato disponível em

açúcares fermentescíveis, para se obter alto rendimento do produto de interesse.

Logo, a degradação ou a perda de carboidratos deve ser evitada, bem como a

formação de compostos inibidores do metabolismo celular (McMILLAN, 1994a). Esta

condição também é mencionada por Garg e Jain (1995) em sua revisão sobre

produção fermentativa de 2,3-butanodiol. Como exemplo pode-se citar o trabalho de

Shan e Lee (1994), que desenvolveram um processo de produção de

acetona-butanol a partir de madeira, através do sistema de fermentação extrativa e

sacarificação associadas. Neste estudo foram empregadas enzimas que

hidrolisavam a fração celulósica e hemicelulósica da madeira.

GONG et al. (1997), utilizando material lignocelulósico, empregaram um

processo de sacarificação e fermentação simultâneas para a produção de

2,3-butanodiol. Neste processo as frações de celulose e hemicelulose foram

hidrolisadas pela celulase obtendo-se glicose, xilose e uma mistura de outros

açúcares em menor quantidade, predominando arabinose. Simultaneamente estes

açúcares foram convertidos a 2,3-butanodiol pela bactéria Klebsiella oxytoca ATCC

8724. Neste processo, obtiveram-se maiores velocidades de hidrólise e rendimento

em produto quando comparados com aqueles envolvendo hidrólise e fermentação

separadas.

Um dos principais problemas relativos à utilização de hidrolisados

hemicelulósicos é a presença de substâncias inibidoras do metabolismo dos

microrganismos fermentadores (FRAZER e McCASKEY, 1989; YU et al., 1982). Tais

inibidores são liberados ou formados durante o processo de hidrólise ácida dos

materiais lignocelulósicos (FRAZER e McCASKEY, 1989). A composição dos

inibidores varia com as condições de hidrólise empregadas e a fonte de materiais

lignocelulósicos. A temperatura do processo de hidrólise, o tempo e a concentração

19

de ácido utilizada são fatores que influenciam na formação dos inibidores da

fermentação (OVEREND e CHORNET, 1987), citados por Taherzadeh et al. (2000).

O hidrolisado obtido por hidrólise ácida de materiais lignocelulósicos necessita

ser concentrado, para aumentar o teor de açúcares, antes de ser utilizado como

substrato num processo fermentativo como o de produção de 2,3-butanodiol. Isto

porque a concentração de açúcar do meio deve estar em torno de 100 g/L

(JANSEN et al, 1984; SILVEIRA, 1991) e os hidrolisados contêm de 25 (ALMEIDA e

SILVA, 1996) a 40 g/L de carboidratos fermentescíveis (GARCIA, 2006).

Os compostos tóxicos presentes no hidrolisado podem causar inibição do

crescimento celular e limitação do consumo dos açúcares presentes, inibindo assim,

a formação do produto e o rendimento do processo (PARAJÓ et al., 1998c).

Ocasionalmente, a inibição é o resultado do efeito sinergístico, ou seja, interação

dos efeitos negativos dos compostos tóxicos proporcionando um aumento da

inibição existente. Os inibidores também aumentam o “stress” químico do meio até

um certo limite, porém podem proporcionar a morte celular, se a capacidade da

célula de resposta ao “stress” for excedida (PALMQVIST & HAHN-HÄGERDAL,

2000b).

Leonard & Hajny (1945), citados por Parajó et al. (1998c), consideraram os

seguintes inibidores: (i) minerais ou metais pesados contidos no material

lignocelulósico ou resultantes da corrosão do equipamento de hidrólise; (ii) produtos

derivados da hidrólise da hemicelulose, como o ácido acético (formado pelos grupos

acetil da matéria-prima) ou furfural e hidroximetil-furfural (formados pela degradação

dos açúcares); (iii) produtos derivados da degradação da lignina (compostos

fenólicos, ácidos aromáticos e aldeídos) e (iv) compostos derivados de extrativos.

Ácidos como vanílico, siringílico, capróico, caprílico, pelargônico e palmítico têm sido

citados entre os ácidos orgânicos com capacidade inibitória presente nos meios de

fermentação formulados com hidrolisados de materiais lignocelulósicos. O processo

de hidrólise, o qual envolve o tratamento do material lignocelulósico à alta

temperatura sob condições ácidas, leva à formação e liberação de vários compostos.

a principal via de degradação está esquematizada na Figura 2.1 (PALMQVIST &

HAHN-HÄGERDAL, 2000b).

20

CH3COOH Compostos

Ácido acético Fenólicos

CHO CHO CHO CHO

H C OH HO C H H C OH H C OH

HO C H HO C H HO C H HO C H

H C OH H C OH HO C H H C OH

CH2OH H C OH H C OH H C OH

CH2OH CH2OH CH2OH

Xilose Manose Galactose Glicose

O CHO HOH2C O CHO

Furfural Hidroximetilfurfural

O

HCOOH H3C C CH2 CH2 COOH

Ácido Fórmico Ácido Levulínico

Figura 2.1 Reações que ocorreram durante a hidrólise do material lignocelulósico.

De acordo com Palmqvist e Hahn-Hägerdal (2000b), o efeito inibitório do

furfural tem sido relacionado com a redução da velocidade de crescimento específica

do microrganismo. PARAJÓ et al. (1997) verificaram que em concentrações de 1,3 a

3,2 g/L, o furfural apresenta efeito inibitório sobre a levedura Pichia stipitis. Porém,

em concentrações inferiores a 1,0 g/L, este efeito pouco influencia o processo

fermentativo. Nigan (2001) verificou que a adição de 0,27 g/L de furfural ao meio de

fermentação não reduziu significantemente o rendimento e a produtividade em

etanol, porém a adição de 1,5 g/L de furfural reduziu notoriamente o rendimento e a

produtividade em 90,4 e 85,1%, respectivamente. Isto mostra que a alta

MATERIAIS LIGNOCELULÓSICOS

HEMICELULOSE CELULOSE LIGNINA

21

concentração de furfural inibiu diretamente a respiração e o crescimento da levedura

P. stipitis. O autor verificou ainda, que o furfural é reduzido a álcool furfurílico, o qual

também diminui a velocidade de crescimento, bem como a velocidade específica de

produção de etanol.

Em relação ao hidroximetilfurfural, Palmqvist e Hahn-Hägerdal (2000b)

relataram que seu mecanismo de inibição é muito similar ao do furfural, causando

uma longa fase lag durante o crescimento do microrganismo. Porém, o

hidroximetilfurfural é considerado menos tóxico que o furfural, e sua concentração no

hidrolisado hemicelulósico é normalmente baixa devido a 3 fatores: (1) baixa

quantidade de hexose na hemicelulose, (2) as condições empregadas no processo

de hidrólise, o qual normalmente não degrada hexoses em grande quantidade e (3)

a alta reatividade dos compostos. De acordo com Delgenes et al. (1996), o

crescimento P. stipitis foi reduzido em 43, 70 e 100%, quando a concentração de

HMF no meio foi de 0,5; 0,75 e 1,5 g/L, respectivamente.

Martinez et al. (2000) verificaram que a produção de etanol por E. coli em

hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana foi afetada somente em presença de

concentrações maiores que 900 mg/L de furanos (furfural e HMF), sendo que estes

não foram os principais compostos que determinaram a toxicidade dos hidrolisados

hemicelulósicos para a produção de etanol. De acordo com Vogel-Lowmeier et al.

(1998), a toxicidade do furfural e do HMF pode estar relacionada ao efeito

sinergístico, quando estes dois compostos são combinados com outros compostos,

incluindo uma variedade de compostos fenólicos e aromáticos derivados da

degradação da lignina, e outros tipos de ácidos como, acético, fórmico e levulínico

(MUSSATO e ROBERTO, 2004).

O efeito tóxico do ácido acético (pka=4,75) está relacionado com a inibição do

crescimento do microrganismo. Este ácido pode ser, portanto, utilizado como

preservativo em alimentos. Os ácidos fracos, em valores de pH baixo, apresentam-

se na forma não-dissociada. Sendo lipossolúveis, têm sua passagem facilitada

através da membrana plasmática. Ao entrar na célula e encontrar um pH interno

neutro, este ácido se dissocia no citossol liberando prótons H+. A enzima ATPase

existente na membrana da célula tem a função de expulsar os prótons do interior

desta, de forma a manter a integridade da célula. Quando a concentração de ácido

aumenta, a atividade da enzima ATPase também aumenta, porém, dependendo da

concentração do ácido, esta enzima pode não conseguir bombear os prótons para

22

fora da célula. Em conseqüência, cada vez mais o pH intracelular vai se acidificando

e inibindo a atividade da célula, o que pode levá-la à morte (LARSSON et al., 1999b;

PALMQVIST e HAHN-HÄGERDAL, 2000b). A toxicidade do ácido acético varia de

acordo com as condições de cultivo empregadas no processo fermentativo. Van Zyl

et al. (1991) utilizaram P. stipitis para produção de etanol a partir de hidrolisado

hemicelulósico de bagaço-de-cana e concluiram que o grau de inibição causado pelo

ácido acético depende não somente da sua concentração, mas também da

concentração de oxigênio e do pH do meio. Verificaram que em pH 6,5 e com

concentração de ácido acético acima de 4 g/L a produção de etanol caiu,

descrescendo até 50% quando a concentração do ácido alcançou 15 g/L. Em pH 5,1

o mesmo decréscimo de 50% na concentração de etanol foi observado quando a

concentração de ácido acético foi de somente 1,0 g/L e nenhum etanol foi produzido

na concentração de ácido de 10 g/L no hidrolisado.

Segundo Felipe et al. (1995) a produção de xilitol por Candida guilliermondii,

utilizando meio semi-sintético, foi favorecida em baixa concentração de ácido acético

(até 1,0 g/L), enquanto que em níveis superiores a 3,0 g/L foi inibida. Virgínio da

Silva (2001) constatou que a inibição do ácido acético é dependente da sua

concentração bem como da fase de crescimento da levedura. Segundo o autor, o

maior efeito tóxico do ácido acético ocorreu quando, após 12 horas de cultivo, as

células foram expostas a 5,0 g/L deste ácido, no tempo que corresponde à fase de

atividade máxima metabólica da levedura C. guilliermondii. Assim, relacionou a

toxicidade a uma possível interação do efeito inibidor do ácido acético com outros

compostos tóxicos como, furfural, 5-HMF e fenóis, já que os maiores valores de

rendimento e produtividade em xilitol foram obtidos com a utilização de meio

simulando a composição de açúcares do hidrolisado, tendo apenas o ácido acético

como composto inibidor. A assimilação de ácido acético pela levedura C.

guilliermondii, foi observada por outros autores em hidrolisado de bagaço-de-cana

(MARTON, 2002), eucalipto (GINORIS, 2001) e palha de trigo (CANILHA, 2002).

Rossi et al. (2006) estudou o comportamento da bactéria K. pneumoniae para

a produção de butanodiol em meio sintético contendo diferentes concentrações de

ácido acético. Concluiu que o ácido acético favorece o processo em termos de

velocidade quando a adição de ácido acético no meio foi de 2 g/L e em termos de

conversão de substrato em produto quando a adição foi de 6 g/L de ácido acético. O

23

mesmo autor verificou que a bactéria consome ácido acético mesmo antes do

esgotamento do substrato do meio.

A influência de outros ácidos fracos foi verificada por Larsson et al. (1998),

que concluiram que existe uma clara diferença entre a toxicidade dos ácidos acético,

fórmico e levulínico nas mesmas concentrações de suas formas não dissociadas. É

provável que isto ocorra devido a diferenças de permeabilidade da membrana ou da

toxicidade da forma aniônica dos ácidos, uma vez no interior da célula (PALMQVIST

e HAHN-HÄGERDAL, 2000b).

Uma grande variedade de compostos aromáticos, poliaromáticos, fenólicos e

aldeídicos são liberados durante a degradação da estrutura da lignina dos materiais

lignocelulósicos. Os compostos fenólicos têm sido considerados por exercerem

grande efeito inibitório na fermentação de hidrolisados hemicelulósicos, sendo

considerados mais tóxicos, os compostos fenólicos de baixa massa molecular

(LARSSON et al., 1998; LUO et al., 2002; MACIEL et al., 2001). De acordo com

Heipieper et al. (1994), citados por Palmqvist e Hahn-Hägerdal (2000b), os

compostos fenólicos causam uma perda da integridade da membrana celular,

afetando sua habilidade de atuar como barreira seletiva e matriz enzimática. Estes

autores utilizaram como base o estudo de Larsson et al. (1998), que observaram que

o hidrolisado hemicelulósico de madeira é consideravelmente mais inibidor do que

um meio sintético contendo concentrações correspondentes de ácidos alifáticos,

furfural e 5-HMF, porém sem compostos fenólicos. Contudo, o mecanismo do efeito

de inibição destes compostos ainda não foi elucidado, devido, em grande parte, à

falta de exatidão das análises quantitativas e qualitativas.

Tran e Chambers (1986) testaram o efeito de nove fenólicos, a maioria dos

quais foram compostos benzílicos, em Klebsiella pneumoniae, e concluiram que os

compostos fenólicos foram mais tóxicos que os compostos de extrativos

não-fenólicos, os quais foram também testados. Nishikawa et al. (1988) estudaram o

efeito de sete compostos benzílicos em K. pneumoniae. Como resultado destes

estudos, foi proposto que os álcoois aromáticos são menos tóxicos que seus

correspondentes ácidos, os quais são menos tóxicos que seus correspondentes

aldeídicos (LARSSON et al., 2000).

Lee et al. (1999) estudaram o efeito de compostos inibidores do hidrolisado de

madeira na produção de etanol por Sacharomyces cerevisiae. O produto da

degradação da lignina, p-hidroxibenzóico aldeído foi o composto mais inibidor

24

testado neste estudo. Os compostos com grupo metil adicional apresentaram

toxicidade menor e os ácidos aromáticos foram menos tóxicos do que seus aldeídos

correpondentes. Os autores concluiram que os produtos da degradação da lignina

foram mais inibitórios do que os produtos derivados de açúcares, como o furfural e o

HMF.

Fitzgerald (2004) conclui que o efeito inibitório da vanilina consiste

principalmente na sua habilidade de afetar a integridade da membrana

citoplasmática, resultando na perda de gradientes de íons, pH de homeostase e

inibição da atividade respiratória. A inibição por vanilina depende da concentração,

do tempo de exposição e do microrganismo utilizado.

Os íons de metais pesados podem ser provenientes da corrosão dos

equipamentos de hidrólise (íons ferro, cromo, níquel e cobre). Watson et al. (1984)

estudaram os efeitos dos íons Fe, Cu, Cr e Ni (em concentrações similares às

encontradas nos hidrolisados) sobre o crescimento de Cândida tropicalis em meio

sintético. Segundo estes autores, a presença dos íons cobre e cromo em

concentrações de 0-0,004 e 0-0,10 g/L, respectivamente, não tiveram efeito

significativo sobre μmáx, porém, 60% de redução foi notada para o meio contendo

0,10 g Ni+2/L. Existem poucos estudos sobre o efeito de cátions metálicos na

atividade das enzimas envolvidas no metabolismo de xilose. Girio et al. (1996),

citados por Parajó (1998c), verificaram que os íons Ca+2, Mg+2 e Mn+2 não afetam a

atividade da enzima XDH, ao passo que os íons Zn+2, Cd+2 e Co+2 inibiram

fortemente esta enzima.

Rodrigues et al. (2001) detectaram a presença de alguns minerais no

hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana, bem como de metais, provavelmente

derivados da matéria-prima lignocelulósica ou da corrosão dos equipamentos de

hidrólise. Segundo os autores, as concentrações de alguns íons encontrados no

hidrolisado não foram consideradas inibitórias da atividade microbiana quando

comparados aos resultados obtidos por Watson et al. (1984).

2.1.2 Tratamento do hidrolisado

A fermentação de hidrolisados não destoxificados é caracterizada por uma

cinética lenta, com rendimentos e produtividades limitadas, quando comparada à

fermentação realizada a partir de açúcares comerciais ou hidrolisados

25

destoxificados. Isto é devido à presença de uma variedade de compostos que atuam

como potentes inibidores do metabolismo microbiano. Muitos estudos têm sido

realizados para identificar os compostos inibidores do hidrolisado hemicelulósico,

sendo de grande importância o conhecimento destes inibidores e como minimizar

seus efeitos negativos para se obter uma grande eficiência num processo

fermentativo (PALMQVIST e HAHN-HÄGERDAL, 2000b).

De acordo com Taherzadeh et al. (2000a) existem quatro diferentes

alternativas para contornar o problema dos inibidores dos hidrolisados

hemicelulósicos: (1) Evitar a formação dos inibidores durante hidrólise; (2)

Destoxificar o hidrolisado antes da fermentação; (3) Desenvolver espécies de

microrganismos capazes de tolerar os inibidores; (4) Converter os compostos tóxicos

em produtos que não interferem no metabolismo microbiano. Segundo estes

autores, novas espécies de microrganismos metabolicamente engenheiradas para

aumentar sua tolerância aos inibidores podem diminuir a necessidade de

destoxificação dos hidrolisados. Porém, não se tem totalmente definido contra quais

compostos é requerida esta resistência.

Vários tratamentos vêem sendo propostos com o objetivo de reduzir as

concentrações dos compostos tóxicos presentes nos hidrolisados a níveis não

inibitórios ou até mesmo eliminá-los, visando a melhoria da fermentabilidade dos

hidrolisados (DOMINGUEZ et al., 1996; GARCIA, 2006; MATOS, 2004; PALMQVIST

e HAHN-HÄGERDAL, 2000b; PRATA, 1997; ROBERTO et al., 1991a; VILLARREAL

et al., 2006; VIÑALS, 2001). Estes tratamentos podem ser classificados em função

da forma de realização (individual ou combinado) e da natureza dos agentes

empregados (físico, químico e biológico). A eficiência do método de destoxificação

depende do tipo de hidrolisado hemicelulósico e da espécie de microrganismo

empregada, uma vez que cada tipo de hidrolisado apresenta diferente grau de

toxicidade, e cada espécie de microrganismo apresenta diferente grau de tolerância

aos inibidores (Palmqvist & Hahn-Hägerdal, 2000a). Antes da escolha do método

deve-se considerar a composição do hidrolisado, a qual varia de acordo com a

matéria-prima e as condições de hidrólise empregadas (LARSSON et al., 1999b).

O método físico de destoxificação do hidrolisado baseia-se no processo de

concentração por evaporação à vácuo, que reduz a concentração de compostos

voláteis presentes como ácido acético, furfural e vanilina. Porém, este método

também aumenta moderadamente a concentração de compostos tóxicos

26

não-voláteis como extrativos e derivados de lignina e, conseqüentemente, seu grau

de inibição (PALMQVIST e HAHN-HÄGERDAL, 2000a). Esta situação pode ser

contornada associando a evaporação a outro método de destoxificação

(LARSSON et al, 1999; PALMQVIST e HAHN-HÄGERDAL, 2000b).

Converti et al. (2000) e Rodriguez et al. (2001) relataram que o método de evaporação é capaz de remover ácido acético, furfural e outros compostos voláteis

do hidrolisado hemicelulósico, aumentando a produtividade do processo

fermentativo para produção de xilitol.

Converti et al. (2000) estudaram os processos de explosão à vapor e pré-

hidrólise com ácido sulfúrico diluído para a hidrólise de Eucalyptus globulus para a

produção de xilitol. Os autores concluiram que o processo de explosão à vapor é

capaz de hidrolisar mais rapidamente a madeira, mas o hidrolisado produzido desta

maneira requer fortes tratamentos de destoxificação. A precipitação através da

elevação e abaixamento do pH e a adsorção com carvão ativo foram mais

adequados para a remoção dos compostos derivados da lignina.

Os métodos químicos baseiam-se na precipitação de compostos tóxicos e na

instabilidade de alguns inibidores em determinado valor de pH (MARTINEZ et al.,

2000; SILVA et al., 1998;), na extração com solventes orgânicos (CRUZ et al., 1999),

na adição de substâncias redutoras (PARAJÓ et al.,1997b), na adsorção com carvão

ativo (DANNER et al., 2003; GINORIZ, 2001; MARTON, 2002b), na utilização de

resinas de troca iônica (CANILHA et al., 2003, GARCIA, 2006; LARSSON et al.,

1999b; NILVEBRANT et al., 2001; VIÑALS, 2001) e na combinação deles

(ALVES et al., 1998; KULKARNI et al., 1998b; MARTON, 2005; PRATA e HISS,

1998; VILLARREAL, 2005).

O processo de precipitação pela alteração do pH causa efeitos benéficos

como uma parcial remoção de ácidos (acético e tânico) e compostos fenólicos,

precipitação de íons metálicos pesados e conversão de furfural em ácido furfurílico.

No entanto, os açúcares podem ser parcialmente degradados (ROBERTO et al.,

1994; SILVA et al., 1991). Nesse processo, óxido de cálcio (CaO), hidróxido de

cálcio Ca (OH)2 ou outro hidróxido é adicionado ao meio até se alcançar valores de

pH entre 7 e 10,5 e logo é adicionado ácido para abaixar o pH. O precipitado

formado, constituído principalmente por sais de cálcio de baixa solubilidade, como o

sulfato, é eliminado por filtração à vácuo. Este método foi realizado sob condições de

calor, uma vez que a solubilidade do sulfato de cálcio diminui em alta temperatura.

27

Em estudos realizados com hidrolisados hemicelulósicos de bagaço de cana-de-

açúcar tratados pelo método de alteração de pH observou-se uma eliminação total

do furfural, no entanto, a redução do ácido acético no meio foi parcial (FELIPE et al.,

1993).

De acordo com Palmqvist e Hahn-Hägerdal (2000a), o ajuste do pH até 10

com NaOH ou Ca(OH)2 tem sido relatado como capaz de diminuir a concentração

das cetonas de Hibbert presentes no hidrolisado ácido diluído de madeira, em cerca

de 22%, e as concentrações de furfural e de HMF em cerca de 20%. Porém, a

concentração de ácido acético não foi afetada por nenhum dos tratamentos.

O tratamento com carvão ativo é um método eficiente e econômico para

redução das concentrações de compostos fenólicos (PARAJÓ et al., 1996a),

compostos aromáticos (PARAJÓ et al., 1997b), furfural e HMF (MUSSATO et al.,

2001), encontrados nos hidrolisados hemicelulósicos, e tem sido capaz de melhorar

a fermentabilidade do hidrolisado (GINORIZ, 2001).

Rodrigues et al. (1995) verificaram a influência da elevação do pH e do uso de

carvão ativo sobre a redução dos níveis de inibidores e de Carboidratos Redutores

Totais (CRT) presentes no hidrolisado hemicelulósico de eucalipto obtido por

hidrólise ácida. Os autores constataram que a elevação do pH para 8,0 e a adição

de carvão ativo é o procedimento que proporciona uma menor perda de açúcares

associada a uma maior redução de impurezas do hidrolisado hemicelulósico de

eucalipto.

Prata e Hiss (1998) verificaram que o tratamento por elevação de pH com

CaO e abaixamento com H2SO4 combinado com adsorção por carvão ativo

proporcionaram melhores resultados de crescimento da bactéria

Klebsiella pneumoniae em meio preparado com hidrolisado hemicelulósico de

eucalipto, obtido por hidrólise ácida.

Ginoriz (2001) encontrou como melhor condição de tratamento do hidrolisado

hemicelulósico de eucalipto (fator de conversão de xilose em xilitol por C.

guilhermondii de 0,52 g/g e formação de xilitol de 42,9 g/L), a elevação do pH deste

para 3,5 com CaO seguida da adsorção em carvão ativo pulverizado SYNTH (2,4%,

m/v) sob agitação de 200 rpm, 30 oC por 34,5 min. Mussato e Roberto (2001)

utilizaram hidrolisado hemicelulósico de palha de arroz para o estudo do efeito do

tratamento com carvão ativo na bioconversão de xilose em xilitol por

C. guilhermondii e encontraram que o grau de remoção dos compostos fenólicos

28

aumentou quando a razão hidrolisado:carvão foi diminuída de 120 para 24 g/g.

Contudo, os melhores valores de rendimento (0,72 g/g) e produtividade volumétrica

(0,61 g/L.h) do processo fermentativo foram alcançados com a razão de 40 g/g, a

qual removeu 27% dos compostos fenólicos. Estes estudos demonstraram ainda que

esses parâmetros tiveram um aumento de 22 e 45%, respectivamente, em relação

àqueles obtidos sem tratamento com carvão.

MARTON (2002b) avaliou, para quatro marcas de carvões ativos pulverizados

nacionais (SYNTH, BRASILAC, CARBOMAFRA e CARVORITE), os parâmetros

temperatura (T), tempo de contato (tc), agitação (A), pH e concentração de carvão

(CC), e não foram observadas diferenças significativas em relação à produtividade

volumétrica de xilitol (QP) para os diferentes carvões usados no tratamento. Porém, o

carvão ativo CDA da BRASILAC foi selecionado entre os avaliados por apresentar a

maior relação área superficial/custo do produto. A condição estabelecida de

tratamento (T=60 ºC, tc=30min, A=100 rpm, pH 2,5 e CC=1%) permitiu remoção

média de 44,18% de ácido acético, 76,22% de fenóis, 58,27% de furfural e 59,69%

de 5-hidroximetilfurfural, além da clarificação do hidrolisado. A fermentação deste

hidrolisado, com 64 horas, resultou em um consumo de 94,14% de D-xilose, fator de

conversão de D-xilose em xilitol de 0,66 g/g e produtividade volumétrica de xilitol de

0,51g/L.h, embora esta produtividade seja ainda considerada baixa em relação à

desejada em processos de bioconversão.

Outro método de tratamento químico é o de adsorção por resinas de troca

iônica, contudo, seu custo é alto quando comparado com outros tratamentos

(LEE et al., 1999).

As resinas de troca iônica são compostos macromoleculares constituídos por

um esqueleto tridimensional no qual fixam-se os grupos ativos. Estas permitem

trocar os íons não desejáveis da solução problema por aqueles que se encontram

saturando os grupos funcionais da resina. Este processo de equilíbrio pode ser

representado pela seguinte equação: RA + B → RB + A, onde RA e RB representam

as resinas na forma A e B respectivamente, e A e B os íons trocados. As reações de

troca iônica são estequiométricas, reversíveis e possíveis com qualquer composto

ionizável. A natureza reversível da reação permite o repetido uso das resinas, desde

que estas não sofram mudanças substanciais da sua estrutura. A velocidade da

reação depende da seletividade da resina (DECHOW, 1989).

29

Uma reação de troca iônica pode ser definida como uma troca reversível de

íons entre uma fase sólida (matriz) e uma fase líquida (solução problema). Os

trocadores carregados positivamente têm contra íons carregados negativamente

(ânions) disponíveis para serem trocados, e são denominados trocadores aniônicos.

Logo, os trocadores carregados negativamente têm contra-íons positivos (cátions) e

são denominados de trocadores catiônicos. Como características principais das

resinas encontram-se a não-solubilidade em água e em solventes orgânicos e

inorgânicos mais comuns. Possuem uma estrutura hidrofílica de forma regular e

reproduzível, rápida velocidade de troca e estabilidade física em termos de força

mecânica e resistência à atrição. As resinas, ao contrário do carvão ativo, podem ser

regeneradas com solventes polares como metanol, acetona e eletrólitos, inclusive a

água (HARLAND, 1994).

A capacidade de troca máxima das resinas é um parâmetro importante no

processo de troca iônica e varia segundo as características das resinas,

relacionando o tamanho dos poros e a área superficial com as características das

soluções a serem tratadas (densidade e viscosidade). Esta capacidade é

influenciada também pelos canais preferenciais que podem formar-se no leito das

resinas, pelo fluxo de alimentação empregado, pelas obstruções e pela eficiência da

regeneração (NÁPOLES et al., 1998).

As resinas de troca iônica são classificadas segundo os grupos ativos em,

catiônica ácido forte (fortemente ácida), catiônica ácido fraco (fracamente ácida),

aniônica base forte (fortemente básica) e aniônica base fraca (fracamente básica)

(Tabela 2.1). Segundo a estrutura polimérica, as resinas podem ser classificadas em

estirênicas (copolimerização de monômeros divinilbenzeno e de estireno) ou

acrílicas (copolimerização de monômeros divinilbenzeno e de ácido acrílico ou de

ácido substituído).

Tabela 2.1 Classificação das resinas de troca iônica em função do grupo funcional e da força iônica

Classificação Grupo funcional Forma iônica

Catiônica ácido forte -SO3- -SO3-H+ ; -SO3-Na+

Catiônica ácido fraco -COO- -COO-H+

Aniônica base forte TipoI -CH2N(CH3)3+ -CH2N(CH3)3+Cl-

Aniônica base forte Tipo II -CH2N(CH3)2(CH2CH2OH)+ -CH2N(CH3)2(CH2CH2OH)+Cl-

Aniônica base fraca -CH2NH(CH3)2+ -CH2NH(CH3)2+Cl-

30

A seletividade das resinas depende de fatores como a valência e o tamanho

do íon trocado, a forma iônica da resina, a força iônica total da solução,

entrecruzamento das resinas, o tipo de grupo funcional e a natureza dos íons não

trocados. A Tabela 2.2 apresenta a seletividade para cada um dos tipos de resinas,

de acordo com DANDEL e ANDEN (1989), citados por Harland (1994).

Tabela 2.2 Ordem de afinidade de diferentes resinas por íons em soluções diluídas (HARLAND, 1994).

Segundo Frazer e McCaskey (1989), o emprego de resina de troca iônica é o

processo que leva aos melhores resultados na conversão de substrato em produto

(96% do rendimento teórico). Além das resinas, estes autores obtiveram valores de

conversão de substrato em produto (Yp/S) em torno de 0,3 g/g, empregando carvão

ativo, etil-acetato, clorofórmio, tricloroetileno, benzeno e hexano, após neutralização

do hidrolisado com hidróxido de cálcio, indicando serem esses tratamentos

promissores para a remoção dos inibidores do metabolismo microbiano.

Dominguez et al. (1996) avaliaram a combinação de resina catiônica (DOWEX

50WX4) e neutralização com CaCO3 para tratamento do hidrolisado hemicelulósico

de bagaço de cana com vistas à obtenção de xilitol. Os resultados demonstraram

que o tratamento reduziu a atuação dos agentes tóxicos e favoreceu a formação de

xilitol, que aumentou de 10 g/L para 28 g/L em 96 h de fermentação com a levedura

mutante Candida sp 11-2, comparado ao tratamento em que se fez somente a

neutralização com CaCO3.

Kulkarni et al. (1998) utilizaram as resinas DUOLITE catiônica C-20 (H+) e a

aniônica A-368 (OH-) para purificação de xarope de D-xilose obtido de casca de

algodão em rama. Foram empregadas diferentes temperaturas (30, 40 e 50 oC) e

Resina Seletividade

Catiônica ácido forte Ag+>Cs+>K+>NH4+>Na+>H+>Li+, Ba2+>Pb2+>Ag2+>Sr2+>Ca2+

Catiônica ácido fraco H+>>Cu2+>Pb2+>Ni2+>Co2+>Fe2+>Ca2+>Mg2+>Na2+>K+ > Cs+

Aniônica base forte

TipoI SO42->HSO4->I ->NO3->Br ->Cl ->HCO3->HSiO3->F ->HO-

TipoII SO42->HSO4->I ->NO3->Br ->Cl ->HCO3->HO->HSiO3->F -

Aniônica base fraca OH- >> SO42- > HSO4- > I - > NO3- > Br - > Cl - > F -

31

vazões de alimentação (5, 10 e 15 VL/h, VL/h: volume de leito por hora). Observou-se

que a temperatura de 30 oC e o fluxo de alimentação de 10 VL/h com a resina C-20

combinada com a resina A-368 a 40 oC e fluxo de alimentação de 15 VL/h, resultou

na remoção de 93,6% de fenóis e 100% da coloração. Segundo os autores o fluxo

de alimentação influencia na difusão das moléculas, porém a remoção dos fenóis

permaneceu com valores de 89,93, 90,97 e 92,97% para os respectivos fluxos de 5,

10 e 15 VL/h.

Nápoles et al. (1998) compararam o tratamento com carvão ativo e com uma

série de resinas de troca iônica catiônica e aniônica do hidrolisado hemicelulósico de

cana-de-açúcar concentrado 3 vezes. Obtiveram uma redução dos inibidores ácido

acético e fenóis de 15,2 e 54,7% usando carvão ativo e de 92,5 e 98,9% usando

resinas de troca iônica. Ainda obtiveram, com as resinas, um aumento de 36,5% na

conversão de xilose em xilitol e de 85,6% na produtividade em xilitol, em relação ao

tratamento com carvão ativo.

Nilvebrant et al. (2001) trataram hidrolisado de madeira com resinas de troca

iônica catiônica e aniônica para a produção de etanol. As resinas de troca aniônica

foram mais eficientes, removendo altas quantidades de fenóis, furanos, aldeídos e

ácidos alifáticos do hidrolisado, obtendo produtividade e rendimento em etanol de

1,71 g/L.h e 0,46 g/g, respectivamente. As resinas de troca catiônica apresentaram

rendimento similar (0,45 g/g), porém, baixa produtividade (0,65 g/L.h). Para o

hidrolisado não tratado a produtividade e rendimento obtidos foram de 0,21 g/L.h e

0,42 g/g, respectivamente.

Viñals (2001) utilizou diferentes resinas de troca iônica no tratamento do

hidrolisado hemicelulósico de bagaço-de-cana para obtenção de xilitol, e a máxima

produtividade volumétrica em xilitol e concentração de produto obtidas foram de

0,679 g/L.h e 25 g/L, respectivamente, quando utilizou a seqüência de resinas

aniônicas A-860S e A-500, seguida da catiônica C-150 e finalizada com a resina

aniônica fraca A-103S, todas da PUROLITE. Para esta condição de melhor

produtividade, obteve-se 100% na remoção de ácido acético, 100% na remoção de

furfural, 100% na remoção de hidroximetilfurfural, 86,44% na remoção de fenóis e

97,48% na remoção de cor.

Villarreal et al. (2006) estudaram dois métodos de destoxificação do

hidrolisado de aparas de eucalipto, um empregando carvão ativo e outro um sistema

de resinas de troca iônica para a produção de xilitol por C. guilliermondii. Os dois

32

tratamentos apresentaram melhoras na fermentabilidade do hidrolisado de aparas

de eucalipto, porém, o tratamento com resinas de troca iônica foi mais eficiente

proporcionando uma produtividade volumétrica (Qp) de 1,04 g/L.h e formação de

xilitol de 50,18 g/L, utilizando a seqüência de resinas Applexon catiônica, A-860,

C-150 e Applexon aniônica no hidrolisado concentrado até 80 g/L de xilose. Os

baixos valores dos parâmetros fermentativos obtidos com o tratamento com carvão

(Qp=0,25 g/L.h e xilitol 29,5 g/L) podem ser explicados pelo efeito dos inibidores,

que não foram removidos a um nível considerado não tóxico para a levedura

C. guilliermondii.

Garcia (2006) comparou dois métodos de destoxificação do hidrolisado

hemicelulósico de aparas de eucalipto nos parâmetros fermentativos para a

produção de 2,3-butanodiol por Klebsiella pneumoniae. O autor concluiu que o

tratamento com resinas de troca iônica (seqüência A-860S, A-500, C-150 e A-103S)

foi mais eficiente que o tratamento com carvão ativo, pois removeu 100% dos

inibidores dosados, resultando numa produtividade de 2,8 g/L.h e uma formação de

produto de 29,80 g, enquanto que com o tratamento com carvão obteve-se

1,28 g/L.h e 15,8 g, respectivamente. Em estudo subseqüente, Rossi (2006)

constatou que a resina A-103S pode ser eliminada do processo de tratamento do

hidrolisado quando este for empregado para a produção de butanodiol em sistema

descontínuo alimentado.

Os métodos biológicos de tratamento envolvem o uso de enzimas específicas

ou microrganismos que agem sobre o composto tóxico presente no hidrolisado. A

utilização de microrganismos tem sido proposta para remoção seletiva de compostos

inibidores presentes nos hidrolisados hemicelulósicos (JÖNSSON et al., 1998;

SCHNEIDER, 1996).

2.1.3 Adaptação do microrganismo

Outra forma de minimizar o problema da toxicidade dos inibidores é a

utilização de células adaptadas (AMARTEY e JEFFRIES, 1996; FELIPE et. al., 1996;

FRAZER e McCASKEY, 1989; SENE, 2001). Este método é baseado em

fermentações sucessivas, onde o microrganismo de cada experimento é utilizado

como inóculo para o próximo ensaio. Frazer e McCaskey (1989) concluíram que a

adaptação possibilita obter um inóculo capaz de se desenvolver e produzir maior

33

quantidade de 2,3-butanodiol quando comparado com o inóculo obtido em meio

sintético. Além disso, estudos realizados com diversos inibidores oriundos do

processo de hidrólise ácida demonstram que pelo menos alguns desses compostos

podem ser metabolizados ou modificados por Klebsiella pneumoniae ou ter seu

efeito inibidor atenuado com o prolongamento do tempo de incubação (NISHIKAWA

et al., 1988). Frazer e McCaskey (1991) verificaram que os compostos fenólicos

seringaldeído e vanilina são os maiores inibidores do crescimento e da produção de

2,3-butanodiol.

Adaptação de células foi utilizada por Amartey e Jeffries (1996) na

bioconversão de hidrolisado de palha de milho por Pichia stipitis para produção de

xilitol, os quais destacaram a reciclagem de células adaptadas como a forma mais

econômica para aument

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