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EpiHRMAssay: un metodo rapido, economico e affidabile per l’analisi della

stabilità genetica ed epigenetica delle piante propagate in vitro e non

Rosario Muleo1, Marco Cirilli1,2, Emilia Caboni3, Ines Delfino1, Fabiano Gattabria1, Calogero Iacona4

1Università degli studi della Tuscia, Via S. C. DeLellis snc., 01100 Viterbo, Italia;2Università degli studi di Milano, Via Celoria 2, 20133 Milano; 3Consiglio per laricerca in agricoltura e per l’analisi dell’economia agraria, Centro di ricercafrutticoltura, Via di Fioranello 52, 00134 Roma, Italia; 4Università di Pisa, Via delBorghetto 80, 56124 Pisa. Italia

Laboratorio di Ecofisiologia Molecolare delle Piante Arboree – DAFNE - UNITUS

Pescia, 29 – 31 maggio2017


La propagazione agamica e la coltura in vitro:Le piante non si sono evolute per stare in contenitori ristretti, quali quelli della propagazione agamicaLe condizioni di propagazione generano stressVariazione somaclonale

Cosa occorrerebbe? strumento molecolare economico, facile da impiegare, veloce e

ripetibile, che indentifichi sia le mutazioni genetiche sia epigenetiche (metilazione).


La metilazione del DNA è uno dei meccanismi epigenetici con ilruolo di:1. protezione del genoma da elementi mobili (trasponi) e

retrovirus,2. impronta genomica,3. regolare il silenziamento indotta da eterocromatina,4. istruzioni per i meccanismi dell’espressione genica (dove,

quando, quanto un gene debba esprimersi).

Nei mammiferi la metilazione è diffusa nell’intero genoma, ad eccezione di una corta regione denominata CpG islands.

Nelle piante la metilazione avviene anche in sequenzeasimmetriche, quali: CpHpG and CpHpH (H = A, C, or T),diffuse irregolarmente nelle regioni geniche ed inter-geniche


In concreto cos’è la metilazione del DNACromatina nel nucleo Cosa avviene quando un

organismo fa un’esperienza?

Quali sono le conseguenze?


Methyltransferase1 (MET1), mantiene la metilazione simmetrica CpG;

Chromomethylase1, 2, and 3 (CMT1, 2, and 3), specifici delle piante per i siti asimmetrici (CpHpG e CpHpH);Domain Rearranged Methyltransferases (DRMs), metilano de novoil DNA alle sequenze contesto.

Decreased DNA Methylation1 (DDM1), membro della famiglia SWItch/Sucrose Non-Fermentable (SWI/SNF), rimodella la cromatina intervenendo nella metilazione del DNA e silenziamento dei trasposoni, facilitando l’accesso di MET1 alle regioni target.

Repressor Of Silencing1 (ROS1) e Demeter-like proteins (DML2 and 3) sono delle glicosilasi e demetilano il DNA, hanno anche un ruolo di protezione dei geni dall’effetto deleterio della metilazione.

Nelle piante, almeno tre tipi di metiltransferasi regolano la metilazione:


Le metodologie disponibili per determinare la metilazioneprevedono il trattamento del DNA templato dell’intero genomacon bisolfito, seguito da:a. sequenziamento e comparazione del templato trattato e non,b. analisi PCR del singolo locus.

Le metodologie per singolo locus sono costose e richiedono molto tempo per ottenere informazioni.

Cosa avviene con il trattamento di

bisolfito?


Uno strumento che valuti qualitativamente equantitativamente lo stato di metilazione, non solo delgenoma intero, ma di regioni target di geni sensibili, pergenerare relazioni tra:1. gradienti di fattori ambientali ed espressione genica,2. tra condizioni ambientali e accadimenti di eventi di

variazione somaclonale, con la conseguenteidentificazione di modifiche genetiche

Metodi associano le proprietà delle curve di melting del DNAdell’amplicone la sensitività alla metilazione:a. methylation-sensitive melting curve analysis (MS-MCA),b. methylation-sensitive high-resolution melting (MS-HRM).

Cosa occorre per un test diagnostico da facile impiego nella certificazione e tracciabilità


Materiale vegetale

DNA templato: Estratto con il protocollo CTAB e sciolto in TE buffer, e l’RNA digerito con DNeasy Tissue Extraction Kit.

Germogli di P. persica L. Batsch della cv Rich Lady, generati da una singola gemma ascellare campionata in primavera da albero adulto. Mezzo di moltiplicazione composto da macro elementi QL e micro elementi MS, 87,7 mM sucrose, 5.5 g L-1 agar, arricchito con 1,11 µM BA, 16,3 µM adenine sulphate, 0,29 µM IBA and 0,19 µM GA3. pH to 5,7. Temperatura 24±2°C, 16 h fotoperiodo ad una irradianza di 40 µM m-2

s-1, cool white fluorescent tubes (Fluora L58 vv/77, Osram, Italy). Sub-cultura ogni 21 giorni. I campioni sono stati prelevati dalla pianta donatrice cresciuta in campo, e da foglie e steli dei germogli clonati in vitro alla 4th, 18th e 23th subcultura.

Trattamento con bisolfito: Il trattamento del bisolfito ed il recupero del DNA trattato è stato effettuato con EpiTect Bisulphite kit (Qiagen, Hilden, Germany).Generazione di standard non metilati e epialleli sintetici per il modello di calibrazione: gli standard non metilati (UMstd) e gli epialleli per i geni DDM1, CMT3 e ROS1 sono stati ottenuti ottenuti tramite amplificazione PCR dal templato del DNA genomico. Gli ampliconi sono stati trattati con bisolfito tramite EpiTect Bisulphite kit, ed impiegati come controlli UMstd per I test HRMA. Gli epialleli standard di CMT3 sono stati sintetizzati da GeneArt (Life Technologies, Carlsbad, CA) come frammenti a doppia stringa.


Analisi ad High resolution melting (HRM) e analisi di methylation-sensitive high resolution melting digitale (dMS-HRM)PCR eseguite con Light Cycler® 1.5 (Roche, Germany), con SensiMix kit(Quantace, USA) e LC-Green II plus dye (Idaho Technology, USA), in unvolume totale di 20 μL.HRMA eseguita separatamente con HR1 instrument (Idaho Technology, IdahoUSA) ad un ramp di temperature compreso fra 70° to 90°C, con incrementi di0.10°C s-1.Curve di melting normalizzate con software fornito con strumento e prodottele curve di Derivative e Difference Plot.

Identificazione delle regioni ricche di CpG islands e disegno dei primerSequenze dei geni DDM1, CMT3 e ROS1 identificati in Peach Genome v1.0assembly (http://www.rosaceae.org/species/prunus_persica/genome_v1.0).Regione individuata con Methyl Primer Express® v1.0 software (oppure conMSP-HTPrimer).

http://www.rosaceae.org/species/prunus_persica/genome_v1.0


Step 1CpG

RisultatiLocalizzazione genomica di ciascun promotore e regioni ricche in CpG,

sequenza dei primer, dimensione degli ampliconi, e potenziali siti di metilazione


Identificazione manuale di CpHpG e CpHpH (H = A, C, T). Nei siti dove piùdi una citosina è presente in un sito CpHpH (sottolineate in nero),solamente uno è da scegliere (carattere in blu)

Convertire le rimanenti citosine (C) in timine per ottenere una sequenza metilata completa.

Step 2

Step 3


In A) curve di melting (Derivate Plot), del gene ROS1, degli ampliconi deiDNA templati estratti tal quale. In B) curve di melting degli ampliconi deiDNA dopo il trattamento con bisolfito.In (B) il cursore verticale in nero indica il valori di temperatura del picco dimelting del frammento standard non metilato (UMstd), e quello in rossoquello del campione del clone 23sub.cl4.

Presenza di mutazioni epigenetiche e non genetiche.

Tra i germogli sono presenti germogli epiallelici per la regione di regolazione del gene ROS1.

Pianta donatrice in campo

C) CMT3 untreated

D) CMT3 BS-treated

A) DDM1 untreated

B) DDM1 BS-treated

(°C) (°C)

(°C) (°C)


Presenza di mutazioni epigenetiche e non genetiche tra i cloni.

Presenza di un clone epiallelico per la regione di regolazione del gene DDM1

Tra i germogli sono presenti germogli epiallelici per la regione di regolazione del gene DDM1 e CMT3.


(A) Allineamento sequenza amplicone UT_DNA (metilato 0%) e del tutto metilato (100%). (B)Derivative melting plots predetti dal software uMELTSM con l’algoritmo MELTSIM. (C)Visualizzazione CyMATE delle configurazioni rappresentative per ogni classe epiallelica delmodello di calibrazione. Le classi di epialleli sono generati dalla percentuale di citosina metilata(mC%) e dal numero dei siti metilati (#mC). Le configurazioni in ogni classe di metilazionedifferisce per la distribuzione della metilazione in E (CpG) e/o in L (CpHpG/CpHpH). (D) Valoredi #mC in funzione dei valori di Tm-s (±SD) media predetta per ogni classe di epialleli.

gene DDM1

La linea in giallo e in rosso indica la derivative melting plot di 10L and 8E2L.

E: metilazione in CpG.L: metilazione in CpHpG/CpHpH.

gene CMT3


gene ROS1


Modelli di calibrazione Valori di #mC ottenuti dai profili di melting simulati(quadrati neri) e da quelli sperimentali (circoli rossie verdi) in funzione delle Tm - UMstd Tm. La linearossa è il risultato della procedura di simulazionedei dati in base all’ipotesi di dipendenza lineare#mC = a + b (Tm - UMstd Tm).Esempio: i parametri di fitting per DDM1(n=numero di valori usati per la costruzione delmodello = 96): a = 0.81±0.12 and b = 3.76±0.05(°C)-1 con R = 0.993. Parametri di fitting per CMT3(n=113): a = 0.21±0.23 and b = 3.53±0.07 (°C)-1 conR = 0.978.


Quantificazione dello stato di metilazione tra campioni clonati a diverse subcolture con l’ausilio dei modelli di calibrazione sviluppati in silico.

gene DDM1

In (A) curve di derivative melting generate dal set di campioni, ciascuno contenente unospecifico ♯mC. Temperature di melting osservate (Tm-o) - valori dei picchi delle curve di ciascunamplicone (curve colorate). In nero ed in rosa la curva del UMstd di DDM1 e del clonesub23.cl4 sample. In (B) la tabella con i valori, di ciascun clone, di Tm-o determinati dall’analisiHRMA comparati con i valori predetti e la quantità di numero mC metilate e la % predettarispetto al totale. In (C) la rappresentazione CyMATE della posizione dei siti di metilazioneindividuati con il sequenziamento dell’amplicone.


gene CMT3

Quantificazione dello stato di metilazione tra cloni campionati a diverse subcolture, con l’ausilio dei modelli di calibrazione sviluppati in silico.

gene ROS1


I valori che definiscono il range diaffidabilità del modello sono calcolaticome differenza tra valorisperimentali Tm-o di frammenti #mC(denominati Actual), e quelli predettiin silico (denominati Predicted),relazionati con la temperatura dimelting osservata (Tm-o) di ciascuncampione di tutti i geni.

Affidabilità del valore predittivo del modelloL'affidabilità del modello previsionale è stata valutata confrontando il #mC osservatoverificato con sequenziamento del DNA-bisolfito, con il #mC predetto. I risultati delsequenziamento confermano la fiducia dei modelli di previsione. Per gli ampliconiDDM1 e CMT3, il numero di #mC previsto differisce da quelli osservati entro un rangeinferiore a ±1 (valore minimo della incertezza probabilistica di una quantità discreta),confermando così l’affidabilità delle predizioni dei modelli. Anche per gli ampliconi diROS1 questo è vero, anche se l'errore nella predizione di #mC aumenta fino a circa ±2per sub23.cl4.


Quantificazione dello stato di epiallelismo in un campione

Clone sub18.cl1b

Quantificazione di ciascun epiallele del gene DDM1 con la tecnica MS-HRMA nelclone sub18.cl1b, epieteroallele. Il picco di melting con un basso valore Tm-o(78,61°C) è generato dall’epiallele (DDM1-α), con 2 siti metilati, mentre la curva dimelting con alto valore Tm-o (81,04°C) è generato dall’allele (DDM1-β) con 11 sitimetilati. I due alleli sono presenti in una proporzione approssimativa di 40%, DDM1-α, e 60%, DDM1-β.

DDM1-α

DDM1-β

Generazione di curve di calibrazione

EpiHRMAssay di epialleli standard per la generazione di

Tm-o calibration***

Disegno dei primer EpiHRMAssay per ogni regione

target

Import target sequence in uMELTSM (set thermodynamic parameters) to generate in

silico Tm-s epiallele libraries** Amplificazione delle

regioni target

Quantificazione dello stato di metilazione con curve di

calibrazione e valori di Tm da PCR

Annotazione delle sequenze

Identificazione delle CpG islands

Selezione delle regioni CpG island

Sequenza totale del genoma identificazione delle sequenze

target*

Trasferimento in MethylPrimer Express (or MSP-HTPrimer) delle sequenze

target

Annotazione manuale dei siti CpHpG and CpHpH

Determinazione di polimorfismi

allelici con HRMA

Produzione di ampliconitrattati con bisolfito per generazione di UMstd

Estrazione DNA template

Trattamento con bisolfito per indurre modificazioni

EpiHRMAssay di regioni target



Gli eventi epigenetici sono complessi ed accadono con alta frequenza in condizioni di stress, condizionando la sintesi proteica ed il fenotipo.

EpiHARMAssay è un metodo che impiega kit semplici e rapidi, anche per il bisolfito, ed è:1. affidabile,2. semplice da applicare,3. economico, 4. non distruttivo ed impiegabile, anche in azienda, su molti campioni con

sequenze ignote.

Oggi, la conoscenza dei genomi ci permette di impiegare EpiHARMssayper determinare l’identità genetica ed epigenetica in individui il cui non è noto la sequenza dei genomi, purché sia nota quella di un singolo individuo della stessa specie.

Proposta progettuale: costruire una biblioteca pubblica degli eventi epigenetici possibili per le specie coltivate per garantire identità e stabilità del fenotipo


Grazie per la vostra attenzione

Laboratorio di Ecofisiologia Molecolare delle Piante Arboree – DAFNE - UNITUS


The GC-rich domain is enclosed within the empty black box (A). The broadening of the derivative melting curve can be modulated though the value of s parameter. Derivative plot of in silico predicted melting curve of CMT3 amplicon for extreme configurations of the epiallele classes with 0, 5, 10 and 15 methylated cytosine, using default value (0.00021) of s parameter (B), and s value of 0.25 (C). The adjustment of s parameters reduced the complexity of melting curve in the configurations 14E1L and 10E, as also experimental validated by the in tube HRMA of the respective synthetic amplicons (D).


In silico Tm-s values obtained for the DDM1 amplicon from melting curve profiles as generated by uMELTSM using the three selected thermodynamic sets (see text). The Tm-s values are shown as function of mC number.


Vista teorica della risoluzione di modelli di metilazione omoallelici e/o eteroallelici, determinabili con la HRMA dei prodotti di amplificazione PCR di DNA trattato con bisolfito. In A sono rappresentati campioni con metilazione omogenea che presentano comunemente un singolo picco di melting, con un valore Tm crescente con l'aumento del numero di siti metilati. Raramente, un ampliconeomoallelico per la metailazione o metilato avente domini GC potrebbe presentare una forma curva complessa con più domini di fusione. In B sono rappresentati campioni con metilazione eterogenea che consistono in una miscela di due o più epiallelici con diverso grado di metilazione. Comunemente, si può distinguere una miscela di epiallelici nonmetilati e completamente metilati perché il valore di Tm di ogni allele è diverso, che inequivocabilmente consente di identificare i due picchi di fusione. Quando il campione è composto da una miscela di epiteliali parziali metilati, i profili di fusione diventano molto complessi, a seconda del numero e della proporzione delle classi di epialite presenti. Quest'ultimo caso diventa difficilmente distinto dal caso di una curva di fusione complessa in campioni omogenei metilati.

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