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KISEP Information Korean J Otolaryngol 2004;;;;47::::1081-4

국소유전자 투입을 이용한 창상치유 및 조직공학

연세대학교 원주의과대학 이비인후과학교실

박 동 준

Local Gene Delivery for Wound Healing and Tissue Engineering

Dong-Joon Park, MD

Department of Otorhinolaryngology, Yonsei University Wonju College of Medicine, Wonju, Korea

서 론

조직공학은 개념이 정립된 지 약 십 수년 밖에 되지 않

는 신학문으로서 손상된 신체의 조직을 복원하기 위해 생

적합(biocompatible)하고 생 흡수(bioresorbable) 되는 재

료에 조직세포를 넣어 체외에서 배양한 후 이를 다시 손상

된 체내에 이식함으로써 조직의 재생을 유도하거나 그 자

체로서 인공장기기관(artificial organ)의 역할을 하도록 하

는 방법을 연구하는 학문이다.

그러나 최근에는 전통적 인공장기나 조직 이외에도 인공

장기로써의 신 기능성 의료용구, 인공피부, 창상재료, 신경

망, 중추신경재생, 뇌조직복제, 인공두피(모발), 생체접착

제, 약물전달시스템용 생체재료 개발 등을 포함한 넓은 의

미로 사용되고 있다.

따라서 현대의 조직공학은 초기의 단순한 개념, 즉 생체

재료인 폴리머(polymer)에 세포만 넣어 이식하는 단계를

지나 이 폴리머 자체에 여러 기능성 인자들이나, 성장인자

심지어 유전자 등을 Drug delivery system의 개념으로 첨

가하여 원하는 기능의 조직을 만들거나 재생시키는데 응용

하고 있다. 본 종설에서는 최근 이루어지고 있는 조직공학

기법 중에 유전자를 국소적으로 투입하여 결손 된 조직이나,

창상치유에 이용하는 최신기법에 대해 고찰해 보고자 한다.

배 경

뼈나 피부, 혈관 신경 등의 결손 부위나 창상치유를 위해

생 적합한 (biocompatible) 인공 혹은 자연물질을 충전해

세포의 이동(migration), 증식(proliferation) 그리고 분화

(differentiation)을 도모하는 방법은 최근에 흔히 사용되

는 치료법중의 하나이다. 그러나 이러한 방법들은 유용성

이나 효과적인 측면에서 많은 제한이 따르며 불완전한 조

직의 재생으로 말미암은 후유증도 만만치 않다.

조직공학의 발달로 이러한 결손이나 창상부위에 치유세포

로 분화가 가능한 줄기세포나 성체세포를(endogenous stem/

progenitor) 외부에서 생 적합한 틀(matrix scaffold)에 넣

어 일정기간 배양 후 결손의 재생을 유도하는 방법이 이미

적용되고 있다.1) 이 틀은 궁극적으로 체내에서 흡수되므로

이식된 세포들은 새로운 조직으로 생성되게 된다. 이러한

개념은 결국 간, 신장과 같은 복잡한 장기의 재생에도 이

론적으론 적용이 가능하다.

창상치유나 재생에는 여러 싸이토카인이나 성장인자들

이 관여하여 이들의 존재가 결과에 중대한 영향을 미침은

주지의 사실로서 이를 이용하여 조직의 재생을 도모하기도

한다.2) 예를 들어 당뇨 성 괘양의 경우 epidermal growth

factor를 도포하면 상피의 재생에 도움을 준다. 그러나 신

체 내부에 결손이 생길 경우 cytokine을 전신적으로(sys-temic injection) 주입할 수는 없다. 그 이유는 효과적인

target 농도에 이르려면 많은 양의 cytokine(or growth

factor)을 주입해야 하나 cytokine toxicity가 심하기 때

문이다. 이를 극복하기 위해 조직공학자들은 서방 성이 있

으며, 국소적으로 재 조합된 싸이토카인 이나 성장인자를

(sustained, local delivery of recombinant cytokines and

growth factors) 결손 부위에 주입하기도 하였다. 그러나

이 방법도 안전하고 효과적인 국소전달을 어렵게 하는 몇

가지 장벽이 있음을 알게 되었다. 첫째, 재 조합형의 싸이

토카인이나 성장인자의 반감기가 매우 짧으며 가격이 비

싸다는 점이다. 둘째는 서방형으로 약물이 방출된다 해도

고 농도로 인한 주위의 독작용은 존재한다는 것이다. 따

라서 주위의 세포에 독작용이 없으면서도 적어도 한달 이

상 오랫동안 활성 도를 유지하게 하는 방법이 필요하게

되었다.

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유전적 활성기질 기법 (GAM, Gene Activated Matrix

Technology)

이러한 장애를 극복하는 방법으로 성장인자를 재조합 단

백질의 형태가 아닌 플라스미드 DNA (Plasmid DNA) 형

태로 주입하는 연구가 시작되었다.3) 플라스미드 DNA로

포유동물의 세포에서 원하는 유전자를 이용해 이의 단백질

을 발현시키는 방법은 이미 오래 전부터 사용되어 왔으며

DNA 자체가 매우 안정적이고 폴리머와 결합을 잘하는 화

학적 성질을 가지고 있다(Fig. 1).

이론적으로, 유전자가 전달된 상처부위의 세포들은 자신

의 세포에서 재 조합된 싸이토카인이나 성장인자를 발현할

것이고 그 양은 적지만 매우 오랫동안 서서히 발현하게 되

므로 효과적인 조직재생을 이룩할 것이다. 또한 많은 양의

플라스미드를 만드는데 비용은 매우 저렴하며, 목표조직 이

외로 넘쳐난 DNA들은 혈액 속의 nuclease에 의해 완전히

파괴되어 전신적 독작용도 배제할 수 있다.4) 궁극적으로

plasmid DNA는 경제적이고 효과적인 치료제라 할 수 있다.

이러한 이론을 정립하고 이를 실험한 Jeffrey Bonadio 등

은 국소유전자전달에 의한 조직재생 법을 gene activated

matrix(GAM)이라 명명하고 이에 대한 연구를 발전시켰다.3)

GAM의 기본 성분은 두 가지 인데, 하나는 Plasmid DNA

와 생분해성 기질의 전달체이다(biodegradable structural

matrix carrier). 이는 동결 건조된 임플란트나, 스폰지, 주사

형 젤 그리고 GAM으로 코팅된 의료용품 등 그 형태를 다양

하게 응용 제작하여 상용화된 제품으로 공급할 수 있다.

GAM plasmid gene transfer의 작용기전은 다음과 같다.

즉, 상처회복에 도움이 될 protein의 유전자를 encoding 하

고 있는 plasmid DNA를 함유시킨 생체 틀(scaffold)을

상처부위에 넣으면, 주위에서 염증세포나 섬유아세포등 정

상적인 상처회복에 관여하는 세포들이 모여들게 된다. 이

들 중 일부의 세포가 DNA 전달이 이루어지며(gene tran-sfection, 그 기전은 밝혀지지 않았음) 이들 중 섬유아세

포가 큰 역할을 하게 된다. 이 섬유아세포에서는 지속적으

로 plasmid-encoded protein을 생성하게 되며 상처회복

이나 재생을 촉진 시키게 된다(Fig. 2).

플라스미드 유전자가 세포 내에서 gene transfection이

되면 세포 내에서 transcription에 의한 mRNA를 만들고

translation에 의한 protein을 만드는데 GAM implantation

에 의한 이런 현상은 재 조합된 protein을 주입했을 때와

비교하여 그 지속시간을 보면 수주 대 수시간의 차이임은

이미 밝혀진 사실이다.5)6)

Plasmid gene transfer를 사용하면 생체내에서 많은 양

의 재 조합된 단백질을 발현 시키는데 Bonadio 등의 연구

에 의하면 1.0 mg의 plasmid DNA를 생체에 넣으면 수

pico gram의 peptide가 2주 이상 발현됨을 알 수 있다.5)

현재까지 연구된 plasmid DNA의 생체물질로 된(biomate-rials) matrix carrier는 collagen(sponge, paste, gel), hy-aluronan, alginate 등이고 합성물질로는 poly(lactide-co-

glycolide)나 carboxymethylcellulose 등이 있다.

그간 연구된 GAM의 동물 모델로는 뼈,7) 피부,8) 건과

인대9) 심장 및 근육10) 뇌신경11) 등이 보고되어 있다.

GAM 연구의 예

Fang 등7)은 bone morphogenic protein-4 plasmid

Polymer-Based Gene Transfer

Polymer DNA

DNA-Polymer Complex

CYTOSOL NUCLEUS

Complex Entry Endosome

Plasmid release and uncoating

Tra

nscrip

tion

mRNAmRNATranslation

Pro

teinPolymer DNA

Complex Entry

CYTOSOL NUCLEUS

mRNA mRNA Translation

Protein Transcription

Endosome

Plasmid release and uncoating DNA-Polymer

Complex

Fig. 1. A schema of mechanism of the gene transfer.

Fig. 2. The schematic figure shows a GAM implant in a fresh wound site (inner area). A GAM at its most basic consists of two ingredients：plasmid DNA and a structural matrix carrier. As part of the wound healing response, granulation tissue fibroblasts proliferate and migrate from viable tissue (outer area) surroun-ding the wound into the GAM. Once there, fibroblasts take up and transiently express plasmid DNA. The GAM matrix has two functions：it holds plasmid DNA in the wound site (until cells arrive), and it acts as scaffolding that promotes fibroblast ingr-owth and accumulation near the DNA. While in the matrix, tran-sfected fibroblasts act as local in vivo bioreactors, producing plasmid-encoded proteins that stimulate wound repair (Bona-dio J Nat Med 1999)

박동준

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와 parathyroid hormone plasmid를 함께 뼈의 결손을 유

도한 동물모델에 사용시 뼈의 재생을 촉진시킴을 보고하였

고, Bonadio5) 역시 collagen sponge를 틀로 사용하여 위

의 두 plasmid로 개에서 1 cm이 넘는 뼈의 결손을 재유

합 시키는데 성공하였다.

Bone 뿐 아니라 Shea8) 등은 쥐의 피부에서 GAM을 이

용해 유전자의 서방성 발현을 확인 하였고, PDGF-beta

plasmid로 3-4배의 granulation tissue 생성을 확인하여

Fig. 3. Bone formation in the nudemouse subcutaneous space. After8 weeks of GAM implantation. TheGAM was consisted of chitosangel, BMP-7 (bone morphogenicprotein-7) plasmid DNA, and hu-man mesenchymal stem cells (Left).The toluidine blue staining revealsbone matrix as purple color (Right).(In paper preparation)

비 전 발전방향 핵심기술 전략제품 기능

혈액·세포 조직적합성이 우수한 신소재 합성기술

물리화학적 표면처리기술

천연/합성, 유/무기 하이브리드 재료기술

신기능성 고분자, 금속, 세라믹,

복합재료의 합성

생리활성물질 및 Gene activated matrix (GAM) 전달기술

조직재생 유도 지지체 개발기술

생체재료의 기능 및 분해 조절 기술

조직재생 환경 재조합 기술

바이오 인공조직 가공 및 대량생산

기술

바이오 인공조직의 이식기술

바이오 인공장기의 생체기능 분석

기술

체외 인공장기 기술

줄기세포-생체재료 복합체 배양기술

줄기세포 분리 및 대량 배양기술

세포와 생체재료를 결합한 생물반응기

에서의 대량 배양기술

세포은행 평가기술

생물안전성 평가기술

조직·혈액적합성 평가기술

독성·효능 평가기술

생체재료

및

조직공학

기술

인공장기·의료용구

및 생체적 합성재료 개발기술

바이오 인공장기 및

조직 재생용 재료 개발기술

세포-생체재료

복합체 배양기술

생체재료의

안전성·유효성 평가기술

인공안구, 시신경

인공치, 치골

인공피부, 창상재료

인공심장, 심장판막

인공혈액

인공혈관

인공고관절, 슬관절,

견관절

인공연골, 인공귀, 인공식도

인공뼈, 턱뼈, 두개골

인공인대

인공손톱

인공폐, 인공위, 인공소장, 인공대장

인공간장, 신장,

췌장

인공신경, 신경망

중추신경재생

뇌조직복제

인공고환, 음경, 질

생체접착제

신기능성 의료용구

Fig. 4. 차세대 국가 기술지도, 생체재료 및 조직공학기술(2002. 12 국가과학기술위원회).

국소유전자 투입을 이용한 창상치유 및 조직공학

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상처재생에 도움이 됨을 보고하였다.

Berry 등11)은 cranial nerve injury 회복을 위해 GAM

을 사용하였는데 쥐의 손상된 시신경에서 neural growth

factor plasmid를 사용해 시신경의 회복증진을 확인하였다.

본 저자도 bone morphogenic protein-7(BMP-7) pl-asmid로 누드마우스의 피하조직에서 chitosan을 틀로 이

용해 GAM 기법을 사용한 결과 1달 가량의 BMP-7 표현

을 확인 하였고 이로인해 초기 뼈의 기질생성을 확인할 수

있었다(Fig. 3).

GAM 연구의 중요성 및 결론

Human Genome Science사(미국)의 CEO인 William Hei-seltine은 생체재료와 조직공학을 이용한 인공장기 개발단

계를 4단계로 분류하고 있다. 1단계는 성장인자의 활동성

을 흉내 내는 인체자신의 복원기구를 흉내 내거나 복사하

는 것이며, 2단계는 필요한 생리활성인자로 체외에서 이식

되어야 할 조직과 장기를 키우는 단계이며 3단계는 세포

의 생물학적 시계를 조절함으로써 늙은 조직을 새롭게 하

는 단계이다. 마지막 단계인 4단계는 NT 및 IT와 재료과

학의 복합화로써 원자수준에서 공학화될 것이며 궁극적으

로 세포, 조직과 장기를 위한 새로운 여러 부품들이 자연

조직 내에서 이음매 없이 집적화되어 완전하게 될 것이라

고 예견하고 있다.

따라서 새로운 조직재생용 생체재료의 창제, 배아·성체

줄기세포를 포함한 세포원의 발굴과 대량생산, 생체재료

내에서의 분화, 탈분화, 생물반응기에 의한 장기조직의 대

량생산, 유전자 치료법, DDS들과의 혼합 및 안전성, 유효

성 평가기술이 필수적이며 인체를 모사한 IT+NT+BT

융합과정 역시 필수라 하겠다.

이러한 필요성에 의해 2002년 우리나라에서도 정부 주

도로 국내 유수 과학자를 중심으로 국가과학기술위원회를

발족하여 현재 국내외 기술연구개발 동향을 바탕으로 차세

대 국가 기술지도를 작성하였는데 여기의 핵심기술지도 사

항이 생체재료 및 조직공학 기술이고 이 안에 GAM 기법

이 포함되어 있다(Fig. 4).

그간 이러한 생체재료나 조직공학 기술은 주로 정형외과

나 치과, 성형외과 등에서 연구되어 왔으나 뼈, 연골, 피부

안면신경 등의 영역에서 선진국을 중심으로 이비인후과 영

역에서도 연구가 시작되고 있으며 국내의 이비인후과에서

도 대한 비과 생체재료 연구회(Korean Society for Rhinolo-gic Biomaterials) 설립이 추진되고 있어 연구의 발전 가

능성이 점차 높아지고 있는 추세이다.

REFERENCES

1) Langer R, Vacanti JP. Tissue engineering. Science 1993;260:920-5. 2) Meyer-Ingold W. Wound therapy: Growth factors as agents to pro-

mote healing. Trends Biotechnol 1993;11:387-92. 3) Bonadio J. Tissue engineering via local gene delivery. J Mol Med

2000;78:303-11. 4) Lew D, Parker SE, Latimer T, Abai AM, Kuwahara-Rundell A, Doh

S, et al. Cancer gene therapy using plasmid DNA: Pharmacokinetic study of DNA following injection in mice. Hum Gene Ther 1995;6: 553-64.

5) Bonadio J, Smiley E, Patil P, Goldstein S. Localized, direct plasmid-gene delivery in vivo: Prolonged therapy results in reproducible tissue regeneration. Nat Med 1999;5:753-9.

6) Giannobile WV. Periodontal tissue engineering by growth factors. Bone 1996;19 [Suppl 1]:23S-37S.

7) Fang J, Zhu Y-Y, Smiley E, Bonadio J, Rouleau JA, Goldstein SA, et al. Stimulation of new bone formation by direct transfer of osteoin-ductive plasmid genes. Proc Natl Acad Sci USA 1996;93:5753-8.

8) Shea LD, Smiley E, Bonadio J, Mooney DJ. Controllable DNA deli-very from three-dimensional polymer matrices. Nat Biotechnol 1999; 17:551-4.

9) Zhu YY, Voytik SL, Badylak SF, Bonadio J. Direct gene transfer into regenerating Achilles’ tendon. Trans Orthop Res Soc 1994;19:233-8.

10) Labhasetwar V, Bonadio J, Goldstein S, Chen W, Levy RJ. A DNA controlled-release coating for gene transfer: Transfection in skeletal and cardiac muscle. J Pharm Sci 1998;87:1347-50.

11) Berry M, Gonzalez AM, Clarke W, Greenlees L, Barrett L, Tsang W, et al. Sustained effects of gene-activated matrices after CNS injury. Mol Cell Neurosci 2001;17:706-16.