答 辩 人：王 芳指导教师：台桂香 教授专 业：免疫学

蒋丽娜 免疫教研室

研究背景

设计思路

研究结果

研究结论

内 容 提 要

Antigen & TLRS

DC

Diseased cellsand pathogensLPSCPG

MHC-II CD80CD86

研究背景

Antigen & TLRS

Activated DCIL-12

研究背景

Ampr

★ MBP作为融合蛋白被广泛应用

★ 大肠杆菌麦芽糖结合蛋白

★ MBP作为标签蛋白

研究背景

研究背景：前期工作

MBP

诱导巨噬细胞M1型分化

NK细胞杀伤作用增强

IFNγ分泌增加，诱导Th1活化

MBP

MBP CD4+T

MBP具有增强免疫应答作用

DCMBP M1型极化

活化

Th活化CD4+T

研究背景

研究背景：前期工作

CD4+T

B16LewisBCG

BCG

MBP

抗肿瘤作用明显增强

IFNγ分泌增加、诱导Th1活化

MBP抗肿瘤作用

IFNγ分泌明显增加、显著诱导Th1细胞活化

＊病原识别受体，有13个成员，TLR1/2/4/5/6 在细胞表面表达, TLR3/7/8/9/11/13在胞内表达。

TLR

＊多表达于APCs，连接固有免疫和获得性免疫。

TRIF依赖途径

BCG

卡介苗 (BCG)，结核分枝杆菌减毒活疫苗。作为

活化TLR2/4/9的免疫佐剂应用于抗肿瘤治疗。

MBP

Anti-TLR4

Anti-TLR2

M1型巨噬细胞活化

研究背景：前期工作

MyD88 NFКB水平下调

诱导巨噬细胞M1型分化TLR2TLR4

MBP

MBP

BCG

TLRs■

CD4+T

Anti-TLR4Anti-TLR2

Th1

研究背景：前期工作

Activation

Th1

MBP联合BCG协同诱导Th1活化与TLRs有关

？BCGMBP DC

TLRs■

CD4+T

Th1

DC

Mature DC

？Th2

Polarization

MBP

BCG

Th1

设计思路

Up-regulation of co-stimulatory m o l e c u l e s o n D C s f o l l o w i n g stimulation with MBP, BCG or the combination of MBP and BCG in vitro

Sample MACS® Enrichment Flow analysisLabel Sample

DC细胞分选流程

DC细胞的鉴定

AB

Con

trol

MB

P

BC

G

MB

P+B

CG

0

10

20

30

40

50

The

expr

essi

on o

f CD

80 o

nth

e su

rfac

e of

DC

s **#

**

MBP联合BCG对DC细胞CD80表达的影响

BA

Contr

ol MB

PBC

G

MBP+

BCG

0

10

20

30

40

50

The

expr

essi

on o

f CD

86 o

nth

e su

rfac

e of

DC

s

**

**#

MBP联合BCG对DC细胞CD86表达的影响

A B

Contr

ol MB

PBC

G

MBP+

BCG

0

20

40

60

80

100

The

expr

essi

on o

f MHC

II on

the

surfa

ce o

f DCs * * *

MBP联合BCG对DC细胞MHC-II表达的影响

CD4+T

cont

rol

MB

P

BC

G

MB

P+B

CG

0

10

20

30

40

50

The

prot

ein

leve

l of

IL-1

2 (p

g/m

l) **#

**

ELISA检测细胞因子IL-12p70分泌

* P < 0.05 and ** P < 0.01, compared with control group. # P < 0.05, compared with MBP or BCG group

以上结果提示，MBP与BCG均能够促进DC细

胞CD80、CD86和MHC-II的表达，促进细胞

因子IL-12p70的产生；MBP联合BCG能够协同

诱导DC细胞的成熟、活化。

MBP and BCG synergistically induced Th1 activation in vitro

免疫磁珠CD4+T细胞流程

与Biotin-Antibody cocktail 孵育

与Anti-Biotin MicroBeads孵育

Flow through with unlabeled cells

CD4+T细胞的鉴定

Bla

nk

MB

P

BC

G

MB

P+B

CG

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

The

prol

ifera

tion

of C

D4+ T

co-c

ultu

red

with

DC(

OD)

*#**#

CD4+T淋巴细胞增殖

* P < 0.05 and ** P < 0.01, compared with control group. # P < 0.05, compared with MBP group

ELISPOT检测细胞因子

以上结果提示，MBP联合BCG能够通过

DC细胞协同诱导Th1的活化。

TLR2/TLR4 signaling is required for the MBP plus BCG-induced

maturation of DCs

TLR4

-/- mi

ce

WT m

ice0

1

2

3

The

mRN

A ex

pres

sion

of T

LR4

TLR2

-/- mi

ce

WT m

ice0.0

0.5

1.0

1.5

The

mRN

A ex

pres

sion

of T

LR2

A B

TLR2-/-/TLR4-/-单个核细胞TLR2/TLR4的鉴定

WT DC

TLR2-/-DC

MBP联合BCG对TLR2-/-DC细胞CD80表达的影响

WT DC

TLR4-/- DC

MBP联合BCG对TLR4-/-DC细胞CD80表达的影响

WT DC

TLR2-/- DC

MBP联合BCG对TLR2-/-DC细胞CD86表达的影响

WT DC

TLR4-/- DC

MBP联合BCG对TLR4-/-DC细胞CD86表达的影响

WT DC

TLR2-/- DC

MBP联合BCG对TLR2-/-DC细胞MHCII表达的影响

WT DC

TLR4-/- DC

MBP联合BCG对TLR4-/-DC细胞MHCII表达的影响

WT

DC

TLR

2-/-

DC

TLR

4-/-

DC

0

10

20

30

40

50

The

prot

ein

leve

l of

IL-1

2 (p

g/m

l)

* *

ELISA检测细胞因子IL-12p70分泌

* P < 0.05, compared with DC from WT mice

以上结果提示：

1 TLR2/TLR4分子的表达在MBP联合BCG诱导DC成熟的

过程中具有重要意义。

2 DC细胞TLR2或TLR4的缺失影响了MBP联合BCG通过

DC细胞促进CD4+ T细胞的增殖。

CCK8方法检测增殖

WT CD4+T：WT DC共培养

ELISPOT检测IFNγ/IL-4

MBP+BCG刺激

WT CD4+T：TLR2-/- DC共培养

WT CD4+T：TLR4-/- DC共培养

WT CD4+T：WT DC共培养

TLR2-/- CD4+T：WT DC共培养

TLR4-/-CD4+T：WT DC共培养

ELISPOT检测IFNγ/IL-4

The effects of DC TLR2/TLR4 expression on the proliferation and activation of CD4+ T cells

induced by the combination of MBP and BCG in vitro

MBP+BCG刺激

WTC

D4+

T:W

T D

C

WT

CD

4+T:

TLR

2-/- D

C

WT

CD

4+T:

TLR

4-/ - D

C

0.0

0.5

1.0

1.5

The

prol

ifera

tion

of C

D4+ T

co-c

ultu

red

with

DC(

OD) Control

MBPBCGMBP+BCG

***

CCK8方法检测与DC共培养的CD4+T淋巴细胞增殖

* P < 0.05, compared with control group from WT CD4+T：WT DC; ** P < 0.01, compared with control group from WT CD4+T：WT DC； # P < 0.05, compared with MBP+BCG group from WT CD4+T：WT DC

# #

** P < 0.01, compared with WT CD4+T: WT DC group

ELISPOT检测CD4+T与DC共培养细胞因子分泌

** P < 0.01, compared with WT CD4+T: WT DC group

ELISPOT检测CD4+T与DC共培养细胞因子分泌

WT

CD

4+T:

WT

DC

WT

CD

4+T:

TLR

2-/-

DC

WT

CD

4+T:

TLR

4-/-

DC

TLR

2-/-

CD4

+ T:W

T DC

TLR

4-/-

CD4

+ T: W

T D

C

0

10

20

30

40

The

prot

ein

leve

l of

IL-1

0 (p

g/m

l)

**

*

细胞因子IL-10分泌

* P < 0.05 compared with WT CD4+ T: WT DC group; ** P < 0.01, compared with WT CD4+ T: WT DC group.

以上结果提示：

1 DC细胞TLR2或TLR4分子在MBP联合BCG通过DC诱导

Th1活化中发挥重要作用。

2 CD4+T细胞TLR2/TLR4表达在MBP联合BCG直接诱导

Th1活化中发挥重要作用。

单因素方差分析

（SPSS软件16.0）

Thank you！