به نام خدا

مهار کننده های آنزیمی

عارف فرخی فرد

94زمستان

aarreeff@ymail.com

مفاهیم پایهآنزیم

سوبسترا و جایگاه فعال

فعالیت آنزیم

سرعت بیشینه و میل ترکیبی

مهار کننده و القاکننده

آنزیم ها کاتالیزورهای قوی زیستی مولکول غالبا پروتئینی آنزیم یک•

است که یک واکنش شیمیایی را در یک موجود زنده کاتالیز می کند

ولی خودش دگرگون نمی شود.

آنزیم ها نسبت به کاتالیزگرهای •غیر زیستی کارایی بسیار باالتری

دارند.

اغلب آنزیمها بسیار اختصاصی •هستند و تنها کاتالیست یک

واکنش ویژه می باشند.

سوبسترا و جایگاه فعالپیش ماده یا سوبسترا ماده ای است که تحت تاثیر آنزیم تغییر •

می کند و به یک یا تعدادی محصول تبدیل می شود. بسیاری از مولکول های زیستی و آلی، حتی در بعضی موارد •

یون ها، می توانند سوبسترا باشند.جايگاه فعال محل كوچكي از كل آنزيم است که براي •

سوبسترا قابل دسترس مي باشد. دو فرضيه براي میان كنش آنزيم با سوبسترا پيشنهاد شده است.

فعالیت آنزیم

مول سوبسترا را 1واحد فعالیت آنزیم مقدار آنزیمی است که 1 ثانیه به فراورده تبدیل می کند.1در

The SI unit is the katal 1 katal = 1 mol s−1

But this is an excessively large unit

کینتیک آنزیمی و معادله میکائیلیس منتن

در توصیف ریاضی فعالیت آنزیم که در در • و Leonor Michaelis توسط 1913سال

Maud Menten ارایه شد، دو فاکتور سرعت ( نقش Km ( و میل ترکیبی )Vmaxبیشینه )

مهمی بازی می کنند. این دو هم برای درک فعالیت آنزیمی در مقیاس باال و هم برای فهم اثرات انواع مختلف مهارکننده های

آنزیمی اهمیت دارند.

افزایش غلظت سوبسترا تا یک حد معینی سرعت واکنش را •باال می برد. حدی که تمام جایگاه های فعال توسط

سوبستراها اشباع شوند. سرعت واکنش آنزیمی در این نقطه را سرعت بیشینه می نامند.

عبارت است از غلظت سوبسترایی که Kmثابت میکائیلیس یا •در آن، سرعت واکنش آنزیمی به نصف سرعت حداکثری می

رسد و بیانی است از میل ترکیبی آنزیم به سوبسترایش.

سرعت بیشینه و ثابت میکائیلیس

نمودار الین ویور برک double یا Lineweaver–Burk plotنمودار لین ویور برک یا

reciprocal plot نموداری است برای به دست آوردن پارامترهای کینتیکی واکنش های آنزیمی با دقت پایین که قبل

از ظهور کامپیوتر های قدرتمند و نرم افزارهای رگرسیون خطی استفاده می شد. این نمودار همچنین یک تصویر سریع

از انواع مختلف مهار آنزیمی ارائه می دهد.

مهارکننده ها و القاکننده های آنزیمیبه مولکول هایی مهارکننده آنزیمی گفته می شود که با اتصال به آنزیم، •

فعالیت آن را کاهش دهند.

بسیاری از داروها مهارکننده هایh آنزیمی اند: سولفونامید، فیناستراید ، •نئوستیگمین و مهار کننده های آنزیم مبدل آنژیوتانسین.

به مولکول هایی القاکننده آنزیمی گفته می شود که با اتصال به آنزیم ها •منجر به افزایش فعالیت متابولیک آنها می گردند. این ترکیبات یا پس از

پیوند با آنزیم این کار را می کنند یا با افزایش بیان ژن کد کننده آنزیم دهند :این کار را انجام می

باربیتوراتها و ریفامپین )القاء سایتوکروم ها(•-بیس فسفات که موجب فعال شدن آنزیم فسفوفروکتوکیناز-۲،۶فروکتوز •

می شود.۱

مهار آنزیمی می تواند برگشت پذیر یا برگشت ناپذیر باشد

(Reversible enzyme inhibition پذیر )مهار آنزیمی برگشت•

o( رقابتیcompetitive)o( نارقابتیnon-competitive)o( غیر رقابتیun-competitive)o( مخلوطmixed type)

Irreversible enzymeمهار آنزیمی برگشت ناپذیر )•inhibition)

در مهار رقابتی، مهارکننده و سوبسترا در یک زمان •نمی توانند به آنزیم متصل شوند.

ساده ترین حالت این است که مهارکننده به جایگاه •فعال متصل شود و مانع اتصال سوبسترا شود.

.اما الزاما همیشه این طور نیست •

(competitiveمهار رقابتی )

(competitiveمهار رقابتی )

• Km :

• Vmax:ثابت

• No hamper of catalysis

(un-competitiveمهار غیررقابتی )( anti-competitive inhibitionدر مهار غیر رقابتی یا مهار ضد رقابتی )•

(.EISمهارکننده تنها به کمپلکس آنزیم-سوبسترا متصل شود )ایجاد

موثر باعث افزایش افینیتی آنزیم به ESکاهش غلظت کمپلکس •ای در می شود )بنابر اصل لوشاتلیه : اگر سامانه Kmسوبسترا و کاهش

حال تعادل باشد، در برابر هرگونه تغییری در جهت مخالف واکنش دهد تا اثر آن را از بین ببرد(.نشان می

محصول و یا به علت اینکه مهارکننده غیررقابتی باعث می شود که •جایگاه فعال را دیر تر ترک می کنند، سرعت بیشینه سوبسترا

کاهش می یابد. این نوع مهار نادر است.

• Km :

• Vmax:

• Hamper of catalysis

(mixed typeمهار مخلوط )مخلوطی است از مهار رقابتی )که مهارکننده تنها به آنزیم تنها متصل می •

شود( و مهار غیر رقابتی )که مهارکننده تنها به مجموعه آنزیم-سوبسترا .متصل می شود(

مهار کننده و سوبسترا می توانند به صورت همزمان به آنزیم متصل شوند •اما اتصال هر کدام بر اتصال دیگری موثر است.

باال بردن غلظت سوبسترا اثر مهارکننده را کاهش می دهد اما بر آن فائق •نمی آید.

گرچه ممکن است مهارکننده به جایگاه فعال آنزیم متصل شود اما عموما •اتصال به جایگاه آلوستریک انجام می شود و ساختار سوم آنزیم به گونه ای

تغییر می کند که بر اتصال سوبسترا تاثیر می گذارد.

(mixed typeمهار مخلوط )• Km:

• Vmax:

• Hamper of catalysis

(non-competitiveمهار نارقابتی ) اگر مهارکننده به یک شکل از آنزیم )آنزیم تنها یا آنزیم متصل به •

سوبسترا( تمایل بیشتری داشته باشد به آن مهار کننده مخلوط گفته می شود.

مهارکننده نارقابتی به آنزیم متصل می شود صرف نظر از این که اما•سوبسترا قبال متصل شده یا نشده است. یعنی تمایل آن به آنزیم و

کمپلکس آنزیم-سوبسترا یکسان است.همه مهارکننده های نارقابتی به ناحیه آلوستریک متصل می شوند اما •

همه مهار کننده هایی که به جایگاه آلوستریک متصل می شوند نارقابتی نیستند.

• Km: ثابت

• Vmax:

• Hamper of catalysis

اتصال چونمهارکننده

تاثیری براتصال سوبسترا

گذارد .نمی

نمودار الین ویور برک برای یافتن نوع مهارکننده

در مهار کننده های رقابتی:•( عرض از مبداy-intercept بدون تغییر است چرا که سرعت )

بیشینه تغییری نمی کند.( طول از مبداx-intercept ( تغییر می کند )در حضور

تغییر kmمهارکننده به سمت مقادیر مثبت تر می رود( چون می کند.

.)شیب تغییر می کند )در حضور مهارکننده بیشتر می شود

هم شیب و هم عرض از مبدا در مهار میکس و غیر رقابتی •و هم طول از مبدا تغییر می کند.

در مهار کننده های نارقابتی• شیب و عرض از مبدا تغییر می کند )تغییر در سرعت

بیشینه(.( طول از مبدا تغییری نمی کندkm)بدون تغییر

بیشتر مهارکننده های برگشت پذیر به .جایگاه فعال متصل می شوند

مهارکننده های پروتئاز که دسته موفقی از دارو های ضد ویروسی •هستند ساختاری شبیه به سوبسترای آنزیم هدفشان دارند.

( برای نمونه سه پیوند پپتیدی دارد و از نظر ritonavirریتوناویر ) است. HIV-1ساختاری شبیه سوبسترای پروتئاز

در بسیاری از موارد مهارکننده ساختار حالت گذار یا حد واسط را •تقلید می کند. در این حالت میل ترکیبی آن به هدف آنزیمی خود به

مراتب باالتر از وقتی است که ساختمانی شبیه سوبسترا دارد.( که شبیه حلقه مسطح یون اوکسونیوم در oseltamivirیا اوسلتامیویر )

واکنش ویروسی نورامینیداز می باشد.)رقابت با سالیک اسید گلیکوپروتئین های سطح سلول ها(

( مهار کننده دیگری برای tipranavirبه عنوان استثنا: تیپراناویر )• هیچ شباهت ساختمانی با سوبسترا ندارد و حتی HIV-1پروتئاز

پپتیدی نیز نمی باشد که همین امر پایداری آن را باال برده است.

ناپذیر مهار آنزیمی برگشت(Irreversible enzyme inhibition)

مهار کننده های برگشت ناپذیر معموال به صورت شیمیایی با هدف آنزیمی خود واکنش می دهند. این مهارکننده ها گروه های واکنش گر الکتروفیل دارند:

نیتروژن موستارد•آلدهیدها•آلکن ها•هالوآلکان ها• فنیل سولفونات ها•فلوروفسفونات ها•

این گروه ها با گروه های نوکلئوفیل روی زنجیر جانبی برخی آمینواسیدها واکنش می دهند:

هیدروکسیل یا سولفیدریل آمینواسیدهای سرین، ترئونین، تیروزین، گروه های .سیستئین

انواع ویژه مهار کننده های برگشت ناپذیر

برخی مهار کننده ها گرچه با آنزیم هدف خود پیوند کواالن نمی دهند اما به •قدری محکم به آنزیم متصل می شوند که رفتار کینتیکی مشابه نشان می

دهند. در این موارد ابتدا مهارکننده به سرعت و با افینیتی پایین به آنزیم متصل می •

شود. سپس با یک بازارایی آهسته کمپلکس بسیار محکمی را تشکیل می دهد.

متوترکسات ، معروف است در slow-bindingاین رفتار کینتیکی که به •دیده می شود.آلوپورینول و آسیکلوویر

( که گونه ای از مهار برگشت ناپذیر suicide inhibitionدر مهار خودکشی )•است. آنزیم مهار کننده را در جایگاه فعال خود به شکل فعال تبدیل می کند

و مهارکننده فعال شده، آنزیم را غیرفعال می کند. مثال اورنیتین را به ایمین کونژوگه تبدیل می کندکه با DFMOدکربوکسیالز تریپانوزما که

سیستئین ولیزین جایگاه واکنش می دهد.

مهارکننده های برگشت ناپذیر مهار وابسته به دارند

از انجایی که مهارکننده های برگشت ناپذیر مهار وابسته به •زمان از خود نشان می دهند، پوتنسی آن ها را نمی توان با

IC50.مشخص نمود

زیرا میزان آنزیم فعال در غلظت مشخصی از مهارکننده •بستگی به این دارد که چه مدت با آن مهارکننده انکوبه شده

است.

استفاده می شود. Kobs/[I]در عوض برای این منظور از •

( مهارکننده DFPدی ایزوپروپیل فلوروفسفات )برگشت ناپذیر پروتئاز است

P این مهار کننده را هیدرولیز می کند اما P-Fآنزیم هدف پیوند •به سرین جایگاه فعال متصل می ماند و آن را غیر فعال می

کند

•DFP.با جایگاه فعال استیل کولین استراز هم واکنش می دهد

فیناستراید به صورت آنتاگونیست غیررقابتی و انتخابی به صورت برگشت

آلفا ردوکتاز را مهار می کند.۵ ناپذیر آلفا ۵ به نام ستوسترون توسط آنزیمی•

می شود. DHTردوکتاز تبدیل به می باشد. ۲ و ۱ آلفا ردوکتاز بر دو نوع تیپ ۵• بیشتر در ۲ بیشتر در نمود چربی و تیپ ۱تیپ •

فولیکول مو و بافت پروستات وجود دارد. آنها طبیعی یا ۲مردانی که سطح آنزیم تیپ •

طبیعی باال داشته و DHTباال است میزان بیشتر به ریزش موی مردانه و بزرگی خوش

خم پروستات دچار می شوند. این آنزیم ۲فیناستراید سبب مهار تیپ •

را پایین آورده و احتمال DHTمی شود. سطح ریزش موی مردانه و نیز بزرگی خوش خیم

پروستات را کاهش می دهد.

طراحی مهارکننده دارودر گذشته تنها راه آزمون و خطا بود.•

امروزه همین رویکرد با همراهی شیمی ترکیبی که ایجاد •کتابخانه های بزرگ در زمان کوتاه را مقدور می کند دنبال می

شود.

که از ساختار سه بعدی rational روش طراحی منطقی یا •استفاده می کند با کمک داکینگ و مکانیک مولکولی.

قبل از بررسی و بهینه سازی و موثر بودن دارو، باید مسائلی •چون فراهمی زیستی، نیمه عمر متابولیک، عوارض جانبی و...

بهینه شوند.

نقش مهار کننده های آنزیمی در موجودات زنده

مهارکننده های آنزیمی در کنترل متابولیک موجوداتزنده نقش بسیار مهمی دارند.

توسط سطوح1تنظیم آلوستریک فسفوفروکتوکیناز ATP در مسیر گلیکولیز.

مهارکننده های آنزیمی فیزیولوژیک.پروتئین مهار کننده تریپسین برای حفاظت از پانکراس( بارستارbarstar( که آنزیم بارناز )barnase.را مهار می کند )

مهارکننده های آنزیمی توسط بسیاری از گیاهان بهعنوان یک دفاع طبیعی استفاده می شوند.

گلیکوآلکالوئید های گیاهی که نوروتوکسین های قوی هستند)مهار استیل کولین استراز(.

.آلفاآمانیتین

RNA POLآلفاآمانیتین برای تشخیص نوع

RNA polymerase I is insensitive

RNA polymerase II is highly sensitive (inhibited at 1μg/ml)

RNA polymerase III is moderately sensitive (inhibited at 10μg/ml)

RNA polymerase IV is slightly sensitive (inhibited at 50μg/ml)

کاربردهای مهارکننده های آنزیمی

استفاده در شیمی درمانیبه عنوان حشره کشبه عنوان علف کش به عنوان تسلیحات بیولوژیک و تروریسم: دی

ایزوپروپیل فلوروفسفات

مهارکننده های آنزیمی به عنوان عوامل شیمی درمانی

بیشترین موارد استفاده از مهارکننده های آنزیمی در درمان است.•

cGMP ویژه 5سیلدنافیل برای مثال که مهارکننده قوی فسفودی استراز تیپ •

است.

آنتی بیوتیک هایی نظیر پنی سیلین و ونکومایسین که ترنس پپتیداز را مهار می •

کنند.

ادروفونیوم، فیزوستاگمین و نئوستاگمین در درمان میاستنیا گراویس و در •

هوشبری )به عنوان آنتاگونیسم داروهای مسدود کننده عصبی-عضالنی(

. می باشندسولفونامیدها باکتریواستاتیک

سولفونامیدها بدلیل شباهت ساختمانی با پاراآمینوبنزوئیک اسید •(PABA( به صورت رقابتی آنزیم دی هیدروپتروآت سنتتاز )DHPS )

به اسید PABAباکتری را که مسئول تبدیل کردن دی هیدروفولیک است، مهار می کنند در نتیجه اسید فولیک

ساخته نمی شود.

( در سنتز اسیدهای نوکلئیک نقش مهمی vit B9 اسید فولیک )•دارد و بهمین جهت عدم سنتز آن به توقف رشد سلول منجر

می گردد.

سیلدنافیل سیترات•Sildenafil ، که تحت نام تجاریViagra ، Revatio و اسامی دیگر

به فروش می رسد، یکی از داروهای مورد استفاده در درمان اختالل نعوظ و افزایش فشار خون ریوی است.

این دارو نخستین بار توسط شرکت داروسازی فایزر به بازار •عرضه شد.

آنزیم فسفودی استراز ۵سیلدنافیل باعث مهار نوع شماره • می شود . این آنزیم جریان خون در آلت تناسلی cGMPخاص

مرد را تنظیم می کند.

ادروفونیوم و فیزوستیگمین مهارکننده استیل کولین استراز است

این دارو جهت تشخیص نوع میاستنی گراویس استفاده می •شود.

میاستنیا گراویس نوعی فلج ماهیچه ای است که علت آن •فعالیت ایمنی بر ضد پروتئین های گیرنده استیل کولین در

سیناپس عصبی-عضالنی است.

فیزوستیگمین در درمان آلزایمر، میاستنی گراویس و آب سیاه •استفاده می شوند.

فیزوستیگمین به عنوان پادزهر یا آنتی دوت مسمومیت با •داروهای آنتي کولینرژیک مانند هیوسین و بالدونا نhيز به كار مي

رود.

آنژیوتانسینوژن توسط کبد ساخته و در خون آزاد می شود

تبدیل 1آنژیوتانسینوژن توسط هورمون رنین به آنژیوتانسین •می شود .

( که بیشتر ACE توسط آنزیم مبدل آنژیوتانسین )1 آنژیوتانسین •تبدیل می شود.2در مویرگهای ریه یافت می شود به آنژیوتانسین

اندوتلیوم مویرگ های ریه است. ACEمحل تجمع اصلی •

Cاین آنزیم از گروه کینازها بوده بخش کوچکی از انتهای •آنژیوتانسین یک )دواسید آمینه لوسین- هیستیدین( را حذف

می کند.

کاربرد درمانی مهارکننده های آنزیم مبدل آنژیوتانسین

یک عامل قوی انقباض عروقی )به خصوص 2آنژیوتانسین •.شریانچه ها( است

از راهکارهای مختلف )مانند تحریک ترشح آلدسترون هورمون ضhد •ادراری( موجب احتباس آب و سدhیم می شود .

عملکhرد نهایی هورمون آنژیوتانسین دو افزایش فشار خون است.•

مهار عملکرد آنژیوتانسین دو، نقش مهمی در درمان زیادی فشار •خون دارد.

توسط داروهایی مانند کاپتوپریل، لیزینوپریل و اناالپریل.ACEمهار •

بسیاری از حشره کش ها مهارکننده آنزیم استیل کولین استراز هستند

سموم کارباماته، مهار کننده رقابتی این •آنزیم هستند.

پروپوکسور با نام تجاری بایگون، ایزوالن، •پیروالن، پیرتروم، آلدی کارب و منومتیل

کاربوفوران .

ارگانوفسفره ها مثل ماالتیون، پاراتیون، •( این آنزیم را chlorpyrifosکلرپیریفوس )

به شکل غیر قابل برگشت مهار می کنند.

مهار کننده های آنزیمی به عنوان علف کش-کربوکسی 1-فسفو شیکیمات 3گلیفوزات که نوعی علفکش است •

وینیل ترانسفراز را مهار می کند.phosphoenolpyruvate + 3-phosphoshikimate

• phosphate + 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate (EPSP)

شکل ظاهری این ترکیب، پودر بلورین سفید است.• این محصول را تحت نام تجاری " 1970شرکت مونسانتو در دهه ی •

2000راندآپ " به بازار ارائه نمود که ثبت اختراع مرتبط تا سال اعتبار داشت.

: ALSمهارکننده های •سولفونیل اوره آز که آنزیم استوالکتات سنتاز را مهار می کند.•آنزیم فوق اولین گام برای سنتز اسیدآمینه های شاخه دار مثل والین •

و لوسین را کاتالیز می کند.مهارکننده های فوق، انتخابیت باالیی ندارند.•

رایسین ماده ای بسیار سمی می باشد که حتی مقدار اندکی از آن به اندازه چند دانه نمک

خوراکی می تواند انسان بالغ را از پای در آورد. از مهم ترین موارد استفاده در تروریسم است .از گیاه کرچک تهیه می شود به شکل گرد سفید رنگ بوده و در صورتی که

به غبار تبدیل شود و وارد آب یا غذا گردد، غیر قابل تشخیص است.

1000.برابر قوی تر از سیانور می باشد ( دوز کشنده ریسینLD50 )22 میکروگرم به

ازای هر کیلوگرم وزن بدن است.

مکانیسم آن مهار سنتز پروتئین در مرحله طویل سازی از طریق غیر فعالسازی ریبوزوم است. رایسین این عمل را با دپورینه کردن آدنوزین

60s زیر واحد 28S rRNA از 3 در انتهای’ 4324انجام می دهد.

هافستی ادی نمودار نموداری است Eadie–Hofstee diagra نمودار ادی هافستی یا

برای به دست آوردن پارامترهای کینتیکی واکنش های آنزیمی با دقت پایین تر از رگرسیون خطی و باالتر از نمودار الین ویور برک چرا که بر خالف نمودار الین ویور برک، ارزش یکسانی به

( در هر محدوده ای از غلظت سوبسترا data pointsنقاط داده )یا سرعت واکنش می دهد.

Hanes–Woolf plot

همیت آنزیم با رقابت مهارکننده رقابتی

جرخه مهارکربس

سوکسینات دهیدروژناز

سوکسینات مالونات

زدایی سممتانول

دهیدروژناز الکل متانول اتانول

مهارتولیدانرژی G3-PD فسفات آرسناتمهارتولیدانرژی سنتاز سیتوکروم O2 COهیدروپتروات مهارتکثیرباکتری دی

سنتازPABA سولفافیالمید

تنظیم مسیرمتابولیکی

فسفوگلیسرات موتاز

1,3-DPG PDG-3و2