Jelena Cvetković 1

Enzimska aktivnost

Enzim je svaki protein sposoban da katalizuje neku biohemijsku reakciju u živim organizmima. Svaka biohemijska reakcija ima svoj specifični enzim, mada postoje i enzimi koji mogu katalizovati par reakcija više. Enzimi su prema reakcijama koje katalizuju podeljeni u šest grupa i oni imaju svoju oznaku u međunarodno prihvaćenom sistemu.

Enzimi su veliki i složeni globularni proteini koji imaju jedan ili više polipeptidnih lanaca.Deo enzima odgovoran za njegovo dejstvo je aktivni centar (mesto). Aktivni centar je udubljenje čiji je oblik veoma precizno podešen prema supstratu, slično kao ključ prema bravi. Supstrat (materija na koju enzim deluje) ulazi u aktivni centar i vezuje se za njega pri čemu se nagradi kompleks enzim – supstrat (po principu ključ-brava). Supstrat se razloži na određene proizvode, a enzim iz reakcije izlazi nepromenjen.

Zahvaljujući prisustvu aktivnog centra enzimi pokazuju osobinu specifičnosti, što znači da svaki enzim deluje samo na jedno jedinjenje ili grupu sličnih jedinjenja (pr. ureaza razlaže ureu, a proteinaze proteine). Enzimi obično dobijaju naziv prema supstratu na koji deluju, tako što se na naziv supstrata doda nastavak –aza. Na aktivnost enzima utiče temperatura, pH, količina supstrata i količina samog enzima. Kada su ovi uslovi optimalni (najpovoljniji), aktivnost enzima je najveća.

Da bi enzim najbolje delovao na supstrat potrebni su određeni optimalni (lat. optimus - najpovoljniji, najbolji) uslovi:

temperatura pH vrednost sredine dovoljna količina samog enzima.

Pod enzimskom aktivnošću podrazumeva se osobina enzima da određenom brzinom katalizuje transformaciju supstrata u proizvod. Može se reći da aktivnost enzima označava količinu supstrata koja se pod uticajem enzimskih molekula u jedinici vremena transformiše u produkt reakcije. Aktivnost enzima karakteristična je veličina za određeni enzim-supstrat kompleks, ali zavisi od više faktora. Kinetika obuhvata proučavanje brzine kojom se odigrava reakcija. Proučavanje enzimski katalizovane reakcije zasniva se na praćenju promene koncentracije proizvoda ili supstrata u zavisnosti od vremena u toku same reakcije.

Jelena Cvetković 1

Na grafiku je prikazan uobičajeni tok jedne enzimski katalizovane reakcije. Na početku reakcije promena je linearna, a kasnije se vidi smanjenje brzine zbog utroška supstrata ili nagomilavanja produkta. Dužina linearnog dela zavisi od radnih uslova, pa se uslovi najčešće podešavaju da linearni deo bude što duži.

Dokazano je da su opšti principi kinetike hemijskih reakcija primenljivi i na enzimski katalizovane reakcije. Međutim, primećena je i neobičnost da pri dovoljno velikim koncentracijama supstrata ne dolazi do povećanja brzine-postiže se maksimum. Ovo se objašnjava malom koncentracijom enzima u ćelijama, pa su u jednom trenutku svi molekuli enzima zasićeni (svi su kompleksirani sa molekulima supstrata), više nema raspoloživih molekula i brzina reakcije se ustali.

Jelena Cvetković 1

Faktori koji utiču na aktivnost enzima

Aktivnost enzima zavisi od mnogih činilaca od kojih su najvažniji koncentracija jona vodonika, koncentracija enzima, koncentracija supstrata, koenzimi, temperatura, aktivatori, inhibitori, hormoni i druge biološki aktivne supstance. Prilikom određivanja aktivnosti enzima neophodno je da se obezbede optimalni uslovi za njihovo delovanje, koji omogućavaju ispoljavanje maksimalne katalitičke aktivnosti i maksimalnu stabilnost enzimskih molekula.

Najznačajniji faktori koji utiču na aktivnost enzima su:

1. Temperatura2. pH 3. Koncentracija enzima4. Koncentracija supstrata

1. Temperatura dosta utiče na aktivnost enzima zbog njihove proteinske prirode. Brzina enzimski katalizovane reakcije se povećava sa porastom temperature, ali samo u granicama u kojima je enzim stabilan. Pri temperaturama od 30C do 40C većina enzima ima maksimalnu enzimsku aktivnost. Na optimalnoj temperaturi aktivnost enzima se linearno povećava, pošto se povećava broj sudara između reagujućih čestica (toplota se pretvara u kinetičku energiju). Na temperaturama nešto većim od optimalne brzina reakcije je veća, ali se enzim brže denaturiše, pa dolazi do daljeg pada aktivnosti posle određenog vremena. Na temperaturama većim od 50C većina enzima je denaturisana. Brzina denaturacije zavisi od vrste enzima, od temperature i vremena u kome je enzim izložen povišenoj temepraturi. Izlaganje enzima temperaturama višim od 80C brzo dovodi do inaktivacije skoro svih enzima. Inaktivacija enzima visokim temperaturama je ireverzibilan proces (denaturacija), jer pri tome dolazi do kidanja hidrofobnih, jonskih i vodoničnih veza, čime se remeti tercijarna struktura koja je veoma bitna za katalitičku aktivnost. Pri snižavanju temperature enzimska aktivnost se postepeno smanjuje, do potpunog prestanka katalitičkog procesa. Na 0C enzim potpuno gubi svoju aktivnost, ali je taj gubitak reverzibilne prirode. Kad se enzim dovede na optimalnu temperaturu njegova aktivnost se u potpunosti vraća. Zato se niske temperature koriste za čuvanje enzimskih uzoraka. Karakteristično je da se pri povećanju temperature

Jelena Cvetković 1

za svakih 10C aktivnost povećava 1,5-2 puta. Odnos aktivnosti enzima na određenoj temperaturi i njegove aktivnosti na temperaturi nižoj od 10C označava toplotni koeficijent ili temperaturni faktor.

2. Uticaj pH na aktivnost enzima varira u zavisnosti od vrste enzima. Enzimi su aktivni u uskom intervalu pH, a izvan tog područja katalitička aktivnost se naglo smanjuje. Pri optimalnom pH enzim ispoljava najveću aktivnost. Za veliki broj enzima optimalni pH se nalazi između 4 i 8, ali neki enzimi su najaktivniji u jako kiseloj ili jako baznoj sredini. Na primer pepsin ima maksimum aktivnosti pri pH vrednosti oko 1,5. Vrednost optimalne pH vrednosti ne zavisi samo od prirode enzimskih molekula, već i od koncentracije supstrata i od hemijskih osobina supstanci koje su upotrebljavanje za pripremu pufera. Mehanizam uticaja pH na aktivnost može da bude različit. Smatra se da je najbitniji uticaj pH na enzimske molekule, mada je bitan i uticaj pH na stepen jonizacije supstrata. Molekuli enzima sadrže veliki broj grupa koje mogu da disosuju u zavisnosti od pH vrednosti. Optimalni pH je ona vrednost pri kojoj molekuli enzima imaju onu jonsku formu koja je najadekvatnija za kontakt supstrata sa aktivnim centrom enzima.

3. Uticaj koncentracije enzima na katalitičku aktivnost može se iskazati jednačinom

v=k [E ]

gde je v brzina reakcije tj. aktivnost enzima, E koncentracija enzima, a k konstanta brzine reakcije.

Iz ove jednačine vidimo da je pri optimalnim uslovima brzina reakcije direktno proporcionalna koncentraciji enzima. Kada se grafički prikaže odnos između koncentracije enzima i brzine reakcije i koncentracije dobija se prava linija. Svako odstupanje od pravolinijskog oblika ukazuje da su prisutni inhibitori. Ova zakonitost je od velikog značaja jer omogućava da se umesto koncentracije enzima u biološkom materijalu

Jelena Cvetković 1

određuje enzimska aktivnost. U tkivima i telesnim tečnostima koncentracija enzima je jako mala, pa njihovo određivanje nije moguće vršiti standardnim hemijskim metodama. Specifične metode za merenje koncentacije enzima su imunohemijske tehnike, ali su one veoma skupe i nisu prikladne za praktičan rad. Pošto su enzimi veoma aktivni u veoma malim koncentracijama, određivanjem njihove aktivnosti možemo utvrditi i samu koncentraciju enzima, pod uslovom da su ostali uslovi optimalni.

4. Uticaj koncentracije supstrata na enzimsku aktivnost je specifičan, jer biološki katalizatori pokazuju fenomen zasićenja supstratom. Za sve enzime je karakteristično zasićenje supstratom, samo je za različite enzime potrebna različita koncentracija supstrata pri kojoj dolazi do zasićenja.

Zavisnost brzine reakcije od koncentracije supstrata prikazana je na grafiku. Vidimo da kriva ima oblik krive zasićenja. Pri nižim koncentracijama supstrata brzina se povećava sa povećanjem koncentracije. Međutim, pri daljem povećanju koncentracije supstrata brzina reakcije raste sporije, pa više nije proporcionalna koncentraciji supstrata. Ukoliko se i dalje povećava koncentracija supstrata, brzina reakcije dostiže maksimalnu vrednost i dalje se ne povećava. Ta brzina naziva se maksimalna ili granična brzina vmax . U tim uslovima, kada je postignuta maksimalna brzina, faktor koji ograničava brzinu je koncentracija enzima, a ne supstrata. Ukoliko se dodaju nove količine enzima, postiže se nova maksimalna brzina. Ona koncentracija supstrata pri kojoj se postiže polovina maksimalne brzine označava se kao Km ili Michaelis-Menten-ova konstanta. Pri povećanju koncentracije enzima povećava se maksimalna brzina reakcije, ali konstanta ostaje ista. Ovaj parametar je uvek stalna vrednost za određeni enzim i supstrat. Recipročna vrednost Km definiše se kao afinitet enzima prema supstratu. Ukoliko enzim ima manju Km konstantu za određeni supstrat, utoliko se efikasnije vrši njegovo pretvaranje u produkt reakcije. Vrednost Km zavisi od vrste supstrata, temperature, pH i prisustva efektora (inhibitora ili aktivatora). Specifičan uticaj koncentracije supstrata ispoljava se zbog toga što u toku katalitičkog procesa dolazi do obrazovanja enzim-supstrat kompleksa koji se zatim razlaže na produkt reakcije i enzim. Kada je koncentracija supstrata velika u poređenju sa Km sav enzim je u obliku ES kompleksa tj. zasićen je supstratom. Dalje povećanje koncentracije supstrata ne može da dovede do povećanja reakcione brzine jer nema slobodnih molekula enzima da vežu supstrat.

Jelena Cvetković 1

Brzina reakcije u kojoj je enzim prisutan može biti smanjena inhibicijom. Postoji nekoliko vrsta inhibicija enzimskih reakcija:

konkurentna inhibicija,

nekonkurentna inhibicija,

parcijalna inhibicija

izmešana inhibicija

Konkurentna inhibicija

U konkurentoj inhibiciji, inhibitor, tj. molekul koji dovodi do zaustavljanja reakcije, se povezuje sam na aktivni region enzima, i time sprečava regularno povezivanje molekula na koji enzim treba da deluje. Ova reakcija se naziva konkurentna, jer je konkurentni inhibitor u osnovi istog oblika kao i molekul na koji enzim treba da deluje, i na taj način inhibitor prevari enzim i nadoveže se na aktivni region. To dovodi do toga da pravilni molekul ne može da se poveže, jer je mesto povezivanja zauzeto i kao posledica toga enzim stvara potpuno pogrešan produkat.

Nekonkurentna inhibicija

Kao što je već gore navedeno u strukturi enzima, enzim može da ima puno mesta povezivanja, odnosno veći broj aktivnih regiona. U nekonkurentnoj inhibiciji inhibitor se nadoveže na ono aktivno mesto koje je prazno, i koje neće uticati na povezivanje molekula koji treba da se nadoveže na onaj pravi aktivni region, kako bi reakcija bila realizovana, tako da u ovom slučaju ne postoji konkurencija inhibitora i molekula na koji enzima treba da deluje.

Parcijalna inhibicija

Mehanizam parcijalne inhibicije je sličan nekonkurentnoj inhibiciji. Jedina razlika je u tome da kompleks enzim-inhibitor-supstrat može da ima viši stepen katalitičke aktivnosti od kompleksa koji čine enzim-supstrat.

Izmešana inhibicija

Izmešana inhibicija se zove tako kako se zove jer ima osobine konkurentne i nekonkurentne inhibicije. U ovoj vrsti inhibicije inhibitor može da se nadoveže ili na sam enzim, pri čemu zauzme aktivni region (konkurentna inhibicija) i tad molekul ne može da se nadoveže jer je region zauzet, ili na već postojeći enzim-supstrat kompleks, ali ne zauzime aktivni region namenjen pravom molekulu (osobina nekonkurentne inhibicije).

Jelena Cvetković 1

Inhibitori samoubice

Inhibitori samoubice su inhibitori koji se sami ugrade u enzim i zauvek ga deaktiviraju. Mnogi lekovi su ustvari inhibitori enzima. Na primer, aspirin je inhibitor enzima koji za produkat ima prostaglandin, koji se pojavljuje kao inflamantorni molekul, i na taj način stopira bol i zapaljenjski proces. Otrov cijanid deaktivira enzim citohrom c oksidazu i na taj način blokira ćelijsko disanje.