ENZIMI. Importanza degli enzimi in Medicina 1.Chiave per capire errori del metabolismo 2.Importanti...
-
Upload
rosangela-castellano -
Category
Documents
-
view
214 -
download
0
Transcript of ENZIMI. Importanza degli enzimi in Medicina 1.Chiave per capire errori del metabolismo 2.Importanti...
ENZIMI
Importanza degli enzimi in Medicina
1. Chiave per capire errori del metabolismo 2. Importanti nelle reazioni di detossificazione3. Targets di chemioterapia4. Essenziali per formulare il razionale di un farmaco5. Punto di riferimento nella diagnosi e nel monitoraggio terapeutico6. Il ruolo primario delle vitamine è svolto come cofattori di enzimi
Tutti gli enzimi sono proteine****
**** alcuni RNA catalitici o ribozimi possono essere classificati come enzimi
-hanno un peso molecolare tra 15 kDa – 1000 kDa
-mostrano le stesse proprietà fisiche e chimiche delle proteine:
1. denaturazione2. precipitazione3. sensibilità alle proteasi
Gli enzimi sono caratterizzati da tre proprietà distintive:
1. CAPACITA’ CATALITICA
2. SPECIFICITA’ DI SUBSTRATO
3. REGOLAZIONE
I residui amminoacidici che formano il sito di legame sono disposti in modo tale da reagire specificamente con il substrato mediante forze attrattive
Molti enzimi necessitano di componenti chimici addizionali detti cofattori
I cofattori possono essere
ioni inorganici (Fe2+, Mg2+, Zn2+)
coenzimi (molecole organiche o
metallo-organiche)
I coenzimi legati covalentemente all’enzima sono chiamati gruppi prostetici
GRUPPO PROSTETICO + APOENZIMA = OLOENZIMA
Fe2+ o Fe3+ CatalasiPerossidasi
Cu2+ Citocromo ossidasi
Zn2+Anidrasi carbonicaAlcol deidrogenasi
Mg2+ Glucosio-6-fosfatasiPiruvato chinasi
Mn2+ Ribonucleotide reduttasi
Ni2+ Ureasi
Mo Dinitrogenasi
Se Glutatione perossidasi
Esempi di enzimi che contengono come cofattori ioni inorganici
Esempi di enzimi e coenzimi che trasferiscono gruppi chimici
coenzima gruppi trasferiti enzimi
FADNAD
atomi di idrogenoione idruro
deidrogenasi
coenzima A gruppi acilici acil-transferasi
tiamina pirofosfato
gruppi idrossialchil. decarbossilasi
piridossalfosfato gruppo amminicoamminotransferasi
biotina CO2 carbossilasi
tetraidrofolatoformil, metilen, metil
transferasi C1
A P(spontanea)
[A]t
v= = K[A]
La velocità è proporzionale alla concentrazione di A e K è la costante di proporzionalità o costante di velocità
Poiché v è proporzionale ad A (unico reagente), la reazione è detta reazione di primo ordine (reaz. unimolecolare)
Invece nella reazione:
A P
A + B C + D v= K[A] [B]
Poiché v è proporzionale al prodotto di due concentrazioni, la reazione è di
secondo ordine.
Studio della velocità delle reazioni enzimatiche
La reazione A + B C + Dsi verifica perché ad ogni istante dato
sia A che B hanno l’energia necessaria per raggiungere una condizione
reattiva nota come stato di transizione.
Energia libera media(stato iniziale)
(Energia richiestaper aumentare l’E media di una mole di reagenti)
aumento della temperatura: aggiunta di un catalizzatore:
Ci sono due modi per accelerare una reazione chimica:
P
aumenterà l’energia media dei reagentidiminuendo così l’energia necessaria araggiungere lo stato di transizione.
A P
il catalizzatore abbassa il Gcombinandosi temporaneamente con i reagenti in modo da promuovere il loro ingresso nella condizione reattiva dello stato di transizione
CINETICA DELLE REAZIONI ENZIMATICHE
Il cambiamento nella velocità di reazione in funzione della variazione
della concentrazione del reagente è una delle misure principali
dell’analisi cinetica
Curva di saturazione del substrato per una reazione enzimatica
A bassa [S], v è proporzionale a [S] (reazione di primo ordine)Ad alta [S], v diviene indipendente da [S] e si avvicina ad un limite massimo. Il valoredi v a questo limite è indicato come Vmax.
La reazione enzimatica obbedisce ora ad una cinetica di ordine zero, cioè la velocitàè indipendente dalla [reagente] e dipende direttamente dall’enzima.
Quando v non aumenta anche se [S] aumenta, il sistema è saturato dal substrato
(A)
lo stadio precoce della reazioneè mostrato in scala maggiore
E + SE + SKK11
KK-1-1
ESESKK22
E+PE+PKK-2-2
Teoria generale di azione degli enzimi proposta daMichaelis e Menten:
l’enzima E ed il suo substrato S si associano reversibilmente per formare un complesso ES.Il prodotto si forma in un secondo stadio quando ES si rompe per dare E+P
SS
K
vv
m
max
0
L’equazione di Michaelis-Menten
Km = costante di Michaelis-Menten
Vo = velocità iniziale
Vmax = velocità allo stato stazionario
La velocità di una reazione enzimatica v in qualsiasi istante è determinata dal rapporto fra due costanti Km e Vmax e la concentrazione del substrato in quell’istante.
Il valore di Km è definito dalla concentrazione di substrato che dàuna velocità pari alla metà della velocità massima:
quando [S]= Km, v= Vmax/2
Km è anche una misura dell’affinità dell’enzima per il suo Km è anche una misura dell’affinità dell’enzima per il suo substrato:substrato:
se un enzima ha un piccolo valore di Km, vuol dire che se un enzima ha un piccolo valore di Km, vuol dire che raggiunge la massima efficienza catalitica a basse raggiunge la massima efficienza catalitica a basse concentrazioni di substrato concentrazioni di substrato
(bassa Km = alta affinità)(bassa Km = alta affinità)
Significato della costante di MichaelisSignificato della costante di Michaelis
L’equazione di Michaelis-Menten descrive una curva chiamata iperbole rettangolare
La Commissione Internazionale sugli Enzimi definisce l’Unità Internazionale diEnzima come la quantità che catalizza la formazione di una micromole diprodotto in un minuto.
Il numero di turnover di un enzima, Kcat, è una misura della sua massima attivitàcatalitica.
Kcat = numero di molecole di substrato convertite in prodotto per molecola di enzima per unità di tempo quando l’enzima è saturato con il substrato
Il riconoscimento enzima-substrato e gli eventi catalitici che seguono sonofortemente dipendenti dal pH
L’optimum di pH può non coincidere con l’ambiente naturale in cui l’enzimasi trova: risposta al pH = regolazione intracellulare dell’attività enzimatica
Effetti della temperatura sull’attività enzimatica
La diminuzione dell’attività a temperaturesuperiori a 50° è dovuta alla denaturazione termica.
L’equazione di Michaelis-Menten descrive una curva chiamata iperbole rettangolare
SS
K
vv
m
max
0
A causa della forma iperbolica del grafico di v in funzione di [S]la determinazione precisa del valore di Vmax non è possibile.La maniera migliore per ottenere i valori di Vmax è rimaneggiare l’equazione di MM per ottenere un grafico lineare.
Dall’equazione di Michaelis-Menten si possono ottenere grafici lineari:prendendo i reciproci di entrambi i membri dell’equazione di M-M
SS
K
vv
m
max
0
1V
=Km + [S]Vmax [S]
= Km Vmax [S]
[S]+Vmax [S]
1V
= Km Vmax [S]
+Vmax
1
Grafico dei doppi reciproci di Lineweaver-Burk
questa equazione descriveuna linea retta
y=
x=
Inibizione enzimatica
inibizione reversibile
l’inibitore interagisce con l’enzima attraverso reazioni non covalentidi associazione/dissociazione
inibizione irreversibile
l’inibitore causa alterazioni covalenti stabili dell’enzima
competitiva
non competitiva
I due tipi di inibizione si possono distinguere dal particolare tipo di andamento che si ottiene quando i dati cinetici sono analizzati indiagrammi lineari di Lineweaver-Burk
La Succinato deidrogenasi – un esempio classico di inibizione competitiva
INIBIZIONE REVERSIBILE
inibizione competitiva
Km aumenta
Il substrato e l’inibitore competonoper lo stesso sito di legame sull’enzima(sito attivo)
L’aumento della [S] aumenta la probabilità che sia S a legarsi all’enzima invece dell’inibitore. Alti valori di [S] possono annullare l’effetto di I.
Vmax è invariata
La caratteristica di questo tipo diinibizione è che Vmax non èinfluenzata da I (tutte le rettemostrano la stessa intercettasull’asse y)
INIBIZIONE REVERSIBILE
inibizione non competitiva
KKmm invariata V invariata Vmaxmax diminuisce diminuisce (diminuzione dell’enzima attivo)(diminuzione dell’enzima attivo)
INIBIZIONE REVERSIBILE
L’inibitore ed il substrato si legano a siti diversi dell’enzimae il legame di I non influenza illegame di S L’inibizione non può essere superata
aumentando la [S]
- l’inibitore si lega irreversibilmente all’enzima (per es. con unlegame covalente) .
-tipo di cinetica osservata: simile all’inibizione non competitiva
- differenza: la diluizione non è efficace a dissociare il complessoE-I e non ripristina l’attività enzimatica
INIBIZIONE IRREVERSIBILE
Substrati suicidi: sono inibitori analoghi del substrato che si legano covalentemente all’enzimacon specificità ed alta affinità.
la penicillina è un inibitore irreversibile dell’enzimaglicoproteina transpeptidasi che crea i legami crociati nelle catene di peptidoglicano durante la sintesi dellaparete cellulare batterica.
La specificità è il risultato del riconoscimento molecolare
Il sito attivo dell’enzima comprende solo una parte della sua struttura, una speciale tasca complementare alla struttura del substrato
Adattamento indottoil complesso cataliticamente attivo enzima-substrato è una struttura interattiva:-la forma del sito attivo dell’enzima si modifica in seguito al legame di S -l’enzima induce il substrato ad adottare una forma che mimi lo stato di transizione della reazione
processo di riconoscimento dinamico fra E e S
Controllo dell’attività enzimatica
1. accumulo del prodotto (dimin. velocità di sintesi di P)2. disponibilità del substrato3. controllo genetico4. modifica covalente
5. isozimi6. proteine modulatrici7. enzimi allosterici
reversibile
irreversibile
Gli enzimi regolati mediante modifiche covalenti sono chiamati enzimi interconvertibili
Modificazioni Modificazioni covalenti reversibili:covalenti reversibili:
FosforilazioneFosforilazione
AdenilazioneAdenilazione
UridililazioneUridililazione
ADP-RibosilazioneADP-Ribosilazione
MetilazioneMetilazioneFosforilazioneFosforilazione
4.
enzimi proteolitici del tratto digestivo
L’attivazione proteolitica del chimotripsinogeno’
Modificazioni covalenti irreversibili: Proteolisi (zimogeni)Modificazioni covalenti irreversibili: Proteolisi (zimogeni)
coagulazione del sangue
Controllo dell’attività enzimatica
1. accumulo del prodotto2. disponibilità del substrato3. controllo genetico4. modifica covalente
5. isozimi6. proteine modulatrici7. enzimi allosterici
reversibile
irreversibile
5. IsozimiGli isozimi della lattato deidrogenasi
Numerosi enzimi esistonoin più strutture quaternarieche differiscono nelleproporzioni di associazione di due subunità A e B.
(M4)
(H4)
EnzimaEnzima
Lattico deidrogenasi (infarto del miocardio, epatite Lattico deidrogenasi (infarto del miocardio, epatite virale)virale)
Isocitrico deidrogenasi (epatiti virali)Isocitrico deidrogenasi (epatiti virali)
Glucosio-6-fosfato deidrogenasi (anemia)Glucosio-6-fosfato deidrogenasi (anemia)
Glutammico deidrogenasi (affezioni epatiche)Glutammico deidrogenasi (affezioni epatiche)
Aspartico transaminasi (infarto del miocardio)Aspartico transaminasi (infarto del miocardio)
Creatina chinasi (indice di infarto e distrofia muscolare)Creatina chinasi (indice di infarto e distrofia muscolare)
Acetilcolinesterasi (anestesia)Acetilcolinesterasi (anestesia)
Colinesterasi (indice di funzionalità epatica)Colinesterasi (indice di funzionalità epatica)
Fosfatasi alcalina (affezioni epatiche e dell’app. Fosfatasi alcalina (affezioni epatiche e dell’app. scheletrico)scheletrico)
Enzimi di interesse clinico che si presentano in forme Enzimi di interesse clinico che si presentano in forme multiplemultiple
Controllo dell’attività enzimatica
1. accumulo del prodotto2. disponibilità del substrato3. controllo genetico4. modifica covalente
5. isozimi6. proteine modulatrici7. enzimi allosterici
reversibile
irreversibile
6. Proteine modulatrici
La proteina chinasi AMP ciclico dipendente (PKA)
Controllo dell’attività enzimatica
1. accumulo del prodotto2. disponibilità del substrato3. controllo genetico4. modifica covalente
5. isozimi6. proteine modulatrici7. enzimi allosterici
reversibile
irreversibile
7. Enzimi allostericila loro cinetica non obbedisce
all’equazione di Michaelis-Menten
Grafico sigmoide di V in funzione di [S]
Il modello della regolazione enzimatica: la glicogeno fosforilasi
1. In condizioni normali, l’attività di questo enzima nel muscolo è regolataallostericamente da metaboliti che riflettono lo stato energetico cellulare(AMP, ATP, glucosio 6 fosfato)
2. In caso di stress l’adrenalina stimola una cascata di reazioni che culminano nella fosforilazione (attivazione) dell’enzima
DIMERO DELLA GLICOGENOFOSFORILASI
STRUTTURA DEL MONOMERODELLA GLICOGENO FOSFORILASI
Curve di v in funzione di [S] per la glicogeno fosforilasi
b) L’ATP è un inibitore a feed-back che influenza l’attività dell’enzima per il substratoc) L’AMP è effettore eterotropico positivo; si lega allo stesso sito dell’ATP (in competizione) ed influenza l’affinità dell’enzima per il substrato
Livelli significativi di AMP indicano che lo stato di energia della cellula è basso e che dovrebbe essere prodotta più energia (ATP).
I cambiamenti nelle concentrazioni cellulari di ATP e AMP e la loro competizione per il legameallo stesso sito con effetti opposti assicura che la produzione di energia sia proporzionataalle esigenze cellulari
Meccanismo della modifica covalentee della regolazione allosterica dellaglicogeno fosforilasi
1.
2.
La fosforilazione causa nella fosforilasi un drastico cambiamento conformazionale
La glicogeno fosforilasi è regolata dacascate enzimatiche
L’attivazione ormonale dell’adenilato ciclasi
MECCANISMI DI AZIONE DEGLI ENZIMI
I tipi di meccanismi catalitici utilizzati dagli enzimi sono stati I tipi di meccanismi catalitici utilizzati dagli enzimi sono stati
classificati come:classificati come:
catalisi acido-basica catalisi acido-basica
catalisi covalentecatalisi covalente
catalisi favorita da ioni metallicicatalisi favorita da ioni metallici
catalisi favorita da effetti di prossimità e di orientamentocatalisi favorita da effetti di prossimità e di orientamento
catalisi acido-basica(presente in quasi tutte le reazioni enzimatiche): la velocità aumenta se cambia il pH.
Esistono di 2 tipi di catalisi acido-basica:
catalisi acido-base specifica:gli ioni H+ o OH- accelerano la reazione(la concentrazione del tampone non haalcun effetto sulla reazione)
catalisi acido-base generaleun acido o una base, diversi da H+ o OH- accelerano una reazione (il tampone può donare o accettare protoni, influenzando così la velocità di reazione)
Catalisi covalente: alcune reazioni enzimatiche devono gran parte dell’aumentodella loro velocità alla formazione di legami covalenti fra E ed S
X= centro nucleofilo cheattacca un centro elettrofilo
catalisi favorita da ioni metallici: catalisi favorita da ioni metallici: alcuni enzimi richiedono ioni metallici per alcuni enzimi richiedono ioni metallici per svolgere la loro massima attività catalitica svolgere la loro massima attività catalitica
ll’alcol deidrogenasi epatica’alcol deidrogenasi epatica
uno ione zinco del sito attivo dell’enzimaalcol deidrogenasi stabilizza la formazione di una carica negativa sull’atomo di ossigenodell’acetaldeide, portando alla comparsa di una parziale carica positiva indotta sull’atomodi carbonio carbonilico
catalisi favorita da effetti di prossimità e di orientamentocatalisi favorita da effetti di prossimità e di orientamento
le reazioni chimiche avvengono più velocemente quando i reagenti si le reazioni chimiche avvengono più velocemente quando i reagenti si trovano in prossimità, cioè vicini gli uni agli altri.trovano in prossimità, cioè vicini gli uni agli altri.
Gli enzimi non solo mantengono i substrati e i gruppi catalitici vicini gli uni agli altri, ma li orientano in modo tale da favorire la catalisi
MECCANISMI ENZIMATICI
Serina proteasi
Aspartato proteasi
Serina proteasi
classe di enzimi proteolitici il cui meccanismo catalitico è basato sulla presenza di un residuo di serina nel sito attivo.
-tripsina-chimotripsina-elastasi-trombina-plasmina-attivatore tissutale del plasminogeno
-acetil colinesterasi= non è una proteasi ma una serina esterasi il cui meccanismo d’azione è correlabile a quello delle serina proteasi. Essaidrolizza il neurotrasmettitore acetilcolina nello spazio sinaptico interneuronico.
enzimi digestivi sintetizzati nel pancreas e secreti nell’apparato digerente come proenzimi inattivi o zimogeni
Tripsina, chimotripsina ed elastasi catalizzano tutti la stessa reazione: la scissione di una catena polipeptidica.
Tripsina: agisce su aa basici(arginina, lisina)
Chimotripsina: agisce su aaaromatici
Elastasi: agisce su piccoliresidui di aa neutri
Tre residui polari (His 57, Asp102, Ser195) formano la cosiddetta triade catalitica in corrispondenza del sito attivo il quale è costituito da una depressione sullasuperficie dell’enzima.
Il diisopropilfluorofosfato reagisce con i residui di serina del sito attivo delleserina proteasi e delle serina esterasi (come l’acetilcolinesterasi) causando unainattivazione.
Le proteasi a serina sono sensibili alla inibizione da parte di fluorofosfati organici
complesso covalenteenzima-inibitore
Acetilcolinesterasi: serina esterasi che degrada il neurotrasmettitoreacetilcolina nei neuroni.
DIFP: altamente tossico perché inibisce le acetilcolinesterasi.
Sarin: molecola simile al DIFP (1995, metropolitana di Tokyo)
Gas mortale VX: 10 volte più tossico del Sarin (Inghilterra)
Aspartato proteasi
classe di enzimi proteolitici il cui meccanismo catalitico è basato sulla presenza di due residui di acido aspartico nel sito attivo.
Alcune aspartato proteasi rappresentative
Nome Sorgente Funzione
Pepsina Stomaco Digestione proteine della dieta
Catepsina D Milza, Fegato Digestione lisosomiale proteine
Renina Rene Regolazione pressione arteriosa
Proteasi HIV-1 Virus AIDS Maturazione delle proteine delvirus dell’AIDS
A differenza delle serina proteasi, le aspartato proteasi non formano legami covalenticon i loro substrati peptidici.
La proteasi del virus HIV-1 dell’AIDS è una aspartato proteasi
La proteasi HIV-1 scinde la poliproteina originando proteine diverse necessariealla crescita virale e all’infezione cellulare
Gli inibitori delle proteasi prolungano la vita dei pazienti affetti da AIDSTerapia: inibitori proteasi + AZT
Struttura dell’AZTinibitore dellatrascrittasi inversa
CARATTERISTICHE DI UN FARMACOBiodisponibilità: capacità di raggiungere nell’organismo il luogo di azione desideratoSpecificità: per la proteasi dell’HIV nei linfociti e non per le altre proteasiNovità: per contrastare i ceppi mutanti dell’HIV resistenti agli inibitori delle proteasi (ricerche ancora in corso)
Farmaci progettati con un disegno strategico basato sulla struttura: la parte della struttura contenente il gruppo -OH si inserisce fra i due gruppi carbossilici del sito attivo della proteasi