ENZIMAS DE RESTRICCIÓN Y OTRAS ENZIMAS UTILIZADAS EN...
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ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Y OTRAS ENZIMAS
UTILIZADAS EN
INGENIERÍA GENÉTICA
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ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
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Importancia en el desarrollo de la ingeniería genética
EcoRI GAATTC
CTTAAG
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Restricción-modificación
m
G-A-A-T-T-C
C-T-T-A-A-G
m
Metilasa
EcoRI
mG-A-A-T-T-CC-T-T-A-A-G
m
mG-A-A-T-T-CC-T-T-A-A-G
m
Nucleasa
EcoRI
G-A-A-T-T-CC-T-T-A-A-G
Nucleasa
EcoRI
G-A-A-T-T-CC-T-T-A-A-G
G A-A-T-T-CC-T-T-A-A G
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Sistemas de modificación- restricción:
mecanismo de defensa de las bacterias
contra DNA invasor
Par
endonucleasa + metilasa
misma especificidad
(reconocen la misma
secuencia)
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Tipos de enzimas de restricción
Tipo IIs: Reconocen secuencias no palindrómicas, 4-7 pb. Sitio de
corte en la secuencia y hasta 20 pb de distancia
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ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
- Desoxirribonucleasas, con actividad endonucleolítica, que
reconocen secuncias específicas en el DNA
- Estas secuencias tienen a menudo estructura palindrómica
(simetría), y una longitud de 4, 6, 8 nucleótidos
GTCGAC
CAGCTG
GTAC
CATG
GTCCGGAC
CAGGCCTG
44 46 48
256 4096 65536
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Sitios de corte de las endonucleasas de restricción del tipo II
Tipo IIs: MboII
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Extremos protuberantes o cohesivos
GAATTC
CTTAAG
G-3’
CTTAA-5’
5’-AATTC
3’-G
EcoRI
5’ protuberantes
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Extremos protuberantes o cohesivos
CTGCAG
GACGTC
CTGCA-3’
G-5’
5’-G
3’-ACGTC
PstI
3’ protuberantes
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Extremos romos
CCCGGG
GGGCCC
CCC-3’
GGG-5’
5’-GGG
3’-CCC
SmaI
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Extremos compatibles (I)
GAATTC
CTTAAG
GAATTC
CTTAAG
EcoRI
GAATTC
CTTAAG
EcoRI
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Extremos compatibles (II)
GTCGAG
CAGCTC
GTCGAC
CAGCTG
SalI
CTCGAG
GAGCTC
XhoI
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Extremos romos
(siempre compatibles)
CCCATC
GGGTAG
CCCGGG
GGGCCC
SmaI
GATATC
CTATAG
EcoRV
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Extremos 5’ protuberantes no compatibles. Rellenados, se transforman en romos
(siempre compatibles)
GAATTC
CTTAAG
EcoRI
CTCGAG
GAGCTC
XhoI
G-3’
CTTAA-5’
AA T-3’T
5’-TCGAG
3’-CTCG3’-A
GAATT
CTTAA
TCGAG
AGCTC
Klenow + dNTPs
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Extremos 3’ protuberantes no compatibles. Degradado de cadena sencilla para
convertirlos en extremos romos
CTGCAG
GACGTC
PstI
C
G-5’
• Nucleasa S1: endonucleasa específica de cadena sencilla
• Mung Bean: endonucleasa específica de cadena sencilla
• T4 DNA polimerasa: Carece de la actividad exonucleasa 5’→3’, pero retiene la
actividad exonucleasa 3’→5’
• Klenow: Carece de la actividad exonucleasa 5’→3’, pero retiene la actividad
exonucleasa 3’→5’
TGCA-3’-3’-3’-3’-3’
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Plantas: metilación m5CG y m5CNG.
Uso de endonucleasas con diferente sensibilidad a metilación:
McClelland M. 1983. The frequency and distribution of methylatable DNA
sequences in leguminous plant protein coding genes. J. Mol. Biol. 19: 346-354
Vertebrados: metilación de la C en secuencias CG en el C5, generando 5-
metilcitosina: m5CG. Secuencias (islas) CpG, implicadas en regulación de la
transcripción.
HpaII, MspI: isosquizómeros, reconocen C/CGG
La metilación del ADN en eucariotas superiores está relacionada con la
regulación de la transcripción. El uso de algunas enzimas de restricción
específicas permite distinguir entre ADN metilado y no metilado,
obteniéndose de esta manera información sobre la posible regulación
de la expresión de un gen por metilación del ADN
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Aspectos prácticos
Unidad: Cantidad de enzima que digiere 1 mg de ADN en 1 hora a la
temperatura y condiciones óptimas.
Inhibición: Adición de 20 mM EDTA
Inactivación: Por calor o tratamiento con fenol-CIA
Dos enzimas de restricción pueden utilizarse simultáneamente siempre
que compartan las mismas condiciones de digestión (temperatura, pH,
concentración de sales)
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POLIMERASAS Y ENZIMAS
MODIFICADORAS DEL ADN
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DNA polimerasas: actividades y propiedades
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DNA polimerasas: actividades y propiedades
5’ 3’OH
5’3’DNA molde con primer
dsDNA con huecos
Extremos 5’ protuberantes
dsDNA con “nicks” (nick translation)
5’P3’OH 5’P3’OH
Hairpin5’
3’OH
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Nick Translation
DNasa I
DNA polimerasa I
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DNA polimerasas: utilidades
DNA Polimerasa I
- Marcaje por “nick translation”
Klenow
- Rellenado de extremos 5’ protuberantes
- Síntesis de la segunda hebra de cDNA
T4 polimerasa
- Eliminación de extremos 3’ protuberantes
Taq DNA polimerasa (Vent, Pfu)
- PCR
Transcriptasa reversa (AMV: avian myeloblastosis virus) (MMLV: Moloney murine leukemia virus) (Tth: Thermus thermophylus)
- Síntesis de cDNA a partir de RNA
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Enzimas modificadoras: actividades y utilidades
DNA ligasa (del bacteriófago T4)
- Forma enlaces fosfodiester entre un extremo 5’ P y otro 3’OH. Requiere ATP
- Usos: Unir dos moléculas de DNA: vector - inserto
Fosfatasa alcalina (BAP: bacterial alcaline phosphatase) (CIP: calf intestinal alkaline phosphatase) (SAP: shrimp alkaline phosphatase)
- Eliminan el grupo fosfato del extremo 5’ de DNA, RNA y dNTPs
- Usos: desfosforilación de extremos en experimentos de ligación vector-inserto
5’P3’OH 5’P3’OHNNG GATCCNNNNCCTAG GNN
NNGGATCCNNNNCCTAGGNN
Ligasa
NNGGA TCCNNNNCCT AGGNN
LigasaNNGGATCCNNNNCCTAGGNN5’P3’OH
5’P 3’OH
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Acción de la DNA ligasa
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Enzimas modificadoras: actividades y utilidades
Fosfatasa alcalina
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Enzimas modificadoras: actividades y utilidades
Polinucleótido kinasa
- Transfiere el grupo fosfato g desde una molécula de ATP a un extremo 5’ de DNA o RNA
- Usos: Marcaje 5’ terminal de una molécula de DNA
Fosforilación de fragmentos de DNA que carecen de P en 5’ para ligación
Ribonucleasa H (RNasa H)
- Degradación endonucleolítica del RNA en híbridos DNA-RNA
Nucleasas
DNasa I (de páncreas bovino)
- Corta ambas hebras del DNA en presencia de Mn2+. En presencia de Mg2+
corta una sóla hebra (nick)
- Usos: Eliminación de DNA en muestras de RNA (Mn2+)DNA footprinting (Mn2+)Nick translation: generación de nicks para acción de DNA pol. I (Mg2+)