Enzimas: catalizadores biológicos
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Enzimas: catalizadores biológicos Son capaces de aumentar la velocidad de reacciones químicas. Son muy eficientes, específicas y no se consumen en la reacción. PUEDEN AUMENTAR LA VELOCIDAD DE LA REACCION MAS DE UN MILLON DE VECES
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Enzimas: catalizadores biológicos
Son capaces de aumentar la velocidad de reacciones
químicas.
Son muy eficientes, específicas y no se consumen en la
reacción.
PUEDEN AUMENTAR LA VELOCIDAD DE LA REACCION
MAS DE UN MILLON DE VECES
Cinética enzimática
Estudia cómo cambia la velocidad de reacción (vo) en
respuesta a la modificación de diferentes factores:
• concentración de ligandos (sustratos, inhibidores y activadores)
• concentración de enzima
• condiciones ambientales (pH, temperatura, fuerza iónica)
¿Qué es vo y cómo se determina experimentalmente?
A tiempos muy
cortos (iniciales) las
graficas de [P] vs
tiempo son lineales.
A tiempos mayores
se puede inactivar E,
se da la reacción inversa, se
consume S,
puede haber inactivación por P.
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UTILIZANDO UNA CONCENTRACION DE ENZIMA FIJA PUEDO REALIZAR
CINETICAS VARIANDO LA CONCENTRACION DE SUSTRATO
Y DETERMINAR LAS VELOCIDADES INICIALES O Vo PARA CADA
CONCENTRACION DE SUSTRATO.
V = velocidad de formación del producto
CANTIDAD DE PRODUCTO FORMADO POR UNIDAD DE TIEMPO
Cada velocidad determinada experimentalmente
Variando la concentración de sustrato
Manteniendo constante la cantidad de enzima
Relación observada entre la velocidad inicial (v0)
y la concentración inicial de sustrato ([S]0)
Velocidad
Vo
Concentración de Sustrato
Los estudios cinéticos proporcionan
información acerca:
DEL MECANISMO DE REACCION
LA ESPECIFICIDAD DE LA ENZIMA
DE CUALES MOLECULAS INHIBEN O
ACTIVAN DICHA ENZIMA
Propusieron una ecuación de
velocidad que explica el
comportamiento cinético de
NUMEROSAS ENZIMAS
FORMACIÓN DEL
COMPLEJO
ENZIMA-
SUSTRATO
MODELO CINÉTICO DE MICHAELIS-MENTEN
k1
k-1
kcat
E + S ES P + E
Se asume que la reacción inversa de P+E, a EP y luego a ES se produce tan poco que la podemos ignorar
Michaelis y Menten propusieron que las reacciones catalizadas enzimáticamente
ocurren en dos etapas:
- Formación del complejo ES
- Formación del producto P, liberando el enzima libre E
En este esquema, k1, k-1 y kcat son las constantes cinéticas
individuales de cada proceso y también reciben el nombre
de constantes microscópicas de velocidad.
v1 = k1 [E] [S]
v2 = k-1 [ES]
v3 = kcat [ES]
Este modelo cinético adopta la hipótesis del estado estacionario, según la cual la
concentración del complejo ES es pequeña y prácticamente constante a lo largo de
la reacción.
Por tanto, la velocidad de formación del complejo enzima-sustrato (v1) es igual a la de
su disociación (v2+ v3):
v1 = v2 + v3
k1
k-1
kcat
E + S ES P + E
Además, como [ES] es
constante, la velocidad de
formación de los productos
es constante:
v = v3 = kcat [ES]
k1
k-1
kcat
E + S ES P + E
En el estado estacionario [ES] es prácticamente constante:
d[ES]/dt=0
Velocidad de disociación de ES = velocidad formación de ES
Velocidad de disociación de ES = (K-1 + Kcat)[ES]
Velocidad de formación de ES =K1[E][S]
(K-1 + Kcat)[ES] - K1 [E][S] = 0
(K-1 + Kcat)[ES] - K1 [E][S] = 0
Despejamos [ES]
[ES] = k1 [E][S]
(K-1 + Kcat)
Dado que la enzima libre [E] es igual a [Eo]-[ES]
puedo reescribir la ecuación como:
[ES]=( K1 ) ([Eo]-[ES]) [S]
K-1 + Kcat
Reordenando y definiendo la
constante KM como (K-1+Kcat)
K1
SK
SEES
M 0
SK
SEES
M 0
Recordando que V = Kcat [ES]
SK
SEkV
M 02
0
cat
Ecuación
de
Michaelis-Menten
Tenemos que
Para cualquier reacción enzimática, [Eo], kcat y KM son constantes
KM como (K-1+Kcat)
K1
k1
k-1
kcat
E + S ES P + E
A altas [S], el enzima se
encuentra saturada por el
sustrato, y la velocidad ya
no depende de [S].
En este punto, la reacción
es de orden cero y la
velocidad es máxima (Vmax).
GRAFICO DE
Michaelis-Menten
vo = kcat [Eo][S]
Km + [S]
como la Km es muy baja respecto a [S], la km despreciable, vo = kcat [Eo] [S]
[S]
vo = kcat [Eo]
• por lo tanto v = Kcat [ES] puedo expresarla como
v = Kcat [Eo] = Vmax
a Vmax todos los sitios activos están ocupados y no hay
casi moléculas de enzima libre E por lo cual [ES]=[Eo]
cuando [S] >>> Km estamos en Vmax ¿ Qué ocurre cuando [S] >>> Km?
KM + [S]
vo = Vmax [S]
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kcat denominada constante catalítica o número de recambio
cuando la [S] >>> Km
Útil para reacciones donde entran en juego varias constantes de velocidad ya que
esta constante de velocidad describe el pazo limitante en condiciones de saturación.
Esta constante de denomina constante catalítica kcat o número de recambio.
Es una constante de velocidad de primer orden igual al número de moléculas de S
procesadas por sitio activo dela E en cada segundo cuando todos los sitios
activos están ocupados.
VMAX = kcat [Eo]
kcat=VMAX/[Eo]
Tiene unidades de tiempo-1 y es expresada en s-1
Entonces si sabemos la VMAX y la [Eo] podemos calcular kcat para cada
enzima/sustrato
• por lo tanto v = Kcat [ES] puedo expresarla como
v = Kcat [Eo] = Vmax
COMPARACION DE Kcat DE DIFERENTES ENZIMAS
número de moléculas de S procesadas por la molécula de E cada segundo
Kcat (constante catalítica)
•¿Qué ocurre cuando [S] <<< Km?
vo = Vmáx [S]
Km + [S]
como la [S] es muy baja respecto al Km, [S] es despreciable, vo = Vmáx [S]
Km
En este caso vo tiene una dependencia lineal con la [S].
• Qué ocurre cuando vo = ½ Vmáx?
despejando queda que Km = [S]
• Km es la [S] a la cual v = ½ Vmax
Km representa la cantidad de sustrato necesaria para fijarse a la mitad de la
E disponible y producir la mitad de la Vmax
Cuando [S] es pequeña, la
velocidad inicial es directamente
proporcional a la concentración de
sustrato, y por tanto, la reacción
es de primer orden.
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• Es una constante que tiene unidades de concentración.
Si para una E y S determinados contamos con el valor de km esto nos permitirá:
- conocer la fracción de sitios activos que están ocupados a una [S] dada:
Km
- conocer la concentración celular de [S] aproximada
-conocer la [S] necesaria para una catálisis significativa
Km = k-1 + k2
k1
La Km como cociente de constantes de velocidad de la reacción
y si k2 <<< k-1
Km = k-1
k1
y como la constante de disociación del
complejo ES viene dado por:
KES = [E][S] = k-1
[ES] k1
Solo en esta situación
la km da idea de la afinidad
de la E por el S
KM alto = asociación débil entre ES (k1 pequeña) = baja afinidad de E por el sustrato
KM bajo= asociación fuerte entre ES (k1 grande) = alta afinidad de E por el sustrato.
Km = k-1
k1
La constante de especificidad kcat/KM
cuando la [S] <<< Km
vo = kcat [Eo] [S]
Km
La relación kcat/Km es equivalente a la constante de velocidad
para la reacción entre E y S.
-vo depende de [Eo] y [S] por lo tanto es una ecuación de segundo orden y la
constante kcat/Km tiene unidades de Molar-1 segundos-1.
• Es una constante útil para comparar la eficiencia catalítica de diferentes enzimas,
o una enzima respecto a dos sustratos diferentes.
- En las células, las reacciones nunca se encuentran en condiciones de VMAX (pero in
vitro la pueden alcanzar)
- Los sustratos se encuentran generalmente en el orden de concentración μmolar, las
enzimas en el orden de concentración nanomolar.
El limite superior de kcat/KM es la constante de difusión (109 M-1 s-1)
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Comparar valores de eficiencia catalítica o
Kcat/Km
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Utilizando [E] fija
puedo realizar varios ensayos cinéticos variando [S]
y determinar vo para cada [S] ensayada.
¿Cómo determino experimentalmente VMAX y KM?
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5
0
1
2
3
4
5
vo
Hyperbl Fit of vo
vo
(m
icro
M/m
in)
[S] (mM)
Equation y = P1*x/(P2 + x)
Adj. R-Square 0,9967
Value Standard Error
vo P1 6,78703 0,28758
vo P2 1,2246 0,13189
http://src.sfasu.edu/~avk/BTC560/HOW%20TO.htm
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evita problemas asociados a las linearizaciones
Referencia donde profundizar
Tommasini, R., Endrenyi, L., Taylor, P. A., Mahuran, D. J., Lowden, J. A. (1985)
A statistical comparison of parameter estimation for the Michaelis-Menten kinetics of
human placental hexosaminidase. Can. J. Biochem. Cell Biol. 63, 225-230.
Curva de mejor ajuste a la ecuación de Michaelis-Menten
Fosfatasa silvestre
PtpA
Fosfatasa mutada D126A
PtpA D126A
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Vmax kcat Km
(mmol pNP min-1 m (sec-1) (mM)
PtpA silvestre 4.8 1.59 3.4
PtpA D126A 0.1 0.03 4.8
Linearización de la ecuación de M-M
Gráfico de dobles recíprocos o de Lineweaver-Burk
Grafico de Hanes-Wolff
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REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
• Una molécula de enzima no tiene por qué actuar siempre a la misma velocidad. Su actividad puede estar modulada por:
• cambios en el pH
• cambios en la temperatura
• presencia de cofactores
• las concentraciones del sustrato y de los productos finales
• presencia de inhibidores
• modulación alostérica
• modificación covalente
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Al aumentar la [I] mayor [S] será
necesaria para lograr una velocidad
dada.
Si aumento luyo la [S] puedo revertir la
inhibición y llegar a Vmax
Veré efecto en el Km, aumenta
INHIBICION COMPETITIVA
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Vmax no se altera, Km aumenta
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El inhibidor puede unirse a la
enzima libre y también al
complejo ES.
Aunque aumente la [S] no se
logra llegar a valores de Vmax,
El Km no cambia, hay menos
enzima disponible, pero el S se
une con la misma “afinidad” al
sitio activo de la enzima.
INHIBICION NO COMPETITIVA
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Km no se alterad, Vmax disminuye
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Ejemplo de inhibidores
La penicilina, inhibe una transpeptidasa implicada en la síntesis de
péptidogilcano, componente fundamental de la pared celular bacteriana.
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MODULACIÓN ALOSTÉRICA DE LA
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
• Hay enzimas que pueden adoptar 2 conformaciones interconvertibles llamadas R (relajada) y T (tensa).
• R es la forma más activa porque se une al sustrato con más afinidad. Las formas R y T se encuentran en equilibrio R <==> T
• Ciertas sustancias tienden a estabilizar la forma R. Son los llamados moduladores positivos. El propio sustrato es a menudo un modulador positivo.
• Las moléculas que favorecen la forma R pero que actúan sobre una región del enzima distinta del centro activo son los activadores alostéricos
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Enzimas alostéricas (del griego allos-otro y stero-tridimensional)
• Tienen dos o mas lugares de unión que interactúan entre si
• Se cree que la mayoría de las proteínas son alostéricas
• La enzima puede existir en una conformación activa e
inactiva
Proteína que cambia de una conformación a otra cuando se une a otra molécula o cuando es modificada covalentemente, el cambio de conformación altera la actividad de la proteína
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LAS ENZIMAS ALOSTERICAS NO OBEDECEN
LA CINETICA DE MICHAELIS-MENTEN
ENZIMAS MULTIMERICAS,
MAS DE UN SITIO ACTIVO
EFECTO COOPERATIVO:
La unión de la primera molécula de ligando incrementa la afinidad de la otra subunidad por la misma molécula de ligando
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Las actividades catalíticas están reguladas
para controlar la compleja red de vías
metabólicas
Se requieren elaborados controles para
regular CUANDO y a que VELOCIDAD tiene
lugar cada reacción.
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Figure 3-54a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
LOS COMPLEJOS MULTIENZIMATICOS
AYUDAN A INCREMENTAR
LA VELOCIDAD
DEL METABOLISMO CELULAR
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Figure 3-54b Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
