1

Endonucleasas de Restricción

Enzimas que tienen la capacidad de cortar DNA doble cadena en una secuencia específica o restringida

Extraídas y clonadas de bacterias:

Nombre de ER: según la bacteria a partir de la cual fue aislada

Ejemplo: EcoRI

Eco: Género y especie: Escherichia coli

R: Cepa RY12

I: primer ER aislada de este organismo

Forman parte de un sistema de Restricción-Modificación, actuando como un sistema de defensa contra patógeno, protegiéndolas del ataque de DNA foráneo (ej.: bacteriófago).

R: endonucleasa (corta DNA doble cadena rompiendo uniones fosfodiéster)

M: modifica al DNA por metilación (metilasa)

Es decir, cada enzima de restricción tiene una metilasa asociada.

• Ambas enzimas reconocen la misma secuencia de bases. La metilasa metila una base determinada siempre dentro de la secuencia de reconocimiento, mientras que la endonucleasa puede cortar dentro de la secuencia de reconocimiento o fuera de ella, dependiendo del tipo de enzima.

•La metilación en las dos hebras del DNA evita que la Enzima de Restricción pueda cortar la molécula de DNA. Este mecanismo es empleado por las bacterias para proteger a su propio DNA genómico y plasmídico del ataque de sus propias Enzimas.

2

El sistema R-M funciona como un sistema “inmune”

• Mecanismo para resistir el ataque viral

• Permite a la bacteria distinguir entre DNA propio y DNA foráneo:

las ER digieren al DNA foráneo no metilado

y protegen DNA propio por metilación

Ejemplo: (específico para las de Tipo II)

1) Ambas cadenas metiladas no hay ni metilación ni restricción

3) Ninguna cadena metilada no hay metilación, sí restricción

M.EcoRI5´---- GAATTC ---- 3´3´---- CTTAAG ---- 5´

CH3

CH3

5´---- GAATTC ---- 3´3´---- CTTAAG ---- 5´

CH3

CH3

R.EcoRI

2) Sólo una cadena metilada hay metilación y no restricción

M.EcoRI5´---- GAATTC ---- 3´3´---- CTTAAG ---- 5´

CH3

5´---- GAATTC ---- 3´3´---- CTTAAG ---- 5´

CH3

CH3

R.EcoRI

5´---- G AATTC ---- 3´3´---- CTTAA G ---- 5´

M.EcoRI5´---- GAATTC ---- 3´3´---- CTTAAG ---- 5´

R.EcoRI

3

¿Por qué el sistema R-M funciona como un “sistema inmune”?

No hay lisis

Caso 2

Lisis

Caso 3

No hay lisis

Bacteria EcoRI+ HindIII-

Bacteria EcoRI- HindIII+

Bacteria EcoRI+ HindIII-

Caso 1

HindIII

DNA del fago con las secuencias de reconocimiento de ambas ER

EcoRI

5´---- GAATTC --------------- AAGCTT---- 3´3´---- CTTAAG ----------------TTCGAA---- 5´

CH3

CH3

HindIII

DNA del fago con las secuencias de reconocimiento de ambas ER

EcoRI

5´---- GAATTC --------------- AAGCTT---- 3´3´---- CTTAAG ----------------TTCGAA---- 5´

CH3

CH3

4

DNA metilasas o metiltransferasas:

•Transferencia de un grupo metilo desde una molécula donante (SAM) a una A y C:

•No requieren Mg2+ como cofactor

Eucariotas: asociadas a la inactivación génica: metilaciones en la posición C5 de las C en islas CpG

Procariotas: participan principalmente del sistema R-M

En las cepas de E.coli de laboratorio existen 3 DNA-MT: Sistema hsd: AAC(N6)GTGC and GCAC(N6)GTTDam metilasa: GATC Dcm metilasa: CCAGG y CCTGG

DNA plasmídico aislado de cepas E.coli Dam+ son resistentes al corte por MboI (GATC)

Si se quiere clivar una molécula recombinanate con ER sensibles a la metilación por estas MT, la misma debe ser amplificada y aislada a partir de cepas Dam- y Dcm-

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Composición de las subunidades

Especificidad de la secuencia de reconocimiento

Sitio de clivaje

Requerimiento de cofactores

Sistema de Restricción metilasa dependiente

Endonucleasas que clivan DNA doble cadena cuando está doblemente metilado o hemimetilado

En E.coli existen tres sistemas:

MrcA: m5CG

MrcBC: Pum5CG

Mrr: m6A

Clasificación de ER

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ER Tipo I Tipo II Tipo IIs Tipo III

Estructura proteica

Bifuncional, 3 subunidades

Unifuncional, endonucleasa y metilasa en enzimas separadas

Unifuncional, endonucleasa y metilasa en enzimas separadas

Bifuncional, 2 subunidades distintas

Sitio de reconocimiento

Asimétrico y bipartito

Secuencia palindrómica (simétrica), 4-6 pb (tb de 8pb)

Asimétrico y continuo

Asimétrico, 5-7 pb.R: secuencia duplicada en direcciones opuestos

Sitio de clivaje No específico› 1000pb del sitio de reconocimiento

En el mismo sitio de reconocimiento o adyacente a este

A distancias fijas del sitio de reconocimiento (fuera del mismo)

24-26 pb río abajo del sitio de reconocimiento

Requerimientos

ATP para moverse del sitio de reconocimiento al de clivaje, Mg2+, SAM

No ATPMg2+, (la M requiere SAM)

Mg2+, (la M requiere SAM)No ATP

ATP para moverse del sitio de reconocimiento al de clivaje, Mg2+, SAM

Ejemplo EcoKI AACN6GTGC

TTGN6CACG

EcoRI AwlI EcoP15CAGCAG(N)CTGCTGGTCGTC(N)GACGAC

Uso en biología molecular

No generan fragmentos de tamaño definido

Generan fragmentos de tamaño definido, se usan en el laboratorio!!!

Generan fragmentos de tamaño definido

No generan fragmentos de tamaño definido

Clasificación de ER

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Tipo II (las que se emplean en el laboratorio)

Las secuencias de reconocimiento pueden ser:

sec palindrómicas y continuas (reconocidas por homodímeros)Ejemplo: EcoRI

Secuencias simétricas y discontinuas (reconocidas por homodímeros)Ejemplo: BglI

sec asimétricas y continuas (reconocidas por heterodímeros)Ejemplo: BbvCI

Código de una letraN = A or C or G or T

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Extremos:

Romos:

Cohesivos:

•5’ protruyente

•3’ protruyente

5´---- GAATTC ---- 3´3´---- CTTAAG ---- 5´

5´---- G AATTC ---- 3´3´---- CTTAA G ---- 5´

EcoRI

5´----CCCGGG ---- 3´3´----GGGCCC ---- 5´

5´----CCC GGG ---- 3´3´----GGG CCC ---- 5´

SmaI

5´---- CTGCAG ---- 3´3´---- GACGTC ---- 5´

5´----CTGCA G ---- 3´3´----G ACGTC ---- 5´

PstI

• La ligación de extremos cohesivos requiere complementariedad de secuencia

• La ligación de extremos romos no requiere de secuencias complementarias: dos extremos romos cualquiera pueden ser unidos por la DNA ligasa.

• La eficiencia de ligación de extremos cohesivos es mayor que la de extremos romos.

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Isoesquizómeros:

Son distintas ER que reconocen la misma secuencia, generalmente con distintas especificidades. Pueden generar:

los mismos extremos: Acc65I y KpnI

distintos extremos:

ER que reconocen distintas secuencias, pero dejan los mismos extremos:

5´----GGTACC ---- 3´3´----CCATGG ---- 5´

5´----G GTACC ---- 3´3´----CCATG G ---- 5´

5´----CCCGGG ---- 3´3´----GGGCCC ---- 5´

5´----CCCGGG ---- 3´3´----GGGCCC ---- 5´

5´----CCC GGG ---- 3´3´----GGG CCC ---- 5´

5´----C CCGGG ---- 3´3´----GGGCC C ---- 5´

XmaI

SmaI

5´----GGATCC ---- 3´3´----CCTAGG ---- 5´

5´----AGATCT ---- 3´3´----TCTAGA ---- 5´

5´----G GATCC ---- 3´3´----CCTAG G ---- 5´

5´----A GATCT ---- 3´3´----TCTAG A ---- 5´

BglII

BamHI

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Cómo generar nuevas secuencias de corte

1- Corte, filling in/trimming back, religación:

Filling in (5’ protruyente)

Trimming back (3’protruyente)

5´---- GAATTC ---- 3´3´---- CTTAAG ---- 5´

5´---- G AATTC ---- 3´3´---- CTTAA G ---- 5´

EcoRI

fill in (con DNApol + dNTPs)

5´---- GAATT AATTC ---- 3´3´---- CTTAA TTAAG ---- 5´

5´---- GAATTAATTC ---- 3´3´---- CTTAATTAAG ---- 5´

ligasa

XmnI (GAANN/NNTTC)

5´---- CTGCAG ---- 3´3´---- GACGTC ---- 5´

5´----CTGCA G ---- 3´3´----G ACGTC ---- 5´

PstI

3´-5´exonucleasa

5´----C G ---- 3´3´----G C ---- 5´

Ligados entre sí o a otros fragmentos con extremos

romos

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3- Ligación de extremos romos:

2- Ligación de extremos complementarios:

5´----G GATCC ---- 3´3´----CCTAG G ---- 5´

5´----A GATCT ---- 3´3´----TCTAG A ---- 5´

BglII

BamHI

Ligasa

MboI (/GATC)

5´----AGATCC ---- 3´3´----TCTAGG ---- 5´

5´----GGATCT---- 3´3´----CCTAGA ---- 5´

5´----AG CT---- 3´3´----TC GA---- 5´AluI

5´----GAT ATC---- 3´3´----CTA TAG---- 5´

EcoRVLigasa

5´----AGATC---- 3´3´----TCTAG---- 5´

5´----GATCT---- 3´3´----CTAGA---- 5´

MboI (/GATC)

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Usos en el laboratorio

Generar fragmentos de DNA de tamaño definido para:

• generar moléculas recombinantes: clonado

HindIIINcoINcoI HindIII

Fragmento amplificado

Yep51p

p +

Ligación

Digestión con ER

•Screening de transformantes por ER

Digestión con HindIII

Calle1: markers (23.13, 9.42, 6.55, 4.36, 2.32, 2.07 y 0.56 kpb) Calle2: vector digerido sin insertoCalle3: vector con inserto digerido(digestión completa)

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En el laboratorio: reacción de digestión con ER

1) Elección de la ER

Extremos, secuencia y frecuencia de corte, y la cepa

2) Reacción de digestión

3) Mezcla: pipetear + spin-down

4) T 37ºC (ó 50-65ºC)

5) tiempo: 1 hs

(compromiso entre tiempo y cantidad de enzima)

Tiempos muy prolongados: cortes inespecíficos: “Actividad STAR”

6) Frenar de la reacción:

• calor o shock térmico (65-80ºC por 20’)

• fenol/cloroformo y posterior precipitación del DNA

DNA (≤1 μg) libre de contaminantes

Buffer de reacción (1X)

(viene 10X)

pH (Tris-Cl)sales (NaCl o KCl) =Ficofactores (Mg2+)BSA

ER (1 μl= 10U)

mantener en fríoúltima en ser agregadaglicerol < 5% v/v

1UE: cantidad de enzima que corta completamente 1 μg de DNA del fago lambda en un volumen de 50 μl en 1 hs usando el buffer correspondiente

H2O csp 50μL

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Actividad STAR:

Algunas enzimas (en condiciones de reacción que no son las óptimas) pueden producir cortes en secuencias que son similares a sus secuencias de corte.

Ejemplo: EcoRI en condiciones óptimas cliva: 5´ G/AATTC 3´

en condiciones no óptimas puede clivar:5´ N/AATTN 3´

Condiciones que contribuyen a la actividad STAR

1- glicerol [>5% v/v] 2- alta UE/ µg of DNA (>100 UE/µg) 3- baja Fi [<25 mM] 4- alto pH [>pH 8.0] 5- sv orgánicos (DMSO, etanol) 6- sustitución de Mg++ por otros cationes divalentes (Mn++, Cu++, Co++, Zn++)7- tiempo de incubación mayor al óptimo 8- fragmento de DNA amplificado por PCR, sin previa purificación del mismo

Cómo inhibir la actividad STAR

1- mín UE (digestión completa)2- DNA libre de contaminantes3- aumentar Fi 100-150 mM 4- pH 7.0. 5- Mg++

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En los catálogos se describen las distintas características de cada enzima, como las siguientes:

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Secuencia a digerir:

Existen programas en internet en los cuales uno puede introducir la secuencia de bases completa simple cadena y obtener el MAPA DE RESTRICCIÓN. Ejemplo: Neb cutter V2.0

Secuencia del gen BCY1:

Z

No presenta las secuencias de corte para HindIII ni NcoI

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NcoI

Digestión doble

Digerir un mismo fragmento de DNA con dos ER distintas. Por ejemplo: hacer clonado direccional

evitar tener que precipitar al DNA dos veces, lo cual podría resultar en la pérdida de masa de DNA

ahorrar tiempo

A tener en cuenta:

• En el vector:Las secuencias de reconocimiento de las ER a emplear no deberán solaparse, y deberán estar a una determinada distancia en pb cuando se realiza una digestión doble.

• En el fragmento: la distancia del sitio de corte al extremo del fragmentoPrimers: Forward: 5' GACCATGGTATCTTCTTTGCCCAAGG 3' Reverse: 5' GGAAGCTTTTAATGTCTTGTAGGAT 3'

NcoI

HindIII

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Digestión doble

• Buffer de reacción compatible

Incompatibilidad digestión secuencial :

a) corrección del buffer o T

b) precipitación del DNA

Tabla de doble entrada: