Elisa: quantificação de proteínas e moléculas
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Elisa: quantificação de proteínas e moléculas
Elisa: quantificação de proteínas e moléculas
Sistema Duplo-Híbrido de Levedura
Sistema Híbrido-Simples: identificar proteínas que ligam ao DNA
Sistema Híbrido-Simples
Sistema Híbrido-Simples
Sistema Híbrido-Simples
Protein synthesis inhibitors cycloheximide: [active] 20mM, Boe 103675 chloramphenicol: [active] 100mM, Sigmaanisomycin: [active] 60mM, Sigma A9789
2nd messengers/inhibitors dibut cA/GMP: [active] 1mM, Sigma B1381Ca ionophore: [active] 5mM, Sigma 7272PMA: [active] 10mM, Froskolin: [active] 10mM,
1. Reagents interacting with DNA*(a) Alkylating agents: Dimethyl sulphate, Mitomycin C, Nitrogen and sulphur mustards(b) Intercalating agents: Acridine dyes, Actinomycins, Adriamycin, Anthracenes
Benzpyrene, Ethidium bromide, Propidium diiodide(c) Intertwining agents Distamycin, Netropsin2. Analogues of bases, Acyclovir ,Adenine /3‑1‑D‑arabinoside, Amethopterin
Aminopterin, 2‑aminopurine, Aphidicolin, 8‑azaguanine, Azaserine6‑azauracil, 2'azido‑2'‑deoxynucleosides, 5‑bromodeoxycytidineCytosine /3‑1‑D‑arabinoside, Diazooxynorleucine, Dideoxynucleosides5‑fluorodeoxycytidine, 5‑fluorodeoxyuridine, 5‑fluorouracil, Hydroxyurea6‑mercaptopurine
3. Inhibitors of topoisomerases: Coumericin, Nalidixic acid, Novobiocin, Oxolinic acid
4. Inhibitors of cell division: Colcemid, Colchicine, Vinblastine , Vincristine
GFP: green fluorescent protein
Microscopia confocal: estudo das células vivas
Actina F nas células da pele do bulbo da cebola: transformação transiente utilizandoA actina fundida a proteína gfp
Ela está presente nas invaginações e envolta do núcleo
Invaginações e dinâmica do núcleo
Reconstrução tridimensional da topologia do retículo endoplasmáticoNas plantas transgênicas expressando gfp
Luciferinas
Luciferinas
Luciferinas
Luciferinas
Luciferinas
Promotor da GA20 ox fundido
ao gene da luciferina
Pulverização comluciferina
Planta transgênica
Câmera CCDpara fluorescencia:::superimposição de
imagens
Luciferinas: uso simultâneo de diferentes
Luciferinas: Uso
Luciferinas: Uso
Luciferinas: Uso
Aequoporina:
Estudo das alterações na Concentração de cálcioIn vivo e em tempo real, Por um método não-destrutivo
Frio: “manchas” de aumento de calcioem resposta a baixas temperaturas
Fluoróforos utilizados para medir a [Ca2+] intracelular
Tipos: 1) Fuoróforos monovalentes (single-wavelenghth dyes): continuam a tera fluorescência no mesmo comprimento de onda
2) Fuoróforos polivalentes (ratio dyes): mudam o comprimento de onda da fluorescência quanto excitados
Fluorescência independente da [fluoróforo]: precisão na determinação do Ca2+:
Ex: fura-2 e indo 1 (polivalentes):precisão na determinação do Ca2+: precisam maior intensidade luminosa (maior dano;experimentos mais curtos)
Fluorescência dependente da [fluoróforo]: determinação semi-quantititiva do Ca2+:
Ex: fura-3 e “calcio-verde”:semi-quantitativos, precisam de luz de menor intensidade (menos dano)
Efeito Luz vermelha:::protoplasto de folha de trigo:::Fluro-3:::tempo apósadição do fluoróforo
Tempo após redução do Ca2+ do meio e o citosólico e fechamento do estômatoFluoróforo indo-1
Fura2:::gradiente de Ca2+ citosólico:::abundância canais de calcio na extremidade
Efeito do GA e do ABA nos níveis de Ca2+ em protoplastosda camada de aleurona da cevada
Estudo da expressão diferencial dos genes:
Confecção de Bibliotecas de Subtração
Checando a eficiênciada subtração
Confirmando a presença de uma proteína em um compartimento citosólico
Hibridização in situ: FISH (Fluorescent In Situ Hybridization)
Mapeamento de genesEstudo da estrutura do cromossomaEstudos citogenéticos: translocação, recombinação, etc.
Manipulação de substâncias ativas “enjauladas” (caged)
NucleotídeosQueladoresMensageiros secundáriosPeptídeos
Canais de Ca2+ queRespondem ao IP3 no estômato, pólem, etc.
Manipulação de cálcioEnjaulado: calcio controla
a orientação de crescimentodo tubo polínico
(crescimento só no ápice)
Efeito da liberação do ABA “enjaulado” após microinjeção em células-guarda
Formas de enjaular um peptídeo ou proteína
Outros sistemas modelos opcionais à Arabidopsis
Phiscomitrella
Phiscomitrella
Phiscomitrella
Phiscomitrella
GFP-talina
Estudo da Estrutura de um promotor
1) Análise por deleção
Estudo da Estrutura de um promotor
2) Análise por mutagênese
Estudo da Estrutura de um promotor
3) Análise por transativação