Eletroforese - aplicação da técnica
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Eletroforese
Pontifícia Universidade Católica de Goiás
Departamento de Biologia
Prof. Hugo Henrique Pádua M.Sc.
Fundamentos de Biofísica
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Eletroforese migração de moléculas ionizadas, deacordo com suas cargas elétricas e pesos moleculares emcampo elétrico.
Na rotina laboratorial os suportes podem ser:
Gel de agarose
Gel de poliacrilamida
A migração das partículas depende do seu tamanho e carga, além da DDP a que foram submetidas
Introdução a Eletroforese
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Técnica de separação de partículas de DNA, RNA ou proteínas, através da aplicação de uma diferença de potencial (corrente elétrica)• as partículas são separadas de acordo com o tamanho (massa)
Introdução a Eletroforese
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• Acetato de celulose
• Gel de agarose
• Gel de amido
• Gel de poliacrilamida
• Eletroforese capilar
Introdução a Eletroforese
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Eletroforese em gel é eficiente em promover a separação de partículas de acordo com o seu tamanho.
Gel de poliacrilamida Usado em separação de proteínas ou partículas muito pequenas
Gel de agarose Utilizado para separação de partículas relativamente pequenas e partículas
grandes
O DNA contém carga negativa, portanto migra para o pólopositivo
Quanto mais concentrado o gel, mais “fechada’’ é sua malha, portanto a partícula terá mais dificuldade em atravessá-la
Introdução a Eletroforese
Eletroforese em gel
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A amostra é inserida nos “pocinhos”
Uma corrente elétrica é aplicada
Partículas de menor tamanho ou carga mais negativa corre primeiro
Eletroforese em gel
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Eletroforese em gel
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CORRENTE ELÉTRICA:
A passagem da corrente elétrica através de uma
solução segue a lei de Ohm, na qual:
V = R . I
V = voltagem, R = resistência e I = amperagem
Para que a técnica funcione, deve ser desenvolvida sob
voltagem (V), corrente (I) e potência (W) constantes.
VELOCIDADE DE MIGRAÇÃO:
* Diretamente proporcional: ao campo elétrico e à carga
líquida.
* Inversamente proporcional: ao raio, à distância entre os
dois eletrodos e à viscosidade.
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PROTEÍNAS: corante “coomasie blue”
ENZIMAS: solução específica (substrato,
coenzimas, solução-tampão e sais)
DNA e RNA: vários sistemas de revelação, tais
como:
- Fluorescência (Brometo de Etídio);
- Radioatividade;
- Nitrato de prata;
VISUALIZAÇÃO DAS BANDAS
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Quando submetidas a luz UV o gel apresenta um padrão de bandas. Cada banda é um fragmento de DNA de determinado tamanho.
O ladder é formado por diferentestamanhos de DNA e serve comomarcador de peso molecular
VISUALIZAÇÃO DAS BANDAS
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AGAROSE POLIACRILAMIDA
COMPOSIÇÃOPó matriz AGA(Alga marinha)
Acrilamida (I) + Bisacrilamida (T)
CARACTERÍSTICAS Malha frouxa Malha complexa
OBJETIVO Longos fragmentos Deleção de bases
SOLIDIFICAÇÃO 15 – 20 minutos 24 horas
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• Brometo de etídio• Agente intercalante do DNA
• Cancerígeno!
• Composto fluorescente à luz UV
• Nitrato de prata
• Gel Red
Eletroforese em gel
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• A agarose, um polissacarídeo extraído de uma alga marinha vermelha;
• Dissolve em água fervente e então gelifica quando esfria;
• Mais utilizada para separação de fragmentos longos de DNA
Eletroforese em gel de agarose
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• É utilizado em uma cuba horizontal ligada a uma fonte
• Uma solução tampão é adicionada à cuba, onde irá manter estáveis as condições de pH do meio
Eletroforese em gel de agarose
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Visualização do gel de agarose em luz UV
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Eletroforese
Marcadores de peso molecular são usados
para estimar o tamanho das moléculas das
amostras.
Eletroforese em gel
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GEL DE AGAROSE
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A poliacrilamida também pode ser utilizada com gelpara a eletroforese. A poliacrilamida é uma mistura dedois polímeros, acrilamida e bisacrilamida;
Utilizada para observação de fragmentos menores(poucos pares de bases ou proteínas);
Melhor resolução do que a eletroforese em gel deagarose;
Desvantagem: Neurotóxica
Eletroforese em gel de poliacrilamida
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• É realizada em uma cuba de eletroforese vertical.
Eletroforese em gel de poliacrilamida
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Eletroforese em gel de poliacrilamida
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• Gel de poliacrilamidaEletroforese em gel de poliacrilamida
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GEL DE POLIACRILAMIDA
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Gel acrilamida
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Eletroforese: métodos de leitura
Densitometria
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Aplicações
• Identificação de pessoas: em testes de
paternidade, comparando o DNA do suposto pai,
da mãe e do filho.
• Na identificação de criminosos.
• Na Industria farmacêutica (vacinas, reagentes
de diagnóstico).
• Na agropecuária (animais e plantas
transgênicos).
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• Na rotina:
• Análise do paciente
• Pesquisa genética
• Conduta terapêutica
• Prognóstico
• Aconselhamento
Aplicações
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• Tamanho da molécula
• Tipo de molécula
• Concentração
• Conformação do DNA
• Voltagem
• Tampão (TAE, TPE, TBE, PBS, etc)
Fatores determinantes