Eletroforese 15-06-2012 Biotec Tecnicas MM · 2012. 6. 25. · 15/06/2012 ELETROFORESES Marcelo...
Transcript of Eletroforese 15-06-2012 Biotec Tecnicas MM · 2012. 6. 25. · 15/06/2012 ELETROFORESES Marcelo...
Universidade Federal de PelotasCentro de Desenvolvimento Tecnológico – CDTec
Graduação em Biotecnologia
TÉCNICAS INSTRUMENTAIS
15/06/2012
ELETROFORESES
Marcelo Mendonça
PrincípioPrincípio
• Eletroforese � Consiste na migração e separação de partículas em uma matriz (suporte), submetidas a umadiferença de potencial elétrico
• A migração das partículas depende do seu tamanho e carga, além da DDP a que foram submetidas
Gel de Agarose Gel de Poliacrilamida (SDS-PAGE)
Os matriz podem ser:
DNA / RNA Proteínas / DNA / RNA
EletroforeseEletroforese emem gelgel
• Eletroforese em gel é eficiente em promover a separação de partículas de acordo com o seu tamanho
– Gel de Poliacrilamida
• Usado em separação de proteínas ou partículas muito pequenas
– Gel de Agarose
• Utilizado para separação de partículas relativamente pequenas e partículas grandes - Usado mais para DNA e RNA
• O DNA contém carga negativa, portanto migra para o pólo positivo
• Quanto mais concentrado o gel, mais “fechada’’ é sua malha, portanto a partícula terá mais dificuldade em atravessá-la
PrincípioPrincípio
A amostra é
inserida nos
“pocinhos” Partículas de
menor tamanho ou
Corrente elétrica
é aplicada
carga mais
negativa correm
primeiro
PrincípioPrincípio
• Quando submetidas a luz UV o gel apresenta um padrão de bandas
• Cada banda é um fragmento de DNA de determinado tamanho
� O ladder (marcador) é formado pordiferentes tamanhos de DNA e serve como marcador de peso molecular
• É utilizado em uma cuba horizontal ligada a uma fonte
• Uma solução tampão é adicionada à cuba, onde irá manterestáveis as condições de pH do meio
Gel de Gel de AgaroseAgarose
Video
Eletroforese em Gel de AgaroseEletroforese em Gel de Agarose
Gel de Gel de AgaroseAgarose
• A agarose, um polissacarídeo extraído de uma alga marinha vermelha
• Dissolve em tampão quente e então gelifica quando esfria
Preparação do gel
VisualizaçãoFotodocumentador com luz UV Fotodocumentador com luz UV
Tampões utilizados para preparo do gel e na cuba de corrida (migração)
Gel de AgaroseGel de Agarose
� Concentrado e diluídos para o uso
Tampões comumente usado
TBE: Tris-Borato-EDTA Diluído para 0,5x – Fornece poder tamponante suficiente, Diluído para 0,5x – Fornece poder tamponante suficiente,
Maior poder tamponante do que outros
TAE: Tris-Acetato-EDTADiluído para 1x – Resolução melhor para alguns DNAs (maiores)
TPE: Tris-Fosfato-EDTA
IntercalantesIntercalantes
CorantesCorantes• Brometo de Etídio
– Agente intercalante do DNA• Cancerígeno!
– Composto fluorescente - luz UV
• GelRed• GelRed
• GelGreen
Visualização do gel de agarose em luz UV
Transluminador – UV
(Fotodocumentador)
Gel de Gel de poliacrilamidapoliacrilamida
• A poliacrilamida também pode ser utilizada com gel para a eletroforese. A poliacrilamida é uma mistura de dois polímeros, acrilamida e bisacrilamida;
• Utilizada para observação de fragmentos menores (poucos pares de bases ou proteínas);(poucos pares de bases ou proteínas);
• Melhor resolução do que a eletroforese em gel de agarose;
• Desvantagem: Neurotóxica
(Acrilamida em forma liquída)
Gel de Gel de PoliacrilamidaPoliacrilamida
SDSSDS--PAGEPAGE
• É realizada em uma cuba de eletroforese vertical