Elektroforeza II
description
Transcript of Elektroforeza II
1/14/2015
1
Elektroforeza
II
dr Mara Aleksić, vanr. prof.
• IEF - koristi se za razdvajanje proteina na osnovu njihovih različitih
izoelektričnih tački pI
Izoelektrično fokusiranje
pI je pH vrednost na kojoj je količina + i – naelektrisanja na čestici jednaka,
čestica je neutralna i ne kreće se u elektročnom polju
GEL SA STABILNIM pH GRADIJENTOM
Gelu se dodaje smeša od 50-100 amfolita nosača
Amfolit nosač je sintetički polimer oligoamino – i oligokarboksilnih kiselina.
Određen broj amino i karboksilnih grupa određuje pI svakog amfolita nosača.
U električnom polju amfolit se kreće ka odgovarajućoj elektrodi i zaustavlja na pH=pI
1/14/2015
2
Izoelektrično fokusiranje
RAZDVAJANJE PROTEINA
1. U gel sa stabilnim pH gradijentom unosi se smeša proteina. U zavisnosti od
znaka i količine naelektrisanja koje nose, proteini se kreću ka odgovarajućoj
elektrodi.
2. Kretanjem kroz gel prolaze kroz sredine različitih pH i tada dolazi do
promene u naelektrisanju grupa. Kada se protein nađe u sredini gde je pH=pI,
neto naelektrisanje je 0, µ=0, protein se zaustavlja.
1.
2.
Dvodimenzionalna elektroforeza
Koristi se za analizu smeše velikog broja komponenata.
Kombinacija dve jednodimenzionalne tehnike.
Vektori spoljašnjeg električnog polja su međusobno normalni.
Najčešće korišćena kombnacija je IEF i SDS-page:
Prvo se komponente smeše razdvoje u gradijentu pH prema svojim
izoelektričnim tačkama, tj. naelektrisanju.
Zatim se u pravcu normalnom na pravac prvobitnog električnog polja
vrši SDS-PAGE razdvajanje prema relativnim molekulskim masama.
1 2
1
2
1/14/2015
3
Dvodimenzionalna elektroforeza
Važno je obezbediti dobro prijanjanje gelova
kada se prelazi u drugu dimenziju
Dvodimenzionalna elektroforeza
Koristi se za detaljno razdvajanje složenih proteinskih smeša
i za procenu čistoće proteina
1/14/2015
4
IZOTAHOFOREZA
Iso - jednako
Tachos - brzina
Phoresis - migracija
Razdvajanje pri jednakim brzinama
Elektroforeza sa diskontinuiranim sistemom elektrolita:
Dva pufera
Tris-HCl pufer
Cl- jon
velika pokretljivost
vodeći jon
(“leading” jon L)
Tris-glicin pufer
glicinatni jon
mala pokretljivost
zaostajući - krajnji jon
(“trailing” jon T)
Konvencionalne
elektroforetske tehnike Izotahoforeza
- jedan pufer
- jedna vrsta jona provodi struju
- jačina električnog polja je ista
u svim delovima
- zone se kreću različitim brzinama
koje su proporcionalne pokretljivosti
- dva pufera
- više vrsta jona provodi struju
- jačina električnog polja
nije konstantna u svim delovima
- zone se kreću istim brzinama
iako su im pokretljivosti različite
EvE
v
Kada se primeni spoljašnji potencijal:
Slabo električno polje nastaje u oblasti vodećeg L jona
jer je njegova pokretljivost velika.
Jako električno polje nastaje u oblasti zaostajućeg T jona
jer je njegova pokretljivost mala.
IZOTAHOFOREZA
1/14/2015
5
IZOTAHOFOREZA
Pre
unošenja
uzorka
t=0
U sistem se unosi
smeša dve
negativno
naelektrisane
komponente S1 i S2
1S2S
T1S2SL
U električnom polju svi anjoni kreću ka anodi i obrazuju zone
srazmerno svojim pokretljivostima
Sve zone putuju istom brzinom koja je jednaka brzini najbržeg vodećeg jona L.
Struju provode i joni uzorka.
Zone su u direktnom kontaktu.
1/14/2015
6
Ev Brzine kretanja jona su iste
Pokretljivosti jona su različite
U svakoj zoni je različita jačina električnog polja
GRADIJENT ELEKTRIČNOG POLJA
Disk-gel elektroforeza
DISKONTINUALNA podloga
DISKONTINUALNI puferski sistem
Zone u obliku DISKA
Podloga: 3 različita poliakrilamidna gela
sa porama različite veličine
Puferski sistem: 2 pufera različitih pH i I
1/14/2015
7
Disk-gel elektroforeza
Podloga
poliakrilamidni gel sastavljen od tri gela 1. Gel sa uzorkom (sample gel)
2. Gel za koncentrovanje (stacking gel)
- velika poroznost (mala konc.
akrilamida 3-5%)
- Tris-HCl pufer, pH 6,9 mala jonska
jačina
3. Gel za razdvajanje (resolving,
separating gel)
- mala poroznost (velika konc.
akrilamida 8-20%)
- Tris-HCl pufer, pH 8 - 9 velika jonska
jačina Puferski sistemi:
•Tris-HCl, pH 6,9 (u gelu za koncentrovanje) i
pH 8-9 (u gelu za razdvajanje)
•Tris-glicin, pH 8,3 (u rezervoarima pufera)
Disk-gel elektroforeza
Na početku, Cl¯ joni
(zeleni) su u gelu, a
glicinski anjoni
(narandžasti) u
rezervoarima (pH 8,3)
Proteini koji se razdvajaju
imaju pokretljivost između
vodećeg Cl¯ i zaostajućeg
glicinskog jona – nalaze
se u “sendviču” (plavo).
Proteini se koncentrišu u
gelu za koncentrovanje u
uskim zonama na osnovu
razlike u naelektrisanju.
Kada proteini dođu u
gel za razdvajanje,
pokretljivost glicina
raste (pH 8-9)
Zbog male poroznosti
proteini zaostaju, a Cl¯
i glicinski anjoni
nastavljaju ka anodi.
Proteini se razdvajaju
na osnovu razlike u
veličini.
pH 8-9
pH 6,9
pH 8,3
pH 8,3
1/14/2015
8
Prenos makromolekula na membranu
BLOTING
• Za dalju analizu makromolekula razdvojenih
elektroforezom potrebno ih je odvojiti od podloge – gela
• BLOTTING tehnika (engl. blot – mrlja)
• Makromolekuli se sa gela prebacuju na membranu od
nitroceluloze ili polivinilfluorida
BLOTING
KAPILARNI BLOTING
• Pufer iz rezervoara
kapilarno prolazi kroz gel,
pa kroz membranu noseći
makromolekule.
• Spor proces (24 h)
• Brzina se može povećati
vakuum blotingom
ELEKTROBLOTING
• Ponovljena elektroforeza:
posle klasičnog razdvajanja
gel se prekrije membranom i
ponovi se proces
elektroforeze.
• Efikasniji proces
1/14/2015
9
KAPILARNI BLOTING
ELEKTROBLOTING
Kada se uključi struja počinje elektroforeza
makromolekuli sa gela prelaze na nitroceluloznu membranu
1/14/2015
10
DNK – Southern blotting
(1975 prof. Southern, engl. south - jug)
RNK – Northern blotting (engl. north - sever)
Proteini – Western blotting (engl. west - zapad)
BLOTING
Proteini – Western blotting
Proteini koji su razdvojeni
SDS gel eleltroforezom
elektroblotingom se
prebacuju sa
poliakrilamidnog gela na
nitroceluloznu membranu.
Sa gornje i donje strane se
nalazi bloting papir čija je
uloga da pokupi višak
tečnosti.
1/14/2015
11
Proteini – Western blotting
A) Blokiranje nespecifičnih veznih mesta za
ligand na membrani (albumin seruma
gobečeta, mleko u prahu)
B) Membrana se izlaže primarnom antitelu
koje prepoznaje određeni protein i vezuje
se za njega.
Membrana se ispira puferom i oslobađa
nevezanog antitela.
C) Membrana se izlaže sekundarnom
antitelu (za koje je vezan enzim) koje
prepoznaje primarnon antitelo i vezuje se
za njega.
D) Detekcija: dodaje se supstrat koji reaguje
sa enzimom i daje obojene ili
luminiscentne proizvode.
Intenzitet boje srazmeran je količini proteina
Uvećano na
sledećem
slajdu
Proteini – Western blotting
1/14/2015
12
KAPILARNA
ELEKTROFOREZA CE
Izvor visokog napona
5-50kV (kod klasične elektroforeze 0,1-0,5 kV)
Razdvajanje se izvodi u
kapilari malog prečnika
(prečnik 10–100 m
dužina 10-100cm)
(kod klasične elektroforeze u kadici)
Kapilara
- punjena puferom (“free solution CE”)
- punjena gelom (“capillary gelelectrophoresis”)
VEĆI NAPON BOLJE RAZDVAJANJE, ali i velika Joulova toplota.
U uskoj kapilari toplota se efikasno rasipa i ne predstavlja problem kao
kod klasične elektroforeze.
Shema aparata za CE
1/14/2015
13
Unutrašnja površina kapilare sadrži
slabo kisele silanolne grupe SiOH
koje disosuju na pH>3 (SiO)
Za negativnu površinu kapilare
vezuju se hidratisani pozitivni joni.
Stvara se dvostruki električni sloj
ELEKTROOSMOTSKI TOK
EOF “electroosmotic flow”
Elektroosmotski tok prema katodi
Ev efef
Ev eofeof eofoeftot vvv
Posledice EOF kod kapilarne elektroforeze:
- Nenaelektrisani molekuli se kreću u električnom polju!
- Anjoni se kreću ka katodi!
ELEKTROOSMOTSKI TOK
EOF “electroosmotic flow”
1/14/2015
14
KAPILARNA ELEKTROFOREZA –
DETEKCIJA NA KAPILARI “on line”
Deo kapilare je ogoljen (“prozor”)
kroz njega prolazi svetlosni zrak sa lampe.
Komponenta koja prolazi kroz taj deo kapilare apsorbuje
svetlost, što registrije detektor.
UV VIS spektrofotometar
Fluorimetar
Maseni spektrometar! CE-MS
• Bolje razdvajanje
• Kraće vreme razdvajanja (nekoliko minuta, čak
u nekim slučajevima nekoliko sekundi)
• Veoma male količine uzorka (nL = 10-9L)
• Može se povezati sa masenim
spektrometrom
PREDNOST CE NAD DRUGIM ELEKTROFORETSKIM TEHNIKAMA
1/14/2015
15
CE sa masenim spektrometrom
UREĐAJ ZA KAPILARNU ELEKTROFOREZU
1/14/2015
16
Razdvajanje komponenata smeše
Kvalitativna i kvantitativna analiza lekova u svim vrstama
farmaceutskih formulacija
Određivanje čistoće lekova (primese, nečistoće)
Određivanje droga, peptidnih lekova, enantiomera
Analiza lekova i njihovih metabolita u biološkom
tečnostima
Određivanje supstanci iz metabolizma (vitamini, proteini,
bilirubin...)
PRIMENA CE
Primena elektroforeze u
kliničkoj hemiji
• Kvantitativna analiza proteina seruma
• Identifikacija i kvantifikacija hemoglobina
• Razdvajanje i određivanje klasa lipoproteina
• Razdvajanje i kvantifikacija enzima
• Određivanje specifičnih klasa imunoglobulina
• ....