ELECTROPHORESIS

Zunayroh Nasution

The science of today is the technology of tomorrow.Edward Teller

ELEKTROFORESIS Teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan

berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik (titik iso elektrik)

Note: that charge and size influence the movement of charged particles, in opposite ways.

PRINSIP Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang

mengandung sampel yang akan dipisahkan Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada

muatan terhadap massanya serta tergantung pula pada bentuk molekulnya

Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz

F = Gaya Lorentzq = Muatan objekE = Medan listrik

TYPES OF ELECTROPHORESIS Zone ElectrophoresisZone Electrophoresis

a. Paper Electrophoresisa. Paper Electrophoresisb. Gel Electrophoresisb. Gel Electrophoresisc. Thin Layer Electrophoresisc. Thin Layer Electrophoresisd. Cellulosa Acetat Electrophoresis d. Cellulosa Acetat Electrophoresis

Moving Boundry ElectrophoresisMoving Boundry Electrophoresisa. Capillary Electrophoresisa. Capillary Electrophoresisb. Isotachophoresisb. Isotachophoresisc. Isoelectric Focusingc. Isoelectric Focusingd. Immuno Electrophoresisd. Immuno Electrophoresis

1. Elektroforesis larutan (Moving boundary electrophoresis)

Larutan penyangga yang mengandung makro-molekul ditempatkan dalam suatu kamar tertutup dan dialiri arus listrik

Kecepatan migrasi dari makro-molekul diukur dengan jalan melihat terjadinya pemisahan dari molekul (terlihat seperti pita) di dalam pelarut

2. Elektroforesis daerah (zone electrophoresis)

Menggunakan suatu bahan padat yang berfungsi sebagai media penunjang yang berisi (diberi) larutan penyangga

Media penunjang yang biasa dipakai adalah gel agarose, gel pati, gel poliakrilamida dan kertas sellulose poliasetat.

Zone Electrophoresis disebut sebagai elektroforesis gel dengan dua buah model yaitu horizontal dan vertikal. Metode yang biasa digunakan adalah model horizontal, karena mempunyai beberapa keuntungan yaitu peralatan yang digunakan sangat sederhana, relatif murah dan pemisahan untuk enzim tertentu dapat menghasilkan pemisahan yang lebih baik

Gbr . Pemisahan Molekul ProteinZone Electrophoresis

Terdiri dari kertas sebagai fase diam dan partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ion-ion kompleks

Pemisahan terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang sistem pemisahan(12 - 14 Jam)

Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan absorpsivitas zat terlarut

A. ELEKTROFORESIS KERTAS

Electrophoresis: GelElectrophoresis: Gel

In gel electrophoresis, small samples are used. Samples travel through a running buffer when an electric field is applied.

Separation is stopped before analytes come to end of the support.

A series of bands represent separated analytes. Distance traveled is called migration time (dm), which can be compared to standards.

Gel ElectrophoresisGel Electrophoresis The sample is placed on the gel support, which is then

subjected to an electric field. Usually multiple samples are applied and allowed to separate as they migrate toward the ends of the gel (analytes are stopped before reaching the end of the support).

The location of the migration band (and intensity) is determined. The size and charge of the analyte is influential.

The support may be horizontal or vertical with a running buffer that carries current.

The applied field causes migration of analytes for a set time, then migration is measured.

Gel SupportsGel Supports Agarose Electrophoresis: nonspecific binding

for biologicals, low inherent charge, wide pores allow for work with large molecules. i.e. DNA sequencing

Polyacrylamide: merupakan gel yang paling sering digunakan, ukuran porinya bervariasi, biasanya PAGE mempunyai ukuran pori yang lebih kecil dari agarose dan lebih cocok untuk protein, ikatannya spesifik.

Polyacrylamide does not have charged groups within its structure.

Sodium Dodecyl Sulfate Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel ElectrophoresisPolyacrylamide Gel Electrophoresis

SDS-PAGE: Proteins are denatured, which converts them to single-stranded polypeptides.

Then they are treated with SDS, which coats each protein, forming rod-like negative structures with similar mass/charge.

The rods are passed through a porous polyacrylamide gel near an electric field. Small rods travel more quickly.

PRINSIP KERJA ELEKTROFORESIS GEL

Fase diam berfungsi menyaring objek yang akan dipisahkan

Fase gerak berfungsi membawa objek yang akan dipisahkan, pada fase gerak sering ditambah lar. penyangga untuk menjaga kestabilan objek elektroforesis gel

Elektroda positif dan negatif diletakkan pada masing-masing ujung aparat elektroforesis gel

Zat yang akan dielektroforesis dimuat pada kolom-

kolom (well atau sumur) pada sisi elektroda negatif

Bila aliran listrik diberikan, terjadi aliran elektron

dan zat objek akan bergerak dari elektroda negatif

ke arah sisi elektroda positif

Kecepatan pergerakan ini berbeda-beda,

tergantung dari muatan dan berat molekul DNA.

Kisi-kisi gel berfungsi sebagai pemisah

Objek dengan BM yang lebih besar akan lebih

lambat berpindah

Pita DNA Setelah Elektroforesis dan Diamati di Bawah Sinar UV

Molekul DNA yang bermuatan (-) karena adanya gugus fosfat dan bergerak menjuju anoda (elektroda bermuatan positif) saat dipisahkan dengan elektroforesis

Fragmen DNA yang memiliki ukuran yang sama akan memiliki elektromobilitas yang sama dan menempuh jarak migrasi yang sama

Topologi DNA yang dipisahkan menentukan elektromobilitas DNA. DNA yang mengalami supercoil (melingkar membentuk helai DNA) akan bermigrasi lebih cepat karena strukturnya sangat kompak

Migrasi Molekul DNA pada Gel

MIGRATION SET-UP AND GEL PROCESSING SET-UP

Medium Pendukung

Seperti apa hasilnya ?

Elektroforesis DNA (EtBr Stanning)

Hasil SPE (Protein) Lab. Klinik Prodia

C. KAPILER ELEKTROFORESIS

Organic analysis is performed by laser-induced fluorescence of biomarkers separated by micro-fabricated capillary electrophoresis

Electrophoresis: CapillaryElectrophoresis: Capillary

With capillary, all analytes travel the same distance, but the migration time (tm) for that distance is measured.

Relate time to identity Relate peak area or

height to amount

Elektroforesis kapiler menggunakan listrik bertegangan tinggi, yang menyebabkan semua komponen ion atau molekul netral bergerak ke katoda

Deteksi dilakukan dengan teknik pendeteksian spektrometri atau elektrokimia

Teknik pemisahannya dipengaruhi oleh; listrik, koefisien difusi, panjang dan diameter pipa kapiler serta konsentrasi sample

Memiliki efisiensi dan selektivitas yang baik, namun boros listrik karena menggunakan tegangan tinggi dan alatnya mahal

Instrumentasi

Pada elektroforesis kapiler, komponen dalam

campuran ditransport melalui tabung kapiler

horizontal oleh potensial dc yang tinggi di

sepanjang tabung.

Ukuran dan bentuk molekul analit akan berpengaruh terhadap mobilitas elektroforetik

Kolom kapiler Biasanya digunakan fused silika baik yang dimodifikasi maupun tidak.Permukaan Silika bermuatan negatif (Si2O- atau silanol)

Na Na Na

Na Na Na Na

O Si

OH

O Si O Si

OH O

O Si

OH

O Si

O

O Si

OH

O Si

OH

O Si

O

O Si

OH

OSi

O

OSi

OH

OSi

O

OSi

OH

OSi

O

OSi

OH

OSi

OH

OSi

O

OSi

OH

O

Cl ClNa

Na

ClNa

Elektroda Platinum foil Potensial dc supply 20-30 kV (high

voltage) Daerah buffer diberi sungkup dari flexiglass ~ V >>>

Detektor: Pada dasarnya semua detektor yang digunakan pada HPLC dapat juga diaplikasikan pada CE dan HPCE .

Detektor tersebut meliputi: UV, dioda array, fluorescence, refraktif indeks, elektrokimia dan lainnya.

Injeksi: beberapa L (atau nL untuk elektroforesis kapiler kinerja tinggi/HPCE) ke bagian ujung kapiler yang bermuatan + (positif) dibantu dengan gravitasi

Sistem injeksi:

a. Injeksi hidrodinamik: pada sistem ini digunakan bantuan tekanan saat menginjeksikan sampel pada kolom kapiler.

b. Injeksi elektrokinetik: digunakan bantuan arus listrik saat sampel diinjeksikan pada kolom kapiler.

volume sampel yang diinjeksikan pada sistem injeksi hidrodinamik dihitung dengan persamaan

P adalah perbedaan tekanan (Pa)d adalah diameter kapiler bagian dalam (m)t adalah waktu menggunakan (det) adalah viskositas buffer (kg m1s1),L panjang tabung kapiler. The fact (m)103 merupakan faktor konfersi m3 ke liter.

Pada prakteknya:Spesi bermuatan (+) mencapai katoda paling cepat karena EOF & EMF arahnya samaSpesi netral bergerak ke katoda dengan kecepatan ditentukan oleh aliran elektroosmotik Spesi bermuatan (-) bergerak paling lambat karena EOF & EMF berbeda arah

Proses analisis CE berlangsung cepat karena adanya perbedaan gaya elektroosmotik dan elektoforetik Elektroosmotik: Jika kapiler pada elektroforesis diberi tegangan maka terjadi perpindahan muatan kearah kutub (-), perpindahan yang terjadi disebut EOF Elektroforetik: partikel bermuatan akan menuju kutub yg akan berlawanan muatannya (pergerakan elektrolit yang tidak dipengaruhi oleh EOF)

Sehingga elektroforesis kapiler dapat memisahkan spesi bermuatan (+), (-), dan netral dalam satu kali injeksi/analisis

Analisis dapat dibantu dengan menggunakan marker yang netral dan dapat dideteksi.

Syarat marker: inert terhadap dinding dalam kapiler, molekul contoh, dan terhadap komponen buffer. Contoh marker: metanol, aseton, mesitil oksida.

Perhatikan:eof : mobilitas Elektroosmotik (EOF) yang bertambah secara vektorial

ep: mobilitas analit atau mobilitas elektroforetik (EMF)

eap: mobilitas aktual= ep + eof

CE Instrument

Application

Analysis of carbohydrates

Analysis of inorganic anions/metal ions

DNA Profiling

Protein identification

Advantages- Fast- Small sample- Relatively inexpensive- Automated

Disadvantages- Cannot identify neutral species- Joule heating- Cannot descern shape

Sequencing with GE & CE

Vrs JLaboratory of Biosensors and Bioelectronics, Institute

for Biomedical Engineering, ETH Zurich, Switzerland

Cth: Pola SPE abnormal pasien dengan multiple myeloma (Gamma mengalami peningkatan)

Cth: Pola SPE pasien normal

D. MICROCHIP ELECTROPHORESIS

Recently undergone substantial development like integrated microchip designs, advanced direction system

DNA & Protein

ADVANTAGES High speed

- 4-10x faster than conventional capilarry electrophoresis- 1 order of magnitude faster than slab gel electrophoresis

Simplicity Potential for automation

Limited separation efficiency of zone electrophoretic measurement

Imprecise injection Low sensitivity of absorption detection

(UV/Vis absorption detection) Early stage of commercialization

DISADVANTAGES

INSTRUMENTATION

Separation channel Sample injection channel Reservoirs Sample preparation reactors Pre and post column reactor

Truly multi-functional, "intergrated" analytical device embedded in a single monolitic substrate

Fabricated onto the surface of the microchip, using photolithografic processes

Combination Microarrays with Electrophoresis

Microchip Electrophoresis

DETECTION

LIF (Laser Induced Fluorescence)-Most commonlyused method on chip due its high sensitivity- Most analytes are not fluorophores&have to bederivatized to be detected by LIF- LIF is much larger than the microfabicatedseparation device, which makes it unfavorable forportable analytical device

Electrochemical detection- Ampherometric detection- Voltametric detection- Conductiometric detection- Potentiometric detection

FABRICATION

Polydimetilsiloksan Polymeric material (Plastik)

Oligonucleotide Separation by Microchip Electrophoresis(Grant No: DMR-0454887, Program Director: Dr. Benjamin Chu)

Decreasing Chip Temperature

40C 25C3230282624222018

37C 34C 31C 28C

Decreasing Chip Temperature

40C 25C3230282624222018

37C 34C 31C 28C

1. Thermo-responsive copolymer E61P40E61/E99P69E99 mixture gel was used as a separation matrix with E & P being oxyethylene and oxypropylene, respectively, and subscripts denoting number of segments.

2. Oligonucleotide fragments ranging from 10-40 bases could be separated in a 1.5-cm long channel.3. E61P40E61/E99P69E99 mixture with a weight ratio of 1:2 shows the best sieving ability.4. The sieving matrix has been successfully implemented in an Agilent Bioanalyzer 2100.

Publications on Oligonucleotide Separation: Lab on a chip 2006, 6(4), 526-533; Electrophoresis2006, in press. The work also received partial support from NSF MRSEC (DMR-0080604).

Figure 1. Schematic diagram of oligonucleotide separation by microchip electrophoresis.

Figure 2. Temperature effect on the resolution of oligonucleotide separation.

Oligonucleotide Separation by Microchip Electrophoresis(Grant No: DMR-0454887, Program Director: Dr. Benjamin Chu)

Education at Graduate and High School Levels:Two Ph.D. students: Jun Zhang (5th yr), Fen Wan (4th yr)One post-doctoral fellow: Dr. Weidong HeTwo High School students: Vikas Anand and Esther Kwak, Jericho High School, LI, NY

The high school students performed experiments to prepare thermo-responsive gels foroligonucleotide separation by microchip electrophoresis. (a) They learned how to preparepolymer solutions at desired concentrations. (b) They determined the relative weight ratios ofthe two copolymers to achieve the desired sol-gel transition. (c) The mentor educated themon DNA separations using polymer networks. The high school students were regional teamfinalists in the Siemens Westinghouse Competition.