EK-1 NUMUNE ALMA METOTLARI 1. GENEL HÜKÜMLER Yemin ...
Transcript of EK-1 NUMUNE ALMA METOTLARI 1. GENEL HÜKÜMLER Yemin ...
-
1
EK-1
NUMUNE ALMA METOTLARI
1. GENEL HKMLER
Yemin resmi kontrol amacyla alnacak numuneler aada tarif edilen metotlara gre alnmaldr. Bu ekilde
alnan numunelerin, numune alnan ksmlar temsil ettii kabul edilir.
Temsili numune alnmasnn amac bir partiden kk bir ksm elde etmek, bunu yaparken de bu ksmn
zelliinin partinin sz konusu zellii bakmndan ortalama deere sahip olmasna dikkat etmektir. Partinin
ierisinden numune alnmas partideki farkl noktalardan tekrarl biimde birincil numune alnmas yoluyla olur.
Sz konusu birincil numune, temsili blme yoluyla temsili nihai numunelerin hazrlanaca toplu bir paal
numune oluturmak zere kartrlarak bir araya getirilir.
Grsel muayene yoluyla, yemin numune alnacak ksmlar nitelik bakmndan ayn partideki yemin geri
kalanndan farkllk gsteriyorsa, sz konusu ksmlar yemin geri kalanndan ayrlmal ve ayr bir alt parti olarak
deerlendirilmelidir. Yemin farkl alt partilere ayrlmasnn mmkn olmad durumda, yem tek bir parti olarak
deerlendirilmek suretiyle yemden numune alnmaldr. Bu tr durumlarda, numune alma raporunda bu husus
belirtilmelidir.
Bu Ynetmelik hkmleriyle uyumlu olarak alnan bir yem numunesi, ayn snf veya tanmdaki bir yem
partisinin ksm ise ve bu numunenin ulusal mevzuat gerekliliklerini karlamad ynnde deerlendirme
yaplrsa, sz konusu partideki tm yemin ayn ekilde etkilendii varsaylr. Partinin geri kalan ksmnn ulusal
mevzuat gerekliliklerine uyumlu olduunun detayl bir deerlendirmeyle ortaya koyulmas durumunda
yukardaki varsaym geerli olmaz.
Numune, mhr krlmadan veya uzaklatrlmadan numuneye eriimi nleyecek ekilde mhrlenmelidir.
Numunenin mhr aka belirlenebilir ve grlebilir olmaldr. Numune geri dnmsz zarar grmeden
alamayacak ekilde kapatlm bir kap ierisine yerletirilebilir.
Numunenin tanmlanmas: Numune kalc bir ekilde iaretlenmeli ve numune alma tutana ile aka balantl
olarak tanmlanmaldr.
Yem iletmelerinde yaplan resmi kontrollerde kontrol grevlisi tarafndan takm numune alnr. Birinci takm numunenin muayene ve analizi Bakanlka belirlenen laboratuvarda yaplr. kinci takm olan ahit
numune Bakanlk il/ile mdrlnde muhafaza edilir. nc takm numune ise iletmeciye braklr.
Mikrobiyolojik incelemeler ve rn miktarnn ahit numunenin analizinin yaplabilmesi iin yetersiz olduu
durumlarda bir takm numune alnr.
2. NUMUNE ALMA ARALARI
2.1. Numune alma arac numune alnacak rnleri kontamine etmeyecek maddelerden yaplm olmaldr.
Numune alma aralar birden fazla kullanlmas gerekiyorsa ise apraz kontaminasyonun nlenmesi amacyla
temizlii kolay olmaldr.
2.2. Kat yemden numune alnmas iin nerilen aralar
2.2.1. Manuel numune alma
2.2.1.1. Dikey kenarl dz tabanl krek
2.2.1.2. Uzun ayrk veya blmlere sahip numune alma sondas: Numune alma sondasnn boyutlar numune
alnan ksmn zellikleri (konteynr derinlii, uval boyutlar, vb.) ve yemin parack byklne uygun
olmaldr.
-
2
Numune alma sondasnn birden fazla deliinin olmas durumunda, numune sondas boyunca farkl konumlardan
alnmasn salamak iin, delikler blmlerle ayrlmal veya sral kademeli delikler mevcut bulunmaldr.
2.2.2. Mekanik numune alma
Ak halindeki yemden numune alnmas amacyla uygun mekanik aralar kullanlabilir. Burada uygun aralarla
ifade edilmek istenen, ak halindeki yemin tmn temsil edecek numune alnmas iin gerekli aralardr.
Hareket halindeki yemden (yksek ak oranna sahip) numune alnmas otomatik numune alma aralaryla
gerekletirilebilir.
2.2.3. Blme arac
Mmkn ve uygun olduu hallerde, numuneyi yaklak olarak eit paralara blme amacyla tasarlanan
aralardr. Azaltlan numunelerin hazrlanmas amacyla kullanlabilir.
3. BRNCL NUMUNE SAYISINA LKN MKTAR GEREKLLKLER
3.1 ve 3.2.de birincil numune saysna ilikin miktar gereklilikleri, maksimum 500 tona kadar ve temsili numune
alnmasnn mmkn olaca byklkteki ksmlar iin geerlidir. Tanmlanan numune alma prosedr,
belirlenen ve numune alnan maksimum ksm byklnden daha byk miktarlar iin de geerlidir. Bunun
koullar; aadaki tablolarda belirtilen maksimum birincil numune saylarnn dikkate alnmamas, birincil
numune saysnn prosedrn uygun ksmnda verilen karekk formlyle belirlenmesi (bkz. 3.3) ve minimum
Paal numune byklnn oransal olarak artmasdr. Bu durum byk bir partinin daha kk alt partilere
blnmesini ve her alt partiden 3.1 ve 3.2.de tarif edilen prosedre uygun olarak numune alnmasn nlemez.
Numune alnan ksmn bykl, sz konusu ksmn her alt ksmndan numune alnabilmesine uygun olmaldr.
ok byk parti veya alt partiler iin (500 tondan byk) veya bu blmn 3.1 ve 3.2sinde belirtilen numune
alma prosedryle uyumlu olarak numunenin alnmasnn mmkn olmad ekilde tanan veya saklanan
partiler iin 3.3te belirtilen numune alma prosedr uygulanr.
Yem iletmecisinin mevzuat uyarnca zorunlu bir izleme sistemi kapsamnda erevesinde bu Ynetmelikle
uyumlu olarak numune almas gerektiinde, yem iletmecisinin numune alma prosedrnn denklii yannda
numunenin btn temsil edebilme dzeyini yetkili makama ispatlamasndan ve yetkili makamn onay
vermesinden sonra, ilem zelliklerini dikkate almak amacyla bu blmdeki miktar gerekliliklerinden sapabilir.
Kontrol grevlisince, partide oluacak kabul edilemez ticari hasar dolaysyla miktar gerekliliklerine ilikin
numune alma metodlarnn yrtlmesinin mmkn olmad istisnai durumlarda (ambalajlama biimi, tama
aralar, saklama ekli, vb.), mmkn olduunca temsili olmak ve tam anlamyla tarif edilmek ve
belgelendirilmek kouluyla alternatif bir numune alma metodu uygulanabilir.
3.1. Yem ierisinde homojen dalm gsteren maddelerin veya rnlerin kontrol iin alnacak birincil
numuneler hakknda miktar gereklilikleri
3.1.1. Dkme kat yem
Numune alnan ksmn bykl Alnacak en az birincil numune says
2,5 ton 7
> 2,5 ton Numune alnan parti miktarnn (ton) 20 katnn karekk
alnarak elde edilen say kadar.(*)
En fazla 40 birincil numune alnr.
* Elde edilen say kesirliyse en yakn st tam sayya yuvarlanr.
-
3
3.1.2. Dkme sv yem
Numune alnan ksmn bykl Alnacak en az birincil numune says
2,5 ton veya 2500 litre 4 (*)
> 2,5 ton veya > 2500 litre 7 (*)
(*) Svnn homojen hale getirilmesinin mmkn olmad durumda birincil numune says arttrlmaldr.
3.1.3. Ambalajl yem
Yem (sv ve kat), tabloda birim olarak bahsedilen torba, uval, teneke, f, vb. ierisinde saklanabilir. Byk
birimlerden ( 500 kg veya litre) 3.1.1 ve 3.1.2 deki ambalajsz yem iin ngrlen hkmlere uygun olarak
numune alnmaldr.
Numune alnan ksmn bykl Birincil numune alnmas gereken paketlerin minimum says (*)
1 ila 20 paket 1 Paketten(**)
21 ila 150 paket 3 Paketten (**)
151 ila 400 paket 5 Paketten (**)
> 400 paket Numune alnan partideki paket saysnn karekknn drtte biri
kadar. (*) (***)
En fazla 40 paketten birincil numune alnr.
(*) Bir paketin (r. bozulabilir ya yemler) almasnn analizi etkileyebilecei durumlarda almayan paket birincil numune olarak kabul edilir.
(**) Miktar 1 kg veya 1 litreyi gemeyen paketler iin bir orijinal paket miktar birincil numune olarak kabul edilir.
(***) Elde edilen say kesirliyse en yakn st tamsayya yuvarlanr.
3.1.4. Blok yem ve mineral yalama talar
25 niteden oluan her parti iin bir blok veya bir yalama ta alnr. En ok drt blok veya yalama ta alnr.
Her biri 1 kgdan az olan blok veya yalama talar iin, bir blok veya bir yalama ta arl birincil numune
kabul edilir.
3.1.5. Kaba yem
Numune alnan ksmn bykl Alnacak en az birincil numune says (*)
5 ton 5
> 5 ton Numune alnan parti miktarnn (ton) 5 katnn karekk alnarak elde
edilen say kadar. (**)
En fazla 40 birincil numune alnr.
(*) Baz yemlerden (r. silajlar), partiye kabul edilemez bir zarar vermeksizin birincil numunelerin almas mmkn olmayabilir. Bu
durumlarda alternatif numune alma metotlar uygulanabilir ve bu tr partilerden numune almak iin bir klavuz hazrlanabilir.
(**)Elde edilen say kesirliyse en yakn st tamsayya yuvarlanr.
-
4
3.2. Yemde ierisinde homojen dalm gstermeyen bileen veya maddelerin kontrolne ilikin birincil
numuneler hakknda miktar gereklilikleri
Birincil numunelere ilikin miktar gereklilikleri aadaki durumlarda uygulanr:
- Yem maddelerinde aflatoksinler, avdarmahmuzu, dier mikotoksinler ve zararl botanik bulaklklarn kontrol;
- GDOlu materyaller de dahil olmak zere, bir bileen veya maddenin yem maddesinde homojen dalm gstermeyen ekilde apraz kontaminasyonun kontrol.
Kontrol yetkilisinin karma yemdeki bir bileen veya maddeyle apraz kontaminasyon durumunda da homojen
dalm grlmediine dair gl bir phesi varsa, aadaki tabloda verilen miktar gereklilikleri uygulanabilir.
Numune alnan ksmn
bykl
Alnacak en az birincil numune says
< 80 ton 3.1deki miktar gerekliliklerine baknz. Alnacak birincil numune says 2,5
ile arplmaldr.
80 ton 100
3.3. ok byk partiler iin birincil numunelere ilikin miktar gereklilikleri
Numune alnan byk parti iin (numune alnan parti > 500 ton), alnmas gereken birincil numune says;
- Yem ierisinde homojen dalm gsteren maddelerin veya rnlerin kontrol iin alnacak birincil numune says= Numune alnan parti miktarnn karekk alnarak elde edilen sayya 40 eklenir
- Yem ierisinde homojen dalm gstermeyen bileen veya maddelerin kontrol iin alnacak birincil numune says= Numune alnan parti miktarnn karekk alnarak elde edilen sayya 100 eklenir
4. PAAL NUMUNELERDE MKTAR GEREKLLKLER
Numune alnan ksm bana tek bir paal numune gereklidir.
Yemin tr En az paal numune miktar(*),(**)
4.1. Dkme yem 4 kg
4.2. Ambalajl yem 4 kg (***)
4.3. Sv veya yar sv yem 4 lt
4.4. Blok yem veya mineral yalama talar
4.4.1. 1 kgden fazla olan her yem 4 kg
4.4.2. 1 kgden fazla olmayan her yem Drt blok yem veya yalama ta arl
4.5. Kaba yem 4 kg (****)
(*) Numune alnan yemin yksek deerli olmas halinde, numune alma raporunda tanmlanmak ve belgelenmek kouluyla paal numune
daha dk bir miktarda alnabilir.
(**) Genetii deitirilmi materyalin varlnn kontrol iin alnacak olan paal numune en az 35 000 tohum/dane iermelidir. Buna gre,
msr iin paal numune bykl en az 10,5 kg soya iin ise 7 kg olmaldr. Arpa, dar, yulaf, pirin avdar, buday ve keten tohumu gibi
dier tohum ve daneler iin 4 kglk paal numune bykl 35 000den daha fazla daneye karlk gelmektedir.
(***) Ambalajl yemde tekli birimlerin byklne bal olarak paal numune iin 4 kglk bykle ulamak mmkn olmayabilir.
(****) Dk zgl arla sahip kaba yeme (r. sap, saman) ilikin olarak paal numune en az 1 kg bykle sahip olmaldr.
-
5
5. NHA NUMUNELERE LKN MKTAR GEREKLLKLER
5.1. Nihai numuneler
En az bir nihai numunenin analizi gereklidir. Analiz iin nihai numunedeki miktar aadakilerden daha az
olamaz:
Kat yem 500 g (*) (**) (***)
Sv veya yar sv yem 500 ml (*)
(*) Genetii deitirilmi materyalin varlnn kontrol iin alnacak numune en az 10 000 tohum/dane iermelidir. Buna gre, msr iin
nihai numune bykl en az 3 000 g, soya iin ise 2 000 g olmaldr. Arpa, dar, yulaf, pirin, avdar, buday ve keten tohumu gibi dier
tohum ve daneler iin 500 glk nihai numune bykl 10 000den fazla daneye karlk gelmektedir.
(**) Paalnumunenin 4 kg veya litreden nemli derecede kk olmas halinde, numune alma raporunda tanmlanmak ve belgelenmek
kouluyla paal numuneden daha dk bir miktarda alnabilir.
(***) 15 Austos 2011 tarihli ve 28026 sayl Resmi Gazetede yaymlanan Trk Gda Kodeksi Gdalarda Pestisit Kalntlarnn Resmi
Kontrol in Numune Alma Teblii hkmleriyle uyumlu olarak baklagiller, tahl daneleri ve aa yemilerinden pestisit kalntlar
bakmndan numune alnmas durumunda, nihai numunenin asgari bykl 1 kg olacaktr.
6. OK BYK PARTLER VEYA PART ERSNDE NUMUNE ALMANIN MMKN
OLMAYACAI EKLDE DEPOLANAN VEYA TAINAN PARTLER N NUMUNE ALMA
METOTLARI
6.1. Genel ilkeler
Bir partinin tanma veya saklanma biimi partinin tmnde birincil numune alnmasna olanak salamazsa, bu
tr partilerden numune alnmas tercihen partinin ak halinde olduu srada yaplmaldr.
Yemlerin depolanmasnn amaland byk depolarda, iletmecilerin otomatik numune alma ekipmann
depoya kurulmas ynnde tevik edilmelidir. Bu sayede saklanan partilerin tmnden (otomatik) numune
alnmasna olanak salanabilir.
Bu blmde bahsedilen numune alma prosedrlerinin uygulanmas halinde, iletmeci veya temsilcisi numune
alma prosedr hakknda bilgilendirilmelidir. Bu numune alma prosedrne iletmeci veya temsilcisi tarafndan
itiraz edilmesi halinde, masraflar kendileri tarafndan karlanmak zere sz konusu kiiler yetkili makamn tm
partiden numune almasna olanak salarlar.
6.2. Gemiyle tanan byk partiler
6.2.1 Gemiyle tanan byk partilerden dinamik (hareket halinde) numune alnmas
Gemilerdeki byk partilerden numune alnmas tercihen rnn ak halinde olduu srada yaplmaldr.
Numune alma ilemi fiziksel olarak ayrlabilen her parti iin yaplr. Numune alma ilemi ilk fiziksel ayrm
kapsamnda veya depolama tesislerine aktarmdan sonraki ayrm kapsamnda yaplabilir. Fiziksel olarak
ayrlabilen birimler birbiri ardna boaltld iin depolama tesislerine aktarmdan sonra ilk fiziksel ayrm sz
konusu olamaz.
Bir geminin boaltlmas birka gn srebilir. Normalde numune alma ileminin boaltmann tm srasnda
belirli aralklarla yaplmas gerekir. Ancak resmi bir kontrol grevlisinin tm boaltma ilemi boyunca numune
almak iin hazr bulunmas mmkn veya uygun olmayabilir. Bu nedenle tm partinin belirli bir ksmndan
(numune alnan ksm) numune alnmasna izin verilir. Birincil numunelerin says numune alnan ksmn
bykl dikkate alnarak belirlenir.
Ayn snf veya tanmdaki bir yem partisinin bir ksmndan numune alndnda ve partinin sz konusu ksmnn
mevzuat gerekliliklerini karlamad durumda, o partideki yemin tm ayn ekilde deerlendirilir.
Resmi numune otomatik olarak alnsa bile bir denetleyicinin hazr bulunmas gereklidir. Bununla birlikte
otomatik numune alma ileminin nceden belirlenmi ve numune alma srasnda deitirilemeyen parametrelerle
-
6
yaplmas ve birincil numunelerin kapal bir kapta toplanarak olas bir sahteciliin nne geilmesi sz konusu
olduu takdirde, bir denetleyicinin sadece numune alma sreci banda ve sonunda kaplar deitirilirken hazr
bulunmas gereklidir.
6.2.2. Gemiyle tanan partilerden statik numune alnmas
Numune alnmasnn statik olarak yaplmas durumunda yukardan eriimin mmkn olduu depolar (silolar)
iin ngrlen prosedrn ayns uygulanmaldr (bkz. 6.4.1).
Numune alma ileminin partinin/fiziksel olarak ayrlabilen biriminin eriilebilir ksmndan (st) yaplmas
gereklidir. Birincil numunelerin says numune alnan ksmn bykl dikkate alnarak belirlenir. Ayn snf
veya tanmdaki bir yem partisinin bir ksmndan numune alndnda ve partinin sz konusu ksmnn mevzuat
gerekliliklerini karlamad durumda, yemin tm ayn ekilde deerlendirilir.
6.3. Depolarda saklanan byk partilerden numune alma
Numune, partinin eriilebilir ksmndan alnmaldr. Birincil numunelerin says numune alnan ksmn
bykl dikkate alnarak belirlenir. Ayn snf veya tanmdaki bir yem partisinin bir ksmndan numune
alndnda ve partinin sz konusu bu ksmnn mevzuat gerekliliklerini karlamad durumda, yemin tm
ayn ekilde deerlendirilir
6.4. Saklama tesislerinden (silolar) numune alma
6.4.1. Yukardan kolayca eriilebilen silolardan numune alma
Numune, partinin eriilebilir ksmndan alnmaldr. Birincil numunelerin says numune alnan ksmn
bykl dikkate alnarak belirlenir. Ayn snf veya tanmdaki bir yem partisinin bir ksmndan numune
alnd ve partinin sz konusu bu ksmnn mevzuat gerekliliklerini karlamad durumda, yemin tm ayn
ekilde deerlendirilir. Bir seri, parti veya sevkiyattaki ayn snf veya eit yemin bir blmnn gvenilir
olmadnn tespiti durumunda, geri kalan ile ilgili daha kapsaml yaplan deerlendirme sonucunda
gvenilir olduu ispat edilemez ise, o seri, parti veya sevkiyattaki ayn snf veya eidin tamamnn gvenilir
olmad kabul edilir.
6.4.2. Yukardan eriilemeyen silolardan (kapal silolar) numune alma
6.4.2.1 Yukardan eriilemeyen (kapal) silolar (> 100 ton)
Silolarda saklanan yemlerden statik ekilde numune alnmas mmkn deildir. Bu nedenle silodaki yemden
numune alnmas gerektii ve sevkiyatn hareket ettirilmesinin mmkn olmad durumda, silo boaltlaca
zaman yemin ak halinde olduu srada numune alnmasnn salanmas iin iletmecinin denetleyici
bilgilendirmesi gerekir.
6.4.2.2. Yukardan eriilemeyen (kapal) silolar (< 100 ton)
Numune alma prosedr 50 ila 100 kglk miktarn bir kaba alnmas ve buradan numune alnmasn kapsar.
Paal numune bykl tm partiye karlk gelir ve birincil numunelerin says numune alnmas amacyla bir
kaba alnan silonun byklyle ilikilidir. Ayn snf veya tanmdaki bir yem partisinin bir ksmndan numune
alnd ve partinin sz konusu bu ksmnn mevzuat gerekliliklerini karlamad durumda, yemin tm ayn
ekilde deerlendirilir. Partinin geri kalan ksmnn mevzuat gerekliliklerini karlamadna ilikin veri sunan
detayl bir deerlendirme olmamas halinde partinin geri kalan ksm ayr deerlendirilir.
6.5. Byk kapal konteynrlardaki dkme yemlerden numune alma
Bu tr partilerden genellikle boaltma ileminin ardndan numune alnr. Belirli durumlarda ithalat veya kontrol
noktasnda boaltma mmkn olmayabilir, bu nedenle numune alma ilemi sz konusu konteynrlar boaltld
zaman yaplmaldr.
-
7
7. NUMUNE ALINMASI, HAZIRLANMASI VE AMBALAJLANMASINA LKN TALMATLAR
7.1. Genel Hkmler
Numuneler gereksiz gecikmeye meydan vermeden alnmal ve hazrlanmaldr. Ayrca rnn deitirilmesi
veya kontamine olmas sz konusu olmayacak ekilde gerekli nlem alnmaldr. Aralar ve yzeyler ile
numunelerin alnaca kaplar temiz ve kuru olmaldr.
7.2. Birincil numuneler
Birincil numuneler numune alnacak ksmn tamamn temsil edecek ekilde rastgele alnmal ve yaklak olarak
ayn byklkte olmaldr.
Birincil numune bykl en az 100 gr veya dk zgl arla sahip kaba yem iin 25 gram olmaldr.
6 nc maddede belirtilen hkmler kapsamnda 40 birincil numuneden daha az numune alnmas gerektiinde
birincil numunelerin arl, alnacak paal numunenin arln belirleyen 4 nc madde ile uyumlu olarak
belirlenmelidir.
Miktar gerekliliklerine gre snrl sayda birincil numune alnmas gerektii zaman kk ambalajl yem
partilerinden numune alnmas durumunda birincil numunenin miktar 1 kg veya 1 litreyi gemeyen bir orijinal
birim kadar olmaldr.
Kk birimlerden (r.
-
8
1 kgdan byk olmayan blok veya yalama talar iin birincil numune bir blok veya yalama ta ieriklerinden
oluur.
7.3. Paal numunelerin hazrlanmas
Birincil numuneler kartrlarak tek bir paal numune hazrlanmaldr.
7.4. Nihai numunelerin hazrlanmas
Paal numunedeki materyal dikkatle kartrlmaldr(1).
- Her numune uygun bir konteynr/kap ierisine koyulmaldr. Tama veya saklama srasnda numune bileiminde oluabilecek deiiklik veya kontaminasyon ya da sahteciliin nlenmesi amacyla gereken
tm nlemler alnmaldr.
- Yemde homojen ekilde dalm bileen veya maddelerin kontrol amacyla paal numune tercihen bir mekanik ya da otomatik blc yoluyla en az 2,0 kg veya 2,0 litreye temsili ekilde azaltlabilir
(azaltlm numune)(2 ). Baklagiller, tahl daneleri ve aa yemilerinde pestisit kalntlarnn kontrol
amacyla azaltlm numunenin asgari bykl 3 kg olmaldr. Yemin yapsnn blc kullanmna
imkan salamamas veya blcnn mevcut olmamas durumunda, numune eyrekleme metotlaryla
azaltlabilir. Azaltlan numunelerle (Asl, ahit ve firma numunesi olarak) yaklak olarak ayn miktarda
ve 5 inci maddedeki miktar gerekliliklerine uygun olarak nihai numuneler alnr. Genetii deitirilmi
materyaller de dahil olmak zere bileenlerin kontrol durumunda, Paal numune:
- Tamamen homojenize edilir ve sonrasnda nihai numunelere blnr ya da
- Mekanik veya otomatik bir blc kullanlarak en az 2 kg veya 2 litreye(3) azaltlr. Sadece yemin yapsnn blc kullanmna olanak salamad durumda, gerek duyulmas halinde numune
eyrekleme metoduyla azaltlabilir. Genetii deitirilmi materyalin varlnn kontrol amacyla
azaltlm numune en az 10000 tohumun/dane iermelidir (4 nc maddedeki dipnot (**) ve 7 nci
maddedeki dipnota (*) baknz).
7.5. Numunelerin ambalajlanmas
Resm kontroller iin alnan numuneler, mhrlenir ve etiketlenir. Numunenin konulduu kap veya ambalajn
mhrleme ilemi, numunenin gvenliini temin etmek amacyla mhr bozulmadan paket alamayacak ekilde
yaplr.
7.6. Numunelerin laboratuvara gnderilmesi
Numune analizi yapacak kii iin gerekli bilgilerle beraber tayin edilen analiz laboratuvarna gecikme olmakszn
gnderilmelidir.
8. NUMUNE ALMA KAYDI
Her bir numunenin kayd tutulmal, numune alnan her ksmn ve numune byklnn aka tanmlanmasna
olanak salanmaldr.
Kaytta ayn zamanda bu Ynetmelikte sunulan numune alma prosedrnden sapma varsa belirtilmelidir.
Kayt altna alnan numune resmi kontrol laboratuvarna gnderilir.
(1) Topaklanm paralar ezilir ve kartrlr. (2) Dk zgl arla sahip kaba yemler dnda. (3) Dk zgl arla sahip kaba yemler dnda
-
9
EK-2
YEMLERN ANALZ METOTLARINA LKN GENEL HKMLER
A. NUMUNELERN ANALZ N HAZIRLANMASI
1. Ama
Aada belirtilen prosedrler EK-1de belirtilen hkmlere uygun olarak yaplan numune alma ileminin
ardndan kontrol laboratuvarlarna gnderilen numunelerin analize hazrlanmas amacyla belirlenmitir.
Analize alnacak numuneler hazrlanrken tartlan miktarlar analiz metotlar ksmnda belirtildii zere homojen
ve nihai numuneleri temsil edecek ekilde hazrlanmaldr.
2. Alnacak tedbirler
zlenecek numune hazrlama prosedr, kullanlacak analiz metotlarna ve kontrol edilecek bileen ve maddelere
baldr. Bu nedenle aadaki numune hazrlama prosedr, kullanlan analiz metodu ve kontrol edilecek
bileen veya maddeler iin uygun olmaldr.
Gerekli tm ilemler, numunenin olas kontaminasyonunu ve numune bileimindeki deiiklii mmkn
olduunca nleyecek ekilde yaplmaldr. tme, kartrma ve elekten geirme ilemleri numunenin hava ve
a en az dzeyde maruz kalmasna dikkat edilerek gecikme olmakszn yaplmaldr. Numune ssn
artrabilecek deirmen ve tcler kullanlmamaldr.
Isya zellikle duyarl olan yemler iin manuel tme tavsiye edilmektedir. Bunun dnda kullanlan aparatn
bir kontaminasyon kayna olmamasn salamak iin zen gsterilmelidir.
Hazrlama ilemi, numunenin nem dzeyinde nemli deiiklik olmakszn gerekletirilemiyorsa, hazrlk
ncesi ve sonrasnda EK-3n A Blmnde belirtilen metoda gre nem dzeyi belirlenmelidir.
3. Prosedr
3.1. Genel prosedr
Numune, analiz iin hazrlanrken uygun ayrma teknikleri kullanlarak analiz ve referans iin yeterli alt
numunelere blnr. Alt numunelere blnrken konileme ve eyrekleme metotlar kullanlmaz.
3.1.1. n ilemsiz tlebilen yemler
Elenen numune kartrlr, temiz, kuru, hava szdrmayan uygun bir kaba alnr. Analiz yaplmak zere numune
alnaca zaman, numune tartlmadan hemen nce homojenizasyon salamak amacyla tekrar kartrlr.
3.1.2. Kurutmann ardndan tlebilen yemler
Analiz metodunda farkl bir ekil belirtilmemise numune, EK-3n A Blmnn 4.3nde belirtilen metottaki
n kurutma ilemine uygun olarak, nem ierii % 8 12 aralna dnceye kadar kurutulur. Bundan sonraki
ilemler, 3.1.1de belirtildii ekilde yaplr.
3.1.3. Sv veya yar sv yem
Numune temiz, kuru ve hava szdrmayan uygun bir kaba alnr. Analiz yaplmak zere numune alnaca zaman,
numune tartlmadan hemen nce homojenizasyon salamak amacyla kartrlr.
-
10
3.1.4. Dier yemler
Yemlerin zelliine gre, yukarda belirtilen ekillerde hazrlanmas mmkn olmayan dier yemlerin
hazrlanmasnda farkl metotlar uygulanabilir. Ancak, analiz iin alnan miktar, homojen ve numuneyi temsil
edecek ekilde olmaldr.
- Grsel inceleme veya mikroskopi yoluyla muayene ya da numunenin tmnn homojenize edildii durumlara ilikin prosedr.
- Grsel incelemeyle muayene durumunda (mikroskop kullanmakszn), muayene amacyla laboratuvar numunesinin tm kullanlr.
- Mikroskopla muayene durumunda, laboratuvar numuneyi azaltabilir. - Numunenin homojenize olduu durumda, nihai numune homojenize olan numuneden alnr.
4. Numunelerin saklanmas
Numuneler bileenlerinin deimeyecei bir scaklkta saklanmaldr. Ia zellikle duyarl olan vitamin veya
dier maddelerin analizi iin alnan numuneler, ktan olumsuz etkilenmeyecek koullarda saklanmaldr.
B. ANALZLERDE KULLANILAN REAKTFLER VE APARATLARA LKN HKMLER
1. Analiz metodunda farkl bir ekil belirtilmemise, kullanlan kimyasallarn analitik olarak saf olmas gerekir.
Eser miktardaki maddelerin analizinde kullanlan kimyasallarn safl, kr test ile kontrol edilir. Elde edilen
sonulara gre kimyasallarn daha da saflatrlmas gerekebilir.
2. Kullanlan solvent veya diluentin yaps belirtilmeksizin analiz metotlarnda belirtilen zelti hazrlanmas,
seyreltme, durulama veya ykamay ieren herhangi bir ilem suyun kullanlmasn gerektirir. Genel bir kural
olarak su demineralize veya distile olmaldr. Analiz metotlarnda belirtilen baz durumlar dnda bu metot zel
saflatrma prosedrlerine tabi olmaldr.
3. Analiz metotlarnda, kontrol laboratuvarlarnda normal olarak bulunan ekipmandan, sadece zel olan veya
zel bir kullanm gerektiren ara ve aparatlara atf yaplmtr. zellikle kk miktarlardaki maddelerin
belirlenmesi gerektii zaman bu ara ve aparatlar temiz olmaldr.
C. ANALZ METOTLARININ UYGULANMASI VE SONULARIN FADESNE LKN
HUSUSLAR
1. Ekstraksiyon prosedr
Ekstraksiyon ileminde deiik metotlar uygulanabilir. Genel bir kural olarak, metotta atfta bulunulan prosedr
dndaki ekstraksiyon prosedrleri uygulanabilir. Bunun uygulanabilmesi iin kullanlan ekstraksiyon
prosedrnn analiz edilen matriks iin metotta belirtilen prosedre denk bir ekstraksiyon verimine sahip
olduunun ortaya konulmas gerekir.
2. Temizleme prosedr
Temizleme prosedr farkl metotlarla yaplabilir. Genel bir kural olarak metotta atfta bulunulan prosedr
dndaki temizleme prosedrleri uygulanabilir. Bunun uygulanabilmesi iin, kullanlan prosedrn analiz edilen
matriks iin metotta belirtilen prosedre denk bir temizleme verimine sahip olduu ortaya koyulmaldr.
3.Tespitlerin says
stenmeyen maddeler ynnden analiz yaplyorsa kalite prosedrlerine uyulmu olmas kouluyla, allan ilk
rnekte belirlenen analiz sonucunda elde edilen deer, spesifikasyonda belirtilen deerin yarsndan dkse
ikinci bir almaya gerek yoktur. Dier durumlarda numunenin i apraz kontaminasyonu ya da kazara karma
olasln darda brakmak iin ift analiz (ikinci bir tespit) gereklidir. lm belirsizlii gz nne alnarak
sz konusu iki tespitin ortalamas, uyumun dorulamas iin kullanlr.
-
11
Bir maddenin ieriinin veya beyan edilen deerin kontrolnde, kalite prosedrlerine uyulmu olmas kouluyla,
allan ilk rnekte belirlenen analiz sonucu, beyan edilen deeri ve ierii doruluyor ve kabul edilebilir
tolerans deerleri (aral) bulunuyorsa ikinci bir almaya gerek yoktur. Dier durumlarda numunenin i apraz
kontaminasyonu ya da kazara karma olasln darda brakmak iin ift analiz (ikinci bir tespit) gereklidir.
lm belirsizlii gz nne alnarak sz konusu iki tespitin ortalamas, uyumun dorulamas iin kullanlr.
Yemin bileen deeri, etiketinde belirtilen bileen deerinden farkl bulunduunda Yemlerin Piyasaya Arz ve
Kullanm Hakknda Ynetmelik ve Hayvan Beslemede Kullanlan Yem Katk Maddeleri Hakknda
Ynetmelik ile belirlenen tolerans deerleri uygulanr.
4. Kullanlan analiz metodunun raporlamas
Analiz raporunda kullanlan analiz metodu belirtilmelidir.
5. Analiz sonucunun raporlamas
Analiz sonucu, analiz metodunda belirtilen basamak says kadar anlaml rakamlarla yazlr. Eer gerekli ise
numune analize hazrlanmadan nce belirlenen nem ieriine gre sonuta dzeltme yaplr.
6. stenmeyen maddelerin analizinde lm belirsizlii ve geri kazanm oran
Yemlerde stenmeyen Maddeler Hakknda Tebli kapsamndaki istenmeyen maddelerin yemlerde tespiti ve
deerlendirilmesi, geniletilmi lm belirsizlii, geri kazanm ve % 12 nem dzeyi dzeltmesi hesaba katlarak
yaplr. stenmeyen maddelerin analiz sonucu belirlenen maksimum dzeyi ayorsa bu yem uygun olmayan yem
olarak deerlendirilir. Geri kazanm ve % 12 nem dzeltmesi yaplm analiz sonucu geniletilmi lm
belirsizlii ile raporlandrlr. Uygunluk deerlendirmesi geniletilmi lm belirsizlii dlerek yaplr. Bu
prosedr sadece analiz metodunun lm belirsizlii ve geri kazanm dzeltmesi tahminine olanak salad
durumlarda geerlidir. Bu ekildeki deerlendirme mikroskobik analizler iin uygun olmadndan yaplmaz.
Analiz sonucunun raporlanmasnda lm belirsizlii ve geri kazanm oran aadaki ekilde belirtilir:
a) Geri kazanm iin yaplan dzeltmede, geri kazanm seviyesi belirlenir. Geri kazanm iin yaplan dzeltme %
90 ile % 110 arasnda olduu durumlarda gerekli deildir.
b) x +/- U eitliinde, x analiz sonucunu, U geniletilmi lm belirsizliini ifade eder. Yaklak % 95
gven aral iin, kapsam faktr 2 kullanlr.
Ancak kalite prosedrlerine uyulmu olmas kouluyla, belirlenen analiz sonucu elde edilen deer,
spesifikasyonda belirtilen deerin yarsndan dkse, analiz sonu raporunda lm belirsizlii ve geri kazanm
dzeltmesinin belirtilmesine gerek yoktur.
-
12
EK-3
YEM MADDELER VE KARMA YEMLERN BLEMNN KONTROLNE YNELK ANALZ
METOTLARI
A. NEM TAYN
1. Ama ve kapsam
Bu metot; yemdeki nem ieriinin tayinini mmkn klar. Yemin organik asitler gibi uucu maddeler iermesi
durumunda, nemli miktarda uucu maddenin de nem ierii ile birlikte tayin edilir.
Bu metot; yem maddeleri olarak kullanlan st rnlerinin analizini, mineral maddelerin ve ounlukla mineral
maddelerden oluan karmlarn analizini, hayvansal ve bitkisel yalarn analizini ya da yal tohumlar ve yal
meyvelerin analizini kapsamaz.
2. Prensip
Numune, yemin yapsna gre deien, belirlenmi koullar altnda kurutulur. Arlktaki kayp tartlarak tayin
edilir. Yksek nem ieriine sahip kat yem sz konusu olduunda, birincil kurutma ilemi gereklidir.
3. Cihaz
3.1. Nem absorbe etmeyen materyallerden retilmi, tme esnasnda nem kaybna neden olacak kadar
snmayan temizlenmesi kolay hzl ve homojen ezme ilemine olanak tanyan, dardaki havayla temas
olabildiince nleyen ve 4.1.1. ile 4.1.2.deki gereklilikleri karlayan ezici (rnein eki ya da su soutmal
mikro eziciler, katlanabilir konik deirmenler, yava hareket eden ya da dili eziciler).
3.2. Analitik terazi, 1 mg hassaslnda.
3.3. Hava szdrmaz kapakl, alma yzeyi, test numunesinin yaklak 0,3 g/cm2ye yaylmasn salayan
anmaz metal ya da camdan yaplm kuru kaplar.
3.4. Uygun havalandrma sistemi olan ve hzl scaklk dzenlemesi salayan elektrik stmal izotermal etv. (
2C) (4)
3.5. Bir ya pompas taklm ve scak kurutulmu havann girii iin bir mekanizma ya da bir nem ekici
madde (kalsiyum oksit gibi) ieren ayarlanabilir elektrik stmal vakumlu etv.
3.6. Kaln, delikli metal ya da porselen tablal, uygun bir nem ekici ieren desikatr.
4. Metot
Bu blmde aklanan ilemler numune paketleri aldktan hemen sonra gerekletirilmelidir. Analiz en az iki
paralel olarak gerekletirilmelidir.
4.1. Hazrlama
4.1.1. 4.1.2 ve 4.1.3 kapsam dndaki yemler
En az 50 g numune alnr. Gerekiyorsa, nem ieriinde herhangi bir deiimi nleyecek ekilde ezilir ya da
blnr. (baknz 6)
(4) Tahl ve rnlerinin kurutulmas iin etvn termal kapasitesinin 131Clik bir n ayarda olmas ve e zamanl kurutma iin maksimum sayda test numunesi yerletirildikten sonra en fazla 45 dakika iinde bu scakla ulaacak ekilde olmas gerekir. Alabildii kadar buday
numunesi iki saat boyunca kurutulduunda, drt saatlik kurutmaya gre sonular arasndaki farkn en fazla % 0,15 olaca ekilde
havalandrma salanmaldr.
-
13
4.1.2. Tahllar ve rnleri
En az 50 g numune alnr. En az % 50sinin 0,5 mm gzl bir elekten geecei ve en fazla % 10unun 1 mm
yuvarlak gzl elekte kalaca ekilde tlr.
4.1.3. Sv ya da ezme biimindeki yksek younlukta ya ieren yemler
Yaklak 25 g numune alnr, 10 mg hassasiyetle tartlr, tartlan numuneye uygun miktarda daha nce etvde
kurutulmu kuvars kumu 10 mg hassasiyetle tartlr ve eklenir, homojen bir karm elde edilene kadar
kartrlr.
4.2. Kurutma
4.2.1. 4.2.2 ve 4.2.3 kapsam dndaki yemler
Kapa ile birlikte bir kap (3.3) 1 mg hassasiyetle tartlr. Tartlan kaba 1 mg hassasiyetle yaklak 5 g numune
tartlr ve eit olarak yaylr. Kap, kapa ak olarak nceden 103Cye stlm etve konulur.
Etv scaklnn ar dmesini nlemek iin kap olabildiince hzl yerletirilir. Etv scaklnn 103Cye
ulat saatten itibaren drt saat boyunca kurumaya braklr. Kapak kabn stne yerletirilir, kap etvden
kartlr, desikatr (3.6) iinde 30-45 dakika soumaya braklr 1 mg hassasiyetle tartlr.
Ya ierii yksek olan yemler, 130Cde ek olarak 30 dakika daha etvde kurutulur. ki tartm arasndaki fark
en fazla, nemin % 0,1i olmaldr.
4.2.2. Tahllar ve rnleri
Kapa ile birlikte bir kap (3.3) 0,5 mg hassasiyetle tartlr. Tartlan kaba 1 mg hassasiyetle yaklak 5 g
tlm numune tartlr ve eit olarak yaylr. Kap, kapa ak olarak nceden 130Cdeki etve konur. Etv
scaklnn ar dmesini nlemek iin kap olabildiince hzl yerletirilir.
Etv scaklnn 130Cye ulamasndan itibaren iki saat boyunca kurumaya braklr. Kapak kabn stne
yerletirilir, kap etvden kartlr, desikatr (3.6) iinde 30 45 dakika soumaya braklr ve 1 mg hassasiyetle
tartlr.
4.2.3. % 4ten fazla sakkaroz ya da laktoz ieren karma yem: Keiboynuzu, hidrolize hububat rnleri, malt
tohumlar, kurutulmu pancar posas, balk ve eker znrleri gibi yem materyalleri; kristalleen suyu da dahil
% 25ten fazla mineral tuz ieren karma yem.
Kapa ile birlikte bir kap (3.3) 0,5 mg hassasiyetle tartlr. Tartlan kaba 1 mg hassasiyetle yaklak 5 g numune
tartlr ve eit olarak yaylr. Kab, kapa ak olarak nceden 80C - 85Cye stlm vakumlu etve (3.5)
konur. Etv scaklnn ar dmesini nlemek iin kap olabildiince hzl yerletirilir.
Basn 100 Torra getirilir ve bu basnta, scak ve kuru bir hava akmnda ya da bir nem ekici madde (20
numune iin yaklak 300 g) kullanarak drt saat kurumaya braklr. Sonraki ilemde, belirtilen basnca
eriildiinde vakum pompas kartlr. Etv scaklnn 80C - 85Cye ulat andaki kurutma sresi
kaydedilir. Etv dikkatle yeniden atmosfer basncna getirilir. Etv alr, kapa hemen kabn stne
yerletirilir, kap etvden kartlr, desikatr (3.6) iinde 30- 45 dakika soumaya braklr ve 1 mg hassasiyetle
tartlr. 80C - 85Cdeki vakumlu etvde 30 dakika daha kurutulur ve yeniden tartlr. ki tartm arasndaki fark
en fazla nemin % 0,1ini amamaldr.
-
14
4.3. n kurutma
4.3.1. 4.3.2 kapsam dndaki yemler
Paralama ilemini zorlatran, yksek nem ierikli kat yemler aadaki ekilde n kurutma ilemine tabi
tutulmaldr: 50 g paralanmam numune uygun bir kaba (rnein 20 12 cm boyutlarnda ve 0,5 cm kenarl
alminyum tepsi ) 10 mg hassasiyetle tartlr (gerekiyorsa, sktrlm ya da ylm yem kabaca blnebilir).
60C ile 70C arasndaki bir etvde, nem ierii % 8-% 12ye azalncaya kadar kurumaya braklr. Etvden
kartlr, laboratuvarda kapaksz olarak bir saat soumaya braklr ve 10 mg hassasiyetle tartlr. Hemen
4.1.1.de belirtildii gibi paralanr ve yemin yapsna gre 4.2.1 ya da 4.2.3te belirtildii gibi kurutulur.
4.3.2. Tahllar
% 17nin zerinde nem ierii olan taneler aadaki ekilde n kurutma ilemine tabi tutulmaldr:
50 g tlmemi tane uygun bir kapta (r. 20 12 cm boyutlarnda ve 0,5 cm kenarl alminyum tepsi) 10 mg
hassasiyetle tartlr. 130Cdeki etvde 5-7 dakika kurumaya braklr. Etvden kartlr, laboratuvarda kapaksz
olarak iki saat soumaya braklr ve 10 mg hassasiyetle tartlr. Hemen 4.1.2.de belirtildii gibi tlr ve
4.2.2.de belirtildii gibi kurutulur.
5. Sonularn hesaplanmas
Nem ierii (X), numunenin yzdesi olarak aadaki formlle hesaplanr:
5.1. n kurutmasz kurutma
Burada;
m = Numunenin gram cinsinden ilk arl,
m0 = Kuru test numunenin gram cinsinden arl,
5.2. n kurutmal kurutma
Burada:
m = Numunenin gram cinsinden ilk arl,
m1 = n kurutmadan sonra numunenin gram cinsinden arl,
m2 = Krma ya da tmeden sonra numunenin gram cinsinden arl,
m0 = Kuru numunenin gram cinsinden arl.
5.3. Tekrar edilebilirlik
Ayn numunenin iki paralel tayininin sonular arasndaki fark mutlak nem deerinin % 0,2sini gememelidir.
-
15
6. Gzlem
Krma ilemi gerekiyorsa ve bu ilem rnn nem ieriini deitirecek gibi grnyorsa, yem bileenlerinin
analiz sonular, numunenin ilk durumundaki nem ierii esas alnarak dzeltilmelidir.
B. HAYVANSAL VE BTKSEL YALARDA NEM TAYN
1. Ama ve kapsam
Bu metot; hayvansal ve bitkisel yalardaki nem ve uucu madde ieriinin tayinini mmkn klar.
2. Prensip
Numune, 103Cde sabit arla ulaana kadar kurutulur. ki tartm arasndaki arlk kayb 1 mga eit ya da
daha az olmaldr. Arlktaki kayp tartlarak tayin edilir.
3. Cihaz
3.1. Anmaya direnli malzemeden retilmi, 8 - 9 cm apnda ve yaklak 3 cm yksekliinde dztabanl
kurutma kab.
3.2. Glendirimi ampull ve st ucunda genleme tp olan, yaklak 80C ile en az 110Cye kadar lm
yapabilen ve yaklak 10 cm uzunluunda termometre.
3.3. Kum banyosu ya da elektrikli stc tabla.
3.4. Etkin bir nem ekici ieren desikatr.
3.5. Analitik terazi.
4. Metot
Yaklak 20 g homojen numune 1 mg hassasiyetle, termometre (3.2) ieren kuru tartlm bir kapta (3.1) tartlr.
Scak Kum banyosu ya da elektrikli stc tabla (3.3) stnde stlr, termometre ile devaml kartrlarak
yaklak 7 dakikada scaklk 90Cye ulatrlr.
Is drlr, kabn tabanndan ykselen kabarcklarn skl izlenir. Scaklk en fazla 105C olmaldr.
Kabarcklarn olumas durana kadar, kabn dibini kazyarak kartrmaya devam edilir.
Nemin ortadan kaldrlmasn tamamlamak iin birka kez 103C 2Cye tekrar stlr, ardk stma arasnda
93Cye soutulur. Ardndan desikatrn (3.4) iinde oda scaklnda soumaya braklr ve tartlr. Bu ilem iki
ardk tartm arasndaki arlk kayb en fazla 2 mg olana kadar yinelenir.
Not: Yinelenen stma ileminden sonra numunenin arlndaki bir art yan oksitlendiini gsterir, bu
durumda sonucun hesaplanmasnda, arln artmaya balamasndan hemen nce gerekletirilen tartm
kullanlr.
5. Sonularn hesaplanmas
Nem ierii (X), numunenin yzdesi olarak aadaki formlle elde edilir:
Burada;
m = Numunenin gram cinsinden arl,
-
16
m1 = Istma ncesinde kabn iindekilerle birlikte gram cinsinden arl,
m2 = Istma sonrasnda kabn iindekilerle birlikte gram cinsinden arl,
% 0,05in altndaki sonular % 0,05ten dk olarak kaydedilmelidir.
6. Tekrar edilebilirlik
Ayn numunenin iki paralel tayininin sonular arasndaki nem fark mutlak deerin % 0,05ini gememelidir.
C. HAM PROTEN ERNN TAYN
1. Ama ve kapsam
Bu metot, Kjeldahl metodu ile tayin edilen azot ieriine dayanarak yemdeki ham protein ieriinin tayinini
mmkn klar.
2. Prensip
Numune, bir katalizr varlnda slfrik asit tarafndan paralanr. Asit zeltisi, sodyum hidroksit zeltisi
tarafndan bazik hale getirilir. Amonyak damtlr ve miktar belli olan slfrik asit iine alnr, geri kalan
standart bir sodyum hidroksit zeltisiyle titre edilir.
Alternatif olarak, aa kan amonyak daha fazla miktarda bulunan borik asit zeltisine damtlr, ardndan
hidroklorik asit ya da slfrik asit zeltisi ile titre edilir.
3. Ayralar
3.1. Potasyum slfat
3.2. Katalizr: bakr (II) oksit (CuO) ya da bakr (II) slfat pentahidrat (CuSO4.5H2O)
3.3. Granl inko
3.4. Slfrik asit, 20 = 1,84 g/ml
3.5. Slfrik asit, standart hacimsel zelti, c(H2SO4) = 0,25 mol/l
3.6. Slfrik asit, standart hacimsel zelti, c(H2SO4) = 0,10 mol/l
3.7. Slfrik asit, standart hacimsel zelti, c(H2SO4) = 0,05 mol/l
3.8. Metil krmzs indikatr; 300 mg metil krmzsn 100 ml etanol iinde zndrlr, = % 95-% 96 (v/v)
3.9. Sodyum hidroksit zeltisi (Teknik dereceli kullanlabilir) = 40 g/100 ml (m/v: % 40)
3.10. Sodyum hidroksit, standart hacimsel zelti, c(NaOH) = 0,25 mol/l
3.11. Sodyum hidroksit, standart hacimsel zelti, c(NaOH) = 0,10 mol/l
3.12. Granl kaynama ta, hidroklorik asit iinde ykanm ve yaklm
3.13. Asetanilid (erime noktas = 114C, Azot -ierii= % 10,36)
3.14. Sakkaroz (azot iermeyen)
3.15. Borik asit (H3BO3)
-
17
3.16. Metil krmzs indikatr zeltisi: 100 mg metil krmzs 100 ml etanol ya da metanol iinde zdrlr.
3.17. Bromkrezol yeili zeltisi: 100 mg bromkrezol yeili 100 ml etanol ya da metanol iinde zdrlr.
3.18. Borik asit zeltisi (kullanlan cihaza gre 10 g/l - 40 g/l)
Kolorimetrik olarak dnm noktas belirlenecei zaman metil krmzs ve bromkrezol indikatrleri borik asit
zeltisine eklenmelidir. 1 litre borik asit zeltisi hazrlanrsa, hacmi tamamlanmadan nce 7 ml metil krmzs
indikatr zeltisi (3.16) ve 10 ml bromkrezol yeili zeltisi (3.17) eklenmelidir.
Kullanlan suya bal olarak borik asit zeltisinin pHs partiden partiye deiebilir. Genelde kk hacimde
alkali ieren bir ayarlama, pozitif kr elde etmek iin gereklidir.
Not: Yaklak 3 ml-4 ml NaOHnin (3.11) 1 litre 10 g/l borik aside eklenmesi genelde iyi ayarlamalar verir.
zelti oda scaklnda depolanr ve depolama sresince ktan ve amonyak duman kaynandan korunur.
3.19. Hidroklorik asit standart hacimsel zeltisi c (HCl) = 0,10 mol/l
Not: Hesaplamalar iin dzeltilmise dier hacimsel zelti konsantrasyonlar (3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11 ve 3.19)
kullanlabilir. Konsantrasyonlar her zaman drt ondalk haneye kadar ifade edilmelidir.
4. Cihaz
Kjeldahl metoduna gre ya yakma, damtma ve titrasyona uygun cihaz.
5. Metot
5.1. Ya yakma
1 g numune 0,001 g hassasiyetle tartlr ve kjeldahl balonuna aktarlr. 15 g potasyum slfat (3.1), uygun
miktarda katalizr (3.2) (0,3 - 0,4 g bakr (II) oksit veya 0,9-1,2 g bakr (II) slfat pentahidrat), 25 ml slfrik
asit (3.4) ve gerekiyorsa granl kaynama ta (3.12) eklenir ve kartrlr.
Kjeldahl balonu nce yavaa stlr, ktle karbonize olana ve kpk kaybolana kadar gerekiyorsa ara sra
dndrerek kartrlr, ardndan sv srekli kaynayana kadar daha youn ekilde stlr. Kaynayan asit cam
balonun eperinde younlayorsa stma yeterlidir. eperin ar snmas ve organik paracklarn bunlara
yapmas nlenir.
zelti berrak ve ak yeil olduunda iki saat daha kaynatmaya devam edilir, ardndan soumaya braklr.
5.2. Damtma
Slfatlarn tmyle znmesini salamak iin dikkatle yeterli miktarda su eklenir (yaklak 150-200 ml).
Soumaya braklr ve ardndan gerekiyorsa birka granl inko (3.3) eklenir. 5.2.1. ya da 5.2.2.ye gre devam
edilir.
5.2.1. Slfrik aside damtma
Damtma cihaznn toplama erlenine varsaylan azot ieriine gre tam olarak llm 25 ml slfrik asit (3.5
ya da 3.7) eklenir. Birka damla metil krmzs indikatr (3.8) eklenir.
Kjeldahl Balon damtma cihaznn younlatrcsna balanr ve younlatrcnn ucu toplama erleni iindeki
svya en az 1 cm derinliinde batrlr. (baknz 8.3). 100 ml sodyum hidroksit zeltisi (3.9) yavaa balona
amonyak kayb olmadan eklenir (baknz 8.1) Balon amonyak damtma ilemi tamamlanana kadar stlr.
-
18
5.2.2. Borik aside damtma
Damtk rndeki amonyan titrasyonu elle yaplyorsa aada bahsedilen metot uygulanr. Damtma nitesi
amonyak ieriinin titrasyonunu da kapsayacak ekilde tam otomatik ise, cihaz reticisi firmann kullanm
talimatlar uygulanr.
25 ml ila 30 ml borik asit zeltisi (3.18) ieren bir toplama erleni, iletim borusunun yksek borik asit
zeltisinin yzeyi altnda olaca ekilde younlatrcnn altna yerletirilir. Damtma cihaz 50 ml sodyum
hidroksit zeltisini (3.9) datacak ekilde ayarlanr. Damtma cihaz reticinin talimatlarna gre kullanlr ve
sodyum hidroksit zeltisi eklenmesiyle aa kan amonyak damtlr. Distilat borik asit toplama zeltisinde
toplanr. Distilatn miktar (buhar damtma sresi), numunedeki azot miktarna gre deiir. reticinin
talimatlarn izlenir.
Not: Yar otomatik bir damtma cihaznda, yksek sodyum hidroksitin eklenmesi ve buhar damtma ilemi
otomatik olarak gerekletirilir.
5.3. Titrasyon
5.3.1. ya da 5.3.2.ye gre devam edilir.
5.3.1. Slfrik asit
Kullanlan slfrik asidin konsantrasyonuna bal olarak, toplama kab iindeki slfrik asidin fazlas, sodyum
hidroksit zeltisi ile (3.10 ya da 3.11) dnm noktasna ulalncaya kadar titre edilir
5.3.2. Borik asit
Toplama iesinin ierii bir bret kullanlarak hidroklorik asit standart volumetrik zeltisi (3.19) ya da slfrik
asit standart volumetrik zeltisi (3.6) ile titre edilir ve kullanlan miktar okunur.
Dnm noktasna, ierikte pembe rengin ilk grld yerde ulalr. Bret, en yakn 0,05 mlye okuyarak
tahmin edilir. Aydnlatmal bir manyetik kartrma plakas ya da fotometrik bir detektr dnm noktasnn
grlmesine yardmc olabilir. Bu, otomatik titrasyonlu buhar damtc kullanlarak otomatik olarak yaplabilir.
zel damtc ya da damtc/titre edicinin kullanm iin reticinin talimatlar izlenir.
Not: Otomatik titrasyon sistemi kullanldnda, titrasyon, damtma ilemi baladktan hemen sonra balar ve %
1 borik asit zeltisi (3.18) kullanlr.
Tam otomatik bir damtma cihaznn kullanld yerde, ayrca amonyan otomatik titrasyonu da bir
potansiyometrik pH sistemi kullanan dnm noktas tespiti ile yrtlebilir. Bu durumda pH metreli bir otomatik
titre edici kullanlr. pH metre, normal laboratuvar pH kalibrasyon metotlar izlenerek pH 4 ve pH 7 deerlerinde
dzgn olarak kalibre edilmelidir. Titrasyonun pH dnm noktasna pH 4,6da eriilir.
5.4. Kr testi
Ayralarn azot iermediini dorulamak amacyla numune yerine 1 g sakkaroz (3.14) kullanlarak kr testi (ya
yakma, damtma ve titrasyon) uygulanr.
6. Sonularn hesaplanmas
Hesaplamalar 6.1 ya da 6.2ye gre gerekletirilir.
6.1. 5.3.1e gre titrasyon hesab
Arlka yzde olarak ifade edilen ham protein ierii, aadaki formlden hesaplanr:
-
19
Burada;
V0 = Kr testinde kullanlan NaOH (3.10 ya da 3.11) hacmi (ml)
V1 = Numune titrasyonunda kullanlan NaOH (3.10 ya da 3.11) hacmi (ml)
c = Sodyum hidroksit (3.10 ya da 3.11) konsantrasyonu (mol/l)
m = Numunenin arl (g)
6.2. 5.3.2ye gre titrasyon hesab
6.2.1. Hidroklorik asitle titrasyon
Arlka yzde olarak ifade edilen ham protein ierii, aadaki formlden hesaplanr:
Burada;
m = Numunenin arl (g)
c = Standart volumetrik hidroklorik asit (3.19) zeltisinin konsantrasyonu (mol/l)
V0 = Kr testinde kullanlan hidroklorik asidin (ml cinsinden) hacmi
V1 = Numune iin kullanlan hidroklorik asidin (ml cinsinden) hacmi
6.2.2. Slfrik asitle titrasyon
Arlka yzde olarak ifade edilen ham protein ierii, aadaki formlden hesaplanr:
Burada;
m = Arl (g)
c = standart volumetrik slfrik asit (3.6) zeltisinin konsantrasyonu (mol/l)
V0 = kr testinde kullanlan slfrik asidin (3.6) (ml cinsinden) hacmi
V1 = Numune iin kullanlan slfrik asidin (3.6) (ml cinsinden) hacmi
7. Metodun dorulanmas
7.1. Tekrar edilebilirlik
-
20
Ayn numunenin iki paralel tayininin sonular arasndaki fark aadaki deerleri gememelidir:
% 20den az ham protein ierii iin mutlak deer olarak % 0,2,
% 20 ila % 40 ham protein ierii iin bulunan en yksek deerin % 1,0i kadar,
% 40tan fazla ham protein ierii iin mutlak deer olarak % 0,4.
7.2. Doruluk
Analiz (ya yakma, damtma ve titrasyon) 1 g sakkaroz (3.14) varlnda, 1,5 ila 2,0 g asetanilid (3.13) zerinde
gerekletirilir. 1 g asetanilid 14,80 ml slfrik asit (3.5) tketir. Geri kazanm en az % 99 olmaldr.
8. Gzlemler
8.1. Cihaz manuel, yar otomatik ya da otomatik tip olabilir. Ya yakma ve damtma admlar arasnda makine
aktarm gerektiriyorsa, bu aktarm kaypsz gerekletirilmelidir. Damtma cihaznn iesine damlama hunisi
taklmamsa, kjeldahl balonu younlatrcya balanmadan hemen nce sodyum hidroksit yavaa kenardan
dklerek eklenir.
8.2. Ya yakmaya tabi tutulan madde katlarsa, yukarda belirtilenden daha fazla miktarda slfrik asit (3.4)
kullanarak analiz yeniden balatlr.
8.3. Dk azot ierii olan rnler iin toplama erlenine koyulacak slfrik asit (3.7) hacmi gerekiyorsa 10 ya
da 15 mlye azaltlabilir ve su ile 25 mlye kadar tamamlanabilir.
8.4. Rutin analizlerde, ham protein tayini iin alternatif analiz metotlar uygulanabilir, ancak bu Blm Cde
aklanan Kjeldahl metodu referans metottur. Alternatif metotla (DUMAS gibi) elde edilen ve referans metot ile
karlatrlan sonularn edeerlii her matriks iin ayr ayr gsterilmelidir. Alternatif bir metotla elde edilen
sonular, edeerlikleri dorulanm olsa bile referans metot ile elde edilen sonulardan biraz sapabildiinden,
ham protein tayini iin kullanlan analiz metodundan analitik raporda bahsedilmesi gereklidir.
Not: 8.4.te ad geen DUMAS metodu, AOde yaymlanm metoda gre yaplabilir.
. RE TAYN
1. Ama ve kapsam
Bu metot, yemdeki re seviyesinin tayinini mmkn klar.
2. Prensip
Numune, berraklatrma zeltileriyle su iinde sspansiyon haline getirilir. Sspansiyon szlr. Szntnn
re ierii 4-dimetilaminobenzaldehid (4-DMAB) eklendikten sonra 420 nm dalga boyundaki optik younluk
llerek tayin edilir.
3. Ayralar
3.1. 4-dimetilaminobenzaldehid zeltisi: 1,6 g 4-DMAByi 100 ml % 96 etanol iinde zndrlr ve 10 ml
hidroklorik asit (20 1,19 g/ml) eklenir. Bu ayra, en fazla iki hafta kullanlabilir.
3.2. Carrez zeltisi I: Su iinde 21,9 g inko asetat Zn(CH3COO)2 2H2O ve 3 g glasiyal asetik asit
zndrlr. Su ile 100 mlye tamamlanr.
3.3. Carrez zeltisi II: Su iinde 10,6 g potasyum ferrosiyanid K4 Fe (CN)6 3H2O zndrlr. Su ile 100
mlye tamamlanr.
-
21
3.4. re absorbe etmeyen aktif karbon kullanlmaldr. (Kontrol edilmelidir.)
3.5. re, % 0,1 zelti (w/v)
4. Cihazlar
4.1. Kartrc: yaklak 35 ila 40 rpm
4.2. Test tpleri: 160 16 mm, ilifli
4.3. Spektrofotometre
5. Metot
5.1. Numunenin analizi
2 g numune 1 mg hassasiyetle tartlr ve 1 g aktif karbon (3.4) ile 500 mllik balon jojeye konur. 400 ml su ve 5
ml Carrez I zeltisi (3.2) eklenir, yaklak 30 saniye kartrlr ve 5 ml Carrez II zeltisi (3.3) eklenir.
Kartrcda 30 dakika kartrlr. Su ile gereken hacme tamamlanr, alkalanr ve szlr.
5 ml effaf renksiz filtrat alnr, ilifli test tplerine koyulur, 5 ml 4-DMAB zeltisi eklenir (3.1) ve kartrlr.
Tpler 20Cdeki (+/- 4C) bir su banyosuna konur. 15 dakika sonra, 420 nmde spektrofotometrede numune
zeltisinin optik younluu llr. Ayralar ayn ekilde kullanlarak numunesiz kr deneme almas yaplr
ve hesaplamalarda dikkate alnr.
5.2. Kalibrasyon erisi
1, 2, 4, 5 ve 10 mllik hacimlerde re zeltisi (3.5) alnr, 100 ml balon jojeye konur ve su ile gereken hacme
tamamlanr. Her bir zeltiden 5 ml alnr, bunlarn her birine 5 ml 4-DMAB zeltisi (3.1) eklenir, homojen
hale getirir, 5 ml 4-DMAB ve 5 ml re iermeyen su ihtiva eden bir kontrol zeltisi ile karlatrlarak optik
younluu yukarda gsterildii gibi llr, kalibrasyon erisi izilir.
6. Sonularn hesaplanmas
Kalibrasyon erisi kullanlarak numunedeki re miktar tayin edilir. Sonular numunenin yzdesi olarak ifade
edilir. re hesaplanmas iin aadaki forml kullanlabilir.
re(%): c x f x100
m x 1000
Burada;
c: Kalibrasyon erisinden hesaplanan re miktar(mg)
f: Seyreltme faktr
m: Numune miktar (g)
7. Gzlemler
7.1. re ieriinin % 3 gemesi halinde numune 1 ga azaltlr ya da orijinal zelti, 500 mlde en fazla 50 mg
re olacak ekilde seyreltilir.
7.2. re ieriinin dk olmas durumunda, sznt effaf ve renksiz kalana kadar numune artrlr.
7.3. Numune, amino asitler gibi basit azot bileikleri ieriyorsa, optik younluk 435 nmde llmelidir.
-
22
D. UUCU AZOTLU BAZLARIN TAYN
I. MKRO DFZYON METODUYLA
1. Ama ve kapsam
Bu metot; yemdeki, amonyak olarak ifade edilen uucu azotlu bazlarn tayinini mmkn klar.
2. Prensip
Numune su ile ekstrakte edilir ve zelti berraklatrlp szlr. Uucu azotlu bazlar, bir potasyum karbonat
zeltisi kullanlarak mikro difzyon yoluyla kartlr, borik asit zeltisinde toplanr ve slfrik asit ile titre
edilir.
3. Ayralar
3.1. Trikloroasetik asit, % 20 (w/v) zelti.
3.2. ndikatr: 33 mg bromokrezol yeili ve 65 mg metil krmzs 100 ml % 95 ila % 96 (v/v) etanol iinde
zndrlr.
3.3. Borik asit zeltisi: 1 litrelik balon jojede 10 g borik asit 200 ml % 95 ila % 96 (v/v) etanol ve 700 ml su
iinde zndrlr. 10 ml indikatr (3.2) eklenir. Kartrlr ve gerekiyorsa zeltinin rengi bir sodyum
hidroksit zeltisi ekleyerek ak krmzya ayarlanr. Bu zeltinin 1 mlsi en fazla 300 g NH3 balayacaktr.
3.4. Doymu potasyum karbonat zeltisi: 100 g potasyum karbonat 100 ml kaynar suda zndrlr.
Soumaya braklr.
3.5. Slfrik asit 0,01 mol/l
4. Cihaz
4.1. Kartrc: yaklak 35 ila 40 rpm
4.2. Cam ya da plastik Conway hcreleri (baknz ekil)
4.3. 1/100 ml derecelendirilmi mikro bretler
5. Metot
10 g numune 1 mg hassasiyetle tartlr ve 100 ml su ile 200 mllik balon jojeye konur. 30 dakika boyunca
kartrcda kartrlr. 50 ml trikloroasetik asit zeltisi (3.1) eklenir, su ile gereken hacme tamamlanr,
kuvvetlice alkalanr ve katl bir szge kad ile szlr.
Bir pipet kullanarak 1 ml borik asit zeltisi (3.3) Conway hcresinin ortasna ve 1 ml numune sznts
hcrenin balna eklenir. Yalanm kapakla ksmen kapatlr. 1 ml doymu potasyum karbonat zeltisi (3.4)
hzl bir ekilde bala damlatlr ve kapa hcrenin hava almayaca ekilde kapatlr. Hcre, iki ayracn
karaca ekilde dikkatle yatay bir dzlemde dndrerek evrilir. Oda scaklnda en az drt saat ya da
40Cde bir saat inkbe edilmeye braklr.
Bir mikro bret (4.3) kullanlarak uucu bazlar borik asit zeltisi iinde slfrik asit (3.5) ile titre edilir.
Analiz edilecek bir numune olmadan ayn metot kullanlarak kr testi gerekletirilir.
6. Sonularn hesaplanmas
1 ml H2SO4 0,01 mol/l, 0,34 mg amonyaa karlk gelir. Sonular numunenin yzdesi olarak ifade edilir.
-
23
6.1. Tekrar edilebilirlik
Ayn numunenin iki paralel tayininin sonular arasndaki fark aadaki deerleri gememelidir:
% 1den az amonyak ierii iin bal deer olarak % 10,
% 1 ya da daha fazla amonyak ierii iin mutlak deer olarak % 0,1
7. Gzlem
Numunenin amonyak ierii % 0,6dan fazla ise balang sznts seyreltilir.
ekil: Conway Hcresi
lek 1/1
Hcrenin stten grnm
ilifli cam kapan stten grnm
Kapan S S1 kesiti
Kapan S2S3 kesiti
-
24
II. DAMITMA METODUYLA
1. Ama ve Kapsam
Bu metot; re iermeyen balk ununda, amonyak olarak ifade edilen uucu azotlu bazlarn tayinini mmkn
klar. Bu, yalnzca % 0,25ten az amonyak ierii iin geerlidir.
2. Prensip
Numune su ile ekstrakte edilir ve zelti berraklatrlp szlr. Uucu azotlu bazlar kaynama noktasnda
magnezyum oksit eklenerek kartlr ve belirli miktardaki slfrik asit iinde toplanr, fazla miktar sodyum
hidroksit zeltisi ile geri titre edilir.
3. Ayralar
3.1. Trikloroasetik asit, % 20 (w/v) zelti
3.2. Magnezyum oksit
3.3. Kprmeyi nleyici emlsiyon (silikon gibi)
3.4. Slfrik asit 0,05 mol/l
3.5. Sodyum hidroksit zeltisi, 0,1 mol/l
3.6. % 95 ile % 96 (v/v) etanol iinde % 0,3 metil krmzs zelti
4. Cihaz
4.1. Kartrc: yaklak 35 ile 40 rpm
4.2. Kjeldahl tipi damtma cihaz
5. Metot
10 g numune 1 mg hassasiyetle tartlr ve 100 ml su ile 200 mllik balon jojeye konur. 30 dakika boyunca
kartrcda kartrlr. 50 ml trikloroasetik asit zeltisi (3.1) eklenir, su ile gereken hacme tamamlanr,
kuvvetlice alkalanr ve katl bir szge kad ile szlr.
Varsaylan uucu azotlu baz ierii iin uygun miktarda berrak sznt alnr. (100 ml genelde uygundur) 200
mlye seyreltilir ve 2 g magnezyum oksit (3.2) ile birka damla kprmeyi nleyici emlsiyonu (3.3) eklenir.
zelti turnusol kadna gre alkali olmaldr, deilse biraz magnezyum oksit (3.2) eklenir. Ham protein
ieriinin tayini iin analiz metodunun 5.2 ve 5.3 maddelerine gre devam edilir. (Baknz Blm C).
Numune olmadan ayn metot kullanarak kr testi gerekletirilir.
6. Sonularn hesaplanmas
1 ml H2SO4 0,05 mol/l, 1,7 mg amonyaa karlk gelir. Sonular yzde olarak ifade edilir.
6.1. Tekrar edilebilirlik
Ayn numunenin iki paralel tayininin sonular arasndaki fark, bal deer olarak en fazla amonyan % 10u
olmaldr.
-
25
E. AMNO ASTLERN (TRPTOFAN HAR) TAYN
1. Ama ve kapsam
Bu metot, amino asit analizr kullanarak yemdeki serbest (sentetik ve doal) ve toplam (peptid bal ve serbest)
amino asitlerin tayinini mmkn klar. Sistein, metiyonin, lizin, treonin, alanin, arjinin, aspartik asit, glutamik
asit, glisin, histidin, izolysin, lysin, fenilalanin, prolin, serin, tirozin ve valin amino asitleri iin geerlidir.
Metot, amino asit tuzlarn ayrt etmez ve amino asitlerin D ve L formlar arasnda ayrm yapmaz. Triptofan ya
da amino asitlerin hidroksi analoglarnn tayini iin geerli deildir.
2. Prensip
2.1. Serbest amino asitler
Serbest amino asitler seyreltilmi hidroklorik asit ile ekstrakte edilir. Beraber ekstrakte edilmi azotlu makro
molekller slfosalisilik asit ile keltilir ve szlr. Szntnn pH 2,20ye ayarlanr. Amino asitler iyon
deiim kromatografisi ile ayrlr ve ninhidrin ile reaksiyona sokularak fotometrede 570 nm dalga boyunda tespit
edilir.
2.2. Toplam amino asitler
Seilen metot inceleme altndaki amino asitlere gre deiir. Sistein ve metiyonin hidrolizden nce srasyla
sisteik aside ve metiyonin slfona okside edilmelidir. Tirozin, oksitlenmemi numunelerin hidrolizatlarnda tayin
edilmelidir. Ama ve kapsamda listelenen dier tm amino asitler oksitlenmi ya da oksitlenmemi numunede
tayin edilebilir.
Oksidasyon 0Cde performik asit/fenol karm ile gerekletirilir. Oksitlenme ayracnn fazlas sodyum
dislfit ile ayrtrlr. Oksitlenmi ya da oksitlenmemi numune, hidroklorik asit (3.20) ile 23 saat boyunca
hidrolize edilir. Hidrolizat pH 2,20ye ayarlanr. Amino asitler iyon deiim kromatografisi ile ayrlr ve
ninhidrin ile reaksiyona sokularak fotometrede 570 nm (prolin iin 440 nm) dalga boyunda tespit edilir.
3. Ayralar
ki kere distile edilmi su ya da edeer nitelikte su kullanlmaldr. (iletkenlik < 10 S).
3.1. Hidrojen peroksit, a (a/a) = % 30
3.2. Formik asit, a (a/a) = % 98 - % 100
3.3. Fenol.
3.4. Sodyum dislfit
3.5. Sodyum hidroksit
3.6. 5-Slfosalisilik asit dihidrat
3.7. Hidroklorik asit, yaklak younluu 1,18 g/ml
3.8. Tri-Sodyum sitrat dihidrat
3.9. 2,2'-Tiyodietanol (tiyodiglikol)
3.10. Sodyum klorr
3.11. Ninhidrin
-
26
3.12. Petrol eteri, kaynama aral 40-60C
3.13. Norlysin ya da baka bir bileik i standart olarak kullanlmaya uygundur.
3.14. Azot gaz (< 10 ppm oksijen)
3.15. 1-Oktanol
3.16. Amino asitler
3.16.1. Standard maddeler paragraf 1 altnda listelenmitir. Saf bileikler kristalizasyon suyu iermezler.
Kullanmadan nce bir hafta boyunca P2O5 ya da H2SO4 zerinde vakum altnda kurutulur.
3.16.2. Sisteik asit
3.16.3. Metiyonin slfat.
3.17. Sodyum hidroksit zeltisi, c = 7,5 mol/l, (300 g NaOH (3.5) su iinde zndrlr ve 1 litreye
tamamlanr.)
3.18. Sodyum hidroksit zeltisi, c = 1 mol/l, (40 g NaOH (3.5) su iinde zndrlr ve 1 litreye tamamlanr.)
3.19. Formik asit fenol zeltisi, (889 g formik asidi (3.2) 111 g su ile kartrlr ve 4,73 g fenol (3.3)
eklenir.)
3.20. Hidroliz karm, c = 6 mol/l HCl (1 g/l fenol ieren), (492 ml HCI (3,7) iine 1 g fenol eklenir ve suyla 1
litreye tamamlanr)
3.21. Ekstraksiyon karm, c = 0,1 mol/l HCl (% 2 tiodiglikol ieren) (8,2 ml HCl (3.7) alnr, yaklak 900 ml
su ile seyreltilir, 20 ml tiodiglikol (3.9) eklenir ve su ile 1 litreye tamamlanr) (3.7 ve 3.9. dorudan
kartrlmaz).
3.22. 5- Slfosalisilik asit, = % 6, (60 g 5- slfosalisilik asidi (3.6) su iinde zndrlr ve su ile 1 litreye
tamamlanr.)
3.23. Oksidasyon karm (Performik asit fenol) (0,5 ml hidrojen peroksidi (3.1) 4,5 ml formik asit-fenol
zeltisi (3.19) ile kk bir beherde kartrlr. Performik asit oluturmak iin 20-30Cde 1 saat boyunca
inkbe edilir. Numuneyi eklemeden nce (15 dakika) buz-su banyosunda soutulur.)
Not: Deriyle temasndan saknlr ve koruyucu giysiler kullanlr.
3.24. Sitrat tamponu, c = 0,2 mol/l Na+, pH 2,20 (19,61 g sodyum sitrat (3.8), 5 ml tiodiglikol (3.9), 1 g fenol
(3.3) ve 16,50 ml HCIyi (3.7) yaklak 800 ml su iinde zndrlr. pHs 2,20ye ayarlanr. Su ile 1 litreye
tamamlanr.)
3.25. Elsyon tamponlar, kullanlan analizr koullarna gre hazrlanr (4.9)
3.26. Ninhidrin ayrac, analizr koullarna gre hazrlanr (4.9)
3.27. Amino asitlerin standart zeltileri. Bu zeltiler 5Cde saklanmaldr.
3.27.1. Amino asitlerin stok standart zeltileri (3.16.1)
c = 2,5 mol/ml (Her birinin hidroklorik asit iindeki zeltisi. Ticari olarakta bulunur.)
3.27.2. Sisteik asit ve metiyonin slfatn stok standart zeltileri, c = 1,25 mol/ml
-
27
0,2115 g sisteik asit (3.16.2) ve 0,2265 g metiyonin slfat (3.16.3)1 litrelik balon jojede sitrat tamponu
ierisinde zndrlr ve sitrat tamponu ile iaretine kadar tamamlanr. 5Cnin altnda ve en fazla 12 ay
saklanr. Bu zelti, stok standart zeltisi (3.27.1) sisteik asit ve metiyonin slfat ieriyorsa kullanlmaz.
3.27.3. standardn stok standart zeltisi, rnein norlysin, c = 20 mol/ml 0,6560 g norlysin (3.13) balon
jojede sitrat tamponu (3.24) iinde zndrlr ve sitrat tamponu ile 250 mlye tamamlanr. 5Cnin altnda en
fazla 6 ay saklanr.
3.27.4. Hidrolizatlar ile kullanlmak zere standart amino asitlerin kalibrasyon zeltileri, c = 5 nmol/50 l,
sisteik asit ve metiyonin slfat ve c = 10 nmol/50 l dier amino asitler. 2,2 g sodyum klorit (3.10) 100 mllik
beher iinde 30 ml sitrat tamponu (3.24) ile zndrlr. 4,00 ml amino asit stok standart zeltisi (3.27.1),
4,00 ml sisteik asit ve metiyonin slfatn stok standart zeltisi (3.27.2) ve eer kullanlyorsa 0,50 ml i
standardn stok standart zeltisi (3.27.3) eklenir. Sodyum hidroksit (3.18) ile pHs 2,20ye ayarlanr.
Hazrlanan ksm 50 mllik balon jojeye aktarlr ve sitrat tamponu (3.24) ile iarete kadar tamamlayp kartrlr.
5Cnin altnda en fazla 3 ay saklanr. (Baknz gzlem 9.1.)
3.27.5. Hidrolizatlarla kullanlmak zere standart amino asitlerin kalibrasyon zeltileri paragraf 5.3.3.1.e gre
ve ekstraktlarla (5.2) birlikte kullanlmak zere hazrlanr. Kalibrasyon zeltisi 3.27.4.e gre hazrlanr ancak
sodyum klorr ilave edilmez. 5Cnin altnda en fazla 3 ay saklanr.
4. Cihaz
4.1. Geri soutucu taklm 100 ila 250 mllik yuvarlak tabanl balon joje
4.2. Etv kullanm iin kauuk/teflon astarl vida kapakl 100 mllik borosilikat cam ie (rnein Duran,
Schott)
4.3. Havalandrmal ve 2Cden daha iyi bir hassasiyette scaklk dzenleyicili etv
4.4. pH-metre ( ondalk haneli)
4.5. Membran filtre (0,22 m)
4.6. Santrifj
4.7. Rotary vakum evaporatr
4.8. Mekanik alkalayc ya da manyetik kartrc
4.9. Amino asit analizr ya da iyon deiimi kolonlu HPLC cihaz, ninhidrin iin gere, kolon sonras
trevlendirme ve fotometrik detektr.
Kolon, amino asitleri birbirinden ve dier ninhidrin-pozitif materyallerden ayrabilecek kapasitede slfonlu
polistren reineleri ile doldurulur. Tampon ve ninhidrin hatlarndaki ak, hem standart kalibrasyon almas ve
hem de numune analizini kapsayan sre boyunca % 0,5 ak stabilitesi olan pompalarla salanr.
Baz amino asit analizrleri ile birlikte; hidrolizatn c = 0,8 mol/l sodyum konsantrasyonuna sahip olduu ve
oksidasyon basamandan kalan tm formik asidi ierdii durumlarda hidroliz metotlar kullanlabilir. Hidrolizat
yksek formik asit ve/veya yksek sodyum iyon konsantrasyonlar ierirse, dierleri belirli amino asitlerde
tatmin edici bir ayrm salamaz. Bu durumda, asit hacmi hidrolizden sonra ve pH ayarlamasndan nce
buharlatrma ile yaklak 5 mlye azaltlr. Buharlatrma vakum altnda en fazla 40Cde yaplmaldr.
-
28
5. Metot
5.1. Numunenin hazrlanmas
Numune 0,5 mmlik elekten geecek ekilde tlr. Nem oran yksek numuneler ilemden nce ya 50Cyi
amayacak scaklkta hava ile kurutulmal ya da dondurularak kurutulmaldr. Yksek ya oranl numuneler
ilemden nce petrol eteri ile ekstrakte edilmelidir (3.12).
5.2. Yem ve premikslerde serbest amino asitlerin belirlenmesi
Hazrlanan numuneden 0,2 mg hassasiyetle uygun bir miktar (1-5 g) (5.1) erlene tartlr ve ekstraksiyon
zeltisinden 100 ml eklenir (3.21). Mekanik bir alkalayc ya da manyetik bir kartrc kullanarak karm 60
dakika boyunca alkalanr (4.8). keltinin kmesi beklenir ve 100 mllik bir behere spernatant zeltiden 10
ml pipetlenir.
5,0 ml slfosalisilik asit zeltisi (3.22), kartrlarak eklenir ve manyetik kartrc yardm ile 5 dakika
boyunca kartrmaya devam edilir. keltiyi ayrmak iin spernatant szlr ya da santrifje tabi tutulur. Elde
edilen zeltiden 10 ml, 100 mllik bir behere alnrak sodyum hidroksit zeltisi (3.18) eklenir pH 2,20ye
ayarlanr, sitrat tamponu (3.24) kullanarak uygun hacimdeki balon jojeye aktarlr ve tampon zeltisi (3.24) ile
iarete kadar tamamlanr.
Bir i standart kullanlacaksa, her 100 ml nihai zelti iin 1ml i standart (3.27.3.) eklenir ve tampon zeltisi
(3.24) ile iarete kadar tamamlanr.
5.4.e gre kromatografi ilemine geilir.
Ekstraktlar ayn gn incelenmeyecekse 5Cnin altnda saklanr.
5.3. Toplam amino asitlerin belirlenmesi
5.3.1. Oksidasyon
Hazrlanan numuneden (5.1) 0,2 mg hassasiyetle 0,1 ile 1 g,
- Ak hidroliz (5.3.2.3) iin 100 mllik yuvarlak tabanl balon (4.1) iine ya da, - Dk sodyum konsantrasyonu gerekiyorsa (5.3.3.1) 250 mllik yuvarlak tabanl balon (4.1)iine ya da, - Kapal hidroliz (5.3.2.4) iin 100 mllik vidal kapakl ie (4.2) iine tartlr.
Tartlan numune yaklak 10 mg azot ieriine sahip olmal ve su miktar100 mg amamaldr.
Balon/ie buz-su banyosu iine yerletirilir ve 0Cye soutulur, 5 ml oksidasyon karm (3.23) eklenir ve eik
ulu bir cam spatula ile kartrlr. Balon/ie spatula ile birlikte hava geirmez bir filmle kapatlr, buz-su
banyosu iindeki filmle kapatlm balon/ie ile birlikte 0 Cdeki buzdolabna yerletirilir ve 16 saat bekletilir.
16 saatten sonra buzdolabndan karlr ve 0,84 g sodyum dislfr (3.4) ekleyerek fazla oksidasyon ayrac
ayrtrlr.
5.3.2.1e gre ileme devam edilir.
5.3.2. Hidroliz
5.3.2.1. Oksitlenmi numunelerin hidrolizi
5.3.1.e gre hazrlanm oksitlenmi numuneye, 25 ml hidroliz karm (3.20) kabn ve spatulann zerine
yapm tm numune kalntlarn ykamaya zen gstererek eklenir.
Kullanlan hidroliz metoduna bal olarak, 5.3.2.3 ya da 5.3.2.4.e gre ilerlenir.
5.3.2.2. Oksitlenmemi numunelerin hidrolizi
-
29
Hazrlanan numuneden (5.1) 0,2 mg hassasiyetle 0,1 ile 1 g arasnda 100 ya da 250 mllik yuvarlak tabanl
balona (4.1) ya da 100 mllik vidal kapakl ieye (4.2) tartlr. Tartlan numune yaklak 10 mglk bir azot
ieriine sahip olmaldr. 25 ml hidroliz karm (3.20) dikkatlice eklenir ve numuneyle kartrlr. 5.3.2.3 ya da
5.3.2.4.e gre ileme devam edilir.
5.3.2.3. Ak hidroliz
Balondaki karma (5.3.2.1 ya da 5.3.2.2ye gre hazrlanm) 3 kaynama boncuu eklenir ve geri soutucu
altnda 23 saat boyunca srekli kabartarak kaynatlr. Hidroliz tamamlandnda, younlatrc 5 ml sitrat
tamponu (3.24) ile ykanr. Cam balon ayrlr ve buz banyosu iinde soutulur.
5.3.3.e gre ileme devam edilir.
5.3.2.4. Kapal hidroliz
5.3.2.1 ya da 5.3.2.2.e gre hazrlanm karm ieren ie 110Cdeki etve (4.3) yerletirilir. lk bir saat
iinde basn oluumunu engellemek iin (gaz halindeki maddelerin oluumundan kaynaklanan) ve patlamay
nlemek iin, ienin stne vidal kapak yerletirilir. ie kapakla kapatlmamaldr. Bir saatten sonra ie
kapak ile kapatlr ve etv (4.3) iinde 23 saat boyunca braklr. Hidroliz tamamlandnda, ie etvden
karlr, ienin kapa dikkatlice alr ve buz-su banyosuna yerletirilir. Soumaya braklr.
pH ayarlama metoduna (5.3.3) bal olarak, hazrlanan ksm ienin ierii 250 mllik bir behere ya da 250
mllik yuvarlak tabanl bir balona sitrat tamponu (3.24) kullanarak aktarlr.
5.3.3.e gre ileme devam edilir.
5.3.3. pHn ayarlanmas
Amino asit analizrnn (4.9) sodyum toleransna bal olarak pH ayarlamas iin 5.3.3.1 ya da 5.3.3.2.ye gre
ileme devam edilir.
5.3.3.1. Dk sodyum konsantrasyonu gerektiren kromatografik sistemler (4.9) iin
Dk bir sodyum konsantrasyonu gerektiren amino asit analizrleri kullanldnda (asit hacmi
drldnde), bir i stok standard (3.27.3) kullanlmas nerilir.
Bu durumda buharlatrmadan nce hidrolizata 2 ml i stok standard (3.27.3) eklenir.
Alnan hidrolizata 5.3.2.3 ya da 5.3.2.4e gre 2 damla 1-oktanol (3.15) eklenir.
Rotary evaporatr (4.7) kullanarak hacim vakum altnda 40Cde 5-10 mlye drlr. Kazayla hacim 5 mlnin
altna drlrse, hidrolizat atlr ve analiz batan balatlr.
Sodyum hidroksit zeltisi (3.18) ile pH 2,20ye ayarlanr ve paragraf 5.3.4e gre ileme devam edilir.
5.3.3.2. Tm dier amino asit analizrleri iin ( 4.9 )
5.3.2.3 ya da 5.3.2.4.e gre elde edilen hidrolizatlar alnr ve 17 ml sodyum hidroksit zeltisi (3.17)
kartrlarak eklenir ksmen ntrletilir, bu durumda scaklk 40Cn altnda olmaldr.
Oda scaklnda sodyum hidroksit zeltisi (3.17) ve sonra dier sodyum hidroksit zeltisi (3.18) ekleyerek pH
2,20ye ayarlanr. 5.3.4e gre ileme devam edilir.
5.3.4. Kromatografi iin numuneler
pHs ayarlanm hidrolizat (5.3.3.1 ya da 5.3.3.2) sitrat tamponu (3.24) ile birlikte 200 mllik balon jojeye
aktarlr ve tamponla (3.24) iarete kadar tamamlanr.
-
30
standart henz kullanlmadysa, 2 ml i standart (3.27.3) eklenir ve sitrat tamponuyla (3.24) iarete kadar
tamamlanr. yice kartrlr.
Kromatografi basamana (5.4) geilir.
Numune zeltileri ayn gn iinde incelenmeyecekse, 5Cnin altnda saklanmaldr.
5.4. Kromatografi
Kromatografiden nce ekstrakt (5.2) ya da hidrolizat (5.3.4) oda scaklna getirilir, karm alkalanr ve uygun
bir miktar 0,22 m membran filtreden (4.5) szlr. Elde edilen berrak zelti, amino asit analizr (4.9)
kullanlarak iyon deiim kromatografisine enjekte edilir.
Enjeksiyon elle ya da otomatik olarak uygulanabilir. Bir i standart kullanld durumlar dnda standartlar ve
numunelerin analizi iin kolona ayn miktarda % 0,5 zelti eklenmesi nemlidir ve standartlarla numune
zeltileri iindeki sodyum/amino asit oranlar benzerdir.
Genel olarak uygulanan kalibrasyon skl ninhidrin ayracnn stabilitesine ve analitik sisteme baldr.
Numune amino asit pik alannn % 30-200 orannda bir standart pik alan vermesi iin standart ya da numune
sitrat tamponu (3.24) ile seyreltilir.
Amino asitlerin kromatografisi kullanlan analizr trne ve kullanlan reineye gre ok az deiim gsterebilir.
Kullanlan sistem amino asitleri birbirinden ve dier ninhidrin-pozitif materyallerden ayrabilecek kapasitede
olmaldr. alma aralnda kromatografik sistem, kolona eklenen amino asitlerin miktarlarndaki deiime
dorusal bir tepki vermelidir.
Kromatografi basamanda; emolar bir zelti (belirlenen aminoasitlerin) analiz edildiinde aada bahsedilen
ukur/pik ykseklik oranlar uygulanr. Bu emolar zelti amino asit analizr sistemi (4.9) ile hassas bir
biimde llebilecek olan her bir amino asidin en azndan % 30unu iermelidir.
Treonin-serin ayrm iin kromatogramdaki iki akan amino asidin daha dnn ukur:pik ykseklii oran
2:10u gememelidir. (Sistein, metiyonin, treonin ve lizin belirlenecekse, birleik piklerden kaynaklanan yetersiz
ayrm belirlemeyi olumsuz etkiler). Tm dier amino asitlerin ayrm 1:10dan daha iyi olmaldr.
Sistemde lizinin, lizin benzeri maddelerden ve ornitinden ayrldna emin olunmaldr.
6. Sonularn Hesaplanmas
Numune ve standart pik alanlar her bir amino asit iin ayr ayr llr ve miktar(X), her bir kilograma den
amino asit miktar g olarak aadaki gibi hesaplanr:
Bir i standart kullanlacaksa D/C ile arplr.
A = Pik alan, hidrolizat ya da ekstrakt
B = Pik alan, kalibrasyon standart zeltisi
C = Pik alan, hidrolizat ya da ekstrakt iinde i standart
D = Pik alan, i standart, kalibrasyon standart zeltisi
M = Belirlenen amino asidin mol arl
c = mol/ml cinsinden standardn younluu
-
31
m = Numune arl (g) (kurutulmusa ya da ya karlmsa orijinal arlna gre dzeltilmelidir)
V = Toplam hidrolizat (5.3.4) ya da ekstraktn ml cinsinden hesaplanan toplam seyrelti hacmi (6.1)
Hem sistin hem de sistein, oksitlenmi numunenin hidrolizatlarndaki sisteik asit olarak belirlenir, ancak mol
arl M =120,15 g/mol (= 0,5 x 240,30 g/mol) kullanlarak sistin olarak hesaplanr ((C6H12N2O4S2, M 240,30
g/mol)
Oksitlenmi numunenin hidrolizatlarndaki metiyonin, metiyonin slfon olarak belirlenir, ancak metiyoninin mol
arl M149,21 g/ kullanlarak metiyonin olarak hesaplanr.
Metiyonin ekstraksiyonundan sonra ilave edilen serbest metiyonin belirlenir hesaplanmas iin ayn mol arlk
kullanlr.
6.1. Serbest amino asitlerin (5.2) belirlenmesi iin ekstraktlarn (F) toplam seyrelti hacmi aadaki gibi
hesaplanr:
V = Nihai ekstraktn hacmi
7. Metodun deerlendirilmesi
Metot drt farkl yem (domuz yemi, etlik pili yemi, protein konsantresi, premix) kullanlarak 1990 ylnda
uluslar aras dzeyde yaplan dngl karlatrlma iinde test edilmitir. Aykr deerlerin elemesinden sonra;
sonularn anlam ve standart sapma aadaki tabloda verilmitir:
Referans materyal
Amino Asit
Treonin Sist(e)in Metionin Lisin
Domuz yemi
6,94
n = 15
3,01
n = 17
3,27
n = 17
9,55
n = 13
Etlik Pili Yemi
9,31
n = 16
3,92
n = 18
5,08
n = 18
13,93
n = 16
Protein konsantresi
22,32
n = 16
5,06
n = 17
12,01
n = 17
47,74
n = 15
Premiks
58,42
N = 16
90,21
n = 16
98,03
n = 16
n= Katlan laboratuvar says
7.1. Tekrar edilebilirlik
Yukarda belirtilen dngl karlatrma ile elde edilen laboratuvar ii standart sapma iin elde edilen sonular
aadaki tabloda verilmitir
-
32
Laboratuvar i Standart Sapma (Sr) g/kg olarak
Referans materyal
Amino Asit
Treonin Sist(e)in Metionin Lisin
Domuz yemi
0,13
n = 15
0,10
n = 17
0,11
n = 17
0,26
n = 13
Etlik Pili Yemi
0,20
n = 16
0,11
n = 18
0,16
n = 18
0,28
n = 16
Protein konsantresi
0,48
n = 16
0,13
n = 17
0,27
n = 17
0,99
n = 15
Premiks
1,30
N = 16
2,19
n = 16
2,06
n = 16
n= Katlan laboratuvar says
Laboratuvar i Standart Sapma (Sr) iin Varyasyon Katsays (%)
Referans materyal
Amino Asit
Treonin Sist(e)in Metionin Lisin
Domuz yemi
1,9
n = 15
3,3
n = 17
3,4
n = 17
2,8
n = 13
Etlik Pili yemi
2,1
n = 16
2,8
n = 18
3,1
n = 18
2,1
n = 16
Protein konsantresi
2,7
n = 16
2,6
n = 17
2,2
n = 17
2,4
n = 15
Premiks
2,2
N = 16
2,4
n = 16
2,1
n = 16
n= Katlan laboratuvar says
7.2 Tekrar retilebilirlik
Yukarda belirtilen dngl karlatrma ile elde edilen laboratuvarlar aras standart sapma iin elde edilen
sonular aadaki tabloda verilmitir.
Laboratuvarlar aras Standart Sapma (SR) g/kg
-
33
Referans materyal Amino Asit
Treonin Sist(e)in Metionin Lisin
Domuz yemi 0,28
n = 15
0,30
n = 17
0,23
n = 17
0,30
n = 13
Etlik Pili yemi 0,48
n = 16
0,34
n = 18
0,55
n = 18
0,75
n = 16
Protein Konsantresi 0,85
n = 16
0,62
n = 17
1,57
n = 17
1,24
n = 15
Premiks 2,49
n = 16
6,20
n = 16
6,62
n = 16
n= Katlan laboratuvar says
Laboratuvarlar Aras Standart Sapma (SR) iin Varyasyon Katsays (%)
Referans materyal
Amino Asit
Treonin Sist(e)in Metionin Lisin
Domuz yemi
4,1
n = 15
9,9
n = 17
7,0
n = 17
3,2
n = 13
Etlik Pili Yemi
5,2
n = 16
8,8
n = 18
10,9
n = 18
5,4
n = 16
Protein konsantresi
3,8
n = 16
12,3
n = 17
13,0
n = 17
3,0
n = 15
Premiks
4,3
N = 16
6,9
n = 16
6,7
n = 16
n= Katlan laboratuvar says
8. Referans materyallerin kullanm
Metodun doru uygulanmas; eriilebildii noktalarda onayl referans materyallerin oklu lmnn
yaplmasyla snanmaldr. Kalibrasyonun; onayl amino asit kalibrasyon zeltisiyle yaplmas nerilir.
9. Gzlemler
-
34
9.1. Amino asit analizrleri arasndaki farklardan tr; standart amino asitlerin (baknz 3.27.4 ve 3.27.5) ve
hidrolizatlarn (baknz 5.3.4) kalibrasyon zeltilerinin son konsantrasyonlar klavuz olarak alnmaldr.
Cihazlarn lineer tepkilerinin aral tm amino asitler iin kontrol edilmelidir.
Standart zelti; araln ortasndaki tepe alanlarn vermesi iin sitrat tamponu ile seyreltilir.
9.2. Yksek performans sv kromatografik donanmlarn hidrolizatlarn analizinde kullanld yerlerde,
deneysel koullar reticinin nerilerine gre optimize edilmelidir.
9.3. % 1den fazla klorit ieren yemlere (konsantre, mineral yemleri, ilave yemler) Metodun uygulanmasyla,
metioninin eksik tahmin edilmesi durumu oluabilir ve zel uygulama yaplmak zorundadr.
F. TRPTOFAN TAYN
1. Ama ve kapsam
Bu metot, yemdeki toplam ve serbest triptofan miktarn belirlemek iindir. D- ve L- formlar arasnda bir ayrm
yapmaz.
2. Prensip
Toplam triptofan tayini iin numune, alkali koullar altnda doymu baryum hidroksit zeltisi ile hidrolize edilir
ve 20 saat boyunca 110Cye stlr. Hidrolizden sonra i standart eklenir.
Serbest triptofan tayini iin numune, i standardn varlnda hafif asidik koullar altnda ekstrakte edilir.
Hidrolizatn ya da ekstraktn iinde triptofan ve i standart, HPLC floresan dedektr ile tayin edilir.
3. Ayralar
3.1. ki kere distile edilmi su ya da edeer nitelikte su kullanlmaldr (iletkenlik < 10 S/cm)
3.2. Standard madde: Triptofan (saflk/ierik % 99) fosfor pentoksit ile vakum altnda kurutulmu
3.3. standart madde: -metil-triptofan (saflk/ierik % 99), fosforlu pentoksit ile vakum altnda kurutulmu
3.4. Baryum hidroksit okta-hidrat (tayini bozabilecek BaCO3 oluumunu nlemek amacyla havaya yksek
Ba(OH)2 .8H2O aa kmamas iin gerekli nlemler alnacaktr) (baknz gzlem 9.3)
3.5. Sodyum hidroksit
3.6. Orto-fosforik asit, w (a/a) = % 85
3.7. Hidroklorik asit, 20 1,19 g/ml
3.8. Metanol, HPLC kalitesine edeer
3.9. Petrol eteri, kaynama aral 40- 60C
3.10. Sodyum hidroksit zeltisi, c = 1 mol/l,
40,0 g NaOH (3.5) su iinde zdrlr ve su ile 1 litreye tamamlanr (3.1)
3.11. Hidroklorik asit, c = 6 mol/l, 492 ml HCl (3.7) alnr ve su ile 1 litreye tamamlanr.
3.12. Hidroklorik asit, c = 1 mol/l, 82 ml HCl (3.7) alnr ve su ile 1 litreye tamamlanr.
3.13. Hidroklorik asit, c = 0,1 mol/l, 8,2 ml HCl (3.7) alnr ve su ile 1 litreye tamamlanr.
-
35
3.14. Orto-fosforik asit, c = 0,5 mol/l,
34 ml orto-fosforik asit (3.6) alnr ve su ile 1 litreye tamamlanr. (3.1)
3.15. Konsantre triptofan zeltisi (3.2), c = 2,50 mol/ml,
500 mllik balon jojede 0,2553 g triptofan (3.2) hidroklorik asit (3.13) iinde zndrlr ve iarete kadar
hidroklorik asit (3.13) ile tamamlanr.
- 18Cde en fazla 4 hafta saklanr.
3.16. Konsantre i standart zeltisi, c = 2,50 mol/ml,
500 mllik balon jojede 0,2728 g -metil-triptofan (3.3) hidroklorik asit (3.13) iinde zndrlr ve iarete
kadar hidroklorik asit (3.13) ile tamamlanr. - 18Cde en fazla 4 hafta saklanr.
3.17. Triptofan ve i standardn kalibrasyon standart zeltisi,
2,00 ml konsantre triptofan zeltisi (3.15) ve 2,00 ml konsantre i standart (-metil-triptofan) zeltisi (3.16)
alnr. Bitmi hidrolizatta ayn hacimde ve ayn metanol konsantrasyonunda (% 10 - % 30) olacak ekilde eit
hacimdeki su (3.1) ve metanol (3.8) ile seyreltilir. Bu zelti kullanmadan nce taze olarak hazrlanmaldr.
Hazrlama srasnda dorudan gne ndan korunmaldr.
3.18. Asetik asit
3.19. 1,1,1-trikloro-2-metil-2-propanol
3.20. Etanolamin w (a/a) > % 98
3.21. 100 ml metanol (3.8) iinde 1 g 1,1,1-trikloro-2-metil-2-propanol (3.19) zeltisi
3.22. HPLC iin mobil faz: 3,00 g asetik asit (3.18) + 900 ml su (3.1) + metanol (3.8) iinde 50,0 ml 1,1,1-
trikloro-2-metil-2-propanol (3.19) zeltisi (3.21) (1g/100ml). Etanolamin (3.20) kullanarak pH 5,00a
ayarlanr. Su ile 1000 mlye tamamlanr (3.1)
4. Cihaz
4.1. Spektroflorometrik detektrl HPLC ekipman
4.2. Sv kromatografik kolon, 125 mm x 4 mm, C18, 3 m dolgu ya da edeeri
4.3. pH metre
4.4. Polipropilen erlen, 125 ml kapasiteli, geni boyunlu ve vidal kapakl
4.5. Membran filtre, 0,45 m
4.6. Otoklav, 110 ( 2)C, 1,4 ( 0,1) bar
4.7. Mekanik alkalayc ya da manyetik kartrc
4.8. Vorteks kartrc
5. Metot
5.1. Numunelerin hazrlanmas
-
36
Numune 0,5 mm elekten geecek ekilde tlr. Nem ierii yksek numuneler en fazla 50C scaklkta hava
kurutulmal etvde ya da tlmeden nce dondurularak kurutulmaldr. Yksek ya ierikli numuneler
tlmeden nce petrol eteri (3.9) ile ekstrakte edilecektir.
5.2. Serbest triptofan tayini (ekstrakt)
Hazrlanm numuneden (5.1) uygun bir miktar (1-5 g) 1 mg hassasiyetle erlene tartlr. 100,0 ml hidroklorik asit
(3.13) ve 5,00 ml konsantre i standart zelti (3.16) eklenir. Mekanik bir alkalayc ya da manyetik bir
kartrc (4.7) kullanarak 60 dakika boyunca alkalanr ya da kartrlr. keltinin kmesi beklenir ve 10,0
mllik spernatant zelti pipetle bir behere alnr. 5 ml orto-fosforik asit (3.14) eklenir. Soydum hidroksit (3.10)
kullanarak pH 3e ayarlanr. Nihai hacimde % 10 ila % 30 arasnda bir metanol konsantrasyonu elde etmek iin
yeteri kadar metanol (3.8) eklenir. Uygun hacimdeki bir balon jojeye aktarlr ve su ile kromatografi iin gereken
bir hacme seyreltilir (Yaklak olarak kalibrasyon standart zeltisiyle (3.17) ayn hacimde).
HPLC kolonuna enjeksiyondan nce 0,45 mlik bir membran filtresinden (4.5) birka ml zelti szlr. 5.4.e
uygun ekilde kromatografi ileme devam edilir.
Standart zelti ve ekstraktlar dorudan gne ndan korunur. Ekstraktlarn ayn gn analizi mmkn deilse,
ekstraktlar 5Cde en fazla 3 gn saklanabilir.
5.3. Toplam triptofan tayini (hidrolizat)
Hazrlanm numuneden (5.1) 0,1 ila 1 g 0,2 mg hassasiyetle polipropilen malzemeye (4.4) tartlr. Tartlan
numune ksmnda yaklak 10 mg azot ierii olmaldr. 8,4 g baryum hidroksit okta-hidrat (3.4) ve 10 ml su
eklenir. Bir vorteks kartrcda (4.8) ya da mekanik kartrcda (4.7) kartrlr. Teflon kaplanm mknats
karm iinde braklr. Kabn duvarlar 4 ml su ile ykanr. Vidal kapa taklr ve balon joje geveke kapatlr.
Kaynayan su ieren bir otoklava (4.6) aktarlr ve 30-60 dakika buhar verilir. Otoklav kapatlr ve 110 ( 2)Cde
20 saat boyunca otoklavlanr.
Otoklav amadan nce scakl 100Cnin biraz altna drlr. Ba(OH)2 8 H2O kristallemesini nlemek
iin scak karma oda scaklnda 30 ml su eklenir. Yavaa alkalanr ya da kartrlr. 2,00 ml konsantre i
standart (-metil-triptofan) zeltisi (3.16) eklenir. Kaplar su/buz banyosunda 15 dakika soutulur.
Ardndan 5 ml orto-fosforik asit (3.14) eklenir. Kap soutucu banyoda tutulur ve HCl (3.11) ile ntrletirilir, bu
srada kartrlr ve HCl (3.12) kullanlarak pH 3,0e ayarlanr. Nihai hacimde % 10 ila % 30 arasnda bir
metanol konsantrasyonu elde etmek iin yeteri kadar metanol eklenir. Uygun hacimdeki bir balon jojeye aktarlr
ve su ile kromatografi iin gereken tanmlanm hacme (rnein 100 ml) seyreltilir. Metanoln eklenmesi
keltiye neden olmayacaktr.
HPLC kolonuna enjeksiyondan nce birka ml zelti 0,45 mlik bir membran filtresinden (4.5) szlr. 5.4e
uygun ekilde kromatografi admna geilir.
Standart zelti ve hidrolizatlar dorudan gne ndan korunur. Hidrolizatlarn ayn gn analizi mmkn
deilse, 5Cde en fazla 3 gn saklanabilirler.
5.4. HPLC tayini
Aadaki izokratik elsyon koullar rehber olarak sunulmutur; edeer sonular vermeleri kaydyla baka
koullar da kullanlabilir (baknz gzlemler 9.1 ve 9.2):
-
37
6. Sonularn hesaplanmas
100g numune bana g cinsinden triptofan miktar (X) aadaki gibi hesaplanr:
X = (A x B x V1 x c x V2 x M) / (C x D x V3 x 10 000 x m)
A = standardn pik alan, kalibrasyon standard zeltisi (3.17)
B = Triptofan pik alan, ekstrakt (5.2) ya da hidrolizat (5.3)
V1 = Kalibrasyon zeltisine (3.17) eklenen konsantre triptofan zeltisinin (3.15) ml cinsinden hacmi (2 ml)
c = Kalibrasyon zeltisine (3.17) eklenen konsantre triptofan zeltisinin (3.15) mol/ml cinsinden
konsantrasyonu (= 2,50)
V2 = Ekstraksiyonda (= 5,00 ml) (5.2) hacmi ya da hidrolizata (= 2,00 ml) (5.3) eklenen konsantre i standart
zeltisinin (3.16) ml cinsinden
C = standardn pik alan, ekstrakt (5.2) ya da hidrolizat (5.3)
D = Triptofann pik alan, kalibrasyon standard zeltisi (3.17)
V3 = Kalibrasyon standart zeltisine (3.17) eklenen konsantre i standard zeltisinin (3.16) ml cinsinden
hacmi (= 2,00 ml)
m = g Cinsinden numune arl (kurutulmu ve/veya ya alnmsa orijinal arla gre dzeltilmi)
M = Triptofann mol arl (= 204,23 g/mol)
7.