Einsatz in optischen Sensoren Absorptionsbanden im nahen … · 2020. 3. 26. · den...
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Research Collection
Doctoral Thesis
Bestimmung von Elektrolyten im Blutplasma mit chemischenSensoren und die Verarbeitung der Rohdaten und Farbstoffe mitAbsorptionsbanden im nahen Infrarot-Spektralbereich für denEinsatz in optischen Sensoren
Author(s): Citterio, Daniel
Publication Date: 1998
Permanent Link: https://doi.org/10.3929/ethz-a-001890759
Rights / License: In Copyright - Non-Commercial Use Permitted
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ETH Library
Diss ETH Nr 12503
Bestimmung von Elektrolyten in Blutplasma mit chemischen
Sensoren und die Verarbeitung der Rohdaten
und
Farbstoffe mit Absorptionsbanden im nahen Infrarot-
Spektralbereich für den Einsatz in optischen Sensoren
ABHANDLUNG
zur Erlangung des Titels
DOKTOR DER NATURWISSENSCHAFTEN
der
EIDGENOSSISCHEN TECHNISCHEN HOCHSCHULE ZÜRICH
vorgelegt von
Daniel Citteno
Dipl Chem ETH
geboren am 17 Dezember 1967
von Zürich (ZH)
Angenommen auf Antrag von
Prof Dr G Folkers, Reierent
PD Dr U E Spichiger, Korreferentin
Prof Dr U P Wild, Korreferent
Zürich 1998
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Für meine lieben Eltern
und
meine Freunde
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Prot Dr G Folkers danke ich für die Möglichkeit, die Promotionsarbeit
in seiner Gruppe durchfuhren zu dürfen Besonders danke ich PD Dr
U E Spichiger, die es verstand, meine Arbeit durch zahlreiche anregende
Diskussionen zu leiten Auch danke ich ihr für den unermüdlichen Einsatz
zur Sicherstellung der finanziellen Unterstützung Ich danke Prof Dr U
Wild lur die Übernahme des Korreferats
Grosser Dank gebührt Prof Dr DJ Vonderschmitt, Dr P Pei und
seinem Team vom Institut für klinische Chemie am Universitatsspital
Zürich sowie Remo Wild für die Unterstützung wahrend des klinischen
Teils dieser Arbeit
Der Optik-Gruppe am Paul-Schener-Institut Zürich, besonders Dr R E
Kunz, Dr H P Zappe und Bernd Maisenholder bin ich zu grossem Dank
für die Ratschlage in physikalischen Belangen und Messungen verpflichtet
Prof Dr G Patonay (Atlanta), Prof Dr O S Wolfbeis (Regensburg)
und Dr Gerhard Mohr (Graz) danke ich für die zur Verfugung gestellten
Farbstoffproben
Den Laborkollegen Dr Stefan Räsonyi und Dr Luzi Jenny bin ich für
ihre Unterstützung oder Durchfuhrung der Synthese- und Strukturaufkla-
rungsarbeiten äusserst dankbar Für die statistische Beratung danke ich
den Mitdoktoranden Caspar Demuth, Alphons Fakler und Mathias Nagele
sowie Dr W Stahel vom Seminar für Statistik der ETH Für die sorgfal¬
tige Durchsicht des vorliegenden Texts danke ich Caspar Demuth und
Thomas Roth, der mich auch bei Computerproblemen tatkraftig unter¬
stutzte
Zum Schluss mochte ich allen heutigen und ehemaligen Gruppenmitghe-
dern für das offene und kameradschaftliche Klima in unserer Forschungs¬
gruppe danken, das das Arbeiten auch in schwierigen Phasen zu einer
grossen Freude machte
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Die folgenden Publikationen wurden wahrend dieser Arbeit verfasst
D Freiner, R E Kunz, D Citteno, U E Spichiger, M T Gale Integrated
optical sensors based on refractometry of wn selective membranes, Sens
Actuators B, 29, 277-285 (1995)
U E Spichiger, D Citteno, M Bott Analyte-selective membranes and
optical evaluatwn techniques Characterizatwn of response behavwur by
ATR measurements, Proc SPIE, 2508, 179-189 (1995)
D Citteno, S Räsonyi, U E Spichiger Development of new dyes for use
in integrated optical sensors, Fresenius J Anal Chem, 354, 836-840
(1996)
R Wild, D Citteno, J Spichiger, U E Spichiger Continuous momtonng
of ethanol for bioprocess control by a chemical sensor, Journal of
Biotechnology, 50, 37-46 (1996)
D Citteno, L Jenny, S Räsonyi, U E Spichiger Dyes for use in
integrated optical sensors, Sens Actuators B, 39, 202-206 (1997)
G J Mohr, D Citteno, U E Spichiger Synthesis of novel chromogenic
hgandsfor optical sensing of ethanol, eingereicht zur Publikation (1997)
D Citteno, M Nagele, W Stahel, P Pei, D J Vonderschmitt, U E
Spichiger Determination of the mass concentratwn of water, wmc
strength and single-ion activity coefficients in blood plasma of individual
specimens, in Vorbereitung (1997)
L Jenny, D Citteno, U E Spichiger Reduced dicyanovinyl dyes, in
Vorbereitung (1998)
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
1. ZUSAMMENFASSUNG 13
2. SUMMARY 15
3. EINFUHRUNG 17
4. CHEMISCHE SENSOREN IN DER MEDIZINISCHEN
ANALYTIK 23
5. GRUNDLAGEN DER FUNKTIONSWEISE CHEMISCHER
SENSOREN 27
5 1 Ionenselektive Elektroden 27
5 2 Ionenselektive Optoden 32
6. KLINISCHE IONENANALYTIK MIT CHEMISCHEN
SENSOREN 39
6 1 Einfuhrung in die Problemstellung 39
6 2 Menschliches Blut als Probenmatrix Fraktionierung 40
6 3 Abschätzung der Massenkonzentration von Wasser in Plasma 43
6 4 Abschätzung der Etnzehonen-Aktivitatskoeffizienten in Plasma 45
6 4 1 Das erweiterte Debye-Huckel-Modell 46
6 4 2 Stokes-Robinson-Hydratationstheone 48
6 4 3 Das Pitzer-Modell 49
6 4 4 Vergleich von Aküvitatskoeffizienten im physiologischenBereich 52
6 5 Aktivitäten versus Konzentrationen 54
6 6 Umrechnung von Ionenaktivitaten in Ionenkonzentrationen 57
6 6 1 Individuelle und mittlere Massenkonzentration von Wasser 62
6 6 2 Individuelle und mittlere molale Ionenstarke 64
6 6 3 Individuelle und mittlere molale Einzehonen-
Aktivitatskoeffizienten 66
6 6 4 Komplexierung von zweiwertigen Kationen 70
10 INHALTSVERZEICHNIS
6 6 5 Transformation von aktiven Molahtaten in freie
(molare) Ionenkonzentrationen 73
6 7 Kalibration chemischer Sensoren für physiologische Proben 82
6 8 Abschätzung der Massenkonzentration von Wasser durch Vergleichvon Ionenaktivitaten und Ionenkonzentrationen 84
6 9 Probenbedingte Variationen des Flussigkeitspotentials einer
ISE-Messkette 95
6 10 Direktmessungen mit optischen Sensoren 99
6 10 1 Einfluss des pH-Wertes auf die Messung mit optischenSensoren 99
6 10 2 Vorversuche zur Messung der freien Ionenkonzentration
in Vollblut 103
6 11 Schlussfolgerungen 105
OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON
NIR-FARBSTOFFEN 109
7 1 Einfuhrung in die Problemstellung 109
7 2 Optische Eigenschaften von Molekülen 111
7 3 Chromoionophore für Optodenmembranen 114
7 4 NIR absorbierende Farbstoffe 119
7 4 1 Allgemeines 119
7 4 2 Polymethin-Farbstoffe 120
7 5 Cyanine und Streptocyanine als Chromoionophore 124
7 5 1 Ausgangslage 124
7 5 2 Stabilität der Farbstoffe 127
7 5 3 Geeignete Membranmedien 129
754 pH-empfindliche Optoden basierend auf Nafion-Membranen 130
7 5 5 Optoden basierend auf PVC-Membranen 136
7 5 6 Schlussfolgerungen 138
INHALTSVERZEICHNIS 11
7 6 Merocyanine als Chromoionophore 140
7 6 1 Ausgangslage 140
7 6 2 pH empfindliche Optoden basierend aufweichgemachten PVCMembranen 143
7 6 3 Ca +-selektive Optode für den Einsatz im NIR Spektralbereich 151
7 64 Schlussfolgerungen 157
7 7 Reduzierte Dicyanovinyl Farbstoffe 158
7 7 1 Ausgangslage 158
7 7 2 pH empfindliche Optoden basierend aufweichgemachten PVC-Membranen 165
77 3 Ca'-selektive Optode für den Einsatz im NIR-Spektralbereich 177
7 7 4 Schlussfolgerungen 181
7 8 Das miniaturisierte Mach Zehnder-Interferometer 182
8. AUSBLICK 187
9. EXPERIMENTELLER TEIL 189
9 1 Klinische Untersuchungen 189
9 1 1 Probanden 189
9 1 2 Probenahme 189
9 1 3 Verwendete Gerate und Methoden 190
9 1 4 Kahbrationsmethoden 192
9 1 5 Qualitätskontrolle 192
9 2 Zusammensetzung und Herstellung von Optodenmembranen 193
9 2 1 Optodenmembranen basierend auf PVC und OH-PVC 193
9 2 2 Optodenmembranen aus Nafion 194
9 3 Messlosungen und Kahbratoren 195
9 4 Messgerate 196
9 5 Computersoftware und -hardware 196
9 6 Verwendete Abkürzungen 197
12 INHALTSVERZEICHNIS
10. LITERATUR 201
Anhang 1 219
Anhang 2 225
Lebenslauf 235
13
1. Zusammenfassung
Der erste Teil dieser Arbeit beschreibt die Rahmenbedingungen für
den Einsatz von chemischen Sensoren für die Bestimmung von Elektro¬
lyten (Na+, K+, Ca1+, Mg1+) in Blutproben Die Resultate von direkten
Messungen in unverdünnten Specimen wurden mit denjenigen von in¬
direkten Messungen in verdünnten Proben verglichen Das Probanden¬
kollektiv (n=82) setzte sich aus "Gesunden", sowie aus Hamodialysepati-
enten und Patienten der Intensivstation für innere Medizin zusammen Das
Ziel der Studie war es, den Einfluss von Variationen der Massenkonzen¬
tration von Wasser, der Ionenstarke, der Einzehonen-Aktivitatskoeffizi-
enten und dem Komplexierungsgrad auf die Interpretation von Rohdaten
zu untersuchen Diese Parameter sind verantwortlich für Differenzen zwi¬
schen den Resultaten aus indirekter und direkter Messung mit chemischen
Sensoren Die IFCC (International Federation of Clinical Chemistry)
empfiehlt einen Algorithmus, um Ergebnisse aus direkten ISE-Messungen
(lonenselektive Elektroden) rechnerisch in Gesamtkonzentrationen, äqui¬
valent zu Messwerten aus der indirekten Bestimmung, umzuwandeln Die
Fehler, die durch die Anwendung dieses Algorithmus entstehen, wurden
untersucht und diskutiert Für Na+- und K+-ISE-Messungen traten bei
17% und bei Ca2+- und Mg1+-Analysen bei 37% der untersuchten Pati¬
entenproben Abweichungen vom "wahren" Wert von mehr als 0 5% auf
Die Fehler rührten hauptsächlich von den interindividuellen Variationen
der Massenkonzentration von Wasser her, die im IFCC-Algorithmus nicht
berücksichtigt werden Die Datentransformation basierend auf diesem Al¬
gorithmus ist nicht nur gefahrlich in Bezug auf Fehlinterpretationen,
sondern kann auch zum Verlust von wertvollen Informationen aus dem
Sensor-Rohsignal fuhren Zusätzliche Information, die Rückschlüsse auf
die nicht direkt messbare Massenkonzentration von Wasser erlaubt,
konnte aus dem Vergleich von direkter und indirekter Elektrolytmessung
insbesondere von Natriumionen gewonnen werden
14 ZUSAMMENFASSUNG
Im zweiten Ted der Arbeit ging es darum, pH-Indikatoren, die sich
für den Einsatz als Chromoionophore in monolithisch-integrierten opti¬
schen Sensorsystemen eignen, zu entwickeln Das Ziel war es, die hohe
Effizienz der Messplattform im roten und im nahen infraroten (NIR)
Spektralbereich sowie billig verfugbare Laserdioden als Lichtquellen nut
zen zu können Dies bedingte die optische Empfindlichkeit der Chromo¬
ionophore im NIR-Bereich Die kationischen Cyanin- und Streptocyanin-
Farbstotfe zeigten Probleme in der Kombination mit den zur Verfügung
stehenden neutralen, hpophilen Ionophoren in apolaren Membranmedien
pH-empfindliche NIR-Optoden mit dem polaren lonentauscherpolymer
Nafion als Membranmatrix wurden realisiert Neutrale oder zwittenoni-
sche Merocyanine mit Absorptionsmaxima im Bereich von 800 nm führ¬
ten zu pH-empfindlichen NIR-Optoden auf der Basis von weichgemachten
PVC-Membranen In Kombination mit dem Ionophor ETH 1001 war es
möglich, eine Ca2+-selektive Optode herzustellen, die bei pH 4 8 einen dy¬
namischen Messbereich von 10 'bis 10s
mol L' Ca2+ zeigte
Reduzierte Dicyanovinyl-Farbstoffe (ETHT 5003-5009), eine Klasse neu¬
artiger, neutraler Indikatoren, wurden isoliert und in weichgemachten
PVC-Membransystemen charakterisiert Diese Chromoionophore zeich¬
neten sich in der Optodenmembran durch eine ausserordentlich hohe
chemische Stabilität gegenüber stark sauren oder stark alkalischen Medien
sowie durch gute Loslichkeit aus Im deprotonierten, anionischen Zustand
wurden breite Absorptionsbanden (emax 7000-12000 L mol' cm"1) beob¬
achtet, deren Maxima in Abhängigkeit von Substituenten zwischen 600
und 760 nm lagen und die bis in den NIR-Bereich reichten Chemische
Modifikationen zur Erhöhung der Aciditat der Indikatoren wurden vorge¬
nommen Die pKa-Werte in der Membranphase lagen alle oberhalb von
7 0 und waren teilweise hoher als 14 0, was eine genaue Bestimmung ver-
unmoghchte Eine Ca2+-selektive Optode, die bei pH 2 7 einen dynami¬
schen Messbereich von 10"' bis 10"6 mol L"1 Ca2+ zeigte, wurde realisiert
15
2. Summary
The hrst part ol the present work describes the conditions met
when using chemical sensors to determine electrolytes in blood samples
The results trom direct measurements in the undduted specimen were
compared to the results from indirect measurements in diluted samples
Electrolytes were analyzed in blood plasma samples from 82 volunteers
The volunteers included "healthy" individuals as well as hospitahzed
patients who were either from the intensive care unit or undergoing
haemodialysis The aim of the study was to investigate the influence of
vanations in the mass concentration of water, lonic strength, single-ion
activity coefficients and degree of complexation on the Interpretation of
raw data These parameters may explain the differences between the re¬
sults obtained from indirect and direct measurements The IFCC (Inter¬
national Federation of Chnical Chemistry) recommends an algonthm in
order to transform the results from direct ISE (ton-selective electrodes)
methods into total substance concentrations, corresponding to results from
indirect ISE methods Errors resulting from the application of the algo¬
nthm were examined and discussed It was found that, when this algo¬
nthm was applied to the results of direct ISE-analysis, deviations from the
"true" values of more than 0 5% occurred in 17% of the samples in which
Na+- and K+-ions were determined and in 37% of those tested for Ca2+-
and Mg,+-ions These errors were mainly due to individual differences in
the mass concentration of water, which are not taken into consideration in
the IFCC-algonthm It was concluded that the transformation procedure
based on this algonthm is not only dangerous with regard to possible mis-
mterpretations, but may also lead to the loss of important Information in¬
cluded in the "raw" sensor Signal Additional Information could be gained
by companng direct and indirect electrolyte measurements, which
allowed to estimate the mass concentration of water not directly accessible
by other methods This method worked best with sodium 10ns
16 SUMMARY
The aim of the second part of this work was to develop pH
indicators suitable lor use as chromoionophores in monolithically
integrated optical sensing Systems In order to be able to use the high
efticiency of the measunng plattorm and low-cost diode lasers as light
sources, the indicators had to be optically sensitive in the near-intrared
(NIR) spectral ränge In a tirst step, known polymethine dyes were
studied With cyanine and streptocyanine dyes, there were problems com
bintng cationic chromoionophores with neutral hpophilic lonophores in
apolar membrane media pH sensitive NIR-optodes, based on the polar
lon-exchanger polymer Nafion where therelore developed The
application of electncally neutral or zwittenonic merocyamnes allowed
pH sensitive NIR-optodes to be produced in plasticized poly(vinyl
chlonde) membranes (PVC) In combination with the Ca"+-selective
lonophore ETH 1001, a Ca+ selective NIR-optode with a dynamic
measunng ränge from 10'to 10
^
mol L' Ca,+ at pH 4 8 was developed
Reduced dicyanovinyl dyes (ETHT 5003 5009), a new cluss of neutral
indicators were isolated and analyzed in plasticized PVC membranes
These chromoionophores were extremely stable in both strongly acidic
and strongly basic media as well as easily soluble In the deprotonated,
anionic State, broad absorption bands (emax 7000 12000 L mol'cm ') with
maxima in the ränge between 600 and 760 nm and reaching into the NIR
spectral ränge were observed The spectral properties were dependent on
the side-chain residues The indicators were chemically modified to in
crease their acidity The pKa values in the membrane phase were higher
than 7 0 in all cases and higher then 14 0 for some dyes, making it lm-
possible to determine an exact value A Ca'+-selective NIR-optode with a
dynamic measunng ränge between 10'and 10
6mol L
' Ca,+ at pH 2 7
was developed
17
3. Einführung
Ein Sensor ist ein abgegrenztes, miniaturisiertes Messsystem, das
eine physikalische oder chemische Eigenschaft des zu vermessenden
Mediums kontinuierlich in elektrische oder andere von einem Datenver¬
arbeitungssystem auswertbare Informationen, z B Lichtsignale, umwan¬
delt [1 2] Ein chemischer Sensor im speziellen ist ein Analyseinstrument,
das in der Lage ist, Informationen über die chemischen Eigenschaften des
den Sensor umgebenden Mediums zu liefern Die chemischen Parameter
werden dabei in einer Probe selektiv, reversibel und kontinuierlich
erfasst Reversibilität äussert sich in diesem Fall dann, dass Konzentra¬
tionsanderungen des Analyten nach oben und nach unten gemessen werden
können und dass die Fähigkeit zur Signalerfassung nicht verloren geht
Unter diese Definition fallen auch die Biosensoren, die sich dadurch
abgrenzen, dass die Signalerkennung durch Enzyme oder Rezeptoren
erfolgt Im Idealfall erfordert der Einsatz eines chemischen Sensors keine
Probenvorbereitung und das erhaltene Messresultat hangt einzig von der
zu bestimmenden Grosse ab Diese Tatsache macht den chemischen Sensor
zum geeigneten Instrument für eine grosse Vielfalt von Anwendungen
Vereinzelt werden auch analytische Werkzeuge, die einen chemischen
Parameter zwar selektiv, aber irreversibel und daher nicht kontinuierlich
erfassen können, den chemischen Sensoren zugerechnet In diese Klasse
fallen zum Beispiel die meist irreversibel arbeitenden "Immunosensoren",
die eigentlich keine echten Sensoren sind, da die Regenerierung der Anti-
korper in der Regel nur durch Waschvorgange erreicht werden kann
Streng genommen sind diese vielmehr als sogenannte "Probes" zu be¬
zeichnen Auch Teststreifen zum Einweggebrauch oder Testrohrchen
werden oft unberechtigterweise zu den chemischen Sensoren gezahlt
Nicht immer ist es möglich, eine klare Grenze zwischen chemischen und
physikalischen Sensoren zu ziehen Grundsätzlich kann der chemische
18 EINFUHRUNG
Sensor auch als Erweiterung eines physikalischen Sensors betrachtet
werden Schliesslich muss ein chemisches Signal in ein elektronisch mess¬
bares Signal umgewandelt werden, um eine chemische Grosse quantitativ
erfassen zu können Die Messung des generierten elektronischen Signals
erfolgt dann in der Regel mittels eines physikalischen Sensors Dieser, als
Signaltransduktion bezeichnete Vorgang, kann auf vielfaltige Art und
Weise erfolgen Die am häufigsten angewandten Methoden sind die
elektrische, die optische und die mechanische Transduktion über
Beobachtung von Massenanderungen Bei der optischen Transduktion
wird das chemische Signal in einem ersten Schritt in ein optisches Signal
umgewandelt Je nach Auslegung des Signalwandlers wird dann das
optische Signal in einem zweiten Schritt als Absorption, Emission,
optische Dispersion oder Reflexion gemessen, um nur einige Beispiele zu
nennen
Die Einfachheit der Handhabung chemischer Sensorsysteme, die relativ
geringe Grosse und die Unabhängigkeit von Reagenzien ermöglichen eine
rasche, mobile Analyse direkt vor Ort [3] Fernüberwachung gestattet den
Einsatz in gefährdeten Bereichen oder eine kontinuierliche Überwachung
auch über grossere Distanzen Auch in Fallen, in denen eine sehr rasche
Entscheidung notwendig sein kann, wie zum Beispiel in der klinisch-medi-
zinischen Analytik, kommen häufig chemische Sensoren zum Einsatz Die
klinische Chemie ist einer der Bereiche, in dem die chemische Sensor¬
technik schon am tiefsten verwurzelt ist und am häufigsten eingesetzt wird
[4] Sei es, dass chemische Sensorelemente als Bestandteile automatisierter
Laborsysteme dienen (Messung von Blutelektrolyten) oder dass sie für die
direkte Überwachung von Notfallpatienten auf der Intensivstation von
Krankenhausern verwendet werden (Elektrolyte, pO,, pC02, pH)
Der Einsatz chemischer Sensoren in der Mess- und Regeltechnik nimmt an
Bedeutung zu [5, 6] Die Prozesskontrolle und -Steuerung durch die
Kopplung eines Sensors an Dosierpumpen, Forderanlagen und Heizvor¬
richtungen in der industriellen Produktion ist zum Forschungsgegenstand
EINFUHRUNG 19
auf dem Gebiet der Sensonk geworden [7] Chemische Sensoren können
auch als Bestandteile von Warngeraten zum Einsatz kommen In diesem
Fall steht nicht eine genaue Erfassung einer Analytkonzentration im
Vordergrund sondern die Überwachung eines Grenzwertes Wird dieser
überschritten, so muss ein Alarm ausgelost werden In die gleiche
Richtung geht auch die Verwendung von chemischen Sensoren für ein
vorgangiges Screening bei sehr hoher Anzahl anfallender Proben in einem
analytischen Laboratorium In diesem Fall werden nur diejenigen Proben
der detaillierten Laboranalyse zugeführt, deren Konzentration zuvor bei
einer Messung mit einem Sensor einen kritischen Schwellenwert
überschritten hat Dadurch wird ein grosser Anteil von garantiert
negativen (true negative) Proben aussortiert Dies kann zu einer
erheblichen Arbeitsentlastung eines Labors fuhren und dadurch
garantieren, dass wirklich problematische Proben rascher erkannt werden
und deshalb notwendige Gegenmassnahmen früher getroffen werden
können
Für die Evaluation der Qualltat eines chemischen Sensors sind gewisse
Kenngrossen entscheidend Als wichtigste sind hier die Selektivität, die
Sensitivitat, die Ansprechgeschwindigkeit und die Lebensdauer zu nennen
Auf jeden Fall muss ein Sensor immer auf die bevorstehende Applikation
hin ausgewählt und nötigenfalls angepasst werden Wahrend in gewissen
Fallen beispielsweise eine hohe Lebensdauer wichtiger als eine hohe An
Sprechgeschwindigkeit ist, kann es sich für eine andere Anwendung
gerade umgekehrt verhalten Den Allzweck-Sensor für jede beliebige
Anwendung wird es nicht geben, denn dies wäre kein optimierter Sensor
Obwohl auf dem Gebiet der chemischen Sensoren schon seit Jahrzehnten
intensiv gearbeitet wird, bleibt dieser Themenkreis für die wissen¬
schaftliche Forschung von grossem Interesse Die Forschung auf dem
Gebiet der chemischen Sensoren lasst sich heute vereinfacht in zwei
Sektoren einteilen Zum einen sind immer noch grosse Anstrengungen
20 EINFUHRUNG
notwendig und auch im Gange, um neue, selektive Erkennungskompo¬
nenten für weitere Analyte zu entwickeln Zum anderen wird versucht,
den im Laborsystem unter genau definierten Bedingungen bereits funktio¬
nierenden Sensor durch Anpassung an neue Messtechniken und an reale
Gegebenheiten zur Marktreife zu bringen Dass kommerzialisierte che¬
mische Sensorsysteme auf dem Markt durchaus gute Chancen haben, kann
aus den Zahlen in den Tabellen 3 la und 3 lb entnommen werden, die auf
Daten aus dem Jahr 1994 beruhen Über einen Zeitraum von 10 Jahren
wird für die chemischen Sensoren ohne Einbezug der Biosensoren weit
weit eine Marktsteigerung um einen Faktor 2 bis 3 prognostiziert Für die
Biosensoren wird sogar eine Zunahme um einen Faktor 3 bis 4 voraus
gesagt
Tabelle 3 1 (a) Gegenwartiger und projektierter Weltmarkt für che¬
mische Sensoren (ohne Biosensoren) und (b) für Biosensoren (in Milli¬
onen US-Dollar) [8]
3 la
Marktsegment 1994 1999a 2004" Zuwachsb(%)
Biomedizin 200 310 520 8-12
Umwelt-/Arbeitsplatzuberwachung 250 420 760 10-14
Industrieproduktion 50 70 100 6-8
Total 500 800 1380 9-11
EINFUHRUNG 21
3 lb
Marktsegment 1994 1999J 2004a Zuwachsb(%)
Medi/in / Klinik 220 440 950 14 16
Industrieproduktion 75 120 250 10 12
Militär / Verteidigung 65 95 150 7-9
Umweltuberwachung 25 40 75 10-12
Landwirtschaft / Vetennarwesen 10 15 35 10-15
Andere 5 10 20 9-12
Total 400 720 1480 10-15
a
Projektiert im Jahr 1994 in US$, beinhaltet sowohl Verkauf, wie auch
Vertrage in Forschung und Entwicklungb
Durchschnittliche, jährliche Wachstumsrate
Leider muss man aber feststellen, dass der Forschungssektor, der steh mit
der messtechnischen Weiterentwicklung chemischer Sensoren befasst oft
unterschätzt und dadurch vernachlässigt wird Anders hesse sich die doch
recht beachtliche Diskrepanz zwischen der grossen Anzahl Veröffent¬
lichungen auf dem Gebiet der Liganden- und Sensorentwicklung und der
kleinen Anzahl der auf den Markt gebrachten chemischen Sensoren nicht
erklaren Gerade bei den optischen Sensoren gibt es bis heute nur sehr
wenige Gerate, die bereits im Handel erhaltlich sind, obwohl standig neue
Publikationen zu diesem Thema abgedruckt werden Um den optischen
Sensoren zu einem Durchbruch zu verhelfen, sollte vermehrt die Nutzung
der modernen, physikalischen, optischen Messtechnik in die Sensor¬
entwicklung einbezogen werden Dazu ist interdisziplinäre Zusammen¬
arbeit notwendig Nur so lasst sich verhindern, dass die Entwicklung der
optischen Sensoren immer hinter der neuesten Technologie zurückbleibt
22 EINFUHRUNG
Diese Dissertationsarbeit wurde zu einem grossen Teil im Rahmen des
nationalen Forschungsprogramms "OPTIQUE" (Projekt Nr 512)
durchgeführt [9] Einerseits ging es darum, schon vorhandene Prinzipien
auf dem Gebiet der chemischen Sensoren für die Anwendung in klinischen
Blutproben zu untersuchen und im zweiten Ted dann schliesslich an die
neuesten Entwicklungen im Bereich der optischen Messtechnik anzu-
passen, um dadurch einen Beitrag zu einer möglichen Kommer¬
zialisierung zu liefern Diese Arbeit ist also eher dem zweiten der oben
genannten Forschungsschwerpunkte zuzuordnen
23
4. Chemische Sensoren in der medizinischen Analytik
Der klinisch-medizinische Bereich gehört zu den ersten Anwen¬
dungsgebieten der chemischen Sensonk Bereits im Jahre 1970 wurden
lonenselektive Elektroden für die Elektrolytbestimmung in physiolo¬
gischen Proben eingesetzt [10] Heute sind sie aus den Labors nicht mehr
wegzudenken Immunologische und enzymatische Testverfahren, obwohl
keine Sensoren im engeren Sinne, sind sehr stark verbreitet und kommen
zur Hauptsache bei der Bestimmung biologischer Substrate zum Einsatz
Im Bereich der optischen Sensoren allerdings, sind bis heute nur in Aus¬
nahmefallen kommerziell erhältliche Gerate im klinischen Labor im Ein¬
satz Dies erstaunt um so mehr, als Farbreaktionen, oft gekoppelt mit en-
zymatischer Umsetzung eines Analyten, zu den meistverwendeten Bestim¬
mungsmethoden für klinische Analyte gehören und dadurch die optische
Spektroskopie eine bekannte Methode in der klinischen Chemie darstellt
Eine Erklärung mag mitunter der allgemeine Ruckstand der optischen
Sensoren gegenüber den elektrochemischen Sensoren im Hinblick auf die
Kommerzialisierung sein
Besonders in grossen Spitalern werden heute sehr hohe Anforderungen an
die medizinische Analytik gestellt Dies kann man beispielsweise aus
Zahlen entnehmen, welche im Jahresbericht 1996 des Umversitatsspital
Zürich veröffentlicht wurden [11] Die grosse Zahl der Laborauftrage
verlangt weitgehend automatisierte und sehr rasche Methoden In Tabelle
4 1 wird eine Übersicht über die zehn häufigsten, im Jahre 1996 im
Umversitatsspital Zürich geleisteten Analysen gegeben
Chemische Sensoren sind in der Regel nicht dazu gedacht und geeignet,
das klinische Grosslabor mit automatisierten Analysesystemen zu
ersetzten, jedoch aber sinnvoll zu erganzen Zum Teil sind chemische
Sensoren auch als Bestandteile von Laborautomaten im Einsatz Die in
24 CHEMISCHE SENSOREN IN DER MEDIZINISCHEN ANALYTIK
Tabelle 4 1 genannten Beispiele von Referenzen zeigen auf, dass für die
Hälfte der am häufigsten verlangten Analyseparameter chemische
Sensoren bereits heute zur Verfugung stehen und eingesetzt werden oder
in der Entwicklung schon fortgeschritten sind Gerade für Notfall-
stationen, periphere Spitalabteilungen oder Arztpraxen konnte also der
rasch zur Verfugung stehende und einfach handhabbare Sensor eine wün¬
schenswerte Alternative zum klinischen Zentrallabor darstellen Auch im
Hinblick auf die kontinuierliche Zustandsuberwachung von Patienten in
kritischen Situationen [12] bis hin zur m-vivo Überwachung eines Ana-
lyten bietet der Sensor Möglichkeiten, welche die Laboranalytik nicht aul¬
weist Dies mögen bestimmt mit Grunde sein, weshalb in Tabelle 3 1 der
medizinische Bereich stets an erster Stelle bei den projektierten Umsätzen
auf dem Weltmarkt steht
Der Einsatz von chemischen Sensoren im medizinischen Bereich bietet
sich aber nicht nur für stationäre Standorte wie Spitaler und Arztpraxen
an Die Tatsache, dass für viele der in Tabelle 4 1 aufgeführten Analyte
die notfallmassige Analyse sehr häufig angefordert wird (für Kreatinin in
39% aller Falle, für Kalium in 46%, für Harnstoff in 52%) weist darauf
hin, dass mobile Analysegerate für den Notfall- und Katastropheneinsatz
(z B in Ambulanzfahrzeugen) auf dem Markt gute Chancen haben
CHEMISCHE SENSOREN IN DER MEDIZINISCHEN ANALYTIK 25
Tabelle 4 1 Die zehn am häufigsten verlangten Analyseparameter im
klinisch-chemischen Labor des Umversitatsspital Zürich [11] und die an¬
gewandte Methode
Analyt Anzahl
Analysen
(1996)
Methode Sensor"
Kreatinin 124000 Komplexbildung
Optische Detektion
[13, 14]
Kalium 120000 ISE
Flammenphotometne
[15]
C-reaktives Protein 99500 Nephelometrie
Natrium 88800 ISE
Flammenphotometne
[15, 16]
Glucose 79100 Enzymatisch
Optische Detektion
[17]
Alanin-Aminotransferase 78600 Enzymatisch
Aspartat-Aminotransferase 75800 Enzymatisch
Optische Detektion
Prothrombinzeit 65900 Optische Detektion
Alkalische Phosphatase 64500 Enzymatisch
Optische Detektion
Harnstoff 61200 Enzymatisch
Optische Detektion
[18, 19]
a
Ausgewählte Beispiele von Referenzen zu Entwicklungen oder Anwen¬
dungen von chemischen Sensoren auf dem entsprechenden Gebiet
26 CHEMISCHE SENSOREN IN DER MEDIZINISCHEN ANALYTIK
Es stellt sich die Frage, weshalb gerade chemische Sensoren basierend auf
optischer Transduktion für den medizinischen Einsatz entwickelt werden
sollen, obwohl sich die elektrochemischen Analoga schon längere Zeit
bewahrt haben [20, 21] Ein wichtiger Grund ist mit Sicherheit der grosse
technische Fortschritt und das hohe Entwicklungspotential im Bereich dei
optischen Messtechnik Dies fuhrt zu einer Auswahl an hoch¬
empfindlichen, miniaturisierbaren Messplattformen, die den Bedurfnissen
angepasst werden können Ein weiterer Vorzug der optischen Sensoren
hegt in der Vielfalt der möglichen Messtechniken [22] Je nach Aufbau des
Sensorsystems kann die Signaldetektion im Absorptions-, im Fluoreszenz¬
oder im Dispersionsmodus erfolgen (vgl Abschnitte 5 2, 7 2 und 7 8) In
der Regel stehen mehrere der genannten Möglichkeiten simultan zur
Verfugung Neben dem hohen Potential zur Miniaturisierung und zur
kostengünstigen Serienproduktion ist im klinischen Sektor aber auch die
Störanfälligkeit des gemessenen Signals von zentraler Bedeutung Wird
der Sensor im Umfeld elektrischer Gerate oder für den mobilen Einsatz
verwendet, muss für elektrochemische Sensorsysteme gegen die allgegen¬
wärtigen elektrischen Felder abgeschirmt werden, im Gegensatz zu
optischen Systemen Bei invasiven m-vivo Messungen muss zusatzlich die
Sicherheit des Patienten bedacht werden. Auch in diesem Bereich sind
optische Systeme den elektrochemischen vorzuziehen, da kein direkter
elektrischer Kontakt zwischen dem Patienten und dem Messgerat besteht
27
5. Grundlagen der Funktionsweise chemischer Sensoren
Weil in dieser Arbeit hauptsachlich auf dem Gebiet der Elektrolyt-
Analyse gearbeitet wurde, sind in den folgenden zwei Unterkapiteln die
Grundlagen zum Verständnis der Funktionsweise von lonenselektiven
Sensoren zusammengestellt Dabei werden die beiden wichtigsten Kate¬
gorien von Sensoren für die Ionenanalytik behandelt die potentiome-
tnschen Sensoren - lonenselektive Elektroden (ISE) - und die optischen
Sensoren - lonenselektive Optoden In beiden Fallen wird für detail¬
liertere Ausführungen auf die entsprechende Fachliteratur verwiesen und
lediglich auf die für das Verständnis der vorliegenden Arbeit zentralen
Sachverhalte eingegangen
5.1. Ionenselektive Elektroden
Im Falle der lonenselektiven Elektroden (ISE) erfolgt die Trans¬
duktion der chemischen Erkennung über ein Potential Eine lonenselektive
Membranelektroden-Messkette besteht aus zwei galvanischen Halbzellen,
die über ein hochohmiges Voltmeter miteinander verbunden sind Die
eine Halbzelle setzt sich aus der lonenselektiven Membran, dem Innen-
ableitelektrolyten und der Innenableitung zusammen, wahrend die zweite
Halbzelle aus einer Referenzelektrode (z B einer Kalomelelektrode)
besteht Ein schematischer Aufbau ist in Abbildung 5 1 gegeben
28 GRUNDLAGEN DER FUNKTIONSWEISE CHEMISCHER SENSOREN
Referenz
Ag/AgCIInnenableitung
Innenableit-
elektrolyt
lonenselektive
Membran
Kalomel
(Hg/Hg2CI2)
KCl gesattigt
DiaphragmaBrucken-
elektrolyt
Kapillare
Abb. 5.1: Schematische Darstellung einer potentiometrischen Messzelle
Im Idealfall besteht in einer derartigen Messkette eine direkte Ab¬
hängigkeit zwischen der Aktivität des zu messenden Ions und dem
Potential. Das Potential, auch als elektromotorische Kraft (EMK) bezeich¬
net, setzt sich aus der Summe der an allen Phasengrenzen und Kontakt¬
stellen auftretenden Potentialdifferenzen E, zusammen:
Hg Hg2Cl2 KCl i Brücken- .. Pr obe¬
res.); elektrolyt;| lösung
Membran Innenableit-
elektrolytAgCl Ag
y
E2 £, Es E<
I
Referenzelektrode ISE
5 1 lonenselektive Elektroden 29
Die experimentellen Bedingungen werden derart gewählt, dass über die
Messkette kein Strom fliesst (hohe Widerstände) In diesem Fall hegt ein
elektrochemisches Gleichgewicht vor, und die gemessene EMK entspricht
der Gleichgewichtszellspannung
EMK = £,+£, + £,+ E, + EM + E4 + £, (5 1)
mit EMK Gesamtpotential [V]
£,, £„ £, Messgutunabhangige Potentiale in der Referenz
elektrode [V]
Ej Messgutabhangiges Flussigkeitspotential (liquid
junction potential) [V]
EM Messgutabhangiges Membranpotential [V]
£4, £, Messgutunabhangige Potentiale in der Innenableitung
[V]
Alle messgutunabhangigen und demzufolge für ein gegebenes System
konstanten Potentialbeitrage E, bis E, werden durch den Ausdruck £°
zusammengefasst Gleichung 5 1 reduziert sich damit zu
EMK = £° + E, + EM (5 2)
Wird vom Beitrag des Flussigkeitspotentials E, abgesehen, entspricht die
gemessene EMK dem Membranpotential EM und ist somit für das
lonenselektive Verhalten der Membran charakteristisch
Die Abhängigkeit des Messsignals von der Aktivität des Messions wird
durch die Nernstsche Gleichung beschrieben
30 GRUNDLAGEN DER FUNKTIONSWEISE CHEMISCHER SENSOREN
EMK = E° +s loga, (5 3)
mit £° Standardpotential der Messkette [V]
s Nernstsche Steigung der Elektrodenfunktion [V]
a, Aktivität des Messions in der Probelosung [1]
Als weitere messgutabhangige Grosse bleibt noch das Flussigkeitspotential
£j, das im Messsignal nach Gleichung 5 3 mitenthalten ist Es stellt sich
auf Grund der verschiedenen Mobilitäten von Kationen und Anionen in
der als Bruckenelektrolyt gewählten Losung ein Die Ionen der konzen¬
trierten Elektrolytlosung in der Brücke diffundieren in die Messlosung
und verursachen dadurch ein Diffusionspotential Die Brücke hat die
Funktion, das Messgut in Kontakt mit der Referenzelektrode (Kalomel) zu
bringen Der Betrag von Es lasst sich durch Wahl eines aquitransferenten
Elektrolyten (gleiche Mobilität von Anionen und Kationen) hoher
Konzentration als Brücke minimieren Wegen der standigen Diffusion ins
Messgut muss aber die Kontamination der Probelosung beachtet werden
Aus diesem Grund hat sich für klinische Anwendungen eine 1 mol L"1
Kahumchlond-Losung als Kompromisslosung bewahrt
Eine Möglichkeit zur Berechnung des Flussigkeitspotentials bei bekannter
Probenzusammensetzung gibt die Gleichung von Henderson, die einen
linearen Verlauf der Aktivitatsprofile in der Diffusionsgrenzschicht
postuliert
5 1 lonenselektive Elektroden 31
X?, u \a - a \ Hz, u a
1 1 \ 1 1 I n-r 1 1
__J ül_ lnJJJ
r 2 l *\ F
v2
Xz h [a -aj
r
IZj "j ß
£t=-^:
iT^ln-^^ (54)
mit c, Ladung des Ions I
h, Absolute Beweglichkeit des Ions I [cm2 s'J
'
mol]
R Universelle Gaskonstante (R= 8 314 J K'mol ')
T Absolute Temperatur [K]
F Faraday-Konstante (F= 96487 C mol ')
^ Summe über alle Ionen der Probelosung und des
i
Bruckenelektrolyten
a, Aktivität des Ions I in der Probelosung
a, Aktivität des Ions I im Bruckenelektrolyten
Für die praktische Auswertung sollte die gemessene EMK um den Wert
des Flussigkeitspotentials (EMK - £,) korrigiert werden (vgl Kapitel 6 9)
oder bei der Kalibration der Elektrode mitberucksichtigt werden (vgl
Kapitel 6 7)
Auf detaillierte Ausfuhrungen wird an dieser Stelle verzichtet Es sei aber
auf wichtige Literatur zum Thema der Membranmodelle und Selek¬
tivitäten für lonenselektive Elektroden verwiesen [23-29]
32 GRUNDLAGEN DER FUNKTIONSWEISE CHEMISCHER SENSOREN
5.2. Ionenselektive Optoden
Wie in Kapitel 3 erwähnt, erfolgt im Falle der optischen Sensoren
eine Transduktion des chemischen Signals in eine optisch erfassbare
Messgrosse Die wahrend dieser Arbeit untersuchten optischen Sensoren
beruhen alle auf einem aktiven Massentransport des zu untersuchenden
Analyten aus der wassngen Probelosung in eine lipophile, organische
Schicht (Membran), die aus einem weichgemachten Polymer als Matrix
besteht Bei diesem Vorgang stellt sich ein thermodynamisches Gleich¬
gewicht zwischen der Probelosung und der gesamten, homogenen Sensor¬
schicht ein Derartige Membranschichten werden als Bulkoptoden be¬
zeichnet und stehen im Gegensatz zu oberflächenaktiven Systemen Das
Ausmass des Massentransportes wird durch die in die Membran einge¬
brachten Erkennungskomponenten und Hilfsstoffe bestimmt In vielen
Fallen erfolgt die Extraktion des Analyten in die organische Phase durch
Komplexbildung mit einem Liganden L oder durch eine selektive,
reversible chemische Reaktion (in der Regel für neutrale Analyte) Eine
ausführliche Übersicht über die zugrundeliegenden Phasentransfergleich-
gewichte, über verschiedene Realisierungsmoglichkeiten derartiger
Systeme und die Herleitung der zugehörigen Gleichungen findet sich bei
Bakker et al [30, 31] An dieser Stelle werden lediglich die Grundlagen
zum Verständnis eines kationenselektiven Optodensystems diskutiert Eine
schematische Darstellung einer kationenselektiven Membran findet man in
Abbildung 5 2 Der zugesetzte Chromoionophor C, ein hpophihsierter
pH-Indikator, ist für die Transduktion des chemischen Signals in eine
optisch messbare Grosse verantwortlich Die Änderung der optischen
Eigenschaften des Membransystems kommt durch den Austausch von
Protonen H+ gegen Analytkationen I+ und der damit verbundenen Proto-
merung resp Deprotomerung des Indikators zustande Zur Aufrecht¬
erhaltung der Elektroneutrahtat ist in manchen Fallen der Zusatz von
membranloshchen, hpophden ionischen Komponenten R+ oder R"
5 2 lonenselektive Optoden 33
notwendig Als anionischer Zusatz wird in der Regel ein hpophiles Borat¬
salz und als kationischer Zusatz ein hpophiles Ammoniumsalz eingesetzt
(a) (b)
hf
IL+ L
CH C
Abb 5 2 Schematische Darstellungen einer kationenselektiven Bulk-
optode (a) mit neutralem Liganden L und neutralem Chromoionophor C,
(b) mit neutralem Liganden L und (m deprotoniertem) Zustand
geladenem Chromoionophor C,
I+ Analyt Kation, R hpophder,
anionischer Zusatz
Für den einfachsten Fall eines Kationenaustauschsystems ohne Zusatz eines
selektiven Liganden lasst sich das folgende Gleichgewicht zwischen der
Probelosung und der Optodenmembran formulieren
F+(aq) + v CH+(mem) -« Iv+(mem) + v C(mem) + v H+(aq) (5 5)
V bezeichnet die Ladungszahl des Kations Die Austauschkonstante lautet
für diesen Fall
K = Kexch chrom :*H. (*.)" = (5 6)
34 GRUNDLAGEN DER FUNKTIONSWEISE CHEMISCHER SENSOREN
Aktivitäten beziehen sich auf Spezies in der Wasserphase Die eckigen
Klammern bezeichnen Konzentrationen in der organischen Membranphase
unter der Annahme, dass die Aktivitatskoeffizienten konstant bleiben Die
Konstante KH, bezeichnet das Austauschgleichgewicht zwischen Protonen
und Analyt-Kationen und ist durch die Verteilung der beiden Ionen
zwischen der wassngen und der organischen Phase bestimmt K^ be
zeichnet die Aciditatskonstante des Chromoionophors in der Membran¬
phase Die Beziehung 5 6 lasst sich zur experimentellen Bestimmung von
Aciditaten der Chromoionophore in der Membranphase ausnutzen [32]
Wird ein kationenselektiver Liganden L in die Optodenmembran
eingebracht, verändert sich Gleichung 5 5 zu
r+(aq)+pL(mem)+vCH+(mem) -« ILp+(mem)+vC(mem)+vH+(aq)
(5 7)
Der Index p gibt die Stochiometne des Komplexes zwischen dem Mession
Iv+ und dem Liganden L an
In Analogie zu Gleichung 5 6 formuliert man die Austauschkonstante
m _(v)"f [clVK'1^exi.h
ör+ [OT].(5 8)
[L]P
welche auch geschrieben werden kann als
tfexcPh=*H1 ßir (*.)" (5 9)
mit der Bruttostabihtatskonstante ßlL des Komplexes ILp+ in der
Membranphase Aus dem optischen Messsignal kann auf das Konzen-
trationsverhaltnis zwischen protomertem und gesamten Chromoionophor
5 2 lonenselektive Optoden 35
in der Membran, den Protonierungsgrad 1-a geschlossen werden Dieser
wird mit der gewünschten Messgrosse der Analytaktivitat av+
in Ver¬
bindung gebracht (siehe Gleichung 5 14) Als zusätzliche Parameter
stehen die aus der Membranherstellung bekannten Grossen wie die Kon¬
zentration an Ligand LT und an Chromoionophor CT mit ihren Massen-
bilanzen sowie an anionischem Additiv RT mit der Elektroneutrahtatsbe-
dingung zur Verfugung
LT=[L]10lj,=[L] + p [IL;+] (5 10)
CT=[C]toldl=[C] + [CH + ] (5 11)
Rt=[R"L=[CH+] + MILVp1 <512)
Der Protonierungsgrad 1-a lasst sich nun direkt aus dem Messsignal be¬
stimmen, wie hier am Beispiel der Extinktionsmessung gezeigt wird Das
gleiche Prinzip lasst sich aber beispielsweise auch auf die Fluoreszenz¬
emissionsmessung [33 34] oder Brechungsindexmessung [35] anwenden
,-„JSl A~A^(513,
C A — A^T -^prot "deprot
mit A Extinktion der Membranschicht bei einem beliebigen
Gleichgewichtszustand
Aprol, Adtpro, Extinktion der Membranschicht bei vollständig
protomertem bzw deprotoniertem Chromoinophor
36 GRUNDLAGEN DER FUNKTIONSWEISE CHEMISCHER SENSOREN
Aus Kombination von Gleichungen 5 8 und 5 10-5 13 erhalt man für die
Aktivität des Analyten
v,(vl f-«_y —»t-o-ic,—. (514,*- ll-°J
v(LT-£{RT-(.-a)CT})'
Auf ahnliche Weise erhalt man für eine Optode mit einem negativ ge¬
ladenen Chromoionophor C (Abb 5 2b), die ohne den Zusatz eines
anionischen Additivs R auskommt, die untenstehende Beziehung
„.=ivL { ' )' —?£i (515)
1 «£i ld-«)cTJ,(LT_£aCT)'
Aus Gleichungen 5 14 und 5 15 geht klar hervor, dass eine auf Ionen-
austausch basierende Optode nicht allein auf die Metalhonenaktivitat a„t,
sondern vielmehr auf das Verhältnis der Aktivitäten des Mess- und
Referenzions (in diesem Fall der Protonen) anspricht Für den Einsatz der
Optode bedeutet das, dass die Referenzionenaktivitat, d.h der pH-Wert,
entweder simultan miterfasst oder durch Pufferung der Probelosung
konstant gehalten werden muss Es lasst sich berechnen [30], dass pH-
Anderungen von 0 01 Einheiten bei der Erfassung von zweiwertigen
Kationen das Analysenresultat bereits um 4 5 % verfalschen Steigt der
pH-Wert der Probe um 0 01 Einheiten an, sinkt die Messionenaktivitat
eines zweiwertigen Kations vermeintlich um 4 5 % Für einwertige
Kationen ist der Fehlerbeitrag halb so gross Auf die Konsequenzen dieser
Tatsache in Bezug auf klinische Messungen wird in Kapitel 6 10
eingegangen
5 2 lonenselektive Optoden 37
In Gleichungen 5 14 und 5 15 wird der Einfluss von in der Probelosung
auftretenden Stononen nicht berücksichtigt In Analogie zu den poten-
tiometnschen Sensoren lasst sich ein optischer Selektivitatskoeffizient Ar,°pt
definieren An dieser Stelle soll aber nur auf die Arbeiten von Bakker und
Simon [31] sowie von Lerchi et al [36] verwiesen werden, die eine detail¬
lierte Einfuhrung liefern
38
39
6. Klinische Ionenanalytik mit chemischen Sensoren
6.1. Einfuhrung in die Problemstellung
Um die maximale Leistung eines chemischen Sensorsystems nutzen
zu können, ist es von Vorteil, den Sensor auf die zu analysierende Probe
anzupassen und zu optimieren Dazu ist die Kenntnis möglichst vieler
Rahmenbedingungen eine wichtige Voraussetzung Ferner ist die Ver¬
arbeitung des Rohsignals in eine klinisch sinnvolle und interpretierbare
Grosse notwendig, um das System für den Anwender attraktiv zu machen
Schliesslich sollte in einem vollständigen Analysensystem auch die für die
Kalibration und Datenauswertung benotigte Software integriert sein
Das Ziel im klinischen Ted der vorliegenden Arbeit war es, im Hinblick
auf die oben aufgeführten Gesichtspunkte Möglichkeiten, Bedingungen
und Grenzen für den Direkteinsatz von potentiometnschen und optischen
Sensoren in der unverdünnten Probe - in der Regel Vollblut, Plasma oder
Serum - zu untersuchen Es stellte sich unter anderem die Frage,
inwiefern die heute gangige Praxis der Verarbeitung des Rohsignals eines
Sensors Unsicherheiten [37] birgt und wie sich diese eliminieren lassen
Besonders wurde das Problem des Vergleichs von Aktivitäts- und Gesamt-
konzentrationsmessungen durch eine Datenvahdierung mit realen Proben
aus dem Spitalbetrieb genauer beleuchtet Im Zentrum stand in diesem
Zusammenhang die Massenkonzentration von Wasser Diese Grosse be¬
rücksichtigt, dass Vollblut, Plasma oder Serum nicht allein aus einem
wassngen Anteil bestehen
Gleichzeitig ging es darum abzuklären, welche Faktoren beim Einsatz
chemischer Sensoren mögliche Fehlerquellen für verfälschte Resultate
darstellen und in welcher Grossenordnung die daraus resultierenden
Fehler liegen Von Interesse waren vor allem Parameter, die aufgrund
40 KLINISCHE IONENANALYTIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN
der angewandten Messtechnik eine direkte Auswirkung auf das Rohsignal
des chemischen Sensors ausüben Dazu zahlen das Flussigkeitspotential bei
der Verwendung von ISE und der pH-Wert beim Einsatz lonenselektiver
Austauschoptoden
Mit der zur Verfügung stehenden Infrastruktur eines grossen Routine-
spitallabors erfolgte die simultane Messung des pH-Wertes, der Protein-,
Lipid-, Harnstoff- und Glucosekonzentration sowie der Elektrolyt¬
konzentrationen in Plasmaproben Durch lonenselektive Messungen der
freien Elektrolytkonzentrationen konnten Rückschlüsse auf die Ionen-
aktivitaten gemacht werden Die gesammelten Daten wurden aufgrund
von bekannten mathematischen Modellen ausgewertet und auf die be¬
trachteten Sensorsysteme angewendet Die analysierten Proben stammten
von gesunden Testpersonen und von Spitalpatienten mit zwei ver
schiedenen Krankheitsdiagnosen (Patienten mit Nierenversagen und Herz-
Kreislaufbeschwerden) Die beiden Gruppen wurden ausgewählt, weil für
diese Patienten aus medizinischer Sicht die lonenanalytik und damit der
Einsatz chemischer Sensoren besonders relevant ist
6.2. Menschliches Blut als Probenmatrix: Fraktionierung
In menschlichem Vollblut beanspruchen die Blutzellen etwa 44
Prozent des gesamten Volumens Die übrigen 56 Prozent machen das
Blutplasma aus Dann tragt die wassnge Phase ungefähr 93 % zum
Gesamtvolumen bei Etwa 5 3 % nehmen die Proteine ein, 0 62 % Lipide
und 0 9 % Trockensubstanz wie geloste Salze und Zucker [38] In Ab¬
hängigkeit von den physikochemischen Eigenschaften eines Analyten hegt
dieser zwischen der Protein-/Lipidphase und der wassngen Phase verteilt
vor Die angewandte analytische Methode bestimmt, welche Fraktion
quantifiziert wird Da chemische Sensoren am häufigsten für Elektrolyt-
6 2 Menschliches Blut als Probenmatrix Fraktionierung 41
messungen eingesetzt werden, wird dies am Beispiel der Ionenanalytik
erläutert. Im folgenden sollen vier Fraktionen näher beleuchtet werden
[39, 40]:
1. Die totale (molare) Substanzkonzentration c*obe des Ions j und des
Individuums i im gesamten Probevolumen yProbc> ausgedrückt in
mol • Lp'r„(,,,', bestimmt durch indirekte Potentiometrie (d.h. in der
verdünnten Probe) mit ISEs oder mit herkömmlichen, photometrischen
Methoden.
2. Die (molare) Substanzkonzentration c^'' oder die Molalität matJ'fdes freien Elektrolyten in der Wasserphase F,aq, ausgedrückt in
mol • L"H'i0 (Molarität), beziehungsweise in mol • kg^o (Molalität). Diese
Fraktion wird typischerweise durch direkte Potentiometrie mit ISEs in
der unverdünnten Probe erfasst. Die Voraussetzung ist, dass eine adäquate
Kalibrationsmethode zur Verfügung steht. Probleme, welche bei der
Kalibration auftreten können, weiden in Abschnitt 6.7 behandelt.
3. Die aktive Molalität2 des freien Elektrolyten in der Wasserphase
m,aj', ausgedrückt in molkgH'i0. Dies ist die physikalische Grösse,
welche von einer ionenselektiven Elektrode oder Optode direkt erfasst
wird. Die Beziehung zwischen der aktiven Molalität fh^' und der
Molalität mld'J,t wird beschrieben durch einen Proportionalitätsfaktor, den
molalen Einzelionen-Aktivitätskoeffizienten y für ein Ion j und ein
Individuum i. In Analogie dazu definiert man die aktive Konzentration
1 Um Verwechslungen vorzubeugen werden innerhalb des Kapitels 6 die physikalischen Einheiten mit
Indices versehen, welche das Bezugssystem angeben (z.B Probe Gesamte, physiologische Probe wie
Serum, Plasma oder Vollblut, H:0 wassriger Anteil des physiologischen Untersuchungsgutes oder
wassnge Losung)2Diese Grosse ist nahe verwandt mit der dimensionslosen relativen, molalen Aktivität des Elektrolyten
a,! Der Zusammenhang zwischen den beiden Grossen ist gegeben durch. aM =m,*l1l/m" (mit
m" = 1 mol kgH'())
42 KLINISCHE IONENANALYTIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN
des freien Elektrolyten in der Wasserphase C*q', ausgedruckt in
mol L^q und den molaren Einzehonen-Aktivitatskoeffizienten \M
4 Die (molare) Substanzkonzentration des freien Elektrolyten t]ProbLl
im gesamten Probevolumen VProbc, ausgedruckt in mol Lp'robL Diese
Fraktion ist in der klinischen Analytik routinemassig nicht dnekt
zuganglich Ihre Bestimmung erfordert die Kenntnis der Massen¬
konzentration von Wasser p,Hl°, die den Massenanteil von Wasser im
gesamten Probevolumen in kgH^0 Lp'robe beschreibt Für Elektrolyte mit
einem sehr kleinen Anteil an komplex gebundenen Ionen, entspricht diese
Fraktion aber naherungsweise der totalen (molaren) Substanz¬
konzentration c,Probe, die mit klinischer Routineanalytik zuganglich ist
Die Diskriminierung zwischen den verschiedenen Fraktionen ist für die
klinische Dateninterpretation von hoher Wichtigkeit Sie gibt Anlass zu
Kontroversen und Fehldiagnosen (Pseudohyponatraemie scheinbar er¬
niedrigte Natriumionenkonzentration), seit Waugh 1969 seinen ersten
Artikel über die Verdrängung von Wasser durch Proteine und Lipide in
Humanserum und -plasma veröffentlichte [41] Für diagnostische Zwecke
wurde die Unterscheidung zwischen den zwei Fraktionen freie (molare)
Ionenkonzentration in der Wasserphase c,a(jf und der totalen (molaren)
Ionenkonzentration im gesamten Probevolumen c,Probe zur Routine Die
biologische Aktivität von Elektrolyten wie Natrium, Kalium, Calcium
oder Magnesium aber auch von Anionen wird am besten durch die aktive
Molalitat m^' beschrieben Dennoch konnte sich bis heute die Grosse der
aktiven Molalität in den klinischen Laboratorien wegen der Gefahr von
Verwechslungen mit anderen Grossen nicht durchsetzten
6 3 Abschätzung der Massenkonzentration von Wasser in Plasma 43
6.3. Abschätzung der Massenkonzentration von Wasser in
Plasma
Der Gehalt an Wasser in einer Plasma- oder Serumprobe wird als
Massenkonzentration von Wasser p'
bezeichnet und normalerweise in
der Einheit kgH;0 LP'rohL angegeben p'
leitet sich aus dem Produkt
der Dichte von reinem Wasser p*H"° und dem Volumenverhaltnis des
wassngen Anteils der Probe Vj"1 gegenüber dem Gesamtvolumen yProbe
ab
H,0 *H,0 v, ,s ,N
Für die klinische Analytik mit chemischen Sensoren ist diese Grosse
relevant, da mit Sensoren die aktive Molalität m^ einer Substanz in der
Wasserphase erfasst wird Die Massenkonzentration von Wasser ist
routinemassig keine direkt zugangliche Messgrosse Sie muss über Um¬
wege bestimmt werden Eine Übersicht über verschiedene Verfahren
findet man in [42] Eine klassische und sehr direkte Methode ist die
gravimetrische Bestimmung des Wasseranteils durch Verdampfung bei
100 °C wahrend mindestens 24 Stunden Wegen der langen Analysedauer
ist dieses Verfahren für die klinische Laboranwendung nicht geeignet Ein
wesentlich rascheres, aber immer noch relativ aufwendiges Verfahren ist
die gravimetrische Wasserbestimmung durch Verdampfung bei Mikro¬
wellenbestrahlung Diese Methode wurde als mögliche Referenzmethode
vorgeschlagen [43] Ein anderes Vorgehen basiert auf der Messung der
Osmolalitat über Gefrierpunktserniedrigung bei Verdünnung der Probe
mit einer definierten Menge an Wasser [42]. Experimentelle
Unsicherheiten in der Osmolalitatsmessung und beim Verdünnen der
Probe reduzieren aber die Zuverlässigkeit der Resultate
44 KLINISCHE IONENANALYTIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN
Eine gut etablierte und relativ rasche Methode ist die Abschätzung aus
experimentellen Bestimmungen von Protein- und Lipidkonzentrattonen
Zwar stellten Faye und Payne bei einer Methodenevaluation fest, dass die
Massenkonzentration von Wasser dabei systematisch leicht untei schätzt
wurde, da nach der Zugabe einer bekannten Wassermenge nur eine
Wiederfindungsrate von 99 01 % ermittelt wurde [42] Auf der anderen
Seite wies diese Methode mit nur 0 2 % die geringste analytische Un
Sicherheit innerhalb einer Messserie auf Da es für die vorliegende Arbeit
wichtig war, klinische Variationen der Massenkonzentration von Wasser
aufzuzeigen, wurde diese Methode wegen der hohen analytischen
Präzision ausgewählt Das Verfahren basiert auf dem Effekt, dass
Proteine und Lipide einen Teil des Plasmavolumens einnehmen und somit
Wasser verdrangen Über die bekannte Dichte von Proteinen und Lipiden
lasst sich das verdrängte Volumen abschätzen und somit auf die
Massenkonzentration von Wasser zuruckschhessen Neben Proteinen und
Lipiden finden sich in Plasma noch weitere Komponenten (Salze,
organische Substanzen), die in dieser Approximation lediglich mit einem
konstanten Term berücksichtigt werden
P,H°[kgH0 lpLJ = ph,°( -.Protein Lipid ^
0 991--* Protein Lipid
(6 2)
mit
p*' [kg L_l 1 Dichte von Wasser
p*Prolcin,p L,pkl[kg L"1] Mittlere Dichte der Plasma-Proteinfraktion
resp Lipidfraktion
p,Prolun, p,L'p,d[kg Lp'robel Gemessene Massenkonzentration von Proteinen
resp Lipiden
Der konstante Term, 0 991 LHi0 Lp'robe , repräsentiert die Menge an
Wasser in IL Probe, reduziert um das Volumen von Trockensubstanzen
6 4 Abschätzung dei Em/elionen-Akttvitatskoettizienten in Plasma 45
6.4. Abschätzung der Einzelionen-Aktivitätskoeffizienten in
Plasma
Der physikalisch-chemische Zusammenhang zwischen einer Kon-
zentrationsgrosse und einer Aktivitatsgrosse, ist durch den Aktivitats-
koettizienten yu beziehungsweise \,gegeben Gleichungen 6 3 und 6 4
zeigen diese Beziehung auf
><]<=Yn m/V (6 3)
Diese Koeffizienten lassen sich experimentell, beispielsweise über eine
Messung der Dampfdruckermerdrigung, ermitteln Im Falle von
Elektrolyten aber sind die Einzehonen Aktivitatskoeffizienten y+l tund v+l
für Kationen, respektive y, xund v, x
für Anionen, experimentell nicht
direkt zuganglich [44] Mittels verschiedener Naherungsverfahren, die auf
thermodynamischen Gesetzen beruhen, lassen sich aber die mittleren
Aktivitatskoeffizienten y± und k auf der Basis von experimentell
gemessenen Parametern abschätzen Für die anschliessende Aufspaltung in
die Einzelionen-Aktivitatskoeffizienten sind aber nicht-thermodynamische
Annahmen notig Für Losungen eines einzelnen Elektrolyten existieien
verschiedene, einfache Konventionen Einige davon sind durch Morf [24]
zusammengefasst worden Die Behandlung von Losungen mit mehreren
Elektrolyten ist komplexer als diejenige für reine Elektrolyte Oft wird
angenommen, dass die Einzehonen-Aktivitatskoeffizienten in gemischten
Elektrolytlosungen die gleichen Werte annehmen wie in reinen Elektro¬
lytlosungen der gleichen Ionenstarke wie die Mischlosung [45] Dabei
werden also Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Ionen gleicher
Ladung vernachlässigt Um möglichst zuverlässige Abschatzungen für die
Einzehonen-Aktivitatskoeffizienten in Blut, Plasma oder Serum zu
46 KLINISCHE IONENANALY TIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN
erhalten, verwendet man mit Vorteil eine Methode, welche die
Besonderheiten von gemischten Elektrolytlosungen berücksichtigt
6 4 1 Das erweiterte Debye Huckel-Modell
Die von Debye und Huckel abgeleitete Näherung für die Ab¬
schätzung von mittleren Aktivitatskoeffizienten basiert hauptsachlich auf
interionischen Wechselwirkungen unter der Annahme punktförmiger La¬
dungen Das Modell wurde erweitert, um die individuelle Ionengrosse zu
berücksichtigen und schliesslich mit einem empirischen Term, der
abhangig von der Ionenstarke ist, ergänzt [46, 47]
I a Jimolli
logy±=r + ~-'
'V +C/m°'jl (6 5)l + BmaV7"
_|77U Jjmolir
log v+ =
' + 'V - + C/molar (6 6)
l + B,aV/molar
mit
z+, z Ladung des Kations bzw Anions
Am, At / Losungsmittelspezifische Parameter (für Wasser bei 37 °C
Bm, Bu gilt Am= 0 5193 kg"2mol"2 und At = 0 5211 L^mol""1
resp Bm = 0 3301 10 '"m1 kg"2 mol"2
und Bt = 0 331210'"
m"2morl/2)
/ Ionenstarke auf molaler [mol kg"1] bzw molarer [molL-1]
Basis (siehe Gleichung 6 7a / b)
a Ionengrossenparameter [10"'° m] (siehe [48])
C Elektrolytspezifischer Parameter (siehe [48])
6 4 Abschätzung der Etnzelionen Aktivitatskoeffizienten in Plasma 47
Die Ionenstarke / für ein Ion j wird berechnet nach Gleichung 6 7
rmolar' V^ Probt 1 2 /(- -, \
/ =- 2,ci :i (67a)
zi
I i cProbU z27 =; 1»V ?j =r 1—-hTö— (67b>
zj
zj P
Aus den mittleren Aktivitatskoeffizienten erhalt man die Einzehonen-
Aktivitatskoeffizienten nach der Debye-Huckel-Konvention wie in
Gleichung 6 8 dargestellt (im weiteren Verlauf werden nur noch die
molalen Koeffizienten y betrachtet)
logy+ =|z+/z_|logy+(6 8)
logy_ =|?_/?+|logy±
Das Debye-Huckel-Modell ist wegen seiner Einfachheit das am häufigsten
angewandte Verfahren zur Ermittlung von Einzehonen-Aktivitats-
koeffizienten Aus diesem Grund ist es auch schon in Form von Software
Prozeduren in kommerzielle Blutelektrolytanalysatoren integriert In der
Literatur gibt es jedoch keine Hinweise auf die Frage, wieweit das
vereinfachte Debye-Huckel-Modell auf gemischte Elektrolytlosungen
anwendbar ist Die nach Debye-Huckel berechneten Koeffizienten für
Vollblut, Plasma oder Serum entsprechen demzufolge den Koeffizienten,
die durch unabhängige Behandlung der einzelnen Elektrolyte nach
Gleichungen 6 5 und 6 8 erhalten werden
48 KLINISCHE IONENANALYTIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN
6 4 2 Stokes-Robinson-Hydratationstheone
Stokes und Robinson ergänzten die Debye-Huckel-Theone durch
einen zusätzlichen Term, der die Hydratation miteinbezieht [49 50] Durch
H>dratation wird ein Teil des Wassers in der Hydratationssphare der
Ionen gebunden und steht somit nicht mehr als frei bewegliches
Losungsmittel zur Verfugung, was sich auf die Einzehonen-Aktivitats-
koeffizienten auswirkt Unter Berücksichtigung einer Konvention tur die
Abschätzung von Einzehonen-Akttvitatskoeffizienten nach Bates, Staples
und Robinson [51], erhalt man eine Gleichung, die für gemischte
Elektrolytlosungen anwendbar ist [52]
-ln(10)^AmV7mol il
lny+ =
+ "
=— + h+mM,l + BmaV/moi"
f
-In -oois]^-i)m;41
(6 9a)
-ln(\0)z2Am4r*J, _
lny =.
+ h__rfiMhl + BmaV/molal
f \(6 9b)
In 1-0 018^^ -\)n aq I
mit
h+,h Hydratationszahl (Anzahl Mole Wassermolekule, die durch
Hydratation an ein Mol Kationen resp Anionen gebunden
sind, zB /if= 3 5)
Na
m Osmolahtat [molkg']
MHi0 Relative Molmasse von Wasser (0 018 kg mol ')
6 4 Abschätzung der Einzelionen Aktivitatskoeffizienten in Plasma 49
In dieser Approximationsmethode wird über alle in der Losung
vorhandenen Ionen j summiert Durch Einbezug der Osmolalitat werden
Einflüsse elektrisch neutraler osmotisch aktiver Komponenten (z B
Glucose Harnstoff) mitbeiucksichttgt
6 4 3 Das Pitzer Modell
Pitzer entwickelte ein Approximationsmodell für gemischte
Elektrolytlosungen, das nicht nur Wechselwirkungen zwischen
verschiedenen Kationen und Anionen miteinbezieht, sondern auch die
gegenseitige Beeinflussung von Ionen gleicher Ladung untereinander mit-
beruckstchtigt [53] Dennoch ist das Verfahren relativ leicht anzuwenden
und lasst sich auf Computerprogramme implementieren Ein Nachteil
dieser sehr zuverlässigen und thermodynamisch fundierten
Approximation hegt dann, dass nicht alle Parameter für physiologisch
relevante Ionen bekannt sind Da diese Methode zuerst im Bereich der
Geologie Anwendung fand, gibt es vor allem bei den organischen Anionen
wie beispielsweise dem Acetat Ion Lucken in den tabelherten Parameter-
satzen
50 KLINISCHE IONENANALYTIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN
Für ein Salz MX in verdünnter wassriger Lösung gilt (c: cation; a: anum)
[53]:
ln/M =2MfY +25>a[BMa + (X m?)C Ma ] + 2X '«t 6Mta l
+II»V"a[>7MB;j+7MCu+4'Mu]
-^XI'^vK.a']^-
.1 .1'
l"7x =?xfY +2S/»t[Bxc +(I'^)CXL] + 2lmJ0>l a
+XX»W^b:+?xCj, +vpx.1l]
^c (.'
wobei
X«? = XWc?c =XWaka|
und
/ j molal ^>.
,.
V/, ^hil + bVr^,+ bV/molal b V /
R -
Rl0),
2P|y|XDMX -PMX
+
.2 , molal
aV1(l + ccVr^je
-aV/
C-MX ~
BMX -
^\?MZx|
(2ß(;x)
a2(/molal)
1-l + |l + aV7iZ + -a2/molal |e
-aV/m
(6.10a)
(6.10b)
(6.11)
(6.12)
(6.13)
(6.14)
6 4 Abschätzung der Einzelionen Aktivitatskoeffizienten in Plasma 51
mit
A0 Debye-Huckel-Parameter (für Wasser bei 37 °C
ist A^ 0 3995 kg"' mol "2)
b, a Justierbare, universelle Parameter (b = 1 2
kg"2 mol "\ a = 2 0 kg"2 mol ,n)
ß\ix> ßvix' ^mx Spezifische Parameter für das Salz MX, die
Wechselwirkungen über kurze Distanzen
repräsentieren Angepasst an eine Temperatur
von 37 °C nach [53]
0^, 0Xl und Mischparameter für Kation-Kation resp Anion-
4/Mtl,vr'Mla, Anion Wechselwirkungen (nicht temperatur-
•Px.-V korrigiert) [53]
Es ist zu beachten, dass die Mischparameter 0 und ¥ nur einen sehr
kleinen Beitrag leisten und deshalb oft vernachlässigt werden dürfen Den
grossten Beitrag zur Mischung liefern die Parameter ß<0), ß"' und C, die
von reinen Elektrolyten stammen
52 KLINISCHE IONENANALYTIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN
6 4 4 Vergleich von Aktivitatskoeffizienten im physiologischen Bereich
Im Bezug auf die Praxis ist es bei der Kalibiation von chemischen
Sensoren für physiologische Anwendungen wichtig, die molalen Einzel-
lonen-Aktivitatskoeftiztenten zuverlässig abschätzen zu können, solange
mit Kalibratoren, die auf wassrigen Losungen basieren, gearbeitet wird
(vgl Kapitel 6 7) Aus diesem Grund sollte dasjenige Verfahren eingesetzt
werden, welches die zuverlässigsten Resultate garantiert Wie aus Ab¬
bildung 6 1 hervorgeht, lassen sich im physiologischen Konzentrations¬
bereich keine grundlegenden Unterschiede im Verlauf der Einzehonen-
Aktivitatskoettizienten, berechnet nach der Debye-Huckel-Methode, dem
Pitzer-Formahsmus und der Stokes-Robinson-Hydratationstheone, für die
betrachteten Kationen feststellen Die Absolutwerte der Koeffizienten
weichen jedoch voneinander ab
Für die einwettigen Kationen wie Na+ und K+ werden mit der einfachen
Debye-Huckel-Approximation last identische Werte wie mit der auf¬
wendigeren Pitzer-Approximation erhalten Vernachlässigt man hingegen
für zweiwertige Kationen wie Ca2+ und Mg2+ Mischterme, wie dies bei der
Methode nach Debye und Huckel zutrifft, findet man grossere Ab¬
weichungen von den nach Pitzer erhaltenen Werten Im Rahmen dieser
Arbeit wurde demzufolge tur alle Abschatzungen im Zusammenhang mit
klinischen Messungen der rechnerisch aufwendigere Pitzer-Formalismus
angewendet Chlorid wurde in sämtlichen Fallen als Gegenanion
angenommen, da es den höchsten Anteil der Anionen im Plasma ausmacht
Das Bicarbonat-Anion konnte aus experimentellen Gründen nicht
bestimmt und daher nicht berücksichtigt werden
6 4 Abschätzung der Einzehonen-Aktivitatskoeffizienten in Plasma 53
0.77
0.76 H
J 0.75
0.74
0.73
<
<
140 145 150 155 1601 165 170
mNaW(mmolkg 0 )
0.35 -i++
0.34-
0.32-
0.31 H
++
++++
Ä50.33-°°O^
++++++
°°°°°-o^
+++++
°Oo<o°o0oo
°Oo
140 145 150 155 1601 165 170
mNa+/ (mmol kgHa0 )
Abb. 6.1: Molale Einzelionen-Aktivitätskoeffizienten für Na+ (a) und Ca:+
(b) in Abhängigkeit der Na+-Molalitäten in einer wassrigen Lösung mit
physiologischem Hintergrund, abgeschätzt nach den Gleichungen von
Debye-Hückel (Gl. 6.5 / 6.8) (O), Stokes-Robinson (Gl. 6.9a) () und
Pitzer (Gl. 6.10a) (+). (Bedingungen: T=37 °C; wR+= 4.7 mmol • kg~'i0,
mCa
!+= 1.2 mmolkgH)0, »i ,+= 0.6
MgmmolkgHi0; Chlorid als
Gegenion in allen Fällen).
54 KLINISCHE IONENANALYTIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN
6.5. Aktivitäten versus Konzentrationen
Mit dem Einzug der chemischen Sensoren - bis heute in erster Linie
der lonenselektiven Elektroden - in die klinischen Laboratorien wurde die
Erfassung einer neuen physikalisch-chemischen Grosse, dei aktiven
Molalität des Analyten, ermöglicht (vgl Kapitel 6 2) Gleichzeitig stellte
dieser Schritt die Routineanwender aber vor eine Reihe von neuen Fragen
und Problemen Besonders wichtig ist die Beziehung zwischen der aktiven
Molalitat m*q' eines Analyten und der totalen (molaren) Substanz¬
konzentration cPj0be, die mit den herkömmlichen Methoden erhalten wird
Auch ist eine korrekte Kalibration des chemischen Sensors nicht immer
einfach Es ist also nicht erstaunlich, dass sich eine ganze Reihe von
Publikationen mit diesen Themenkreisen befasst [54 57] Aus historischen
Gründen betreffen die meisten Veröffentlichungen die Bestimmung von
Natrium- und Kahumionen mit ISE in Plasma oder Serumproben Die
Mehrzahl der genannten Arbeiten befasst sich mit der Kontroverse
zwischen Aktivitäts- und Konzentrationsmessung und den daraus
resultierenden Folgen für den Vergleich zwischen Messresultaten von ver¬
schiedenen Geraten Es soll darauf hingewiesen werden, dass hier in
erster Linie der analytisch-technische Aspekt dieser Kontroverse be¬
trachtet wird und nicht der klinisch-medizinische
In den meisten Spitalern stehen heute vollautomatische Analysatoren mit
einem sehr hohen Probendurchsatz für die Messung der wichtigsten
klinischen Analyte in Blut, Serum oder Plasma im Einsatz Für die
Bestimmung der Konzentration an Elektrolyten wird in diesen Geraten
meist das Verfahren der indirekten Potentiometrie mit lonenselektiven
Elektroden eingesetzt In diesem Fall wird die Probe stark verdünnt, was
eine drastische Verschiebung der Komplexierungsgleichgewichte zur
Folge hat Aus diesem Grund wird mit der indirekten Potentiometrie
immer die Gesamtkonzentration c*rs°he an Ionen erfasst Gleichzeitig
6 5 Aktivitäten versus Konzentrationen 55
befinden sich aber vor allem an peripheren Standorten und
Notfallstationen auch Gerate im Einsatz, welche mit ISE die aktive
Molalität m ,'j' der freien Elektrolyte im wassrigen Anteil der
unverdünnten Probe messen Auch im Falle des Einsatzes von optischen
Sensoren in unverdünnten Proben werden die aktiven Molahtaten der
Elektrolyte gemessen In den meisten Fallen wird aber das Resultat der
Analyse in derselben Einheit von mmol LP'robLangegeben Die von
verschiedenen Geraten erhaltenen Messwerte können somit beachtliche
Differenzen autzeigen Um dieses Problem zu losen, hat eine Experten¬
kommission der "International Federation of Clinical Chemistry" (IFCC)
empfohlen, eine Methode zur Standardisierung von ISE Methoden durch
Verwendung von frischen Humanseren auszuarbeiten [58] Darauf
veröffentlichte eine Arbeitsgruppe der IFCC, welche sich mit lonen¬
selektiven Elektroden befasst, einen Entwurf mit dem Titel
"Recommendations for Nomenclature, Definitions, and Conventions
Relativ to the Use of lon-Selective Electrodes for Blood-Electrolyte
Analysis" [59] Dieses Dokument befasst sich mit der Bestimmung von
Elektrolytkonzentrationen in unverdünntem Plasma, welches durch
Abtrennung der Blutzellen von antikoaguhertem Blut erhalten wurde Es
beinhaltet Empfehlungen, wie die Messresultate dargestellt und wie sie in
Zusammenhang mit den Ergebnissen von Referenzmethoden gebracht
werden sollen Komplikationen rühren von der Tatsache her, dass lonen¬
selektive Elektroden in der unverdünnten Probe eine Fraktion des
Analyten erfassen, welche sich von der Gesamtkonzentration
unterscheidet Diese einzigartige Möglichkeit liefert zwar wertvolles
Wissen über die biologische Aktivität von Ionen, fuhrt aber dazu, dass die
erhaltenen Resultate nicht konsistent mit den Gesamtkonzentrationen sind,
welche durch indirekte Potentiometrie, Flammenphotometne, Atomab-
sorptionsspektrometne oder kombinierte, komplexometrische und photo¬
metrische Verfahren erhalten werden In einem Versuch, Resultate aus
direkten ISE-Messungen in Einklang mit Messwerten aus der indirekten
56 KLINISCHE IONENANALYTIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN
Potentiometrie in der verdünnten Probe oder anderen Methoden zu
bringen, schlagt das IFCC-Dokument vor, einen Algorithmus
anzuwenden, um die Ergebnisse aus der direkten Potentiometrie
umzurechnen Die Absicht ist es, die Resultate von verschiedenen Mess¬
methoden in derselben Einheit (mmol LP'rohl_) anzugeben Es besteht
jedoch die Gefahr, dass diese Prozedur zu einer übermässig vereinfachten
Interpretation von individuellen Messwerten fuhrt Dies insbesondere
dann, wenn der Anteil an Wasser in der Probe stark vom Normwert
abweicht Ferner muss beachtet werden, dass sich der Algorithmus nur
gerade auf die einwertigen Kationen Natrium und Kalium anwenden lasst
Heute ist es aber auch möglich, mit direkter Potentiometrie die zwei
wertigen Ionen Calcium und Magnesium zu erlassen In diesem Fall ist ein
Vergleich mit herkömmlichen Methoden mit der Bestimmung der
Gesamtkonzentration ohnehin nicht mehr mit einem einfachen Algo¬
rithmus möglich Diese Ionen liegen zu einem hohen Grad als Komplexe
gebunden vor Zusatzlich ist der Komplexierungsgrad stark von weiteren
Parametern abhangig, wie zum Beispiel vom pH Wert und der
Ionenstarke
6.6. Umrechnung von Ionenaktivitäten in Ionenkonzentrationen 57
6.6. Umrechnung von Ionenaktivitäten in Ionenkonzentrationen
Wie in Abschnitt 6.5 erläutert, ist die Grösse der aktiven Molalität
m"^'1 aus historischen Gründen bis heute kein allgemein akzeptierter und
verbreiteter Parameter in der klinischen Chemie. Da aber mit einem
chemischen Sensor gerade diese Grösse erfasst wird, ist eine an¬
schliessende, mathematische Datenumrechnung unvermeidbar. Der von
der IFCC vorgeschlagene Formalismus (Gleichungen 6.20 und 6.21) wird
im folgenden Abschnitt hergeleitet:
Die totale (molare) Substanzkonzentration c^r}°hc des Ions j in einer Probe
des Probanden i kann in die folgenden drei Fraktionen eingeteilt werden:
Die freie Substanzkonzentration in der Wasserphase caiJ', der komplex
gebundene Anteil c,dj\ sowie der Anteil in der nichtwässrigen Phase
non.aq
M
Probe_ ,
aq
Ci.J~
C'i I +<rc+<r [C'HH-Wrot,] (6.i5)
Wenn ein Elektrolyt nur in der wassrigen Phase vorliegt, kann Gleichung
6.15 zu Gleichung 6.16 vereinfacht werden:
Diese Vereinfachung ist für Elektrolyte in den meisten Fällen zulässig. In
einem ersten Schritt sollen nur die frei vorliegenden Ionen in der
wassrigen Phase c^'1 betrachtet werden:
cProbe,!
= c.aq.t (61?)
werden:hergeleitetBeziehung
folgendedie6.16GleichungvonausgehendWeiseanalogeaufkann
soll,werdenermitteltKationengebundenenkomplexxSpeziesneutrale
oderAnionenanderEinbezugunterero
cSubstanzkonzentrationtotale
diee'ro
c
ProbederinSubstanzkonzentrationfreienderStelleanWenn
Probe,
C
rioucueiinioiizeiiuauunProbe.f
,
Probevolumen.gesamten
imIonsdesc1pJrobe,tSubstanzkonzentration(molaren)freienderundwird,
erfasstProbeunverdünntenderinSensorchemischeneinemmitsiewie
Wasserphase,derinIonseinesfh^'fMolalitätaktivenderzwischenhang
Zusammen¬denfürModelleinfachstedasrepräsentiertGleichungDiese
(620)=_LL_p«20Probe,.
man:erhältso6.18,Gleichungmit6.19GleichungmanKombiniert
7..j(6.19)aq.l=_^_
mäqA
verknüpft:gezeigt,6.19Gleichunginwie
yEinzelionen-Aktivitätskoeffizientenmolalendenüberfh^yMolalität
aktivendermitm*qAMolalitätdieisterwähnt,zuvorbereitsWie
(6-18)=<jJP,H2°c,Pjrobe''
wird.eingesetztc^'1Ionenkonzentration(molaren)freien
derStelleanLp'robe•kgHi0p,H2°WasservonMassenkonzentrationdie
undm*q'Molalitätdiewennman,erhältAusdruckgleichwertigenEinen
SENSORENCHEMISCHENMITIONENANALYTIKKLINISCHE58
6.6. Umrechnung von Ionenaktivitäten in Ionenkonzentrationen 59
_. aq.l -H,0
"»i.j -P."
.Probe
i+i^x-<r
r..j(6.21)
mit KjX: Assoziationskonstante für den Komplex jx
Da in den meisten Fällen die einzelnen Assoziationskonstanten sowie die
aktiven Molalitäten m^'der Komplexbildner x nicht bekannt sind, wird
in Gleichung 6.21 der Ausdruck \ + ^Kf n -\
jx i,x
V x=l )
durch Gf, jersetzt:
.Probe i
_ ju.I „H,0"*..j Pi
y..j-a..i(6.22)
a,j entspricht dem Anteil nicht gebundener Kationen j.
Da die einwertigen Kationen Na+ und K+ nur zu einem verhältnismässig
kleinen und nahezu konstanten Anteil komplex gebunden vorliegen [60],
kann für diese beiden Ionen entweder das einfachere Modell nach
Gleichung 6.20 zur Ermittlung der totalen Substanzkonzentration c*obe
angewendet werden oder besser ein konstanter Wert a} in Gleichung 6.22
eingesetzt werden. Für die zweiwertigen Kationen Ca2+ und Mg2+ ist der
Anteil an komplexierten Ionen im Verhältnis zur gesamten Konzentration
aber erheblich, so dass nur mit dem Modell nach Gleichung 6.22
gearbeitet werden kann.
Das Problem wird dadurch erschwert, dass das Ausmass der Kom-
plexierung sehr stark von der Ionenstärke und vom pH-Wert der Probe
abhängt, da Protonierungsgleichgewichte miteinbezogen sind. Bei nicht
anaerober Probenbehandlung wird der pH-Wert sehr rasch verändert und
60 KLINISCHE IONENANALYTIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN
entspricht nicht mehr den in vivo angetroffenen Bedingungen. Aus diesem
Grund werden in den eingesetzten Geräten (ISE-Analyzer) in vielen
Fällen empirische pH-Korrekturen für die Erfassung der freien Konzen¬
trationen cfj'1 an stark komplexierten Ionen wie Calcium oder
Magnesium vorgenommen.
Mit den beiden Gleichungen 6.20 oder 6.22 liesse sich nun eine korrekte
Transformation des Ausgangssignals des Sensors, der aktiven Molalität
waq'', in die klinisch akzeptierte Grösse der freien (molaren) Ionen¬
konzentration cProbe,f oder der totalen (molaren) Ionenkonzentration
cPro!» durchführen. Dazu müssten allerdings die Werte sämtlicher
beeinflussenden Grössen für die individuelle Probe bekannt sein oder
experimentell bestimmt werden'. Vor allem aus Gründen der Analyse¬
dauer ist dies aber nicht möglich.H O
Demzufolge werden in der Laborroutine die Grössen p2
, y und a,s
ersetzt durch konstante Werte pHl°, ft und DTj (siehe Tab. 6.1, 6.3; Abb.
6.5), die in der Regel den Mittelwerten von normalen Proben (d.h.
gesunden Probanden) entsprechen. Dies führt zu Gleichungen 6.23 und
6.24:
Probe.. =^i_,H20 (g ^h
. aq.l „HiO
)be
'il__
mH
W„Probe =_ij
y
(624)
wobei die Ausdrücke c-ipjrobc't und ^1pJrobc als Schätzung für die freie,
respektive die totale Substanzkonzentration stehen. Diese unterscheiden
'Im Anhang 2 sind sämtliche experimentell bestimmten Grossen und die daraus rechnerisch abgeleiteten
Grossen lur alle untersuchten Individuen wiedergegeben
6.6. Umrechnung von Ionenaktivitäten in Ionenkonzentrationen 61
sich vom wahren individuellen Wert cProbe und cProbef, wobei die relative
Abweichung ej;' respektive e^ beträgt:
Ec.t = (£Probe,. _ cProhe.. ) , ^Probe.t (625)
e;3 = (£*<*«• -cProbc)/cProbe (6.26)
Im folgenden werden die Faktoren p,H2°, y, und atJ ,die eine
Datenumrechnung beeinflussen, zunächst einzeln und dann gesamthaft
betrachtet. Dazu werden experimentell gesammelte Daten (vgl. Anhang 2)
für reale Plasmaproben von verschiedenen freiwilligen Probanden
verwendet. Die relativen Abweichungen von den entsprechenden Mittel¬
werten für gesunde Probanden werden für die Massenkonzentration von
Wasser £?, die molalen Einzelionen-Aktivitätskoeffizienten £7' sowie die
Ot
Komplexierung von Kationen e,J zunächst getrennt analysiert, bevor die
Gesamtabweichung e'j' oder ef bestimmt wird.
Aus der Sicht des Analytikers sind primär die mittleren relativen Ab¬
weichungen von Interesse, unabhängig davon, ob sie positiv oder negativ
ausfallen. Die in den folgenden Tabellen präsentierten Daten für die
mittleren relativen Abweichungen vom Mittelwert gesunder Probanden
sind daher immer aus den Absolutbeträgen der individuellen Werte le,l
berechnet. Aus medizinisch-diagnostischer Perspektive ist zusätzlich eine
Trennung der Abweichungen in positive und in negative Richtung
bedeutsam. Dieses Thema wird am Ende von Abschnitt 6.6.5 kurz
angeschnitten.
62 KLINISCHE IONENANALYTIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN
6.6.1. Individuelle und mittlere Massenkonzentration von Wasser
Für vier verschiedene Probandengruppen wurde die Massenkon¬
zentration von Wasser p2 nach Gleichung 6.2 aus Daten der Protein-
und Lipidbestimmung ermittelt. Tabelle 6.1 gibt eine Übersicht über die
erhaltenen Mittelwerte pHl° sowie die 95%-Vertrauensintervalle
(sts,95% /Vn; s: Standardabweichung; ts95%: Studentfaktor; n: Anzahl der
Proben) für die betrachteten Patientengruppen. Die niedrigsten Messwerte
wurden in Proben von Patienten mit Nierenbeschwerden nach erfolgter
Hämodialyse gefunden. Die Höchstwerte traten bei Patienten auf, welche
wegen verschiedener Herzbeschwerden auf der Intensivstation für innere
Medizin behandelt wurden. In Abbildung 6.2 ist dieser Sachverhalt
graphisch dargestellt. Die Massenkonzentration von Wasser unterscheidet
sich bei den Patienten nach der Hämodialyse sowie bei den Patienten mit
Herzbeschwerden eindeutig von den Werten, welche für gesunde
Probanden erhalten werden.
Tabelle 6.1: Experimentell bestimmte, mittlere Massenkonzentration von
Wasser pHl° (Gl. 6.2) in Humanplasmen von gesunden Probanden und
von Patienten mit verschiedenem medizinischen Status.
pHj-° Gesunde Vor Nach Herz- Gesamt
Nj-i l Dialyse Dialyse versagen
H,0'
LProbe I
(n=36) (n=18) (n=13) (n=15) (n=82)
Mittelwert 0.932 0.934 0.928 0.936 0.932
0.931 0.932 0.925 0.934 0.93195%-Intervall
0.933 0.936 0.931 0.938 0.933
6 6 Umrechnung von Ioncnakttvttaten in Ionenkonzentrationen 63
.0 940-
i 0 935 -
0 930
0 925-
VD ND HV
Abb 6 2 Experimentell ermittelte Massenkonzentration von Wasser p
gegliedert nach Probandengruppen (G Gesunde, VD / ND Vor / nach
Hämodialyse, HV Herzversagen) Dargestellt sind Mittelwert (horizon¬
tale Linie), Gesamtbereich der Datenverteilung (vertikaler Balken), 95%-
Vertrauenstntervall (graues Rechteck)
Es sollte beachtet werden, dass die Variationen in der Massen¬
konzentration von Wasser im Einzelfall auf eine Ermittlung der molaren
Ionenkonzentration ausgehend vom Messsignal eines chemischen Sensors
einen nicht unwesentlichen Einfluss haben können (vgl Tabelle 6 4) So
ist im Falle der Massenkonzentration von Wasser p der Betrag der
relativen Abweichung der Individualwerte vom Mittelwert für gesunde
Probanden ef in 20 der untei suchten 82 Falle grosser als 0 5 Prozent1
= (pf PH0)/P,H0 (6 27)
1Du Grenzwert von 0 Wr wurde willkürlich gewählt da in diesem Fall der Fehierbtiüag zum
Analystnresultat durch rechnerische Korrekturen die Haltte des in der klinischen Chemie allgemeintolerierten Gesamttehiers von 1% ausmacht Für weitere Bemerkungen zu diesem Thema sei hier auf den
Abschnitt 6 6 5 und insbesondere auf Tabelle 6 6 verwiesen
64 KLINISCHE IONENANALYTIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN
Dies bedeutet für die Bestimmung der molaren Ionenkonzentration t>1ProbL
durch Umrechnung nach Gleichung 6 24 einen Fehlerbeitrag zum
Analysenresultat von mehr als 0 5 Prozent bei 20 der untersuchten
Individuen, wenn für die Massenkonzentration von Wasser der Mittelwert
p"H'° (in diesem Fall tur gesunde Probanden) an Stelle der
Individualwerte p,'
eingesetzt wird
6 6 2 Individuelle und mittlere molale Ionenstarke
Die molale Ionenstarke /,mola' gehört zwar nicht zu den direkten
Einflussfaktoren für die Datentransformation, sie bestimmt jedoch in
erster Linie die Grosse der molalen Einzehonen-Aktivitatskoeffizienten
und wird daher in die Betrachtungen miteinbezogen In Tabelle 6 2 findet
man eine Zusammenstellung der Mittelwerte 7mohl sowie der 95%-Ver-
trauensintervalle von molalen Ionenstarken in menschlichem Plasma,
ermittelt aus experimentellen Daten nach Gleichung 6 7b Diese Werte
wurden mitunter als Grundlage für die Abschätzung der molalen Einzel-
lonen-Aktivitatskoeffizienten verwendet In Abbildung 6 3 sind die
Resultate graphisch dargestellt Die tieferen Werte für Patienten mit Herz¬
beschwerden lassen sich auf geringere freie Natriumionenkonzentrationen
cp".obet zurückfuhren, welche innerhalb dieser Probandengruppe oft
beobachtet wurden Da das Natnumion den höchsten Anteil der Kationen
im menschlichen Blut darstellt, ist die freie Natriumionenkonzentration
der dominierende Faktor für die Ionenstarke Allgemein wird diese
Tatsache beispielsweise in klinischen Elektrolytanalysatoren, basierend auf
ISE, für die Abschätzung der Ionenstarke ausgenutzt
6.6. limrcchnuna von lonenaktivitäten in Ionenkonzentrationen 65
Tabelle 6.2: Experimentell bestimmte, mittlere molale Ionenstärke 7mola'
in Humanplasmen von gesunden Probanden und von Patienten mit ver¬
schiedenem medizinischem Status.
t molal Gesunde Vor Nach Herz¬ Gesamt
[mmolkgH'i0] Dialyse Dialyse versagen
(n=36) (n=18) (n=13) (n=15) (n=82)
Mittelwert 160.9 158.4 159.0 154.1 158.8
95%-Intervall160.4
161.4
157.0
159.8
158.0
160.0
151.3
156.9
158.0
159.6
164
°.160 -
"öEE
156-
152-
148-
VD ND HV
Abb. 6.3: Molale Ionenstärke /lmol'd gegliedert nach Probandengrttppen;
(Darstellung analog zu Abb. 6.2).
66 KLINISCHE IONENANALYTIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN
Aus Tabelle 6 2 und Abbildung 6 3 lasst sich entnehmen, dass die Ionen¬
starke sich in allen pathologischen Fallen von derjenigen für gesunde
Probanden unterscheidet Dies wirkt sich direkt auf die Einzehonen-
Aktivitatskoeffizienten aus, da diese hauptsächlich von der Ionenstarke
abhangen Da die Aktivitatskoeffizienten mit steigender Ionenstarke
abnehmen, wird für erstere ein verglichen mit /,mohl umgekehrtes
Verteilungsmuster erwartet, was in Abschnitt 6 6 3 auch bestätigt
gefunden wird
6 6 3 Individuelle und mittlere molale Einzehonen-Aktivitatskoeffizienten
In der Tabelle 6 3 sowie in der Abbildung 6 4 sind die Mittelwerte
yi sowie die 95%-Vertrauensintervalle der molalen Einzehonen-Aktivi-
tatskoeffizienten, abgeschätzt aus experimentellen Daten nach der Methode
von Pitzer (vgl Gleichungen 6 10 bis 6 14), für die verschiedenen
Gruppen von Probanden zusammengefasst Sämtliche Daten beziehen sich
auf die physiologische Temperatur 37 °C Über alle Probanden gesamthaft
betrachtet zeigen im Falle von Na+, K+ und Cl die Koeffizienten relative
95%-Vertrauensintervalle unterhalb von 0 06 Prozent Für die zwei¬
wertigen Ionen Ca2+ und Mg,+ liegen die Werte unterhalb von 0 14
Prozent Die grossten Streuungen findet man in der Gruppe der Patienten
mit Herzerkrankungen Wie schon im Falle der Ionenstarke lassen sich
auch diese Variationen hauptsächlich auf die grosseren Schwankungen der
freien Natriumionenkonzentration zurückfuhren Auch bei den Aktivitats¬
koeffizienten findet man signifikante Unterschiede zwischen Probanden
aus den pathologischen Gruppen und gesunden Probanden Es muss jedoch
beachtet werden, dass diese Unterschiede zwar statistisch signifikant, als
relative Differenzen betrachtet aber gering sind
6 6 Umrechnung von lonenaktivitäten in Ionenkonzentrationen 67
Tabelle 6 3 Experimentell bestimmte, mittlere Einzehonen-Aktivitats-
koetfizienten y] in Humanplasmen von gesunden Probanden und von Pati¬
enten mit verschiedenem medizinischem Status
Probanden¬ Ion
gruppe
Gesunde Mittelwert
(n=36)95%-Intervall
Vor Mittelwert
Dialyse95%-Intervall
(n=18)
Nach Mittelwert
Dialyse95%-Intervall
(n=13)
Herz¬ Mittelwert
versagen95%-Intervall
(n=15)
Gesamt Mittelwert
(n=82)95%-Intervall
Na+ K+ Cl Ca1+ Mg2-
0.7430 0.7263 0.7446 0.3417 0.3507
0 7428 0 7261 0 7444 0 3414 0 3505
0 7432 0 7265 0 7448 0 3420 0 3509
0 7440 0 7276 0 7455 0 3430 0 3520
0 7434 0 7269 0 7450 0 3422 0 3512
0 7446 0 7283 0 7460 0 3438 0 3528
0 7438 0 7273 0 7452 0 3428 0 3518
0 7434 0 7268 0 7448 0 3422 0 3513
0 7442 0 7278 0 7456 0 3434 0 3523
0 7458 0 7297 0 7474 0 3455 0 3542
0 7446 0 7283 0 7463 0 3439 0 3527
0 7470 0 7311 07485 03471 03557
0 7438 0 7274 0 7454 0 3429 0 3518
0 7441 0 7270 0 7451 0 3424 0 3514
0 7435 0 7278 0 7457 0 3434 0 3522
68 KLINISCHE IONENANALYTIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN
0.750n
0.748-
Na+ 0.734-
0.732-
0.730-
0.728-
0.726-
1
0.358-
0.356-
0.354-
0.352-
0.350-
1
K+
-0.746-^-
—i—
0.744-r-— h -i
0.742-
1
0.350-
0.348-
II 1 1
G VD ND
„2+
Ca
HVi i 1 1
G VD ND
Mg2+
HV
-0.346-
0.344-
| i
0.342-
0.340-
1— —1 1— —1
i— =i i— —1
1
C7"T3 VD
I
N1
D HV c7"T
VDi i
ND HV
er
0.750-
0.748- w i
Ä.
0.746^
1- —j
0.744-
E 3
r~^ 1 1
G VD ND HV
Abb. 6.4: Molale Einzelionen-Aktivitätskoeffizienten von Na+, K+, Ca2+,
Mg2+ und Cl in Humanplasma, abgeschätzt aus experimentellen Daten
nach dem Pitzer-Modell, gegliedert nach Probandengruppen; (Darstellung
analog zu Abb. 6.2).
6 6 Umrechnung von lonenaktivitäten in Ionenkonzentrationen 69
In Analogie zu Abschnitt 6 6 1 kann auch an dieser Stelle der Fehler¬
beitrag der Variationen in den molalen Einzehonen-Aktivitatskoef-
fizienten auf das Analysenresultat des Sensors im Falle einer Konzentra¬
tionsbestimmung nach IFCC abgeschätzt werden Die Resultate sind in
Tabelle 6 4 zusammengefasst Betrachtet für die Einzehonen-Aktivitats¬
koeffizienten findet man relative Abweichungen vom Mittelwert von
gesunden Probanden |e,''| über 0 5 Prozent bei Na+ und Cl für 5
Individuen, bei 7 Individuen für K+ und bei 23 Individuen für Ca2+ und
Mg2+ nach Gleichung 6 28
£*' =(7l-7n)/Yl) (6 28)
Bei einer Umrechnung von gemessenen aktiven Molahtaten m*q in
molare Substanzkonzentrationen ^|pjobe nach Gleichung 6 24 unter Ver¬
wendung von Mittelwerten der Aktivitatskoeffizienten y} werden in den
oben aufgezahlten Fallen Beitrage von mehr als 0 5 Prozent zum gesamten
Fehler der Analyse geliefert Besonders häufig treten grossere Ab¬
weichungen vom Mittelwert bei Patienten mit Nierenbeschwerden vor der
Hämodialyse, sowie bei herzkranken Patienten auf der Intensivstation auf
In beiden Fallen sind Störungen im Elektrolythaushalt des Korpers Be¬
standteil des Krankheitsbildes Da gerade für diese Patientengruppen die
Erfassung von freien Elektrolytkonzentrationen besonders relevant ist und
sich der Einsatz von peripheren Sensorgeraten hier anbietet, sollte diese
Tatsache keineswegs unbeachtet gelassen werden
70 KLINISCHE IONENANALYTIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN
6.6.4 Komplexierung von zweiwertigen Kationen
In Abbildung 6.5 ist der in der Probe frei vorliegende Anteil a,
der Ionen Ca2* und Mg2+ in Abhängigkeit der Probandengruppe dar¬
gestellt. Die Werte wurden experimentell aus den Differenzen der gemes¬
senen totalen Substanzkonzentratione
und der freien Ionenkonzen¬
tration im wassrigen Probenanteil c1p,"t'e't bestimmt und sind nicht pH-
korrigiert1. Eine rechnerische Bestimmung von c-1p'obe wäre für beide
Ionen nur dann sinnvoll, wenn der Komplexierungsgrad in allen Fällen
gleich gross wäre und dadurch wie in Gleichung 6.24 als Konstante
behandelt werden könnte. Aus Abbildung 6.5 geht jedoch hervor, dass
diese Grösse erheblichen Schwankungen unterworfen ist. Dies insbe¬
sondere dann, wenn die Probe nicht anaerob behandelt wird und es
dadurch zu Veränderungen des pH-Wertes kommt.
52-Ca2+ 76-
72-
68-
0-64-
z 60-
? 56-a
52-
48-
44-
1
Mg2+
1—
It« Mg
—1^48- h- H .
. P —|o
a 44-
40-
M M
Cl
5 V]
D ND HV C3i
V!
D ND HV
Abb. 6.5: Experimentell bestimmte, freie Anteile an Ca2+ und Mg2+ in
Prozent der entsprechenden totalen Substanzkonzentration in Humanplas¬
ma, gegliedert nach Probandengruppen; (Darstellung wie in Abb. 6.2).
1
ISE-EIektrolyt-Analyzcr bieten in der Regel die Möglichkeit zur Korrektur der pH-abhängigen Messwerte
der freien Ionenkonzentrationen von Ca:* und Mg:+ auf einen physiologischen pH-Wert von 7.40 [61, 62].
6 6 Umrechnung von lonenaktivitäten in Ionenkonzentrationen 71
Betrachtet man die relativen Abweichungen e" des Anteils frei
vorliegender Ionen vom Mittelwert für gesunde Probanden nach
Gleichung 6 29, so wird für das Ca2+-Ion und für das Mg'+-Ion bei 75 der
82 untersuchten Individuen ein Wert von 0 5 Prozent überschritten Die
mittleren, relativen Abweichungen für die einzelnen Probandengruppen
sind in Tabelle 6 4 aufgeführt
e^' =(w,-a1J)/a1J (6 29)
Dies bedeutet, dass der Fehlerbeitrag zum Analysenresultat infolge der
Datenumrechnung nach Gleichung 6 24 alleine von der variablen Ionen-
komplexierung für fast alle untersuchten Proben mehr als 0 5 Prozent
betragt
Die Resultate der vorangehenden Untersuchungen zu den einzelnen beein¬
flussenden Parametern p,H'°, y, und al} sind in Tabelle 6 4 zusammen¬
gestellt Die Übersicht beinhaltet alle durch die Datenumrechnung
verursachten, relativen Fehlerbeitrage |e, | in Abhängigkeit der einzelnen
relevanten Grossen
72 KLINISCHE IONENANALYTIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN
Tabelle 6.4: Mittlere relative Fehlerbeiträge |e|, die auftreten, wenn
Mittelwerte gesunder Probanden (Gl. 6.23 / 6.24) anstelle von
individuellen Daten (Gl. 6.20 / 6.22) zur Datenumrechnung eingesetzt
werden. Die Resultate sind aufgelistet nach den einzelnen, beeinflussenden
Parametern. Alle Angaben in Prozent des Messwertes.
Parameter Gesunde Vor Nach Herz- Gesamt
Dialyse Dialyse versagen
(n=36) (n=18) (n=13) (n=I5) (n=82)
AHl0 Mittel 0.24 0.34 0.59 0.40 0.35
95%0.19
0.30
0.20
0.48
0.39
0.79
0.20
0.60
0.29
0.41
'Na*Mittel 0.05 0.15 0.11 0.38 0.14
95%0.03
0.07
0.08
0.22
0.06
0.16
0.23
0.53
0.10
0.18
V Mittel 0.07 0.19 0.14 0.47 0.18
95%0.05
0.09
0.10
0.28
0.08
0.20
0.39
0.65
0.13
0.23
rcr Mittel 0.05 0.13 0.09 0.38 0.14
95%0.03
0.07
0.07
0.19
0.04
0.14
0.23
0.53
0.10
0.18
y^ Mittel 0.16 0.45 0.34 1.12 0.43
95%0.11
0.21
0.24
0.66
0.18
0.49
0.69
1.55
0.31
0.55
6 6 Umrechnung von lonenaktivitäten in Ionenkonzentrationen 73
Tabelle 6.4' Fortsetzung
Parameter Gesunde Vor Nach Herz- Gesamt
Dialyse Dialyse versagen
(n=36) (n=18) (n=13) (n=15) (n=82)
'Mir
Mittel 0.15 0.41 0.31 1.02 0.39
95%0.10
0.20
0.22
0.60
0.16
0.46
0.62
1.42
0.28
0.50
ac- Mittel 2.28 5.65 6.86 4.29 4.11
95%1.67
2.89
4.15
7.15
2.71
11.00
2.63
5.95
3.26
4.96
°v- Mittel 3.01 3.52 26.99 4.53 7.20
95%2.20
3.81
1.47
5.56
17.89
36.09
2.29
6.77
4.82
9.58
6.6.5 Transformation von aktiven Molalitäten in freie (molare) Ionen¬
konzentrationen
Bis jetzt wurden die relativen Beiträge der Massenkonzentration
von Wasser, der molalen Einzelionen-Aktivitätskoeffizienten und der
Komplexierung (im Falle der zweiwertigen Kationen Ca2+ und Mg2+) zum
resultierenden Umrechnungsfehler getrennt analysiert. An dieser Stelle
sollen nun die umrechnungsinduzierten Abweichungen ef,f gesamthaft
nach Gleichung 6.25 betrachtet werden. Die Resultate sind in Tabelle 6.5
und in Abbildung 6.6 dargestellt.
Es ist zu beachten, dass auch für die Ionen Ca2+ und Mg2+ lediglich die
Umrechnung von aktiven Molalitäten m^'1 zu freien Ionenkon-
74 KLINISCHE IONENANALYTIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN
zentrationen cPr"bel berücksichtigt wird Eine allfalhge Ermittlung der
totalen Substanzkonzentration c1Probc wird nicht diskutiert, da wegen der
starken Schwankungen im Komplexierungsgrad eine Umrechnung eines
mit einem Sensor erhaltenen Messwertes nach Gleichung 6 24 nicht
sinnvoll ist und m der Regel auch nicht durchgeführt wird Die dabei
resultierenden Fehlerwerte waren um ein Mehrfaches grosser als
diejenigen, welche durch die Ermittlung der freien Ionenkonzentration
£,pJrobe' nach Gleichung 6 23 erhalten werden
6 6 Umrechnung von lonenaktivitäten in Ionenkonzentrationen 75
Tabelle 6 5 Mittlere relative Fehlerbeitrage Ec,die auftreten, wenn
Mittelwerte gesunder Probanden (Gl 6 23) anstelle von individuellen
Daten (Gl 6 20) zur Umrechnung von aktiven Molalitaten in freie,
molare Ionenkonzentrationen eingesetzt werden Die Resultate sind
getrennt für die einzelnen Ionen aufgelistet Alle Angaben in Prozent des
Messwertes
Ionj Gesunde Vor Nach Herz- Gesamt
Dialyse Dialyse versagen
(n=36) (n=18) (n=13) (n=15) (n=82)
Na+ Mittel 0 24 031 061 0 27 0 32
0 19 021 0 40 0 15 0 2795%
0 30 0 42 0 83 0 38 0 38
K+ Mittel 0 24 0 32 0 62 0 29 0 33
0 19 0 23 0 40 0 17 0 2795%
0 30 0 42 0 84 0 42 0 39
Cl Mittel 0 24 0 32 0 60 0 26 0 32
0 19 0 20 0 39 0 15 0 2695%
0 30 0 43 081 0 38 0 37
Ca,+ Mittel 0 27 0 43 0 78 0 79 0 48
0 20 0 28 0 56 0 43 0 3995%
0 34 0 59 100 1 15 0 58
Mg,+ Mittel 0 27 0 40 0 75 0 69 0 45
0 20 0 25 0 53 0 37 0 3695%
0 34 0 54 0 98 102 0 54
76 KLINISCHE IONENANALYTIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN
^
1.0
0.8-
0.6-
0.4
0.2
0.0
Na
G VD ND HV
2.0-
1.6-
1 ?-
Ca2+
0.8-
0.4-
0.0-
1:
_
r"""^—r
1.0-
0.8-
;o.6-
r0.4-
0.2-
0.0-
Cl"
l j
tz I
1.0-
0.8-
0.6-
0.4-
0.2-
0.0-
K+
i ZDI I
I ^
1.6-
1.2-
Mg2+
0.8-
l—0.4-
i
o.o-
—*—
I —IVD ND HV
G VD ND HV
Abb. 6.6: Durch Datenumrechnung nach Gleichung 6.23 verursachte
relative Abweichungen Ef'
für die Ionen Na+, K+, Ca2+, Mg2+ und Cl in
Prozent: (Darstellung analog zu Abb. 6.2).
6 6 Umrechnung von lonenaktivitäten in Ionenkonzentrationen 77
Die in Tabelle 6 5 zusammengefassten Resultate belegen, dass die freie,
molare Substanzkonzentration cProbe' nicht in allen Fallen mit genügender
Sicherheit aus gemessenen aktiven Molalitäten m*q ermittelt werden
kann Das Risiko, neben dem analytischen Fehler der Messmethode einen
zusätzlichen Beitrag zum Gesamtfehler der Analyse durch mathematische
Datentransformation einzufuhren, ist nicht vernachlassigbar In der
Gruppe von Probanden nach erfolgter Behandlung durch Hämodialyse ist
das Fehlernsiko am grossten Vor allem bei den einwertigen Ionen
unterscheidet sich diese Gruppe von Patienten klar von den übrigen
Probandengruppen Bei den zweiwertigen Ionen, wo allgemein grossere
Differenzen auftreten, heben sich die Gruppen der Patienten nach der
Hämodialyse und die Patienten mit Herzbeschwerden von den übrigen
Probanden ab
Zu Beginn von Kapitel 6 6 wurde erwähnt, dass es aus der Sicht des
Mediziners für die diagnostische Interpretation der Daten entscheidend
sein kann, in welche Richtung die Abweichungen durch rechnerische
Datentransformation aultreten Abbildung 6 7 zeigt die Histogramme mit
dem Verteilungsmuster der Gesamtabweichungen ef' für die einzelnen
Ionen
78 KLINISCHE IONEN ANALYTIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN
40 - Na+
4820 -
o -
21
9
9
11
2
7
_8_15
3420 -
G VD ND HV Tot.'
60
40
N 20
0 H
20
Ca
23
13
"TänrTi" 13
62
20
i 1 i r
G VD ND HV Tot
40
20
20
Cl
48
21
9 117
159 2 _8_
34
I I
40 -
20
0 -
20
G VD ND HV Tot.
40 -
Mc2+
5920 -
o -
22
12 13 12
14L6J 0
323
20 -
G VD ND HV Tot.
Eu >0
£l] <0
G VD ND HV Tot.
Abb. 6.7: Häufigkeit N der relativen Abweichungen ef'j (Gleichung 6.25)
in positiver respektive negativer Richtung, dargestellt für die untersuchten
Ionen.
6 6 Umrechnung von lonenaktivitäten in Ionenkonzentrationen 79
Wie aus Abbildung 6 7 hervorgeht treten die beobachteten relativen Ab¬
weichungen e'' vermehrt mit positivem Vorzeichen auf Dies bedeutet,
dass die nach Gleichung 6 23 aus Mittelwerten abgeschätzten freien Ionen¬
konzentrationen e>Pro1*'' für die Mehrzahl der untersuchten Individuen
grosser als die wahren Werte c,p[obct, berechnet mit den individuellen
Daten ausfallen Hauptverantwortlich für diese Beobachtung ist eine
gegenüber dem Mittelwert im allgemeinen leicht erniedrigte Massen
konzentration von Wasser p,H,°, wie dies sehr deutlich bei Patienten nach
der Behandlung durch Hämodialyse zum Ausdruck kommt Für den Arzt
besteht somit die Gefahr einer Fehldiagnose, verursacht durch
vermeintlich erhöhte Laborwerte für die Elektrolyte
Das Ausmass der in Tabelle 6 5 angegebenen Abweichungen lasst sich am
besten beurteilen, wenn sie mit den idealerweise diagnostisch zulassigen
Fehlern verglichen werden Diese werden oft unabhängig vom Analyten
auf 1 % festgesetzt Daneben existieren aber auch Richtlinien, die sich an
der intraindividuellen biologischen Variation der einzelnen Analyte
orientieren Gemäss den Richtlinien des CAP (College of American
Pathologists) [63 64], berechnet sich der total zulassige analytische Fehler
cva für die Bestimmung einer klinisch relevanten Grosse nach Gleichung
6 30
mit cva Totaler, zulassiger, analytischer Fehler
cvb mtrd Biologische, intraindividuelle Variation [65]
80 KLINISCHE IONENANALYTIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN
Tabelle 6 6 Totaler, zulassiger analytischer Fehler, berechnet nach den
Richtlinien des CAP
Analyt Total zulassiger analytischer Fehler
cvd [%]
Na+ 0 3
K+ 2 2
Ca"+ 0 85a
Mg2+ 1 la
Cl 0 7
aWerte für die totale Ionenkonzentration cvbmlri für freie Ionenkonzen¬
tration nicht verfugbar
Beim Vergleich der Daten in Tabelle 6 5 und 6 6 muss man feststellen,
dass für das Na+-Ion alleine der Beitrag der Datenumrechnung zum
analytischen Fehler den Wert des totalen, idealerweise zulassigen Fehlers
bereits überschreitet oder annähernd erreicht Die Zahlen in Tabelle 6 5
enthalten aber noch keine Fehlerbeitrage, verursacht durch die Mess¬
methode an sich Besser sieht die Situation im Falle des K+-Ions aus Hier
vermag der durch den Umrechnungsalgonthmus nach Gleichung 6 23
verursachte Fehlerbeitrag den total zulassigen analytischen Fehler nicht zu
erreichen Für die beiden zweiwertigen Kationen Ca2+ und Mg2+, sowie
das Amon Cl, werden die total zulassigen analytischen Fehler nicht
überschritten, für manche Probandengruppen (nach der Hämodialyse,
Herzversagen) jedoch nahezu erreicht Es ist zu beachten, dass es sich bei
den Zahlen in Tabelle 6 6 um Idealwerte handelt, die aber in der heutigen
Laborpraxis in der Regel nicht erreicht werden (vgl Abschnitt 9 1 5)
Eine Reduktion der analytischen Fehler drangt sich auf Um so mehr
6 6 Umrechnung von lonenaktivitäten in Ionenkonzentrationen 81
müssen zusätzliche Fehlerbeitrage, die nicht durch die Messmethode
selbst, sondern durch rechnerische Datentransformation verursacht
werden ausgeschlossen werden
Die erhaltenen Resultate belegen am Beispiel von lediglich zwei
pathologischen Probandengruppen, bei welchen der Elektrolythaushalt
eine entscheidende Rolle spielt, dass durch die Umrechnung von
gemessenen aktiven Molalitäten in freie oder totale Ionenkonzentrationen
ein relativ hohes Fehlemsko eingegangen wird In dieser Studie wurden
keine Proben von Patienten, die unter starker Hypo Hydratation leiden,
mituntersucht Auch für solche Falle werden aber grossere Abweichungen
auf Grund der Variationen in der Massenkonzentration von Wasser
erwartet Wegen des experimentell wesentlich höheren Aufwandes ist eine
Datentransformation unter Berücksichtigung individueller Aktivitats¬
koeffizienten und Massenkonzentrationen von Wasser auch keine
allgemeine Losung für dieses Problem Zusatzlich muss bei der
experimentellen Bestimmung der Massenkonzentration von Wasser
bedacht werden, dass die zuvor beschriebene Methode selbst
Unsicherheiten mit sich bringt Klinisch betrachtet, ist das Resultat einer
aktiven Molahtatsbestimmung ohnehin wertvoller als die Konzentrations¬
messung
82 KLINISCHE 1QNENANALYTIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN
6.7. Kalibration chemischer Sensoren für physiologische
Proben
Da die korrekte Kalibration eines Sensorsystems entscheidend fut
die Qualität des Analysenresultates ist, sollen an dieser Stelle einige
grundsatzliche Hinweise zu diesem Thema im Hinblick auf die
Anwendung in klinischen Proben gegeben werden Die hier getroffenen
Überlegungen sind in der Regel für alle Typen von chemischen Sensoren
gültig Ein Spezialfall für die Kalibration von potentiometnschen
Sensoren wird in Kapitel 6 9 diskutiert Prinzipiell stehen für die Kali¬
bration eines chemischen Sensors für den Direkteinsatz (d h ohne Ver¬
dünnung) in der klinischen Probe zwei verschiedene Möglichkeiten zur
Wahl Dabei stosst man auf die Frage ob der Sensor für die Messung der
(molaren) Substanzkonzentration oder der aktiven Molalitat kalibriert
werden soll
Der Sensor kann einerseits mit wassrigen Losungen bekannter Zusammen¬
setzung kalibriert werden oder aber es werden Losungen verwendet, die
mit Proteinen versetzt sind und somit den physiologischen Proben am
nächsten kommen In beiden Fallen kann die Kalibration mit oder ohne
Hintergrund von potentiell interferierenden Komponenten durchgeführt
werden Im Extremfall gelangen sogar physiologische Proben mit
bekanntem Gehalt des zu kalibrierenden Analyten zum Einsatz Diese
müssen zuvor mit einer unabhängigen Referenzmethode analysiert worden
sein Je nach Zielgrosse bietet die eine oder die andere Methode gewisse
Vorteile In einfachen wassrigen Losungen bekannter Zusammensetzung
lassen sich beispielsweise für Elektrolyte relativ leicht und zuverlässig die
Einzehonen-Aktivitatskoeffizienten nach der Methode von Pitzer
abschätzen Somit wird die Kalibration des Sensors auf der Basis der
aktiven Molalitaten ermöglicht Dies bedeutet, dass aus dem Messsignal
direkt das Resultat in Form der aktiven Molalität erhalten wird Alle
resultierenden Fehler sind somit durch die Messmethode selbst (z B
6 7 Kalibration chemischer Sensoren für physiologische Proben 83
Selektivitatsprobleme), sowie duich geringe Unsicherheiten in der
Abschätzung der Aktivitatskoeffizienten gegeben Probleme ergeben sich
lediglich in den Fallen, in denen eine Abschätzung der Aktivitats¬
koeffizienten nicht zuverlässig möglich (fehlende Parameter) oder
problematisch (z B neutrale Analyte) ist Wird die Kalibration mit
wassrigen Losungen durchgeführt, die einen konstanten physiologischen
Elektrolythintergrund haben, können auch Selektivitatsprobleme, sowie
das Flussigkeitspotential (vgl Kap 5 1 und 6 9) weitgehend eliminiert
werden Allerdings wird dadurch die mathematische Abschätzung der
Einzehonen-Aktivitatskoeffizienten erschwert und es muss sichergestellt
sein, dass ein zuverlässiger, plausibler Berechnungsformalismus (z B
nach Pitzer) zur Verfugung steht
Wie in Abschnitt 6 6 ausführlich dargestellt, ist aber in der klinischen
Chemie die Grosse der freien oder der totalen (molaren) Ionen¬
konzentration gebräuchlich Diese wird einerseits durch die im
voranstehenden Kapitel beschriebene Umrechnung erhalten, oder aber
durch die Kalibration des Sensors auf der Basis von Konzentrationen
unter möglichst probennahen Bedingungen Dazu verwendet man protein-
haltige Losungen oder physiologische Proben Beide Verfahren verbergen
die gleichen potentiellen Fehlerquellen In beiden Fallen wird davon
ausgegangen, dass die Aktivitatskoeffizienten für den Analyten in der
Probe und im Kahbrator identisch sind respektive in der Probe
unverändert bleiben Die gleiche Annahme gilt für die Massen
konzentration von Wasser Abweichungen von diesen Annahmen haben
Fehler im Analysenresultat wie in Kapitel 6 6 gezeigt zur Folge
84 KLINISCHE IONENANALYTIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN
6.8. Abschätzung der Massenkonzentration von Wasser durch
Vergleich von lonenaktivitäten und Ionenkonzentrationen
Gleichungen 6 20 und 6 22 zeigen, dass das Verhältnis der totalen
Ionenkonzentration cProbe und der aktiven Molalität m1^' von der
Massenkonzentration von Wasser p, abhangig ist Dies gestattet es
theoretisch, die nicht direkt messbare Massenkonzentration von Wasser
aus den routinemassig zugänglichen Werten für die totale Ionen
konzentration und die aktive Molalitat abzuschätzen Dieses Verfahren
wird beispielsweise in einem kommerziell erhältlichen Analyzer der
Firma NOVA Biomedical1 zur Aufdeckung von Anomalien im
Wassergehalt der Probe eingesetzt [66] Dazu werden die Messwerte für
das Na+-Ion, erhalten mit ISE in der unverdünnten Probe (proportional zu
maq f
j), mit denjenigen, erhalten durch die indirekte Potentiometrie
(entspricht c" ) verglichen
An dieser Stelle soll nun untersucht werden, inwiefern dieses Verfahren
für die in dieser Arbeit untersuchten Proben anwendbar ist und ob sich
die Methode auch auf andere Kationen übertragen lasst Dazu wurde ein
einfaches lineares Regressionsmodell aufgestellt
A = ßc.
V'"'J J
c/in
( Probt ^Cl J
vacl t
m,
+ CONST + E, (6 31)
mit ß(/„, Regressionskoeffizient für den Quotienten aus cProbe
und m")'E, Zufällige Abweichungen vom Modell
Die Regression wurde mit allen 82 Datensätzen durchgeführt Die
Resultate sind in Tabelle 6 7 zusammengefasst Im postulierten Modell
wird der Quotient aus c,Probc und m*q[ als fehlerfreie erklärende Variable
NOVA NUCLEUS(NOVA BIOMEDICAL GmbH Rüdermark Germany)
6 8 Abschätzung der Massenkonzentration von Wasser 85
betrachtet Der Ausdruck E, repräsentiert die Residuen, das heisst den
nicht durch die erklärende Variable und die Konstante erfassten Beitrag
zum Modell
Als experimentelle Parameter wurden für die statistische Analyse
einerseits die mit indirekter Potentiometrie oder Photometrie bestimmte
totale (molare) Ionenkonzentration und andererseits der aus der direkten
Potentiometrie (unverdünnte Probe) stammende Messwert, der direkt
proportional zur aktiven Molalität ist, eingesetzt In Abbildung 6 8 sind
die der Regression zugrundeliegenden individuellen Quotienten von c1Probeund int'q' gegenüber der Massenkonzentration von Wasser graphisch
dargestellt
86 KLINISCHE IONENANALYTIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN
10.94-
Jj?0.93-
0.92-1
Na
—I ' 1 ' 1
0.92 0.94 0.96
0.94-K+
.."
•
. D * "~^^^
0.93- •^^ "
T
1 ' l '
0.90 1.00
Probe ./w aq,f.(c /m )/(kgH0L Probe)
10.94-
CT)0.93-
0.92-
Ca
-i 1 1 1 1 1 r
2.00 2.20 2.40
Probe .*, aq,f
0.94-
0.93-
0.92 4
Mg2+
-i 1 1 , 1 1
1.60 2.00 2.40
(c /m )/(kgH0L Probe)
Abb. 6.8: Zugrundeliegende experimentelle Datenpunkte (o), Regressions¬
gerade (ausgezogene Linie) und 95%-Vertrauensband (unterbrochene
Linie) für das lineare Regressionsmodell (Methode der kleinsten Fehler¬
quadrate) nach Gleichung 6.31.
Alleine die Betrachtung von Abbildung 6.8 zeigt, dass sich die
experimentell bestimmten Daten nicht vollständig durch einen einfachen,
6 8 Abschätzung der Massenkonzentration von Wasser 87
linearen Zusammenhang beschreiben lassen Bei der Regression nach
Gleichung 6 31 wurden bewusst keine Ausreisser aus der Datenanalyse
ausgeschlossen, denn es sollte die Gültigkeit der Modellbeziehung für alle
betrachteten Individuen abgeklärt werden Aus diesem Grund sind auch
offensichtliche Extremwerte, denen möglicherweise mit den beobachteten
Parametern nicht erfassbare medizinische Faktoren zugrunde liegen, im
Regressionsmodel] mitberucksichtigt Dementsprechend fallt auch das
Resultat der Regressionsanalyse (Methode der kleinsten Fehlerquadrate)
aus, wie aus Abbildung 6 8 und Tabelle 6 7 entnommen werden kann Die
Messwerte tur das hier betrachtete Gesamtkollektiv von Probanden lassen
sich durch das nach der Methode der kleinsten Fehlerquadrate gefundene
lineare Modell nicht korrekt beschreiben Die Daten verlangen nach einer
anderen Regressionsmethode Einzelne Individuen üben eine sehr starke
Hebelwirkung auf die Regressionsgerade aus, was besonders deutlich für
das K+-Ion zutrifft Für die Betrachtung der Extrema als Ausreisser,
verursacht durch messtechnische oder experimentelle Fehler, lagen
innerhalb der erfassten klinischen Grossen keine Indizien vor Deshalb
wurden die entsprechenden Daten nicht aus dem Datensatz ausgeschlossen
88 KLINISCHE IONENANALYTIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN
Tabelle 6 7 Resultate aus der einfachen linearen Regressionsanalyse
(Methode der kleinsten Fehlerquadrate) nach Gleichung 6 31 (R"
Bestimmtheitsmass)
Ionj ß/ CONST R1
95%-Vertrauensbereich 95%-Vertrauensbereich
[xlO1]
Na+ 191 58 ± 81 06 0 750 ± 0 077 0218
K+ 30 11 ± 3165 0 904 ± 0 030 0 043
Ca,+ -16 25+ 7 70 0 966 ±0 016 0 182
Mg,+ 1071+ 436 0 950 ± 0 007 0 232
Für alle Ionen j wurde ein kleines Bestimmtheitsmass R1 gefunden, was
auch aus Abbildung 6 8 gut ersichtlich ist Für Kalium kann überhaupt
nicht mehr von einer Korrelation im Sinne des aufgestellten Modells
gesprochen werden Insbesondere ist auch das relative 95%-Vertrauens-
mtervall der Steigung für dieses Ion sehr gross und die Steigung deshalb
nicht mehr signifikant von Null verschieden Dafür verantwortlich sind
die auftretenden Extremwerte, wie aus Abbildung 6 8 sehr gut ersichtlich
ist Im Falle eines Ausschlusses der 4 Extrema (Quotient > 1 0 oder < 0 9)
verbessert sich das Bestimmtheitsmass auf einen Wert von 0 185 und ist
somit mit demjenigen von Ca,+ vergleichbar Ferner findet man eine
Steigung der Regressionsgerade, die nahezu derjenigen von Na+
entspricht Wie bereits erwähnt, fehlt für diese Ausreisserehmination aber
eine plausible Begründung Für die übrigen Elektrolyte Na+, Ca^+ und
Mg2+ sind keine grossen Unterschiede im Bestimmtheitsmass zu
beobachten Dieses Resultat überrascht insofern, als das Verhältnis von
cProbe un(j ^aqi
^uT ^ zweiwertigen Ionen stark vom
6 8 Abschätzung der Massenkonzentration von Wasser 89
Komplexierungsgrad abhangt, der grossen Schwankungen unterliegt (vgl
Abb 6 5) Die negative Steigung für Ca2+ und Mg2+ lasst sich damit
begründen, dass die aktive Molalitat m*q' mit zunehmendem
Proteingehalt einer Probe durch Komplexierung verringert wird
Gleichzeitig fuhrt aber eine erhöhte Proteinkonzentration nach Gleichung
6 2 zu einem verminderten Wasseranted in der Probe
Aufgrund der erhaltenen Resultate wurde versucht, ein gegen
Extremwerte robusteres Regressionsmodell anzuwenden [67 68] Dabei
werden die Extrema mit einem geringeren Gewichtungsfaktor
berücksichtigt Die zugehörigen Daten sind in Tabelle 6 8
zusammengestellt
Tabelle 6 8 Resultate aus der robusten Regressionsanalyse (Methode nach
Huber [68]) nach Gleichung 6 31
Ionj ß./M CONST
95%-Vertrauensbereich 95%-Vertrauensbeieich
[xlO1]
Na+ 322 35 + 91 96 0 625 + 0 088
K+ 26 28 ± 49 48 0 907 + 0 047
Ca1+ -16 23 ± 9 37 0 966 ± 0 020
Mg2+ -14 57 ± 4 92 0 955 ± 0 008
Die Ähnlichkeit der Daten in Tabellen 6 7 und 6 8 belegt, dass mit dem
robusteren Regressionsverfahren mit Ausnahme tur das Natnumion
(geringere Unsicherheit in der Steigung der Regressionsgeraden) keine
90 KLINISCHE IONENANALYTIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN
signifikanten Verbesserungen gegenüber der Methode der kleinsten
Fehlerquadrate erzielt werden können
In einem weiteren Schritt wurde untersucht, ob das Modell verbessert
werden konnte, indem zusätzliche Parameter in die Betrachtung mit
einbezogen wurden Insbesondere war es interessant abzuklären ob das
Alter und das Geschlecht des Patienten sowie der medizinische Status
einen Einfluss auf das Resultat ausüben Dazu wurde das Modell folgen
dermassen erweitert
p,HU=CONST + ß(/,
( Pr obc \' J
mdL] t
+ ßSEX SEX + ßJAHR JAHR
(o M)V ij J
+ßzi Zl + ßZ2 Z2 + ßZ3 Z3 + E,
mit ßk Regressionskoeffizienten
SEX Indikatorvanable für das Geschlecht (l=mannlich,
2=weibhch)
JAHR Jahrgang des Probanden
Zn Indikatorvanable für den medizinischen Zustand
ZI l=Patienten vor der Dialyse 0=ubnge
Z2 l=Patienten nach der Dialyse 0=ubnge
Z3 l=Patienten mit Herzbeschwerden 0=ubnge
Die Variablen SEX und JAHR wurden mitberucksichtigt, da sich ihre
Häufigkeitsverteilungen innerhalb der verschiedenen Probandengruppen
stark unterschieden Da die Specimen nicht anaerob abgenommen und
gelagert werden konnten, traten Schwankungen im pH-Wert auf, die
keinen Zusammenhang mit dem medizinischen Status des Probanden
zeigten Daher wurde für die Betrachtung der zweiwertigen Ionen Ca2+
und Mg2+ mit einem pH-abhangigen, hohen Anteil an komplexierten
6 8 Abschätzung der Massenkonzentiation von Wasser 91
Kationen im Modell 6 32 als zusatzliche Variable der pH-Wert
berücksichtigt Anhand des Modells sollten Antworten auf die folgenden
Fragen gefunden werden
1 Welche Variablen haben einen signifikanten Einfluss auf das
Modell'
2 Lasst sich das Giundmodell nach Gleichung 6 31 durch
Berücksichtigung zusätzlicher Paiametei wesentlich verbessern7
Die Auswahl der signifikanten Koeffizienten erfolgte durch das Verfahren
dei Ruckwartsehmination Dabei wurden schrittweise die Variablen,
deien Koeffizienten den höchsten P-Wert (dient als Mass für die
statistische Unsicherheit) aufwiesen, aus dem Modell eliminiert Dieser
Votgang wurde solange wiederholt, bis sich das Bestimmtheitsmass R1
\on einem Schritt zum nächsten signifikant verschlechterte Die
statistische Analyse wurde wiederum mit dem gesamten Datensatz
(inklusive Extremwerte) durchgeführt Die entsprechenden Resultate
findet man in Tabellen 6 9 (Methode der kleinsten Fehlerquadrate) und
6 10 (lobuste Regiession)
Sign
ifik
anz
statistische
für
95%-Wahrscheinhchkeitsbereichs
des
ausserhalb
liegt
ßkh
d05,
0>
P-Wert
a
331
0007
0±
945
016
±2
42
396
1±
04
234
4±
42
-8
Mg2+
420
0065
0±
902
019'
±9
67
809
2±
66
256
2±
87
-2
19
±2
291
41
9±
65
-17
Ca2+
342
0026
0±
907
015
±2
72
327
2±
73
-3
02a
2±
79
199a
26
±19
26
K+
467
0068
0±
770
094
1±
114
13
±2
49
-2
82
1+
07
261
71
±16
170
Na+
[xlO1]
[xlOj
[xlO
1][x
lO1]
[xlO1]
B95%-V
B95%-V
B95%-V
B95%-V
B95%-V
R1
CONST
ßpH
ßz,
ßz:
ßz,
ß„„,
Ionj
Vertrauensbereich)
BV
Bestimmtheitsmass,
(R2
32
6Gleichung
nach
Fehl
erqu
adra
te)
kleinsten
der
(Methode
Regr
essi
onsa
naly
seder
aus
Resultate
96
Tabelle
Signifikanz.
statistische
für
95%-Wahrscheinlichkeitsbereichs
des
ausserhalb
lieg
tßk
d.h.
0.05,
>P-Wert
a
±0.009
0.951
2.09
±2.94
1.99a
±1.84
5.27
±-12.85
Mg2+
0.070
±0.927
10.10"
+4.45
2.15
±2.62
2.75
±-3.54
2.33
±2.70
10.15
±-14.26
Ca2+
±0.078
0.911
±2.48
3.51
2.79
±-4.83
2.21a
±1.49
81.85a
±21.43
K+
0.099
±0.779
±2.15
4.07
2.34
±-2.96
1.95a
±1.69
103.60
±160.75
Na+
[xlO']
[xlO1]
[xlO1]
[xlO
1][xlO1]
95%-V.B.
95%-V.B.
95%-V.B.
95%-V.B.
95%-V.B.
CONST
ßpH
ßz,
ßZ2
ßz,
Vüm
Ionj
Vertrauensbereich).
(V.B
.:
6.32
Gleichung
nach
[68]
)Huber
nach
(Methode
Regression
sana
lyse
robusten
der
aus
Resultate
6.10:
Tabelle
94 KLINISCHE IONENANALYTIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN
Die Variablen SEX und JAHR trugen nicht signifikant zum Modell bei
und wurden in allen Fallen eliminiert Gegenüber dem einfachen Modell
nach Gleichung 6 31 erhalt man ein höheres Bestimmtheitsmass (Methode
der kleinsten Fehlerquadrate) Man stellt fest, dass die Parameter, die den
medizinischen Zustand des Probanden festlegen, ausser im Falle des Mg,+-
Ions bei Patienten nach der Hämodialyse, nicht eliminiert werden konnten
Dies weist darauf hin, dass der Zusammenhang zwischen dem Quotienten
aus ClProbe und fh*q' und der Massenkonzentration von Wasser in der
Regel vom Gesundheitszustand des Probanden abhangig ist, auch wenn
sich die Koeffizienten ßzl, ßZ2 und ßz1 nicht in allen Fallen signifikant von
Null unterscheiden Für die Ca*-Ionen wird das Modell für einzelne
Individuen zusätzlich durch den pH-Wert der Probe beeinflusst, allerdings
ist der Koeffizient ßpH gesamthaft betrachtet nicht signifikant von Null
verschieden
Auch beim erweiterten Modell lassen sich keine signifikanten Unter¬
schiede zwischen den Resultaten aus der Regressionsmethode der kleinsten
Fehlerquadrate und der robusten Regression feststellen Dies deutet darauf
hin, dass sich die zugrundeliegenden Daten auch nach der reduzierten
Gewichtung der Extremwerte nur teilweise durch einen linearen Zusam¬
menhang erklaren lassen
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass sich die einfache Quotienten-
Methode nach Gleichung 6 31 zur Abschätzung der Massenkonzentration
von Wasser aus dem Verhältnis von experimentellen Werten der totalen
Ionenkonzentration zur aktiven Molalität für Na*-Ionen in der Praxis nur
bedingt eignet Mit Ausnahme von K* unterscheiden sich die Resultate der
übrigen Elektrolyte aber nur unwesentlich von denjenigen für Na* Aus
diesem Grund kann man festhalten, dass sich das Modell, wie es für Na*
bereits angewendet wird, grundsatzlich auch auf andere Ionen übertragen
lasst Das höchste Bestimmtheitsmass wurde für die Ionen Na* und Mg2*
gefunden
6 9 Probenbedingte Variationen des Flussigkeitspotentials einer ISE Messkette 95
Für den zur Verfugung stehenden Datensatz konnte keines der ange¬
wandten linearen Regressionsmodelle den Zusammenhang zwischen der
Zielvanable p,H,° und der erklärenden Variable (Quotient von c,Probe und
m*q') mit einem Bestimmtheitsmass über 0 5 erklaren Extremwerte üben
eine grosse Hebelwirkung auf das Modell aus, die auch mit robusteren
Regressionsmethoden nicht verhindert werden kann Das Auftreten dieser
Extrema durch biologische Einflüsse kann nicht ausgeschlossen werden
Aus diesem Grund ist es nicht zulassig, die betroffenen Daten aus dem
Regressionsmodell auszuschhessen Mit dem erweiterten Modell nach
Gleichung 6 32 kann ein grosserer Anteil der Zusammenhange
beschrieben werden Aus praktischen Gründen kann aber nur mit dem
einfachen Modell nach Gleichung 6 31 gearbeitet werden Die zusatzlich
benotigten Parameter für das erweiterte Modell sind in der Praxis
üblicherweise nicht verfugbar
6.9. Probenbedingte Variationen des Flussigkeitspotentials
einer ISE-Messkette
In Kapitel 5 1 wurde eine kurze Einfuhrung in die Funktionsweise
der lonenselektiven Elektroden gegeben Dabei wurde darauf hinge¬
wiesen, dass neben dem Membranpotential EM, welches das lonenselektive
Verhalten und somit die interessierende Grosse repräsentiert, das Flussig-
keitspotential E, ebenfalls von der Probenzusammensetzung abhangt E, ist
abhangig von der Wahl des Bruckenelektrolyten der Referenzelektrode
Mit Hilfe der Gleichung von Henderson (Gl 5 4) wurde das Flussig-
keitspotential aus gemessenen freien Ionenkonzentrationen von Natrium,
Kalium, Calcium und Magnesium für die individuellen Plasmaproben bei
der Verwendung eines 1 mol L'Kahumchlond Bruckenelektrolyten
abgeschätzt Für Anionen wurde das Chlorid in den experimentell
bestimmten Mengen berücksichtigt, wahrend Bicarbonat und weitere
96 KLINISCHE IONENANALYTIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN
anorganische und organische Anionen naherungsv-eise durch Acetat
ersetzt wurden, da bei der Verwendung von Chlorid als alleinigem
Gegenanion zu hohe Potentialwerte erhalten werden Die Wahl fiel auf
das Acetat, weil es eine nahezu identische Beweglichkeit zum Bicarbonat
aufweist In Abbildung 6 9 findet man das Flussigkeitspotential
aufgetragen in Abhängigkeit der Probandengruppe Es unterscheidet sich
für alle pathologischen Falle signifikant von den Werten für gesunde
Probanden
-0 60 -
__^
-0 65-|
,
__^
> I I 1
£ -0 70- —I— I 1 | 1
^ -0 75 -
, ,
—'— '
L=^ _L_
-0 80- |
"0 85 4 , , 11
1
G VD ND HV
Abb 6 9 Nach der Formel von Henderson (Gl 5 4) experimentell abge¬
schätztes Flussigkeitspotential bei der Verwendung einer 1 mol L'KC1-
Losung als Bruckenelektrolyt, gegliedert nach Probandengruppen, T =
37 °C, (Darstellung analog zu Abb 6 2)v , ,.
Es ist sehr wichtig zu beachten, dass Variationen im Flussigkeitspotential
sowohl die Bestimmung von m]q' als auch von cProbet mit lonen-° i j i j
selektiven Elektroden gleichermassen beeinflussen Im Gegensatz zu der
im Abschnitt 6 6 diskutierten Problematik handelt es sich hier nicht um
einen Einflussfaktor, der von einer mathematischen Datentransformation
herrührt, sondern um ein physikalisches Phänomen
6 9 Probenbedingte Variationen des Flussigkeitspotentials einer ISE Messkette 97
Die Potentialbeitrage Ei wirken sich auf das Resultat einer potentio-
metnschen Elektrolytbestimmung aus, sofern der Messwert nicht
rechnerisch korrigiert wird, oder bei der Kalibration mitberucksichtigt
wird Wird mit einem Kalibrator gearbeitet, dessen Elektrolytzusammen¬
setzung den mittleren Aktivitäten (z B Mittelwert für gesunde
Probanden) einer physiologischen Probe entspricht, lasst sich der Einfluss
des Flussigkeitspotentials auf das Analysenresultat reduzieren Alternativ
kann die mit dem Sensor gemessene EMK auch um einen fixen Betrag
korrigiert werden, der beispielsweise dem Mittelwert des Flussigkeits¬
potentials in Proben gesunder Probanden entspricht Dennoch treten in
beiden Fallen flussigkeitspotentialbedingte Fehler e£) auf, die aus Ab¬
weichungen der Individualwerte einer Probe Eu vom Mittelwert Fjresultieren
e'J =10l s *(6 33)
s Steigung der Elektrodenfunktion [V]
Tabelle 6 11 gibt eine Übersicht über die zu erwartenden Fehlerbeitrage
nach erfolgter Korrektur der Messwerte um einen konstanten Betiag
98 KLINISCHE IONENANALYTIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN
Tabelle 6 11 Mittlere Flussigkeitspotentiale F, für die einzelnen Proban¬
dengruppen Mittlere, relative Fehlerbeitrage E/j,verursacht durch Va¬
riationen des Flussigkeitspotentials bei der Analyse einwertiger (z=l) und
zweiwertiger (z=2) Ionen unter Annahme theoretischer Elektrodenstei-
gungen, T=37 °C, Bruckenelektrolyt 1 mol L'KCl
Probanden¬ z, |e£|| K'lgruppe [mV] z=l
[%]
z=2
[%]
Gesunde Mittelwert -0 77 0 10 0 20
(n=36)95%-Intervall
-0 78
-0 76
0 08
0 12
0 16
0 24
Vor Mittelwert -0 68 0 33 0 67
Dialyse
(n=18)95%-Intervall
-0 71
-0 65
0 23
0 43
0 46
0 88
Nach Mittelwert -0 70 0 26 0 52
Dialyse
(n=13)95%-Intervall
-0 71
-0 69
021
031
0 41
0 63
Herzversagen Mittelwert -0 71 0 26 0 53
(n=14)95%-Intervall
-0 75
-0 67
0 15
0 37
031
0 75
Gesamt Mittelwert -0 73 0 20 041
(n=82)95%-Intervall
-0 74
-0 72
0 16
0 24
0 34
0 48
6 10 Direktmessungen mit optischen Sensoren 99
Die Daten der letzten beiden Kolonnen in Tabelle 6 11 zeigen, dass sich
Fehlerbeitrage, die von der Variation des Flussigkeitspotentials her¬
rühren, zwar durch eine Korrektur minimieren, nicht aber vollständig
eliminieren lassen Eine Berücksichtigung der Individualwerte kommt aus
Gründen des experimentellen Aufwandes in der Regel nicht in Frage Im
allgemeinen kann festgehalten werden, dass im Falle der Elektrolyt¬
analytik mit lonenselektiven, potentiometnschen Sensoren beim Einsatz
von konventionellen Referenzelektroden das Flussigkeitspotential eine ge
nauigkeitslimitierende Grosse darstellt Dies trifft bei Direktmessungen zu
und wirkt sich auf die Bestimmung von m*ql und von c^obefgleichermassen aus Im Falle vom Einsatz der ISE in stark verdünnten,
gepufferten Specimen sind hingegen kaum Auswirkungen auf die
Resultate von Gesamtkonzentrationsbestimmungen ClProbe zu erwarten
6.10. Direktmessungen mit optischen Sensoren
6 10 1 Einfluss des pH-Wertes auf die Messung mit optischen Sensoren
Der pH-Wert der Probe beeinflusst den mit optischen Sensoren
erhaltenen Messwert im Falle einer Elektrolytmessung in mehrfacher
Hinsicht Zum einen bestimmt der pH-Wert den Anteil an frei oder
komplex gebunden vorliegenden Ionen, da die bestimmenden Kom¬
plexierungsgleichgewichte allesamt pH-abhangig sind Diese Tatsache gilt
natürlich auch für die Elektrolytanalytik mit potentiometnschen Sensoren
und fallt besonders dann ins Gewicht, wenn keine anaerobe Proben¬
entnahme und Behandlung erfolgt In Analogie zu den ISE konnten daher
gegebenenfalls die gleichen empirischen Faktoren für die rechnerische
Korrektur des Analysenresultates auf einen physiologischen pH-Wert von
7 4 angewendet werden [61, 62]
100 KLINISCHE IONENANALYTIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN
Eine zweite Art der pH-Abhängigkeit ist spezifisch für den in dieser
Arbeit angewandten Typ von Optoden, wie er in Kapitel 5 2 eingeführt
wurde Da die kationenselektiven Austauschoptoden gemäss Gleichungen
5 14 und 5 15 stets auf das Verhältnis der Messionenaktivitat und der
Protonenaktivitat in der Probe ansprechen, ist für eine exakte
Bestimmung der Messionenaktivitat die genaue Kenntnis des pH-Wertes
erforderlich Diese Voraussetzung ist dann erfüllt, wenn der pH-Wert der
Probe entweder konstant und bekannt ist, durch Putferung konstant
gehalten wird, oder simultan mitgemessen wird Soll allerdings mit der
Optode die aktive Molalität des Analyten in der unverdünnten Probe
erfasst werden (Direktmessung), wäre eine Pufferung ohne nennenswerte
Verdünnung höchstens durch Zusatz einer geringen Menge einer hoch¬
konzentrierten Pufferlosung realisierbar Ferner konnte gezeigt werden
(vgl Abb 6 10), dass die Annahme eines konstanten pH-Wertes im Falle
von realen Plasmaproben, entnommen unter normalen Laborbedingungen,
verworfen werden muss Das Ausmass der Variationen des pH-Wertes
von 4 verschiedenen Probandengruppen ist in Abbildung 6 10 dargestellt
6 10 Direktmessungen mit optischen Sensoien 101
7.9-
7.8-_^
—I—|
7-7- I 1
X~ I ^, ,
a76-p=^ rz
7.5-
7 4-
1 I I I I
G VD ND HV
Abb 6 10 Gemessene pH Weite in Plasma gegliedeit nach Piobanden-
gruppen Bemeikung Keine anaciobe Piobeiibehandlung (.Daistellung
analog zu Abb 6 2)
Daiaus lassen sich nun mit Gleichungen 5 14 und 6 ^4 die pll mdu/ieiten
Messtehlei e1'" auf die Messung dci aktnen Molalität in1]1 des \nal\ten
abschätzen, die untei Annahme eines konstanten pH-Weites in det Ptobe
eihdlten winden
e^"=[.Ti;|,(pn)-rti;;l(pn1)]/ih;;,(pH1) & u)
hui den konslanten pH Weit winde dei Mitlclwcit hu gesunde
Piobanden eingesetzt Die Resultate sind in \bbildung b 1 I
zusaiiimeiigciasst
102 KLINISCHE IONENANALYTIK MIT CHFMISCHFN SENSOREN
^
100-
80-
60-
40-
20-
a)
300-
200-
100-
(b)
XCl
d
.±1
I I E —1 H 3
C7"T3 VD N D HV
1 i
G VD NDi i
HV
Abb 6 11 Durch pH-Variationen verursachte mittlere relative Messfehler
einer lonenselektiven Austauschoptode bei Annahme eines konstanten pH-
Wertes in der Ptobe tut einwertige Kationen (a) und für zweiwertige
Kationen (b)
Abbildung 6 11 belegt, dass beim Einsatz einer kationenselektnen Optode
für die Erfassung der aktiven Kationenmolahtat keinesfalls von einem
konstanten pH Wert in physiologischen Proben ausgegangen werden darf
Dabei wurden im Falle der zweiwertigen Ionen wie Ca2* und Mg1*
Messfehler bis zum Vierfachen des Messresultates erhalten
Als Losung für den Direkteinsatz von Optoden in der klinischen Probe
bleibt die simultane Miterfassung des pH-Wertes mit anschliessender
rechnerischer Korrektur der gemessenen aktiven Molalitat Dazu können
herkömmliche pH-Elektroden oder auch optische pH-Sensoren [69 73]
eingesetzt werden Wie bei Bakker [30] festgehalten, müssen jedoch sehr
hohe Anforderungen an die Genauigkeit der pH-Messung gestellt weiden
Um bei der Bestimmung der aktiven Molalitat eine Fehlergrenze von 1 %
nicht zu überschreiten, durfte die pH-Messung eine Unsicherheit von
höchstens 0 004 pH-Einheiten (für einwertige Ionen) aufweisen, was mit
heutigen Methoden kaum zu erreichen ist
6 10 Dnektmessungen mit optischen Sensoren 103
Zusammenfassend muss festgestellt werden, dass Direktmessungen in
klinischen Proben mit Optoden basierend auf Ionenaustausch nicht die
geforderten Erwartungen erfüllen können Nur die Stabilisierung des pH-
Wertes der Probe in einem sehr engen Bereich wurde die optische Dnekt-
messung mit zufriedenstellender Sicherheit ermöglichen
6 10 2 Vorversuche zur Messung der freien Ionenkonzentration in
Vollblut
Ungeachtet der ungelösten Probleme der pH-Messung, wurde in
einigen Vorexperimenten untersucht, wie sich eine lonenselektive
Optodenmembran in Vollblut mit Heparin als Antikoagulans verhalt Als
Beispiel wurde ein calciumselektiver Sensor gewählt Dazu wurde die
ATR-Messtechnik mit einem planaren Reflexionselement in einer Durch-
flussmesszelle angewendet (siehe Kap 9 2 1) Von besonderem Interesse
war bei diesen Experimenten die Signalregeneration nach dem Kontakt
mit der Vollblutprobe Abbildung 6 12 zeigt, dass mit dem zur Verfugung
stehenden Messaufbau keine zufriedenstellende Regeneration des Mess¬
signals nach dem Blutkontakt erreicht werden konnte Dies musste
zumindest teilweise auf die verwendete Messzelle zurückgeführt werden,
die sich nicht für den Durchfluss viskoser Proben eignete und die keine
vollständige Spulung nach dem Blutkontakt gewährleistete Auch gelang es
nicht, wahrend der Messung im Vollblut stabile optische Signale zu
erhalten Vielmehr wurde über mehrere Messungen eine Zunahme der
Absorption für die Blutprobe beobachtet, obwohl sich der pH-Wert nicht
veränderte
104 KLINISCHE IONENANALYTIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN
1 14-
1 12-1
?c 1 10-1m
£l 08Hc
o
2 1 06c
UJ 1 04
1 084 1 081
K2K2
1 02 H
1 00
1 022
K3
1 106
K2
•*Blut
^J
1 015 1 017
0 20 40 60 80
Zeit / min
Abb 6 12 Ansprechverhalten eines optischen ATR-Ca+
Sensors der
Membranzusammensetzung M l' (ETH 1001, ETH 5350, NaTFPB, DOS /
PVC) in wassrigen Kahbrationslosungen (K2, K3, vgl Abschnitt 9 3)
sowie in Vollblut
fs wurden keine weiteren Experimente aul diesem Gebiet durchgeführt
Die Vorversuche haben gezeigt, dass im Vergleich zur Arbeit mit
verdünnten Proben [li] insbesondere in messtechnischen Belangen
grossere Anpassungen an bestehenden Systemen notwendig sind, die über
den Rahmen dieser Arbeit hinausgegangen waren
Mcmbr in/us immtnsct/ungcn siehe Anh tng I
6 11 Schlussfolgerungen 105
6.11 .Schlussfolgerungen
Am Beispiel eines ausgewählten Kollektivs von 82 Probanden,
klassifiziert nach medizinischen Gesichtspunkten, wurde untersucht durch
welche Faktoren das Resultat einer klinischen Elektrolytanalyse mit einem
chemischen Sensor in der unverdünnten Probe beeinflusst wird Im
Vordergrund stand zum einen die Frage, welche Parameter mögliche
Fehlerquellen tur verfälschte Resultate darstellen und in welcher
Grossenordnung die daraus resultierenden Fehler liegen Zum anderen
wurde eine kritische Betrachtung der heute üblichen Praxis zur
Verarbeitung eines Sensor Rohsignals in eine klinisch interpretierbare
Grosse vorgenommen
Bedingt durch die physikalischen Gegebenheiten der Methode treten beim
Einsatz von lonenselektiven Elektroden in biologischen Proben
Unsicherheiten in der Messung auf, die vom Flussigkeitspotential Es
herrühren Diese sind aus messtechnischen Gründen nicht für jede
einzelne Probe erfassbar und die verursachten Unsicherheiten lassen sich
daher auch nicht vollständig rechnerisch kompensieren Eine teilweise
Korrektur ist möglich und sinnvoll und w.id heute bereits in direkt
messenden ISE Systemen angewendet
Bei der Verwendung von lonenselektiven Optoden ist man hingegen mit
einem anderen Problem, bedingt durch die Methode, konfrontiert Die
mit einer Optode gemessenen aktiven Molalitaten sind sehr stark vom pH-
Wert der Probe abhangig Die Annahme eines biologisch regulierten und
daher konstanten pH-Wertes muss verworfen werden Insbesondere bei
nicht anaerober Probenbehandlung, wie sie im Spital den Normalfall
darstellt, treten pH-Schwankungen auf, die eine rechnerische Kom¬
pensation mit einem konstanten Wert verunmoglichen Als Ausweg bleibt
die simultane Erfassung des pH-Wertes in jeder einzelnen Probe
Allerdings ist mit der heute verfugbaren Messtechnik eine pH-Messung
106 KLINISCHE IONENANALYTIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN
mit der erforderlichen Präzision von ± 0 004 pH-Einheiten nicht ohne
weiteres realisierbar, so dass eine nicht kompensierbare Unsicherheit der
Methode verbleibt Ferner besteht die Möglichkeit, durch Pufferung der
Probe den pH-Wert konstant zu halten Um aber der Forderung der un¬
verdünnten Probe nachzukommen, durfte dazu nur ein vernachlassigbar
kleines Volumen einer hochkonzentrierten Pufferlosung zugesetzt werden
Ein positiver Nebeneffekt wäre dabei die Stabilisierung der Ionenstarke,
so dass sich die relativ geringen klinischen Variationen nicht mehr in Än¬
derungen der molalen Einzehonen-Aktivitatskoeffizienten äussern
wurden
In ersten Experimenten wurde versucht, Ca2+-Ionen mit einer Optode
direkt in Vollblut zu messen Probleme mit dem Transport der viskosen
Blutprobe in den engen Kanälen der ATR-Durchflussmesszelle führten
dazu, dass sich das optische Signal nach Blutkontakt nicht mehr ohne
weiteres regenerieren hess Für weitere Experimente auf diesem Gebiet
ist es daher wichtig, mit einem optimierten Messaufbau zu arbeiten Auch
ist eine Verkleinerung des Systems zur Reduktion der benotigten Blut¬
menge erforderlich
Ein lonenselektiver Sensor kann mit gemischten, wassrigen Elektrolyt¬
losungen auf der Basis von aktiven Molalitaten m*q kalibriert werden
Dazu ist die Kenntnis der molalen Einzehonen-Aktivitatskoeffizienten X,
notwendig, die mit der Methode von Pitzer auch in gemischten Elektrolyt¬
losungen mit genügender Zuverlässigkeit abgeschätzt werden können
Dies fuhrt unter Berücksichtigung der zuvor genannten Parameter (Flus¬
sigkeitspotential, pH-Wert) zu Messwerten, die die biologisch relevante
aktive Molalität m'q' des Ions im wassrigen Anteil der unverdünnten
Probe korrekt wiedergeben
Der zusatzliche Schritt der rechnerischen Umwandlung der aktiven
Molalität in eine freie (molare) Ionenkonzentration clpJrobef oder gar die
totale (molare) Ionenkonzentration cProbe birgt aber unnötige Risiken,
6 11 Schlussfolgerungen 107
wenn diese auf der Basis von gemittelten Umrechnungsfaktoren geschieht
Im Rahmen dieser Untersuchungen musste festgestellt werden, dass 17 %
(einwertige Ionen), respektive 37 % (zweiwertige Ionen) aller Mess¬
resultate durch den Umrechnungsvorgang in freie Ionenkonzentrationen
um mehr als 0 5 % verfälscht werden In dieser Zahl sind die analytischen
Fehler verursacht durch die Messmethode selbst (z B Änderungen des
Flussigkeitspotentials beim Einsatz von ISE) noch nicht enthalten
Probleme treten bei allen Patienten auf, die eine starke Abweichung der
Massenkonzentration von Wasser gegenüber normalen Personen zeigen,
verursacht durch erhöhte oder reduzierte Protein und Fettwerte im Blut
Innerhalb des untersuchten Patientenkollektivs sind besonders Patienten
nach erfolgter Hämodialyse oder Patienten mit Herzbeschwerden
betroffen Gerade in diesen Fallen wurde die wertvolle Information des
Sensor-Messwertes aufgrund der Interpretation einer molaren Ionen¬
konzentration, basierend auf falschen Annahmen, durch eine Daten¬
umrechnung verloren gehen oder ausgemittelt werden Eine teilweise
Transformation des Messwertes zu einer freien Molalität des Ions m^q'unter Verwendung mittlerer molaler Einzehonen-Aktivitatskoeffizienten
wäre für einwertige Ionen vertretbar, wenn auch vom klinischen
Standpunkt aus betrachtet nicht sinnvoll Die y zeigen verhältnismässig
kleine Variationen und werden vermutlich durch biologische Kontroll¬
mechanismen stark ausgeglichen Für die zweiwertigen Ionen Ca2+ und
Mg1+ ist diese Voraussetzung aber nicht erfüllt
Stehen in einem Labor zur Erfassung von Elektrolyten sowohl direkt¬
messende (unverdünnte Probe), wie auch indirekt arbeitende (verdünnte
Probe) chemische Sensorsysteme oder andere auf Gesamtkonzentrations-
messung basierende Analysatoren zur Verfugung, bietet sich die
Möglichkeit, durch Vergleiche der unabhängigen Messresultate über ein
lineares Regressionsmodell Rückschlüsse auf die Massenkonzentration von
Wasser anzustellen Dieses Verfahren lasst sich grundsätzlich auf die
Kationen Na\ K+, Ca2+ und Mg1+ anwenden Es vermag aber den
108 KLINISCHE IONENANALYTIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN
Zusammenhang zwischen der Massenkonzentration von Wasser und dem
Quotienten aus c,Probt' und m^' für die im Rahmen dieser Arbeit
untersuchten 82 Individuen in allen Fallen nur mit einem beschrankten
Bestimmtheitsmass unterhalb von 0 5 zu beschreiben
Berücksichtigt man die gesammelten Tatsachen, gelangt man zum Schluss,
dass Resultate aus Messungen mit chemischen Sensoren in unverdünnten
biologischen Proben unabhängig von anderen Methoden, beruhend auf
Gesamtkonzentrationsmessungen, behandelt und interpretiert werden
sollen, um den maximalen Grad an Information aus einer Analyse zu
erhalten Dazu ist es aber notwendig in den klinischen Laboratorien eine
unvertraute physikalische Grosse mit neuen Referenzintervallen einzu¬
fuhren Man kann darüber diskutieren, welcher Faktor das grossere
Risiko darstellt die Umrechnung der Messwerte im Versuch, Resultate
aus verschiedenen Messmethoden anzugleichen oder die Einfuhrung einer
neuen physikalischen Grosse, der aktiven Molalität m^ mit einem neuen,
zugehörigen Referenzintervall Sicher ist, dass mit der zunehmenden
Verbreitung von chemischen Sensoren in klinischen Routinelaboratonen
diese Diskussion weitergeführt werden muss Auf alle Falle sollte darauf
geachtet werden, dass die Anwender von Geraten, welche auf chemischen
Sensoren beruhen, über dieses Problem informiert werden und
demzufolge genügend sensibilisiert sind Der Nutzer muss sich der
Unterschiede zwischen den Messresultaten erhalten mit verschiedenen
Methoden bewusst sein Nur dann lasst sich sicherstellen, dass es nicht zu
medizinischen Fehlentscheidungen auf Grund falscher Annahmen kommt,
wie zum Beispiel im Fall der Pseudohyponatraemie
109
7. Optische Sensoren auf der Basis von NIR-Farbstoffen
7.1. Einführung in die Problemstellung
In den vergangenen fahren wurden in der Gruppe von Prof Simon
an der ETH Zürich die Grundlagen für verschiedene optische Sensoren,
basierend auf weichgemachten PVC-Flussigmembranen, entwickelt [74
78] In der Gruppe von PD LI Spichiger [79] wurde damit begonnen, mit
miniaturisierten optischen Systemen zu arbeiten Auch wurde die ATR-
Messtechnik für die optische Sensonk genutzt und Optoden für den
Einsatz in verdünnten biologischen Proben charakterisiert [35, 80, 81]
Erfahrungen mit ATR-Messungen auf planaren optischen Reflexions¬
elementen ermöglichten den Übergang zur Monomoden-Messtechnik für
die Vermessung von Optodenmembranen
Neue Messtechniken wie zum Beispiel die integrierte Optik ermöglichen
heute die Miniaturisierung von Optoden und erweitern dadurch das An¬
wendungsgebiet von optischen Sensoren Insbesondere wurden ver¬
schiedene Realisierungsmoglichkeiten für total integrierte optische Sen¬
soren (TIOS), bei welchen sowohl die Lichtquelle wie auch der Detektor
aus einem Material gefertigt sind, präsentiert [82, 83] Diese Module
eliminieren die Notwendigkeit externer Komponenten sowie deren
aufwendige Justierung und gestatten es, kleine, leichte und stabile Mess¬
plattformen zu fertigen Sie bieten sich für die Realisierung eines
Sensorarrays auf einem einzigen Chip mit einem hohen Potential zur
Serienproduktion an Als Materialien werden zum Beispiel III-V Halb¬
leiter verwendet Ein besonders leistungsfähiges Material ist die ternare
Verbindung AlxGa, xAs, deren Emissionswellenlange im Bereich von 750
bis 870 nm liegt und über die Zusammensetzung abgestimmt werden kann
[84] Aus diesem Grund wird für integrierte, optische Messtechniken der
nahe Infrarot Spektralbereich (NIR, Wellenlange A > 780 nm) als
Wellenlangenbereich bevorzugt Als weitere Vorteile des langwelligen
110 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIR FARBSTOFFEN
Arbeitsbereiches sind die hohe Einkopplungseffizienz des Lichtes in den
Wellenleiter und die geringere spektrale Interferenz durch nicht
spezifische Absorptionen verursacht durch die Probe selbst zu nennen
[85]
Das Ziel der Arbeit war es, eine Anpassung der bisherigen optischen
Sensoren an die Anforderungen moderner Messtechnik vorzunehmen
Dazu war in erster Linie der Ersatz der bis anhin verwendeten Chromo¬
ionophore durch Indikatoren, die ihre maximale Absorption im NIR-
Bereich aufweisen, zu bewerkstelligen Parallel dazu ging es darum, in
interdisziplinarer Zusammenarbeit erste Versuche zum Einsatz von
Optodenmembranen auf einem integrierten Mach-Zehnder-Interferometer
als neuartige Messplattform zu demonstrieren
In einem ersten Schritt wurde eine Reihe von bekannten NIR-absor-
bierenden Farbstoffen untersucht Von Interesse waren ausgewählte
Beispiele von Polymethin Farbstoffen, insbesondere die Cyanine und die
Merocyamne Im Zentrum stand die Frage nach deren Eignung als
Chromoionophore in Optodenmembranen von der Art, wie sie im
Abschnitt 5 2 beschrieben wurden Dazu wurden die Farbstoffe in
Membranen mit verschiedenen chemischen und physikalischen Eigen¬
schaften und Zusammensetzungen charakterisiert Im weiteren erfolgte
dann in Optodenmembransystemen die Charakterisierung einer neuartigen
Verbindung Diese Art von Chromophor wurde zunächst im Rahmen der
Synthese einer bekannten Substanz isoliert und dann aufgrund seiner
speziellen optischen Eigenschaften genauer untersucht Dabei wurde
festgestellt, dass sich der Indikator nicht den Polymethin-Farbstoffen
zuordnen lasst
7 2 Optische Eigenschaften von Molekülen
7.2. Optische Eigenschaften von Molekülen
Die optischen Eigenschaften von Molekülen und Ionen beruhen auf
ihrer Fähigkeit, elektromagnetische Strahlung innerhalb eines bestimmten
Wellenlangenbereiches absorbieren zu können Je nach Wellenlange (resp
Energie) der absorbierten Strahlung spricht man von nahem Ultraviolett
oder Ultraviolett (UV, 10 - 380 nm), vom sichtbaren Bereich (VIS, 380 -
780 nm) und von nahem Infrarot (NIR) oder Infrarot (IR, 780 - 500000
nm) [86] Der Mechanismus der Lichtabsorption ist in den ersten beiden
Fallen (UV und VIS) derselbe Wird die Resonanzbedingung für A£ nach
Gleichung 7 l erfüllt, so kommt es zur Absorption von elektro¬
magnetischer Strahlung der Frequenz v, respektive der Wellenlange A,
was zu wellenlangenabhangigen, elektronischen Spektren fuhrt Im Falle
des IR reicht jedoch die Energie in der Regel nicht aus, um Elektronen
anzuregen In diesem Fall fuhrt die Absorption der Strahlung zur
Anregung molekularer Vibrationen
AE = hv = — (7 1)A
mit A£ Energiedifferenz zwischen 2 Energieniveaus [J]
h Planck-Konstante [J s]
v Frequenz [s ']
c Lichtgeschwindigkeit [ms1]
A Wellenlange [m]
Ein Molekül im angeregten Zustand kann auf verschiedenen Wegen
wieder in den Grundzustand zurückkehren Grundsatzlich lasst sich die
strahlungsfreie Relaxation von der Relaxation unter Emission von elektro¬
magnetischer Strahlung unterscheiden Im letzteren Fall spricht man von
Fluoreszenz oder von Phosphoreszenz
112 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIR FARBSTOFFEN
Eine weitere bedeutsame optische Grosse im Rahmen der Sensonk ist der
Brechungsindex Der Brechungsindex und die Absorption von Licht in
einem bestimmten Medium sind gemäss den von Kramers und Kronig
hergeleiteten Relationen voneinander abhangig [87 88] Dann wird die
Dispersion (Brechungsindex) als Realteil und die Absorption als
Imaginarted der komplexen Suszeptibditat bezeichnet Mathematisch
können die beiden Grossen durch eine Founer-Transformation im
Hilbert-Raum ineinander überfuhrt werden [89] Dies gestattet unter
bestimmten Voraussetzungen die theoretische Abschätzung von Disper
sionsspektren aus gemessenen UV / VIS-Spektren
Für das Verständnis der chromophoren Systeme ist der Zusammenhang
zwischen der Struktur und den zugehörigen elektronischen Spektren von
Interesse An dieser Stelle sollen deshalb einige historisch besonders
wichtige Resultate zur theoretischen Behandlung von elektronischen
Spektren zusammengetragen werden
Nach Gleichung 7 1 lasst sich die Wellenlange der Absorption elektro
magnetischer Strahlung aus der Energiedifferenz der vom Übergang
betroffenen Zustande bestimmen Um also elektronische Spektren eines
Moleküls ausgehend von seiner chemischen Struktur verstehen zu können,
ist die Kenntnis der Energien der Grundzustande sowie elektronisch
angeregter Zustande notwendig Die elektronische Anregungsenergie
sowie die Ubergangswahrscheinlichkeit zwischen den Zustanden
beeinflussen die Lage und die Intensität der Absorptionsbanden
Molekulare Vibrationen im angeregten Zustand sind für die Form der
Banden bestimmend
Die ersten Versuche zur Interpretation von Absorptionsspektren stutzten
sich auf die Tatsache, dass für konjugierte Systeme langwellige
Absorptionsbanden beobachtet werden Daraus wurde geschlossen, dass
nur Elektronen, die in konjugierten Bindungen involviert sind, berück¬
sichtigt werden müssen Von der theoretischen Seite her betrachtet, war es
7 2 Optische Eigenschaften von Molekülen 113
die "valence bond" (VB) Theorie, die erstmals Zusammenhange zwischen
Absorptionsverhalten und Molekulstruktur von konjugierten Systemen zu
erklaren vermochte [90] Die VB-Theone verlor ihre Bedeutung mit dem
Aufkommen der Molekulorbitaltheone (MO) Als Spezialfall sei hier das
von Kuhn im Jahr 1948 entwickelte Modell des Elektronengases (free
electron model, FE-MO) erwähnt [91] Im einfachsten Fall werden dabei
die MO's durch Betrachtung von Elektronen in einem eindimensionalen
Kasten erhalten Die Lichtabsorption kommt durch die Anregung eines
Elektrons aus dem höchsten besetzten MO (HOMO) in das niedrigste,
unbesetzte MO (LUMO), die sog Grenzorbitale zustande Diese
Anregung ist verantwortlich für den Übergang niedrigster Energie, in der
Regel 7t—>7t* oder n—>tc* (n nichtbindendes Orbital) Damit hessen sich
auch für komplexere Moleküle erfolgreiche Abschatzungen vornehmen
Das FE-MO Modell wurde spater durch die auch heute noch
weitverbreitete Methode der Linearkombination von Atomorbitalen
(linear combination of atomic orbitals, LCAO-MO) und die daraus
abgeleitete Huckel Methode (HMO) für 7t-Elektronensysteme abgelost, die
sich beide leichter als Computerprozeduren implementieren hessen Auch
in diesen Methoden wird der Elektronenubergang mit geringster Energie¬
differenz zwischen Grenzorbitalen postuliert Der schwerwiegendste
Nachteil der HMO-Methode ist allerdings die totale Vernachlässigung von
Elektron-Elektron Wechselwirkungen Ferner wird nicht berücksichtigt,
dass für die Absorption von elektromagnetischer Strahlung nicht nur die
Lage der Energieniveaus des Grundzustandes eines Moleküls von
Bedeutung ist, sondern dass auch elektronisch angeregte Zustande eine
wichtige Rolle spielen Ferner wird die Energie eines Molekulorbitals
nicht nur durch eine einzige Elektronenkonfiguration, wie im HMO und
im FE-MO-Modell angenommen, bestimmt Wechselwirkungen zwischen
verschiedenen Elektronenkonfigurationen sind entscheidend Dieser
Gedanke bildete den Grundstein für die Entwicklung der sog Pariser-
114 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIR FARBSTOFFEN
Parr-Pople (PPP) Methode [92-94] Wechselwirkungen zwischen
Elektronen und zwischen verschiedenen Elektronenkonfigurationen
(configuration interaction, Cl) werden mitberucksichtigt Weil die
Wellenfunktionen verschiedener angeregter Zustande kombiniert werden
können, wird jeder elektronische Übergang durch mehrere elektronische
Anregungen zwischen besetzten und unbesetzten Orbitalen interpretiert
Mit dieser Methode lassen sich recht zuverlässige Voraussagen über die
Lage von Absorptionsbanden machen
7.3. Chromoionophore für Optodenmembranen
Wie in Kapitel 5 2 dargestellt, erfolgt die Signalumwandlung von
der molekularen Erkennung in eine optisch erfassbare Messgrosse bei den
hier betrachteten optischen Sensoren mit Hilfe des Chromoionophors Zu
diesem Zweck eignet sich grundsatzlich jede Verbindung, die unter
Änderung ihrer optischen Eigenschaften in der Lage ist, eine selektive
und reversible Wechselwirkung (Komplexierung, Reaktion) mit einem
Analyten einzugehen In Austausch- oder Koextraktionssystemen steht der
Chromoionophor C in Verbindung mit einem zweiten Ionophor L (siehe
auch Abb 5 2), der in der Regel selbst keinen Beitrag zum optischen
Messsignal liefert In allen im folgenden betrachteten Fallen wird für den
Chromoionophor ein H+-selektiver Ligand (pH-Indikator) verwendet, der
durch Protonierung oder Deprotonierung seine optischen Eigenschaften
verändert Das Wasserstoff-Ion unterscheidet sich chemisch sehr stark von
Metalhonen, so dass in der Regel keine Selektivitatsprobleme anzutreffen
sind In Austauschsystemen erfolgt ein Austausch von Protonen gegen
Kationen aus der Probe unter Beibehaltung der Elektroneutrahtat der
7 3 Chromoionophore für Optodenmembranen 115
Membran Nur der Chromoionophor ändert bei diesem Vorgang seine
optischen Eigenschaften
Im folgenden sollen die Anforderungen an einen Chromoionophor für
Optoden basierend auf Ionenaustausch oder Ionenkoextraktion etwas
detaillierter beleuchtet werden Der ideale Chromoionophor sollte für die
oben genannten Anwendungen möglichst viele der unten aufgelisteten
Bedingungen erfüllen
- pH-gekoppelte optische Eigenschaften
- Hohe Selektivität für Protonen gegenüber anderen Metallkationen
- An die Stabihtatskonstante des Ionophor-Analyt-Komplexes und die
Probe angepasste Basizitat, um die Reversibilität zu gewahrleisten
- An das verwendete Messsystem angepasster Wellenlangenbereich, in
dem die optischen Eigenschaften messbar sind
- Photochemische Stabilität im Hinblick auf eine lange Lebensdauer der
Sensormembran
- Hohe Lipophihe um eine gute Loslichkeit in der organischen
Membranphase zu garantieren und somit ein Auswaschen in die
wassnge Probephase zu verhindern oder
- Möglichkeit zur Immobilisierung (kovalent, ionisch) an die
Membranmatiix
- Genugende Mobilität in der Membranphase, um die Ansprechzeiten des
Sensors kurz zu halten
Die hier aufgelisteten Anforderungen sind unabhängig von dem gewählten
Messmodus für den optischen Sensor Im folgenden wurden aber im
Rahmen dieser Arbeit alle Farbstoffe im Absorptionsmodus
charakterisiert Auf Fluoreszenzfarbstoffe wird deshalb nicht weiter
eingegangen
116 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIR FARBSTOFFEN
Als besonders kritisch für die Eignung als Chromoionophor erweist sich
die Basizitat des Indikators Wie aus Gleichung 5 9 ersichtlich ist, geht die
Aciditatskonstante Ä"a des Chromoionophors in der Membranphase in die
Austauschkonstante Kex'h ein Zusammen mit dem pH-Wert der
Probelosung wird somit der dynamische Ansprechbereich des Sensors
festgelegt In Abbildung 7 1 ist als Beispiel der Einfluss der Basizitat des
Chromoionophors auf den Messbereich einer Ca+-selektiven Optode im
physiologischen pH-Bereich, berechnet nach Gleichungen 5 9 und 5 14,
dargestellt
08
0.6-
0.4-
0.2
-12 -10 -8 -6 -4
'09 (aCa**)
0
Abb 7 1 Berechnete Ansprechkurven einer Ca2+-Optode mit lonophor
ETH 1001 [78] bei der Verwendung von Chromoionophoren mit unter¬
schiedlicher Basizitat in einer Probelosung mit pH 7 60 (+) ETH 5294
(pK=12 0), (O) ETH 5350 (pK=13 4) und (D) ETH 2430 (pK=13 7)
[32] Der Ausdruck 1-a beschreibt den Protonierungsgrad des
Chromoionophors (siehe Gl 5 13)
7 3 Chtomoionophore für Optodenmembranen 117
Die Wahl des Indikators erlaubt demzufolge eine flexible Anpassung des
Messbereichs an die zu untersuchende Probe, solange die Auswahl
zwischen Chromoionophoren verschiedener Basizitat besteht Als Alter¬
native besteht die Möglichkeit den pH Wert durch Pufferung anzupassen
Allerdings werden dem pH-Bereich durch die Eigenschaften des Analyten
oft enge Grenzen gesetzt (z B Ausfallung des Analytkations mit
Hydroxidionen) Schliesslich lasst sich die Austauschkonstante Kex*h noch
durch die Wahl eines Liganden mit unterschiedlicher Brutto¬
stabihtatskonstante ßlL verandern Aus Gründen der Selektivität ist dies
allerdings nur sehr selten realisierbar, da in der Regel nicht verschiedene
Liganden mit optimierter Selektivität für den Analyten zur Verfugung
stehen Die Basizitat des Chromoionophors ist also auf jeden Fall sehr
wichtig
Mit bekannten Aciditatskonstanten für die Chromoionophore K^ und den
Austauschkonstanten KeJh für ein bekanntes Optodensystem, lassen sich
nach Gleichung 5 9 die Austauschkonstanten für Chromoionophore mit
beliebiger Basizitat abschätzen Daraus wiederum, erhalt man nach
Gleichung 5 14 die theoretischen Ansprechfunktionen der Optoden Das
erlaubt es, den in Abbildung 7 2 dargestellten pH-Bereich zu ermitteln, in
dem die Kationen Na+, K+ und Ca1+ in physiologischen Konzentrationen
erfasst werden können Der Messbereich wurde so angegeben, dass die
mittlere physiologische freie Ionenkonzentration des jeweiligen Ions (in
der unverdünnten Probe) innerhalb des linearen Ansprechbereichs des
optischen Sensors liegt und mit maximaler Empfindlichkeit erfasst werden
kann Als Grundlage für die Berechnung dienten die Kenngrossen von
bekannten Kationentauscher-Optoden für die betrachteten Ionen, die in
der Gruppe von Prof W Simon entwickelt worden waren [31, 78, 95]
118 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIR-FARBSTOFFEN
9-i
8-
7-
«D6-
.O
3-
2-
1-
4 6 8 10 12 14
pKg (Chromoionophor)
Abb. 7.2: Möglicher Messbereich (pH) in Abhängigkeit des pKa-Wertes
des Chromoionophors für die Erfassung von Ca2+ (lonophor: ETH 1001),
Na+ (lonophor: ETH 4120) und K+ (lonophor: Valinomycin) in physio¬
logischen Konzentrationen (freie Ionenkonzentrationen) mit einer Optode.
Im speziellen markiert der horizontale Balken den physiologischen pH-
Wert von 7.4, der für Direktmessungen relevant ist.
Bis heute werden als Chromoionophore für Optoden basierend auf Ab¬
sorptionsmessungen in vielen Fällen Derivate des basischen Benzo-
phenoxazin-Farbstoffs Nilblau eingesetzt (vgl. Abb. 7.4). Diese wurden in
der Gruppe von Prof. Simon entwickelt [32]. Die einzelnen Chromo¬
ionophore unterscheiden sich lediglich sowohl im Aufbau als auch in der
Länge ihrer Seitenketten am Imin-Stickstoff. Aus diesem Grund liegen
auch die Absorptionsmaxima in einem relativ engen spektralen Bereich
von 600 bis 650 nm für die protonierten Spezies und 500 bis 550 nm für
7 4 NIR-absorbierende Farbstoffe 119
die deprotonierten Spezies (gemessen in Methanol) [32] Die Seitenkette
beeinflusst das Absorptionsverhalten nur marginal, da sie in den meisten
Fallen keine chromophoren Gruppen enthalt, die in Resonanz¬
wechselwirkung mit dem n-Elektronensystem des Farbstoffgrundgerustes
stehen Hingegen übt die Seitenkette einen Einfluss auf die Lipophihe und
die Basizitat des Farbstoffes aus Die pKa-Werte für die Nilblaudenvate
liegen in DOS-weichgemachten PVC-Membranen zwischen 9 0 und 14 0
Der grosse Basizitatsbereich der Indikatoren gestattet eine flexible
Anpassung des Sensorarbeitsbereichs an die Probe
Für die Entwicklung von neuartigen Chromoionophoren wäre es aus
diesem Grund ein grosser Vorteil, wenn ausgehend von einem Grund
gerust, das den Chromophoren enthalt, in Analogie zu den Nilblau-
denvaten durch flexible Variation von Seitenketten die Basizitat resp
Aciditat der Verbindung kontrolliert werden konnte
7.4. NIR-absorbierende Farbstoffe
7 4 1 Allgemeines
In einer ersten Phase wurde nach Farbstoffen gesucht, die ihr
Absorptionsverhalten im NIR-Spektralbereich in Abhängigkeit des pH-
Wertes der Umgebung verandern Zunächst wurden bekannte Verbin¬
dungen mit einem Absorptionsmaximum im NIR-Bereich erfasst Dazu
standen verschiedene Standard-Literaturwerke zu den Themen Farbstoffe,
Indikatoren und Laserfarbstoffe zur Verfugung [96 101] Da die Ab-
sorpüonsmaxima dieser Verbindungen ausserhalb des für das menschliche
Auge sichtbaren Bereichs liegen, begann sich die Forschung erst in
jüngerer Zeit mit den NIR-Farbstoffen zu beschäftigen Für die
Anwendung in der klassischen Farbstoffchemie (Textdfarbung, Indi¬
katoren, Farbreagenzien etc) waren diese Substanzen nicht interessant
120 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIR FARBSTOFFEN
Erst mit dem Aufkommen der modernen Farbphotographie, der Laser¬
technik, der optischen Speichermedien sowie der Farblaserdrucker und
kopierer begann das Interesse an dieser Klasse von Farbstoffen zu steigen
[102 105] Noch spater begann man sich aus der Sicht der analytischen
Chemie mit NIR-Chromophoren zu beschäftigen, wie die folgenden
Literaturstellen zeigen [106-112] Aus diesem Grund ist es nicht
erstaunlich, dass es bis heute keine kommerziell erhältlichen NIR-pH-
Indikatoren gibt, obwohl die Forschung auf diesem Gebiet, stimuliert
durch Entwicklungen auf dem Gebiet der Sensoitechnologte, einen
Aufschwung erlebt hat
7 4 2 Polymetfnn-Farbstoffe
Die wohl bekanntesten im NIR-Bereich absorbierenden Farbstoffe
gehören der Klasse der Polymethine an Sie zeichnen sich durch eine
zusammenhangende Kette von Methingruppen (-CH=), d h durch ein
System von konjugierten Doppelbindungen aus Im Gegensatz zu den
Polyenen, endet im Falle der Polymethine die Kette konjugierter Doppel¬
bindungen mit einem Elektronendonor und einem Elektronenakzeptor, die
beide die notwendigen Energiequanten zur elektronischen Anregung des
Moleküls beeinflussen Ferner weisen die Polymethine im Kontrast zu den
Polyenen gleiche Bindungslangen über alle konjugierten Bindungen auf
Die Polymethin-Farbstoffe lassen sich in folgende Untergruppen
aufgliedern (vgl Tabelle 7 1) [99, 113]
7 4 NIR absorbierende Farbstoffe 121
Tabelle 7 1 Untergruppen von Polymethin-Farbstoffen und deren
allgemeine Darstellung
Gruppe Allgemeine Formel
Cyanin
Hemicyanin
Streptocyanin
Oxonol
Merocyanin
Ein Polymethin-Farbstoff mit N 7t-Zentren (N ist immer ungeradzahlig)
entlang der konjugierten Kette enthalt somit N-2 Methinzentren und N+l
7t-Elektronen Die ungeradzahlige Anzahl an Zentren im 7t-System hat zur
Folge, dass das höchste besetzte Molekulorbital ein nichtbindendes Orbital
(n-Orbital) ist Dadurch weist das HOMO für einen Polymethin-Farbstoff
eine höhere Energie auf, als in einem Chromophor von ahnlicher Grosse,
aber mit geradzahliger Anzahl konjugierter Zentren Die Folge davon ist
122 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIR FARBSTOFFEN
eine geringere Energiedifferenz zwischen HOMO und LUMO (n—>n*)
und damit eine langwelligere Absorptionsbande Die scharfe Form der
Absorptionsbanden lasst sich durch die geringe Änderung der
Bindungslange bei der Anregung erklaren [114] Die Absorptions-
wellenlange nimmt mit zunehmender Anzahl an C-C-Doppelbindungen zu
Für symmetrische Polymethine kann als Faustregel von einer batho
chromen Verschiebung von 100 nm pro zusätzliche Doppelbindung
ausgegangen werden, weshalb man von der sogenannten "Vinylen-
Verschiebung" spricht Durch Substitution von Methingruppen innerhalb
der Kette konjugierter Doppelbindungen oder durch das Einfuhren von
externen Substituenten an den Methingruppen lassen sich spektrale
Verschiebungen der intensivsten Absorptionsbande realisieren, wie durch
Storungsrechnung gezeigt werden konnte [115] Die Auswirkungen auf die
Absorptionsspektren sind in Abbildung 7 3 dargestellt [113]
1 2 3
X — CH — CH — CH — — CH — X
Subst von CH durch Heteroatom
Element höherer Elektroneg bath hyps bath
Element geringerer Elektroneg hyps bath hyps
Externe Seitenkette
Akzeptor bath hyps bath
Donor hyps bath hyps
Abb 7 3 Einfluss von Substituenten auf die spektralen Eigenschaften von
Polymethin-Farbstoffen
7 4 NIR absorbierende Farbstoffe 123
Es ist zu beachten, dass auch die bisher als Chromoionophore verwen¬
deten Nilblauderivate formal den Polymethin-Farbstoffen zugerechnet
werden können, da sie einen Polymethin-Subchromophor enthalten, wie in
Abbildung 7 4 dargestellt ist
Abb 7 4 Polymethin-Sub¬
chromophor innerhalb des
Nilblaumolekuls 11 (N) jt-
Zentren, 12 (N+l) n-
Elektronen, 9 (N-2)
"Methinzentren"
In der Tat können beinahe alle wahrend dieser Arbeit verwendeten NIR-
Farbstoffe formal der Klasse der Polymethine zugeordnet werden Die
Ausnahme bilden die in Kapitel 7 7 beschriebenen reduzierten
Dicyanovinyl-Farbstoffe, die einer eigenen, neuen Farbstoffklasse
angehören
Neben der Anzahl an konjugierten Doppelbindungen, sind es die Eigen
schatten der Donor- und Akzeptorgruppen, die das Absorptionsverhalten
der Polymethine bestimmen In der Regel können aus Gründen der
Stabilität sowie der zunehmenden Tendenz zur cis-trans Isomensierung
oder zur Aggregatbddung, die konjugierten Ketten nicht beliebig
verlängert werden, um die Lage der Absorptionsbanden in den NIR-
Bereich zu verschieben Als Alternativen bleiben die interne und externe
Substitution der Methinzentren (vgl Abb 7 3) und die Verstärkung des
Donor-Effektes von elektronenspendenden Gruppen und des Akzeptor-
Effektes von elektronenziehenden Gruppen Als zwei ausgewählte
Beispiele für besonders effiziente, elektrisch neutrale Elektronen-
Akzeptoren seien hier die mehrfach Cyano-substituierten Systeme
124 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIR FARBSTOFFEN
(Abb 7 5 A) genannt (vgl auch Kapitel 7 6) Auf der Seite der
Elektronen-Donoren wird das Dihydropenmidin-System (Abb 7 5 B) als
ein Beispiel aufgeführt (vgl Kapitel 7 6)
A
Abb 7 5 Zwei Beispiele für
(B)
7.5. Cyanine und Streptocyanine als Chromoionophore
7 5 1 Ausgangslage
In Abbildung 7 6 findet man die Konstitutionen von 3 ver¬
schiedenen, typischen Cyanin Farbstoffen, die alle in der Literatur bereits
beschrieben sind Die Verbindungen IR-125 (A) und HITC+ (B) sind als
Farbstoffe für den Einsatz in Farbstofflasern auf dem Markt, wahrend die
Verbindung pHCOOH+ (C) von Patonay und Mitarbeitern beschrieben
wurde [116] Im weiteren findet man die Molekulstrukturen von zwei
ebenfalls bekannten Streptocyamn-Farbstoffen Es handelt sich um den
Farbstoff PDC+ (D) [117, 118] sowie den Croconium-Farbstoff (E) [119
120] Die vollständigen Namen der Verbindungen findet man in Kapitel
96
B
effiziente Akzeptor- (A) und Donorsysteme
7 5 Cyanine und Streptocyanine als Chromoionophore 125
S03Na S03
Abb. 7.6: Untersuchte Cyanin-Farbstoffe: A IR-125; B HITC+ und C
pHCOOH+ sowie Streptocyanin-Verbindungen D PDC+ und E
Croconium-Farbstoff.
126 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIR-FARBSTOFFEN
Mit Ausnahme der Verbindungen A und E handelt es sich in allen Fällen
um kationische Farbstoffe, die als Salze mit einem zusätzlichen Anion
vorliegen. IR-125 (A) und der Croconium-Farbstoff (E) dagegen, liegen
als Zwitterion gesamthaft elektrisch neutral vor. Diese Tatsache ist von
Bedeutung, da die Löslichkeit der Substanzen in apolaren Medien dadurch
beeinflusst wird. Tabelle 7.2 gibt eine Zusammenstellung der optischen
Eigenschaften der Farbstoffe A-E in Lösung.
Tabelle 7.2: Optische Eigenschaften (Wellenlänge maximaler Absorption
Ä.max, molarer dekadischer Extinktionskoeffizient £max) von Cyanin- und
Streptocyanin-Farbstoffen in Lösung1.
Farbstoff IR-125 HITC+ pHCOOH+ PDC+ Croconium
(A) (B) (C) (D) (E)
A.max 787a 743a 802" 786a 820a
[nm]
emax 192000a 247000a 143000" 102000a n.b.1-
[L mol' cm ']
a
Lösungsmittel: Ethanol
h
Lösungsmittel: Methanol
'
nicht bestimmt; ungenügende Stabilität
Es stellte sich die Frage, inwiefern diese Farbstoffe als pH-Indikatoren
eingesetzt werden können und wo ihre pKa-Werte liegen. Herz charak¬
terisierte eine Reihe von symmetrischen Cyanin-Farbstoffen mittels
spektrophotometrischer pH-Titrationen in Wasser und untersuchte die
1Die Angaben beliehen sich auf die intensivste Absorptionsbande unabhängig davon, in welchem
Protonierungszusland der Indikator vorliegt
7 5 Cyanine und Streptocyanine als Chromoionophore 127
Einflüsse von Methinkettenlange und Substituenten auf die Aciditat der
Indikatoren [121] Mazzucato, Scheibe und andere Autoren stellten fest,
dass die pH-Abhängigkeit der Absorptionsspektren von Verbindungen wie
A, B und D durch einen Unterbiuch der Resonanz über das konjugierte
7t-System entlang der Methinkette verursacht wird Dieser Unterbruch
wird verursacht durch Protonierung eines Stickstoffzentrums oder eines
Methinzentrums [122 127], was zu einem Verlust der langwelligen
Absorptionsbande fuhrt In Analogie kann auch ein nukleophiler Angriff
des OH -Ions im stark alkalischen Milieu zu einem Unterbruch des
konjugierten 71-Systems fuhren, wie beispielsweise in [128] postuliert wird
Die Farbstoffe C und E weisen zusatzliche acide, respektive basische
Gruppen auf, die den pKa der Indikatoren bestimmen und die spektralen
Eigenschaften über das konjugierte n-System des Farbstoffs beeinflussen
Grummt et al zweifelten diese Erklärung für den Indikator C allerdings
an, mit der Begründung, dass der beobachtete Effekt auf die
Absorptionsspektren zu stark sei, um alleine vom protolytischen Einfluss
auf die endstandigen Carboxylatgruppen herzurühren [129]
7 5 2 Stabilität der Farbstoffe
Eine wichtige Voraussetzung für die Eignung eines Farbstoffs als
Chromoionophor ist seine Stabilität Rasches Ausbleichen durch Lichtein
Strahlung oder hohe chemische Empfindlichkeit gegenüber einer che¬
mischen Spezies schranken den Nutzen der Verbindung stark ein Zur
Abklärung wurde die Reversibilität von Protonierung und Depro¬
tonierung der Indikatoren sowie die Signalstabditat in alkoholischer
Losung und in verschiedenen Membranzusammensetzungen spektros¬
kopisch untersucht Dabei musste festgestellt werden, dass lediglich die
Verbindung PDC+ (D) die gestellten Anforderungen zu erfüllen ver¬
mochte In diesem Fall konnten in methanohschen Pufferlosungen über
einen weiten pH-Bereich (mit Ausnahme des stark alkalischen Bereiches)
128 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIR-FARBSTOFFEN
stabile, optische Signale beobachtet werden Für den Indikator pHCOOH+
(C) wurden im neutralen und alkalischen Bereich stabile Signale
beobachtet, bei tieferen pH-Werten (< pH 4 0) jedoch, erfolgte eine rasche
Abnahme der Absorptionsbande im NIR-Spektralbereich Eine chemische
Reaktion des Farbstoffes mit Komponenten der methanolischen Puffer¬
lösungen im sauren Bereich konnte nicht ausgeschlossen werden Eine
saurekatalysierte Veresterung der Carbonsaurereste schien möglich In
wassrigen Pufferlösungen wurden keine vergleichbaren Signalverluste im
sauren Bereich festgestellt Die chemische Stabilität des Indikators war
also sehr stark von der chemischen Umgebung abhangig Allgemein kann
festgehalten werden, dass das Vorhandensein von reaktiven funktionellen
Gruppen im Farbstoffmolekul die Gefahr der unerwünschten chemischen
Umwandlung durch Reaktion mit Puffer- oder Membrankomponenten
erhöht Für die übrigen Farbstoffe dieser Gruppe wurden jeweils Signal¬
verluste oder nur ungenügende Reversibilität bei wiederholter
Protonierung oder Deprotonierung beobachtet Ein Grund für das
beobachtete Verhalten der Indikatoren A und B konnte die bekannte
Abnahme der Stabilität mit Zunahme der Lange der Methinketten sein,
wie sie von Gnffiths beschrieben wurde [105] Der Croconium-Farbstoff
(E) zeigte bei Kontakt mit Lauge in ethanolischer Losung oder in einer
weichgemachten PVC-Membran einen irreversiblen Verlust der NIR-
Absorption bei gleichzeitigem Auftreten eines neuen Absorptionspeaks im
sichtbaren Bereich
Aufgrund der gemachten Beobachtungen zur Stabilität, sowie zusätzlichen
Problemen wie geringer Loslichkeit, wurde entschieden, die
Verbindungen A, B und E im Rahmen dieser Arbeit nicht weiter zu
charakterisieren
7 5 Cyanine und Streptocyanine als Chromoionophore 129
7 5 3 Geeignete Membranmedien
Aufgrund ihres kationischen Charakters hessen sich die Indikatoren
A, B, C und D nicht muhelos in weichgemachten PVC-Membranen losen
Daher wurden andere Polymere, die bisher nicht für den in Kapitel 5 2
beschriebenen Typ von optischen Sensoren verwendet wurden, in die
Untersuchungen miteinbezogen Es war offensichtlich, dass für die
geladenen Farbstotfmolekule Membranmedien mit relativ hoher Polarität
notwendig sein wurden, um eine genugende Loslichkeit zu erhalten Bei
der Verwendung von weichgemachten PVC-Membranen lasst sich die
Polarität der resultierenden Sensorschicht durch die Wahl des Weich¬
machers beeinflussen [130] Für eine Erhöhung der Polarität der
Polymermatrix selbst wurde schon in anderen Arbeiten partiell
hydroxyhertes PVC (OH-PVC) eingesetzt [131] Dadurch blieben die
meisten Eigenschaften des Poly(vinylchlond)-Systems unter gleichzeitiger
Erhöhung der Membranpolantat erhalten Zusatzlich bleibt die
Möglichkeit der Wahl verschiedener Weichmacher In seltenen Fallen
wurde auch die Verwendung von Amino-PVC (PVC-NH,) als Matrix für
Flussigmembranen beschrieben Aufgrund der freien Aminogruppe kann
diese Matrix je nach pH-Wert als neutrales oder kationisches Polymer
betrachtet werden Es zeigt in Abhängigkeit des Weichmachers in einem
pH-Bereich zwischen 4 und 11 eine lineare potentiometnsche Ansprech¬
funktion gegenüber Protonen [132] Noch einen Schritt weiter geht die
Veiwendung von Polymeren, die über den gesamten interessierenden pH-
Bereich elektrisch geladen vorliegen Dazu zahlt beispielsweise auch das
in Ionentauschermembranen eingesetzte Polymer mit dem Handelsnamen
Nafion Es handelt sich dabei um ein perfluorosulfoniertes Polymer Die
chemische Struktur ist in Abbildung 7 7 wiedergegeben Der Gehalt an
Sulfonsaureresten, der die Anzahl ionischer Ladungen im Polymer
festlegt, wurde mittels Titration zu 0 9 mmol SOj / g Polymer bestimmt
[133] Ein Nachteil dieses Materials ist die geringe Loslichkeit in den
130 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIR-FARBSTOFFEN
meisten Losungsmitteln Daher werden in der Regel im Handel
gebrauchsfertige Membranen oder mit speziellen Verfahren hergestellte
Losungen angeboten, die jedoch den Anwendungsrahmen sehr
einschranken
Abb 7 7 Chemische Struktur des
perfluorosulfonierten Polymers
Nafion [133]
-[(CF2CF2)mCFCF2]n
f2CFCF3
O
I
CF2CF2S03H
7 5 4 pH-empfindliche Optoden basierend auf Nafion-Membranen
Die Verwendung des Ionentauscher-Polymers Nafion kombiniert
ein sehr polares Membranmedium mit immobilisierten anionischen
Zentren Dadurch kann zum einen die Loslichkeit kationischer Farbstoffe
durch Bildung von Ionenpaaren verbessert werden Zum anderen steht ein
Kationentauscher in der Membranphase zur Verfugung, der es gestattet,
Optoden beruhend auf dem Ionenaustauschpnnzip zu realisieren Es
wurde dadurch möglich, optische Sensormembranen basierend auf
kationischen pH-Indikatoren, die reproduzierbar und reversibel auf pH-
Anderungen der Probelosung ansprechen, zu realisieren Patonay und
Mitarbeiter beschreiben einen pH-Sensor aus Nafion mit pHCOOH+ (C)
als immobilisiertem pH-Indikator [69] In dieser Arbeit wurde das gleiche
Prinzip neben pHCOOH+ auf den Farbstoff PDC+ (D) angewendet und in
ein optisches Durchflusssystem implementiert [133] Dies gestattete die
Untersuchung des Ansprechverhaltens und der Stabilität des Systems bei
7 5 Cyanine und Streptocyanine als Chromoionophore 131
kontinuierlichem Betneb Auch konnten die Signalverluste durch Aus¬
waschen der Indikatoren erfasst werden Für beide untersuchten Farb¬
stoffe traten keinerlei Loshchkeitsprobleme in der polaren Nafion-Umge-
bung auf Die resultierenden Membranen waren auch nach dem Ver¬
dunsten des Losungsmittels vollständig transparent Abbildung 7 8 zeigt
die Absorptionsspektren, die mit einem Sensor mit PDC+ (D) als
Chromoionophor in Nafion aufgenommen wurden
Abb 7 8 Absorptionsspektren einer Nafion-Optode der Zusammen¬
setzung M21 (Durchflusssystem) mit Chromoionophor PDC+ in Ab¬
hängigkeit des pH-Wertes der Probelosung (Acetat- und Phosphatpuffer)
1Membranzusammensetzungen siehe Anhang 1
132 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIR FARBSTOFFEN
Der zugrundeliegende Ionenaustauschprozess kann schematisch folgender-
massen dargestellt werden
PDC+
(mem) + I+
(mem) + 2 R - SOJ(mem) + H+
(aq)
*
W
PDCH2+(mem) + 2R-SO^mem)-!-I+
(aq)
(7 2)
Die Ansprechgeschwindigkeit für eine 95% Signalanderung (t,,4) betrug
bei kontinuierlichem Probewechsel in der Durchflusszelle (27 ± 3) s für
eine vollständige Deprotonierung (n=6, 95%, Wechsel von 0 01 mol L'
HCl zu 0 14 mol L'
Phosphatpuffer pH 7 0) und (104 ± 11) s für eine
vollständige Protonierung (n=6, 95%, Wechsel zu 0 01 mol L'
HCl) Die
beobachtete Hysterese in der Ansprechgeschwindigkeit wurde erwartet
und lasst sich durch die hohe Pufferkapazitat des verwendeten Phosphat¬
puffers im Vergleich zur verdünnten Saure begründen Für die
eingesetzte Sensormembran wurden mit dem Indikator PDC+ nur geringe
Signalverluste durch Auswaschen des Chromoionophors aus der
Membranphase in die wassrige Probe beobachtet Dies äusserte sich in
einer hohen Signalstabilitat und Reproduzierbarkeit bei wiederholtem
Wechsel vom protonierten in den deprotonierten Zustand des Indikators,
wie in Abbildung 7 9 dargestellt ist
7 5 Cyanine und Streptocyanine als Chromoionophore 133
20-,
E15'c
oCON
11 0-
g
c
X
LU05
00^
U
o
Puffer pH 7 0 Tag 1
n
U 0 01 mol L
u uHCl
u u
50 100
Zeit / min
Tag 2
n
150
Abb 7 9 Kurzzeitreproduzierbarkeit einer Nafion-Optode der Zusam
mensetzung M2 mit PDC+ als Chromoionophor (vgl Abb 7 8), aufge¬
nommen bei 780 nm an zwei aufeinanderfolgenden Tagen, verwendete
Pufferlösung 0 14 mol L'
Phosphatpuffer
Im Falle des Einsatzes von pHCOOH+ als Indikator wurden wesentlich
weniger stabile Signale beobachtet Die Signalverluste waren beim Spulen
mit verdünnter Saure (0 Ol mol L'HCl) am stärksten In Abbildung 7 10
sind die Ansprechfunktionen für zwei verschiedene Nafion-Optoden
dargestellt, wie sie mit den Indikatoren pHCOOH+ (C) und PDC+ (D)
realisiert wurden Es wurde eine pH-unabhängige Auftragung der
Resultate gewählt Daraus hessen sich die scheinbaren pKa-Werte (pH-
Wert für 50 % Protonierungsgrad) der Chromoionophore im Nafion-
Membransystem bestimmen
134 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIR-FARBSTOFFEN
=^r A—a —a
^^-o o o ^g?
1 1 1 1 1 1 1
0 2 4 6 8 10 12 14
log (aNa+ / aH+)
Abb 7 10 Kalibrationskurven von Nafion-Optoden mit Chromoionophor
D (O, M2) und C (A, M3) Experimentelle Messdaten (0,A) sowie
angepasste sigmoidale Kahbrationsfunktion (—)
Für den Streptocyanin-Indikator PDC+ fand man einen scheinbaren pKa-
Wert von 4 5 und für den Cyanin-Indikator pHCOOH+ einen pKa-Wert
von 13 0 im verwendeten Sensorsystem für einen NaMonenhintergrund
von log a =-1 5
Für die mathematische Beschreibung der Kahbrationsfunktion
(ausgezogene Linie in Abb 7 10) wurde eine allgemeine sigmoidale
Funktion der Form y = 1 /(l + e") an die Messdaten angepasst
Da es sich bei Nafion um einen Kationentauscher handelt, muss der
Einfluss von Alkalnonen auf das optische Signal beachtet werden Die
ermittelte scheinbare Aciditatskonstante ist daher möglicherweise vom
Na+-Gehalt abhangig In der Literatur findet man die folgende Reihe der
I .u
08-
aCOi_
O)
«0.6
c
o 04io
02
OO
7 5 Cyanine und Streptocyanine als Chromoionophore 135
Assoziationskonstanten für Nafion mit Alkaliionen und Protonen in
wassriger Umgebung K+>Na+>H+>Li+ [134] Dies bedeutet, dass die in
physiologischen Proben vorliegenden Alkaliionen Kalium und Natrium
starker an Nafion gebunden werden als Protonen Falls diese Tatsache das
Protonierungsgleichgewicht des Indikators beeinflussen wurde, wäre der
praktische Nutzen des Sensors sehr beschrankt Patonay et al führten
Untersuchungen von K+-, Na+- und Li+-Interferenzen auf das Verhalten
des Indikators pHCOOH+ in Nafion durch [69] Dabei wurde keine
signifikante Verfälschung der pH-Bestimmung festgestellt, solange der
Indikator im Absorptionsmodus vermessen wurde Fluoreszenzmessungen
hingegen, zeigten eine Querempfindlichkeit gegenüber Lithiumionen
Eigene Experimente belegten, dass bei der Verwendung von PDC+ als
Chromoionophor in Nafion-Schichten sehr geringe, reversible spektrale
Änderungen des NIR-Signals, verursacht durch Kahumionen in sauren
Losungen (0 01 mol L'KCl in 0 01 mol L
'
HCl), zu beobachten waren,
die vom Verlauf her einer Deprotonierung des Indikators entsprachen
Der Farbstoff selbst zeigte aber in ethanohscher Losung keine
Empfindlichkeit gegenüber den Natrium und Kahumionen Damit konnte
eine direkte Wechselwirkung zwischen Chromoionophor und Alkaliionen
ausgeschlossen werden Die leichte Signalzunahme im NIR-Bereich kann
daher durch eine erleichterte Deprotonierung des Indikators infolge
bevorzugter Aufnahme von Kahumionen in die Nation-Struktur erklart
werden Für Natriumionen war der gleiche Effekt in noch geringerem
Ausmass zu beobachten Eine wesentliche Störung der pH Messung durch
Alkaliionen, vorliegend in geringen Konzentrationen (< 0 01 mol L '), ist
also nicht zu erwarten
Im weiteren Verlauf der Arbeiten stellte man fest, dass aufgrund des
ionischen Charakters und der damit verbundenen hohen Polarität des
Membranmediums sich keine der bekannten Ionophore für die
Realisierung einer lonenselektiven Optode mit Nafion kombinieren lassen
136 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIR FARBSTOFFEN
Diese Aussage trifft auf alle Liganden zu, die im Hinblick auf die
Loslichkeit in apolarer, hoch-lipophiler Umgebung optimiert wurden
Zusätzlich muss bedacht werden, dass der hohe Uberschuss an negativ
geladenen Zentren in Nafion jeglichen Einfluss eines Ionophoren unter¬
drucken wurde und somit zwangsläufig zu einfachen Kationentauscher-
Optoden ohne spezifisches Selektivitatsverhalten fuhren musste
7 5 5 Optoden basierend auf PVC-Membranen
Auf der Basis der vorangehenden Resultate stand fest, dass mit
Vorteil nicht-ionische Polymere verwendet werden, um optische Sensoren
im NIR-Spektralbereich mit Einbezug der bekannten lonenselektiven
Liganden realisieren zu können Aus diesem Grund wurde untersucht, ob
die beiden zuvor in Nafion charakterisierten Indikatoren pHCOOH+ und
PDC+ sich gegebenenfalls auch in weichgemachten PVC- oder Hydroxy
PVC-Membranen (OH-PVC) in Kombination mit einem lonophor ein¬
bringen lassen In Tabelle 7 3 findet man eine Zusammenstellung über
qualitative Eigenschaften wie die Loslichkeit, die pH-Empfindlichkeit und
die allgemeine Stabilität der resultierenden Membransysteme
durchzufuhren
Messungen
lonenselektive
mögl
ich,
nicht
war
Es
werden
untersucht
Anderungen
pH-
gegenüber
Verhalten
das
nur
konnte
enthielten,
Liganden
lonenselektiven
einen
Membranen
die
Obwohl
c
o-NPOE
Membranen
allen
in
Weichmacher
b
1Anhang
siehe
Membranzusammensetzung
die
Für
a
unlöslich
OH-PVC
pHCOOH+
M7
Membran
transparente
unempfindlich
gut
OH-PVC
PDC+
M6
Sign
alve
rlus
terasche
feststellbar
gering
PVC
pHCOOH+
M5
Sign
alve
rlus
terasche
Membranen
transparente
repr
oduz
ierb
ar
nicht
gut
PVC
PDC+
M4
matr
ix''
typ1
Membranquahtat
pH-E
mpfi
ndli
chke
it"
Loshchkeit
Membran¬
Farbstoff
Membran¬
Nafion-Membranen
nicht
in
Chromoionophore
als
Streptocyamn-Farbstoffen
und
Cyanin-
mit
Optodenmembranen
von
Eige
nsch
afte
nQualitative
37
Tabelle
138 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIR FARBSTOFFEN
Die Daten für Membran M6 zeigen, dass der Farbstoff PDC+ gut löslich
in der o-NPOE weichgemachten OH-PVC Matrix war Allerdings konnte
keine pH Abhängigkeit der aufgezeichneten Spektren beobachtet werden
Im Gegensatz zu Membran M4 mit unsubstituiertem PVC als Matrix,
wurden mit M6 auch nach längerem Probendurchfluss optische Signale
mit konstanter Intensität registriert Dies deutet darauf hin, dass die
Polantat des Membranmediums für die Herstellung einer stabilen Sensor¬
membran ausreichend ist und das rasche Auswaschen des Chromo¬
ionophors in die Probelosung verhindert werden kann Die fehlende pH-
Empfindlichkeit - eine Protonierung des Indikators in der Membranphase
war nicht möglich - wurde einer Reduktion des scheinbaren pKa-Wertes
(4 5 in Nafion) gegenüber der wesentlich polareren Umgebung der
Nafion-Membran zugeschrieben Offensichtlich kann die resultierende
zweifach positive Ladung des protonierten Farbstoffes PDCH1+ in der
hpophileren Membran nicht genügend stabilisiert werden Der Indikator
pHCOOH+ (Membran M7) schien in OH-PVC nahezu unlöslich zu sein
7 5 6 Schlussfolgerungen
Innerhalb der Auswahl der untersuchten Vertreter von Indikatoren
aus der Gruppe der Cyanine und Streptocyanine konnte kein Farbstoff
gefunden werden, der alle gestellten Anforderungen an einen Chromo¬
ionophor, wie in Kapitel 7 3 zusammengestellt, erfüllen konnte Einfache,
pH-empfindliche optische Sensormembranen, die im Bereich des nahen
Infrarot eingesetzt werden können, wurden unter Verwendung des
polaren Ionentauscher-Polymers Nafion verwirklicht Das Einbringen von
neutralen, lonenselektiven Liganden in diese Membranumgebung war
jedoch nicht möglich, da diese alle für apolare, hpophile Medien optimiert
wurden und sich daher in Nafion-Schichten ungenügend losen hessen
Umgekehrt konnten die meisten Farbstoffe ihrerseits wegen Loshchkeits-
problemen nicht in weniger polaren Medien eingesetzt werden Mit
7 5 Cyanine und Streptocyanine als Chromoionophore 139
abnehmender Polarität der Membranphase wurde gleichzeitig eine
Verminderung der Basizitat der Chromoionophore beobachtet, bis
schliesslich sehr tiefe scheinbare pKa-Werte gemessen wurden oder eine
Protonierung verunmoglicht wurde Eine Erhöhung der Basizitat der
Indikatoren wurde nicht in Erwägung gezogen, da damit die potentiell
auftretenden Loshchkeitsprobleme im Zusammenhang mit kationischen
Farbstoffen nicht eliminiert worden waren Zumindest wäre eine
gleichzeitige Lipophdisierung der Farbstoffe unumgänglich gewesen
Elektrisch geladene Cyanin- oder Streptocyanin-Farbstoffe lassen sich nur
in Kombination mit polaren oder geladenen Membranmedien einsetzen
und sind daher nicht ohne weiteres mit hpophden Ionophoren
kombinierbar Für das weitere Vorgehen wurde beschlossen, elektrisch
neutrale NIR-Farbstoffe vom Typ der Merocyanine oder zwitterionische
Verbindungen in Analogie zum Croconium-Farbstoff (E) in den Mittel¬
punkt der Untersuchungen zu stellen
140 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIR FARBSTOFFEN
7.6. Merocyanine als Chromoionophore
7 6 1 Ausgangslage
Merocyanine sind ungeladene Polymethin-Farbstoffe Es wurde
erwartet, dass dadurch Probleme mit der Loslichkeit der Indikatoren in
apolarer Membranumgebung, wie sie bei den kationischen Vertretern der
Gruppe der Cyanine und der Streptocyanine beobachtet wurden, ver¬
ringert werden können In Abbildung 7 11 sind die Strukturen der
charakterisierten Verbindungen dargestellt Die drei untersuchten
Beispiele sind der von der Quadratsaure abgeleitete Squann-Farbstoff (F)
[105 135], der in einer zwitterionischen Form als gesamthaft elektrisch
neutrale Verbindung vorliegt, der Dicyanovinyl-Farbstoff (G) [136 137]
und der asymmetrische Tnmethinium-Farbstoff (H) [129 138] Die
vollständigen Namen der Verbindungen sind in Kapitel 9 6 aufgeführt
Verantwortlich für die langwelligen Absorptionsbanden der Farbstoffe F
und G sind die in Abbildung 7 5 präsentierten besonders effizienten
Donor- und Akzeptorsysteme
Wie erwartet, traten aufgrund der elektrischen Neutralität keine schwer¬
wiegenden Loshchkeitsprobleme in apolaren Membranmedien auf
Dennoch muss beachtet werden, dass es sich bei den untersuchten Verbin¬
dungen nicht um lipophihsierte Substanzen handelte, die gezielt für den
Einsatz in lipophiler Umgebung optimiert wurden Aus diesem Grund
zeigte der Tnmethinium-Indikator (H) sowohl in DOS- wie auch in o-
NPOE-weichgemachten Membranen eine begrenzte Loslichkeit, die die
Anwendung von Ultraschall zur Homogenisierung der Membranlosung
erforderlich machte In Tabelle 7 4 sind die optischen Parameter der drei
Indikatoren in Losung und in weichgemachten PVC-Membranen zusam¬
mengefasst
7 6 Merocyanine als Chromoionophore 141
Abb 7 11 Untersuchte Merocyanin Farbstoffe F Squann-Farbstoff, G
Dicyanovinyl-Farbstoff, H Trimethinium Farbstoff
Der hohe molare dekadische Extinktionskoeffizient e des Squann-Farb-
stoffes im Vergleich zu den beiden anderen Merocyaninen lasst sich damit
begründen, dass die Struktur derjenigen eines symmetrischen,
kationischen Cyanin-Farbstoffes sehr nahe verwandt ist Symmetrische
Cyanin-Farbstoffe zeigen allgemein die höchsten Extinktionskoeffizienten
innerhalb der Gruppe der Polymethin Farbstoffe
142 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIR-FARBSTOFFEN
Tabelle 7.4: Optische Eigenschaften (Wellenlänge maximaler Absorption
A.max, molarer dekadischer Extinktionskoeffizient emax) von Merocyanin-
Farbstoffen in verschiedener Umgebung1.
Farbstoff Squarin Dicyanovinyl Trimethinium
(F) (G) (H)
A,max Lösung 815a 763b
[nm]
Membran- DOS 819 755
Weichmacher
o-NPOE 821 768
Propylen- 821 768
carbonat
emax Lösung 136700a 28900"
[L mol"' cnT1]
a
Lösungsmittel: Ethanol
b
Lösungsmittel: Methylenchlorid (ungenügend löslich in Ethanol)
839a
850
n. g.
848
57100a
1Die Angaben beziehen sich auf die intensivste Absorptionsbande unabhängig davon, in welchem
Protonierungszustand der Indikator vorliegt
7 6 Merocyanine als Chromoionophore 143
7 6 2 pH-empfindliche Optoden basierend auf weichgemachten PVC-
Membranen
Ein Vorteil des weichgemachten PVC-Systems ist die Tatsache, dass
die Polarität der Membranphase zum grossten Ted durch den ver¬
wendeten Weichmacher, der als Membranlosungsmittel dient, bestimmt
wird Aus diesem Grund ist es möglich, die Losungsmittelumgebung der
Membranbestandtede zu variieren, ohne aber die Polymer-Matrix (PVC)
wechseln zu müssen Diese Tatsache wurde ausgenutzt, um die Selektivität
von lonenselektiven Elektroden [130] und die Lebensdauer von Mem¬
branen allgemein zu verlangern Im Spezialfall der optischen Sensoren
können die optischen Eigenschaften sowie die scheinbaren Aciditats-
konstanten der Chromoionophore in der Membranphase durch Wechsel
des Weichmachers modifiziert werden [139] Im weiteren beeinflusst die
Loslichkeit des Farbstoffes im Weichmacher zusammen mit seiner Lipo-
philie die Lebensdauer der Sensormembran [81]
Für diese Untersuchungen wurden lediglich drei Beispiele aus der grossen
Anzahl von Weichmachern [130] evaluiert Die Auswahl wurde so
getroffen, dass ein möglichst breiter Polantatsbereich, ausgedruckt durch
die Dielektrizitätskonstante e, abgedeckt werden konnte Die optischen
Eigenschaften der Merocyamn-Farbstoffe F, G und H in PVC-
Membranen mit den drei ausgewählten Weichmachern sind aus Tabelle
7 4 zu entnehmen Für den Squann-Farbstoff (F) und den Tnmethimum-
Chromophor (H) wird kein solvatochromer Effekt beobachtet Der
Dicyanovinyl-Indikator (G) hingegen, zeigt eine bathochrome Ver¬
schiebung von 13 nm beim Wechsel von DOS zum polareren
Weichmacher o-NPOE oder Propylencarbonat Diese sogenannte positive
Solvatochromie lasst auf eine Erhöhung des Dipolmoments im angeregten
Zustand des Farbstoffs gegenüber dem Grundzustand schliessen, die zu
einer Absenkung des Energieniveaus des angeregten Zustands fuhrt [140]
Beim Squann- und beim Tnmethinium-Farbstoff tritt demzufolge keine
144 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIR-FARBSTOFFEN
wesentliche Änderung des Dipolmoments bei der elektronischen
Anregung auf Dieser Sachverhalt konnte durch PPP-Rechnungen
bestätigt werden
Abbildung 7 12 zeigt ein typisches Beispiel von Absorptionsspektren in
Abhängigkeit des pH-Wertes der Probelosung für eine Optode im NIR-
Bereich Dieser Sensor wurde mit dem Squann-Farbstoff (F) in einer
DOS-weichgemachten PVC-Membran realisiert Die Membran enthielt
zusatzlich das hpohile Boratsalz KTFPB (vgl Abschnitt 9 6) zur Auf¬
rechterhaltung der Elektroneutrahtat der Membranphase In Abbildung
7 13 ist das Resultat des analogen Experimentes mit dem Dicyanovinyl-
Farbstoff (G) dargestellt Die entsprechenden Spektren in PVC-
Membranen mit dem Weichmacher o-NPOE unterscheiden sich nicht
wesentlich von den in Abbildungen 7 12 und 7 13 dargestellten Resultaten
Für die Ermittlung der scheinbaren Aciditatskonstante pKa der
Indikatoren in den Optodenmembranen wurden die Signale im
Absorptionsmaximum ausgewertet Das Spektrum des Chromoionophors
F zeigt im Gegensatz zum Dicyanovinyl-Farbstoff (G) und dem im
Kapitel 7 5 4 gezeigten Indikator PDC* (D) in Bezug auf die Protolyse
ein unterschiedliches Verhalten, das aufgrund der Struktur des Farbstoffs
erklart werden kann Im Falle des Streptocyanin-Farbstoffes PDC+ fuhrt
eine vollständige Protonierung (PDCH+) zum Verlust der NIR-
Absorption und es tritt eine neuen Bande um 300 nm hypsochrom
verschoben auf (Abb 7 8) Beim Dicyanovinyl-Chromoionophor stellt
man gar eine Verschiebung der Bande in den UV-Spektralbereich fest
Für den Squann-Farbstoff hingegen, ist die beobachtete hypsochrome
Wellenlangenanderung wesentlich geringer Im PDC+-Ion wird das
konjugierte rc-System durch eine Protonierung (PDCH2+) vollständig
unterbrochen Bei Squann muss von einer Protonierung der vinylogen
Carbonsaure im Quadratsaurekern des Moleküls ausgegangen werden
Dadurch wird das Resonanzsystem jedoch nicht unterbrochen, sondern
durch einen veränderten externen Substituenten von aussen beeinflusst
7 6 Merocyanine als Chromoionophore 145
Die Protonierung reduziert in diesem Fall den Elektronenuberschuss am
Substituenten und kann daher formal als Einfuhrung eines Akzeptors
betrachtet werden, was in dieser Position zu einer hypsochromen
Verschiebung der Absorptionsbande fuhren muss (siehe Abb 7 3) Das
Ausmass ist aber erwartungsgemass geringer, als bei einem vollständigen
Unterbruch des konjugierten Jt-Systems Die beobachtete hypsochrome
Verschiebung betragt in diesem Beispiel noch 110 nm und eine neue
Absorptionsbande tritt bei 700 nm Wellenlange auf
Abb 7 12 pH-abhangige Absorptionsspektren einer Optode der Zusam¬
mensetzung M8 mit Squann-Farbstoff (F) als Chromoionophor in einer
DOS-weichgemachten PVC-Membran
146 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIR-FARBSTOFFEN
Der zugrundeliegende Ionenaustauschprozess folgt den Gleichungen 5.5
und 5.6 und kann schematisch folgendermassen dargestellt werden:
C(mem) +1+ (mem) + R" (mem) + H+ (aq)
^ CH+
(mem) + R"(mem) + r(aq)
(7.3)
Der Zusatz des lipophilen anionischen Additivs R~ ist zur Gewährung der
Elektroneutralität der Membranphase notwendig. Die Ansprechfunktion
des Sensors lässt sich durch Gleichung 5.6 beschreiben und ist in
Abbildung 7.15 dargestellt.
040~| Dicyanovinyl-Farbstoff (G)KTFPB _—-PH 5.0
400 500 600 700 800 900
Wellenlänge / nm
Abb. 7.13: pH-abhängige Absorptionsspektren einer Optode der Zusam¬
mensetzung M9 mit Dicyanovinyl-Farbstoff (G) als Chromoionophor in
einer DOS-weichgemachten PVC-Membran.
7 6 Merocyanine als Chromoionophore 147
Der zugrundeliegende lonenaustauschprozess kann in Analogie zum
Squann-Farbstoff (vgl Abb 7 12) beschrieben werden Die theoretische
Ansprechfunktion, ermittelt nach Gleichung 5 6 ist in Abbildung 7 15
dargestellt
Die Untersuchung der Reversibilität und des Ansprechverhaltens für den
Chromoionophor F in DOS-weichgemachten PVC-Membranen zeigte,
dass mit dem Squann-Farbstoff reproduzierbare Absorptionsanderungen
und stabile optische Signale erhalten werden (Abbildung 7 14) Arbeitete
man allerdings in stark alkalischer oder stark saurer Probelosung (0 01
mol L'NaOH resp 0 01 mol L
'
HCl) traten Signalverluste auf, die als
Hydrolyse des Indikators interpretiert wurden
pH 3 2^pH 3 7
Squann-Farbstoff (F)KTFPB
DOS/PVC
1
10
I
20
I I
30 40
Zeit / min
i
50
1
60
i
70
Abb 7 14 Ansprechverhalten eines pH-Sensors der Zusammensetzung
M8 mit Squann (F) als Chromoionophor gegenüber Citrat-Puffer-
losungen bei kontinuierlichem Probenwechsel in einem Durchflusssystem
148 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIR-FARBSTOFFEN
Mit dem Dicyanovinyl-Farbstoff (G) in der Membran wurde ebenfalls
hohe Signalstabilitat und Reproduzierbarkeit beobachtet, solange der
Sensor nicht im alkalischen Milieu eingesetzt wurde In diesem Fall verlor
die NIR-Absorptionsbande irreversibel an Intensität, wahrend im sicht¬
baren Bereich (bei 600 nm) eine neue Bande zu beobachten war
Besonders rasch verlief dieser Vorgang in der Gegenwart lipophder
Kationen wie MTDDAC1 (vgl Kapitel 9 6) in der Membranphase Der
Amonentauscher wirkt unter diesen Bedingungen als Phasentransfer-
katalysator, der Hydroxid-Ionen in die Membran zu extrahieren vermag
und somit eine basenkatalysierte Hydrolyse unterstutzt
Der Gebrauch von Propylencarbonat als polarer Weichmacher führte zu
Stabilitatsproblemen in der Membranzusammensetzung Der Weich¬
macher schwitzte rasch aus der PVC-Membran aus, und die Polymer¬
schicht verlor ihre Flexibilität und Transparenz Es musste zusatzlich
angenommen werden, dass der Weichmacher bei Kontakt des Sensors mit
wassriger Probelosung aus der Membranphase ausgewaschen wird
Reproduzierbare Messungen konnten mit diesem Material nicht
vorgenommen werden
Beruhend auf den bekannten Modellen von Bakker [32] konnten nach
Gleichung 5 6 die Aciditatskonstanten der Chromoionophore in der
Membranphase abgeschätzt werden Die pH-unabhängige Auftragung der
Ansprechkurven für die verschiedenen Sensormembranen findet man in
Abbildung 7 15 Die zugehörigen Daten der experimentell ermittelten
pKa-Werte in der Sensormembran sind in Tabelle 7 5 wiedergegeben
Daraus kann entnommen werden, dass der Weichmacher o-NPOE mit
einer höheren Polarität (höhere Dielektrizitätskonstante e) als DOS zu
einer verstärkten Basizitat der Indikatoren fuhrt Diese erwartete
Beobachtung lasst sich durch die höhere Stabilisierung der protonierten,
elektrisch geladenen Moleküle über Dipol-Dipol Wechselwirkungen in der
polareren Umgebung erklaren Das Ausmass der Stabilisierung hangt im
einzelnen aber von den Eigenschaften des Indikators ab Für den Squann-
7 6 Merocyanine als Chromoionophore 149
Indikator wurde ein kleineres Inkrement des pKa-Wertes beobachtet
(ApKa = 1 7), wahrend im Falle des Dicyanovinyl-Farbstoffes eine
Basizitatserhohung von 2 5 pKa-Einheiten festgestellt wurde Es kann
davon ausgegangen werden, dass die Squann-Verbindung in der Membran
in zwitterionischer Form auftritt Eine Erhöhung der Polantat der
Umgebung fuhrt zu einem geringeren, zusätzlichen Stabihtatsgewinn im
Vergleich zum Dicyanovinyl-Farbstoff, da der Squann-Chromoionophor
bereits in der nicht protonierten neutralen Form elektrische Ladungen
tragt, im Gegensatz zur ungeladen vorliegenden Dicyanovinyl-
Verbindung
Tabelle 7 5 Aciditatskonstanten pKa für Merocyanine in PVC-Sensor-
membranen mit unterschiedlichen Weichmachern Die Dielektrizitäts¬
konstante e diente der Quantifizierung der Polarität des Weichmachers
rarnsion Weichmacher DOS o-NPOE Propylen-
carbonat
£[130 141] 3 9 ±0 1 23 9±0 3 70 5±5 0
(Membran) (Membran) (Membran)
Squann (F) pKa 2 7±0 1 4 4±0 1a
(M8) (MIO) (M12)
Dicyanovinyl (G) pKa 4 0±0 1 6 5±0 1 a
(M9) (Mll) (M13)
Tnmethinium (H) pKa 11 5±0 0 n g n g
(M14)
a
Die ungenügende Membranstabihtat (siehe Text) erlaubte keine
Bestimmung
150 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIR-FARBSTOFFEN
1 On
08H
T3
c
<y
o 04
o
Q.
02-
00-"T~
0
__, , r
4 8
log [aK> / aH*]
i
12
Abb 7 15 Ansprechkurven für Farbstoffe F (•, log Klxlh=-2 4, M8), G
(A, log Ktxü=-3 7. M9) und H (, log KtxJ=-l 1 3, M14) in DOS-weich¬
gemachten PVC-Membranen sowie F (O, log KtxUl=-2 6, MIO) und G (A,
log KlXL,,=-4 7, Mll) in Membranen mit ^-NPOE Die ausgezogenen
Linien stellen die angepasste theoretische Ansprechfunktion, ermittelt
nach Gleichung 5 14 dai
Nachdem nun mit drei verschiedenen Vertretern aus der Gruppe der
Merocyanine erfolgreiche Messungen in weichgemachten PVC-
Membranen durchgeführt worden waren, stellte sich die wichtige Frage,
ob sich die untersuchten Verbindungen als Chromoionophore in
Kombination mit einem lonenselektiven Liganden zu einem optischen
Sensor für Kationen oder Anionen kombinieren lassen Im Kontrast zu
den kationischen Cyanin- und Streptocyamn-Farbstoffen war in diesem
Fall nicht die Loslichkeit der Komponenten in lipophder Umgebung das
ausschlaggebende Kriterium Für die Verbindungen F und G bestand
7 6 Merocyanine als Chromoionophore 151
zudem eine relativ einfache Möglichkeit zur Lipophdisierung durch
Einführung langkettiger Alkylreste wahrend der Synthese Wichtiger w ar
in diesem Zusammenhang die Frage nach der Basizitat des Chromo
lonophors im Verhältnis zur Komplexstabditatskonstante die zusammen
mit dem pH Wert der Probelosung den Ansprechbereich des Sensors
bestimmt (vgl Kapitel 7 3)
Der Vergleich dei Daten aus Tabelle 7 5 mit Abbildung 7 2 zeigt dass
einzig dei Trimethimum Chromoionophor (H) eine Basizitat autweist die
für eine Kombination mit den ttaditionellen kuttonenselekmen ETH
Liganden [142| genügend hoch ist Ionensclekme Messungen im
physiologischen pH-Beieich mit dem Indikator F als Chromoionophor
sind ausgeschlossen Auch wenn sieh dei pK, Weit des Dic\ano\m\l
Indikatois (G) durch die Wahl eines polaieren Weichmachers zu
basischeren Weiten \etschieben lasst ieicht diese VeisiJuebung nicht aus
um einen kationenselektiven Sensot tut Analysen im philologischen pH
Bereich in dei unverdünnten Piobe mit einem bekannten lonophoi zu
realisieren Anwendungen iintei Bedingungen bei welchen im staik
sauren pH Bei eich in vei dünnten Losungen odei in Kombination mit
einem Liganden mit veihaltnismassig kleiner Komplexierungskonstante
geuibeitet wird, sind jedoch denkbar
7 6 3 Ca +-selektive Optode tur den binsatz im NIR Spektrulbereieh
Der Trimethimum Farbstott (H) wurde erfolgreich in DOS weich
gemachten PVC Membranen als Chromoionophor tur Ca+
Messungen in
Kombination mit dem Liganden FTH 1001 eingesetzt Die Abbildung 7 16
zeigt die Absorptionsspektren des optischen Sensors mit dem lonophoi
ETH 1001 und dem Chromoionophor Trimethimum (H) in Kontakt mit
Ca2+-Losungen
152 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIR FARBSTOFFEN
300 400 500 600 700 800 900
Wellenlange / nm
Abb 7 16 Absorptionsspektren einer Ca1+-selektiven Optode der Zusam¬
mensetzung Ml5, die mit verschiedenen Ca,+haltigen, bei pH 4 8 ge¬
pufferten Losungen äquilibriert wurde
Der zugrundeliegende lonenaustauschvorgang wird durch Abbildung 5 2a
sowie durch Gleichung 5 7 repräsentiert
Die fünf deutlichen isosbestischen Punkte belegen, dass wahrend diesem
Experiment kein Verlust an Chromoionophor auftrat In Abbildung 7 17
ist die zugehörige, nach Gleichung 5 14 berechnete Kalibrationskurve
dargestellt
05-
04-
c
o
| 03-
x
LU
02-
0 1
7 6 Merocyanine als Chromoionophore 153
1.0-|
0.8-
73ro
D)
g,06c
^_
0
o 04
o
Q.
02
0.0 -l
Tnmethinium (H)ETH 1001
NaTFPB
DOS/PVC
Natnumacetatpuffer pH 4.8
-4
log aCa2
r
0
Abb 7 17 Kalibrationskurve für eine Ca+-selektive Optode der Zusam¬
mensetzung M15 in Kontakt mit verschiedenen Ca+-haltigen, bei pH 4 8
gepufferten Losungen Die ausgezogene Kurve wurde nach Gleichung
5 14 mit log K^ = -5 3 berechnet
Das Ansprechverhalten bei vollständiger Protonierung und Deproto¬
nierung war reversibel und führte zu stabilen, reproduzierbaren optischen
Signalen, wie sie in Abbildung 7 18 dargestellt sind In gepufferten, Ca2+-
haltigen Probelosungen wurden gegenüber metalhonenfreien Losungen
(Abb 7 18) deutlich längere Ansprechzeiten beobachtet, wie der Wechsel
zwischen 10'und 10~4 mol L
'
Ca2+-Losung in Abbildung 7 19 zeigt
Dieses Verhalten kann mit den unterschiedlichen Diffusionskoeffizienten
für Protonen und für Ca2+-Ionen sowie mit der verschiedenen
Austauschkinetik von Ionen am lonophor und Protonen am Chromo¬
ionophor erklart werden und wird für alle Ionenaustausch-Optoden
154 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIR FARBSTOFFEN
beobachtet [80] Man geht davon aus, dass die Diffusion der verschiedenen
Spezies in der Membranphase limitierend ist und die Geschwindigkeit
bestimmt
0 806 0 807 0 805 0 802
08-
W = 45 S W = 45 s »95% = 45 S
07-
?c
0 01 mol L"1 HCl
(850o CD 1
Extinktion o
o
*.
Ol
i
i
,
0 01 mo L 1KC)HI
03- W = 96 SJ W = 81 s I t95% = 78 s ^v02-
0 250 0 248 0 250
I I I I I I
0 5 10 15 20 25 3(
Zeit/ min
Abb 7 18 Kurzzeitreproduzierbarkeit einer Optode der Zusammen¬
setzung M15 mit Chromoionophor Trimethimum (H) gegenüber voll-
standiger Protonierung und Deprotonierung bei kontinuierlichem Probe
Wechsel Messlosungen 0 01 mol L'HCl und 0 01 mol L
'KOH Die
angegebenen Extinktionswerte wurden unmittelbar vor dem Proben¬
wechsel gemessen
Bei den hier angegebenen Ansprechzeiten t,,^ ist es wichtig zu beachten,
dass diese für einen kontinuierlichen Probenwechsel gültig sind Bei
Anwendung eines Batch-Verfahrens mit vollständiger Entleerung der
Messzelle zwischen einzelnen Messungen werden wesentlich kürzere An-
7 6 Merocyanine als Chromoionophore 155
Sprechzeiten beobachtet, da keine Mischeffekte in der Messzelle oder
innerhalb des Probenflusses (carry over) eintreten So reduzierte sich
unter diesen Bedingungen die Ansprechzeit für einen Konzentrations¬
sprung von 104
zu 10'mol L
'
Ca,+-Losung in Acetatpuffer von rund 2
min auf lediglich 12 s und tur die Konzentrationsabnahme von 10'auf
104mol L
' Ca1+ Losung von 4 5 min auf 20 s Das wiederholte
vollständige Entleeren und sehr rasche Füllen der relativ grossen Mess
zelle führte aber zu weniger reproduzierbaren optischen Signalen und
teilweise zu mechanischer Beschädigung der Sensormembran
O 100-
0 101 0 101
n r\ r\W = 281 S, »95% = 275 S
10-4 mol L1
CaCL, in Puffer
0 101
S 0 095 -
CO,
c
o
|= 0 090-
,2 t95% = 128s t95%=112s| tQW„=125s
0 085-
u
0 101
r
0 086 0 086 0 086
103
mol L1
CaCI2 in Puffer
—i 1 r~
10 20 30
Zeit / min
Abb 7 19 Kurzzeitreproduzierbarkeit einer Optode der Zusammen
setzung M15 mit Chromoionophor Trimethimum (H) und lonophor ETH
1001 bei kontinuierlichem Losungswechsel Die angegebenen Extinktions
werte wurden unmittelbar vor dem Probenwechsel gemessen
156 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIR-FARBSTOFFEN
Die Lebensdauer des Sensors wurde im Rahmen dieser Arbeit nicht in
ausführlichen Langzeitstudien untersucht Es zeigte sich aber, dass die
Membranen auch nach zweiwöchiger Lagerung in Acetatpuffer unter
Ausschluss von Licht einsatzfahig blieben Bei der Spulung des Sensors
mit destilliertem Wasser (1 5 mL / min) wahrend 15 Stunden, wurde bei
einer Wellenlange von 850 nm ein Signalverlust von 5% festgestellt
Um die Lebensdauer von Optoden zu erhohen, wurde abgeklärt, wieweit
die Viskosität einer PVC-Flussigmembran erhöht werden kann, ohne
damit die Ansprechzeiten drastisch zu verandern [80 143] Dadurch konnte
das Auswaschen von Membrankomponenten bei gleichzeitigem, mecha¬
nischem Stabditatsgewinn vermindert werden Reduzierte man das Ver¬
hältnis von Weichmacher zu PVC m einer Optodenmembran von 2 1 auf
1 1, wurde die Ansprechzeit um lediglich einen Faktor von 2-3 ver¬
längert Erst wenn man das ursprüngliche Mengenverhältnis auf 1 2 um¬
kehrte, beobachtete man eine Reduktion der Ansprechgeschwindigkeit um
mehr als einen Faktor 20 Anderen Autoren ist es gelungen, die Lebens¬
dauer durch Immobilisierung von Chromoionophoren und anionischen
Ladungszentren zu erhohen [144], wobei auch dieses Vorgehen in der
Regel zu einer Reduktion der Ansprechgeschwindigkeit fuhrt
Mit dem Trimethinium-Farbstoff (H) als Chromoionophor wurde ein
optischer Sensor realisiert, mit dem sich im NIR-Spektralbereich bei 850
nm Wellenlange Bestimmungen von Kationen durchfuhren lassen In
dieser Arbeit wurde eine Ca2+-selektive Optode als Beispiel demonstriert
Für eine Erfassung der freien Ionenkonzentration von Ca2+ in klinischen
Blutproben, die das Arbeiten bei einem physiologischen pH von 7 4
voraussetzt, ist die Basizitat des Chromoionophors allerdings zu gering
Dennoch kann man festhalten, dass der Indikator eine ausreichende
Basizitat aufweist, um NIR-aktive Optoden mit weiteren selektiven
Liganden für Kationen, wie sie in der Literatur beschrieben sind, zu
realisieren. Diese Annahme lasst sich damit begründen, dass der
7 6 Merocyanine als Chromoionophore 157
Trimethimum-Farbstoft in der Membran einen pKa-Wert aufweist, der
demjenigen der bis anhin eingesetzten Chromoionophore vom Nilblau-
Typ sehr ähnlich ist
7 6 4 Schlussfolgerungen
Drei Farbstoffe aus der Untergruppe der elektrisch neutralen
Merocyanine wurden im Hinblick auf ihre Eignung als NIR aktive
Chromoionophore für Optodenmembranen untersucht Die Tri¬
methimum-Verbindung vermochte den meisten der in Kapitel 7 3 zusam¬
mengetragenen Anforderungen zu genügen und hess sich zusammen mit
einem Liganden für Ca+-selektive Messungen im NIR-Bereich einsetzen
Die Squarin- und die Dicyanovinyl-Verbindungen konnten die Be¬
dingungen an die Basizitat nicht erfüllen und hessen sich daher nicht mit
einem Ionophoren zu einer lonenselektiven Optode für physiologische
Proben kombinieren Der Einsatz als NIR pH-Indikator ist zwar möglich,
vor allem aber beim Squann-Derivat wegen des tiefen pKa-Wertes kaum
von praktischem Interesse Ein Versuch der Modifikation der Molekul-
struktur zur Erhöhung der Basizitat und der Lipophdie stand nicht zur
Diskussion Dies vor allem deshalb, weil die bestehenden Grundstrukturen
gegenüber alkalischer Probelosung nur ungenügende Stabilität aufwiesen
Obwohl nicht alle Voraussetzungen erfüllt waren, wurde eine Optode mit
dem Dicyanovinyl-Chromoionophor als Versuchsmembran für Messungen
auf einem integrierten optischen Chip eingesetzt, da die Wellenlange der
Lichtabsorption sich ideal mit der Emissionswellenlange der zur
Verfugung stehenden Lichtquelle deckte und die Sensormembran zu sehr
reproduzierbaren Signalen führte (vgl Kapitel 7 8)
158 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIR-FARBSTOFFEN
7.7. Reduzierte Dicyanovinyl-Farbstoffe
7 7 1 Ausgangslage
Im Zusammenhang mit der Synthese des Dicyanovinyl-Farbstoffs
(G) wurde als Nebenprodukt ein weiteres Farbstoffmolekul mitisoliert,
das wegen seiner pH-abhangigen Farbeigenschaften eingehend untersucht
wurde Alle bis anhin diskutierten Beispiele von NIR-Chromoionophoren,
inklusive dem Dicyanovinyl-Indikator, gehorten formal der Klasse der
Polymethin Farbstoffe an Die neu isolierte Verbindung hess sich aber
nicht einer der bisher bekannten Farbstoffklassen zuordnen Es handelte
sich um einen elektrisch neutralen, vom Dicyanovinyl-Indikator (G) abge¬
leiteten, reduzierten Farbstoff Formal betrachtet erfolgte eine Addition
von H2 an die C-N-Doppelbindung des Eduktes Es wird vermutet, dass
Bespalov et al bereits im Jahre 1991 im Rahmen der Synthese des
Dicyanovinyl-Indikators auf Farbstoffe von diesem Typ gestossen sind, sie
aber nicht als solche erkannt haben [137] Die Autoren beobachteten in den
Massenspektren der vermeintlichen Dicyanovinyl-Verbindungen Signale
für das Molekuhon, die um zwei Masseneinheiten zu hoch ausfielen, ohne
eine Erklärung dafür zu finden Dabei handelte es sich möglicherweise
um die reduzierte Form des Dicyanovinyl-Farbstoffes, die sich um zwei
Masseneinheiten vom Vorlaufer unterscheidet
Abbildung 7 20 gibt die Strukturen der Reihe von reduzierten Dicyano-
vtnyl-Farbstoffen wieder Zum Thema der Synthese, Strukturaufklarung
und -bestatigung sei an dieser Stelle auf die Arbeit von Jenny et al ver¬
wiesen [145] Ausgehend von der Grundstruktur, dem sekundären Amin
ETHT 5003 (R=H), hessen sich die Farbstoffe ETHT 5004, 5005, 5006,
5007, 5008 und 5009 relativ einfach synthetisieren Dadurch erhielt man
die Möglichkeit, wichtige Charakteristika wie optische Eigenschaften und
Basizitat der Chromoionophore mit einfachen synthetischen Mitteln durch
7 7 Reduzierte Dtcyanovinyl Farbstoffe 159
Änderung des Substituenten R am sekundären Amin-Stickstoff zwischen
den beiden Ringsystemen zu variieren
Farbstoff
ETHT 5003
ETHT 5004
ETHT 5006
ETHT 5007
ETHT 5008
Abb 7 20 Konstitutionsformeln der Chromoionophore ETHT 5003,
5004, 5005, 5006, 5007, 5008 und 5009
1 Postulierte Struktur (konnte wahrend dieser Arbeit nicht definitiv bestätigt werden)
R
H
\ /
P(C6H5)3
O O
160 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIR-FARBSTOFFEN
Farbstoff
ETHT 5009
R
ETHT 5005
Abb. 7.20 (Fortsetzung): Konstitutionsformeln der Chromoionophore
ETHT 5003, 5004, 5005, 5006, 5007, 5008 und 5009.
Im elektrisch neutralen, d.h. im protonierten Zustand wurde für diesen
Verbindungstyp keine Absorptionsbande im NIR-Bereich beobachtet,
während im anionischen, deprotonierten Zustand breite Banden auftraten,
die sich bis in den NIR-Bereich hinein erstreckten. Im Vergleich zu den
Cyanin- und Streptocyanin-Farbstoffen wiesen die Absorptionsbanden
wesentlich geringere Extinktionskoeffizienten auf. Es wurde postuliert,
dass das Proton am Kohlenstoff (C-2) innerhalb des 5-gliedrigen Rings
des Indansystems, benachbart zum Amin-Stickstoff, bei der De¬
protonierung abgegeben wird. Diese Vermutung wurde im Verlauf der
Arbeit durch mehrere Indizien unterstützt (vgl. Tab. 7.6 und Abb. 7.21
Spektrum von ETHT 5005). Bei den reduzierten Dicyanovinyl-
7 7 Reduzierte Dicyanovtnyl-Farbstoffe 161
Verbindungen handelt es sich demzufolge um sogenannte C-Sauren In
Tabelle 7 6 sind die optischen Eigenschaften der Indikatoren in metha¬
nolischer Losung zusammengestellt Die zugehörigen Absorptionsspektren
finden sich in Abbildung 7 21
lETH 5003
0 0i r
400 600 800
Wellenlange / nm
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1 H
0.0
ETH 5004
1 1
400 600 800
Wellenlange/ nm
0.3-
I 0.2-
x
tu0.1 -
o.o-
ETH 5005
i 1 r^
400 600 800
Wellenlange / nm
"
lETHT 50060 06-
r\0 04- \/ \0.02- \l \
n nn-
\i i r
400 600 800
Wellenlange / nm
Abb. 7.21: UV / VIS-Spektren der Chromoionophore in Methanol (varia¬
ble Konzentrationen). Ausgezogene Kurven: deprotonierte, anionische
Form; durchbrochene Kurven: protonierte Form; ETHT 5005 ist nicht
deprotomerbar.
162 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIR-FARBSTOFFEN
ETH 5007
1 T
400 600 800
Wellenlänge / nm
c
oV-
c
X
111
0.8-t
0.6
0.4-
0.2-
0.0Jr
ETH 5009
T"
400 600 800
Wellenlänge/ nm
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2-1
0.1
0.01 n~
400 600 800
Wellenlänge / nm
Abb. 7.21 (Fortsetzung): UV / VIS-Spektren der Chromoionophore in
Methanol (variable Konzentrationen). Ausgezogene Kurven: depro¬
tonierte, anionische Form; durchbrochene Kurven: protonierte Form.
werden
bestimmt
nicht
koeffizienten
Extinktions¬
dekadischen
molaren
die
konnten
bestätigen,
zu
Verbindung
der
Struktur
die
war,
gelungen
nicht
es
Da
a
9000
637
7000
7000
bestimmt"
nicht
deprotomerbar
nicht
depr
oton
ierb
arnicht
594
3000
576
3000
752
bestimmt"
nicht
12000
12000
759
717
3000
8000
8000
8000
cm"'
]'
mol
[L
e[nm]
A,max
']cm
'mol
[L
e
Form
Unprotomerte
Form
Protonierte
500
5009
ETHT
525
5008
ETHT
513
5007
ETHT
604
5006
ETHT
609
5005
ETHT
597
5004
ETHT
588
5003
ETHT
^max
Chromoionophor
Losung
scher
methanoh
in
5009
-5003
ETHT
Chromoionophore
der
emax)
koeffizient
Extinktions¬
dekadischer
molarer
Amax
,Absorption
maximaler
(Wellenlange
Eige
nsch
afte
nOp
tische
67
Tabelle
164 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIR FARBSTOFFEN
Wie zuvor erwähnt, lassen sich die neutralen Chromoionophore vom Typ
ETHT 5003 - 5009 zunächst keiner bis anhin bekannten Klasse von
Farbstoffen zuordnen Betrachtet man aber den deprotonierten, an
ionischen Zustand des Indikators, kann eine analoge Struktur wie für die
von Figala et al beschriebenen, im langwelligen Spektralbereich absor
bierenden Ybde des Cyclopentadiens postuliert werden [146] Dies
bedeutet, dass die Absorptionseigenschaften hauptsächlich durch das an
ionische Indansystem bestimmt werden Für das Ringsystem lasst sich im
anionischen Zustand ein N-Zentren (N=9) und N+l 7t-Elektronensystem
postulieren (siehe Abb 7 22), wobei das freie Elektronenpaar in Position
2 die Rolle des Donors übernimmt Eine 7t-Resonanzwechselwirkung über
das Indansystem hinaus erscheint für die Erklärung des beobachteten
optischen Verhaltens der Verbindungen nicht zwingend [146] Inter¬
aktionen mit Substituenten R in Position 2 über o Orbitale müssen jedoch
angenommen werden
Abb 7 22 Primares Chromo-
phorsystem für die Verbindungen
ETHT 5003 5009 im deproto¬
nierten, anionischen Zustand
NC
Die Akzeptor- oder Donoreigenschaften des Substituenten R (Abb 7 20)
üben einen starken Einfluss auf die Lage der langwelligen Absorptions¬
bande aus So wird im Falle von elektronenziehenden Substituenten R
(ETHT 5007, 5008 und 5009) eine gegenüber den Chromoionophoren
ETHT 5003, 5004 und 5006 hypsochrome Verschiebung des
Absorptionssignals für den deprotonierten, anionischen Zustand
beobachtet
7 7 Reduzierte Dtcyanovinyl-Farbstoffe 165
7 7 2 pH-empfindliche Optoden basierend auf weichgemachten PVC-
Membranen
Bei Experimenten mit dem Chromoionophor ETHT 5003 in alkoho¬
lischen Losungen wurde festgestellt, dass der Indikator eine sehr hohe
Basizitat aufweist und sich nur unter extremen Bedingungen (konz NaOH
in Methanol) deprotomeren und damit in eine NIR-aktive Form über¬
fuhren lasst Nach Zufügen des lipophilen Tetrabutylammonium-
hydroxids, wurde eine Deprotonierung schon nach Zugabe geringerer
Menge an Base erreicht
In PVC-Membranen, die nur den Chromoionophor ETHT 5003 enthielten,
konnte selbst in stark alkalischen Proben (pH 14) keine Deprotonierung in
Folge eines Ionenaustausches mit Kationen aus der Probelosung
beobachtet werden Der Ersatz des Weichmachers DOS durch das
polarere «-NPOE vermochte diese Tatsache nicht zu verandern Fugte
man hingegen hpophile kationische Zentren in Form des Anionen-
tauschersalzes MTDDAC1 dem Membrancocktail hinzu (100 mol% in
Bezug zum Chromoionophor), konnte der Chromoionophor reversibel
deprotoniert und protomert werden Dabei trat im anionischen Zustand
ein breiter Absorptionspeak mit einem Absorptionsmaximum bei 734 nm
auf, dessen langwellige Schulter bis zu Wellenlangen oberhalb von 800
nm reichte Weitere Experimente bestätigten die Vermutung, dass sich der
Chromoionophor ETHT 5003 nui in der Gegenwart von frei
vorliegenden, lipophilen Kationen (R+) in der Membranphase de¬
protomeren lasst Offensichtlich ist das hpophile Kation als Gegenion für
die Stabilisierung des resultierenden Anions des Chromoionophors (C ) in
der Membranphase notwendig In Abbildung 7 23 findet man die
Spektren, wie sie mit einem Sensor mit ETHT 5003 als Chromoionophor
gegenüber Pufferlosungen mit variablem pH gemessen wurden
166 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIR-FARBSTOFFEN
0.35-
0.30-
ETHT 5003
MTDDACI
DOS / PVC *^
pH 14.0
/^"pH 13.0
/-^S-^"pH 12.0
"""^--""pH 11.5
^y^^pH 11.0
0.25- y^y^ZpH 10.5
q V-" pH 10.0
I 0.20-X
LU
^^m^-PH 9-5
^\___pH 8.9
0.15- 3^5^Tph 8.0
><^l8f^pH 7-5
0.10- X^^L^PH 7.0
^^^^SpH 66
^g^J^pH 6.1
500 600 700 800
Wellenlänge / nm
Abb. 7.23: Titration von ETHT 5003 mit Universalpuffer (pH 6.0 - 12.0;
H,BO, / KH2P04 / KCl / KOH) und KOH (pH 13.0 - 14.0) in einer Sensor¬
membran der Zusammensetzung Ml6.
Aufgrund des hohen Anteils (100 mol%) von lipophilen Kationen R+ wird
von einer Koextraktion von Protonen und Anionen aus der Membran¬
phase ausgegangen. Das zugrundeliegende Koextraktionsgleichgewicht
lässt sich wie folgt formulieren:
CH(mem) + R+X"(mem)
"» C"(mem) + R+
(mem) + H+
(aq) + X"(aq)
(7.4)
7 7 Reduzierte Dtcyanovinyl Farbstoffe 167
Dies äussert sich dann, dass die Eigenschaften des im Puffer vorliegenden
Anions einen nicht vernachlassigbaren Einfluss auf den Protonierungsgrad
des Indikators ausüben Lipophile Anionen lassen sich wesentlich leichter
in die apolare Membranphase extrahieren als hydrophile Anionen und
fuhren bei konstantem pH Wert der Probe zu einem höheren Proto
merungsgrad des Indikators in der Membran Für die Titrationsexperi¬
mente wurde ein Universalpuffer gewählt, der einen weiten pH-Bereich
abdeckte Dadurch konnte ein abrupter Wechsel des Puffersystems und
damit des Pufler-Amons bei einem bestimmten pH-Wert vermieden
werden Zusätzlich wurde ein konstanter, relativ hoher Ionenhintergrund
(0 1 mol L'KCl) eingestellt
0 40
0 35
0 30
0 25
0 20
0 15
0 10
0 05
ETH 5003 / MTDDACI / DOS / PVC
0 324 0 324 0 324 0 324 0 323 0 323
n n0 01 mol L
1
KOH
0 01 mol L HCl
u U
0 083 0 081 0 083 0 084 0 085 0 085
T 1 1 1 1 1 1
0 10 20 30 40 50 60
Zeit / min
Abb 7 24 Kurzzeitreproduzierbarkeit einer Optode der Zusammen¬
setzung M16 mit Chromoionophor ETHT 5003 bei kontinuierlichem
Losungswechsel Die angegebenen Extinktionswerte wurden unmittelbar
vor dem Probenwechsel gemessen
168 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIR FARBSTOFFEN
Abbildung 7 24 zeigt dass mit dem Sensor eine sehr gute Kurzzeitrepro
duzierbarkeit beim Probewechsel zwischen 0 01 mol L1 KOH und
0 01 mol L'HCl erreicht wurde Auch gegenüber konzentnerterer Base
(1 mol L'
KOH) wurden stabile und reproduzierbare Signale beobachtet,
was im Gegensatz zu den Dicyanovinyl Farbstoffen auf eine hohe
Stabilität der Verbindung im stark alkalischen Milieu und eine gute
Loslichkeit in apolarer Membranumgebung schliessen lasst Auch
nachdem der Sensor mehrere Tage in Universalpuffer (pH 7) gelagert
worden war, konnten Signale von identischer Intensität gemessen werden
Die Stabilität des Chromoionophors im betrachteten System war sehr gut
Für die Ansprechzeiten dieses Membrantyps fand man im kontinuierlichen
Durchflussbetrieb Werte von (133 ± 5) s für die vollständige Depro¬
tonierung (n=6, 95%) und (90 ± 5) s für die vollständige Protonierung
(n=5, 95%) Die Reduktion der Ansprechgeschwindigkeit gegenüber einer
Sensormembran mit dem Tnmethinium-Farbstoff (siehe Abb 7 18) steht
in Übereinstimmung mit der Tatsache, dass die C Sauren kleinere Ge
schwindigkeitskonstanten für Protomerungs und Deprotomerungs
reaktionen aufweisen, als beispielsweise Moleküle, die an einem Sauer¬
stoff oder Stickstoff-Zentrum protomert, respektive deprotoniert wer
den Dies wird mit der für C-Sauren im Verlauf der Reaktion
notwendigen Umhybridisierung am Kohlenstoff-Atom begründet
Durch eine Alkylierung des Amin-Stickstoffs von ETHT 5003 gelangte
man zum Chromoionophor ETHT 5004 Die Absicht war es zu
verifizieren, ob ETHT 5003 am C-Atom in Position 2 des Indansystems, in
a-Stellung zum Amin-Stickstoff, deprotoniert wird Mit der alkylierten
Verbindung wurde in PVC-Sensormembranen in der Gegenwart von
MTDDA+ als hpophiles Kation ein sehr ahnliches Verhalten beobachtet
wie für ETHT 5003 Der einzige Unterschied bestand dann, dass der
alkylierte Chromoionophor eine gegenüber dem Vorlaufer leicht erhöhte
Basizitat aufwies, was sich über den induktiven Effekt des Alkyl-
7 7 Reduzierte Dicyanovinyl Farbstoffe 169
Substituenten erklaren lasst Im weiteren waren keine Unterschiede
gegenüber ETHT 5003 zu vermerken Dadurch wurde das Postulat einer
Deprotonierung in Position 2 erhärtet
Am Beispiel dieses Chromoionophors wurde der Einfluss der Konzen¬
tration an lipophilen Kationen MTDDA+ in der Membranphase auf das
Ansprechverhalten untersucht Dazu wurden PVC-Membranen mit 10, 50,
100, 150 und 200 mol% an MTDDAC1 im Verhältnis zum Farbstoff
ETHT 5004 eingesetzt Die Resultate sind in Abbildung 7 25 zusammen¬
gestellt Es wurde das Verhältnis der Intensitäten zwischen den Signalen
für den deprotonierten Chromoionophor C (774 nm) und den
protonierten Chromoionophor CH (592 nm) gegen den pH-Wert der
Pufferlosung aufgetragen
40-,
35-
30-
25-
;20-
M 5-
1 0-
05-
00-
Zusatz von MTDDACI
in Bezug zur Kqnzentration von ETH
10 mol%m DOS
X 50 mol% in DOS
T 100mol%in
+ 150mol%in
200 mol% in
6 8 10
pH der Pufferlosungen
12 14
Abb 7 25 Einfluss der Konzentration von lipophilen kationischen Zen¬
tren in PVC-Membranen mit dem Chromoionophor ETHr 5004, Mem¬
branzusammensetzungen Ml7-21
170 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIR FARBSTOFFEN
Aus Abbildung 7 25 ist ersichtlich, dass ein grosserer Anteil an lipophilen
Kationen R+ in der Membran zu einem erniedrigten scheinbaren pKa-Wert
des Chromoionophors fuhrt Wie bereits erwähnt, wird angenommen,
dass 100 mol% (im Verhältnis zum Farbstoff) des Zusatzes zur Stabi¬
lisierung der resultierenden negativen Ladung des deprotonierten Indi¬
kators notwendig sind Man stellt fest, dass eine Zunahme der Kon¬
zentration von R+ über 100 mol% hinaus, die gleichzeitig einer Erhöhung
der Ionenstarke in der Membranphase entspricht, zu einer steileren Stei¬
gung der Ansprechfunktion fuhrt Erst bei einer Konzentration an
MTDDA+ von 200 mol% kann ein Abflachen der Kurve, das bedeutet eine
vollständige Deprotonierung bei erhöhtem pH-Wert (pH>13) beobachtet
werden Die höhere Ionenstarke in der Membranphase hat eine Abnahme
des Debye Radius zur Folge Dies bedeutet wiederum, dass der ionische
Zustand stabilisiert und demzufolge die Deprotonierung des Indikators
erleichtert wird Für die praktische Anwendung des Chromoionophors ist
es sinnvoll, den Anteil an kationischen, als Anionentauscher agierenden
Zentren so gering wie möglich zu halten, um nicht einen unselektiven
Ionenaustausch zu provozieren Daher wurden für alle Applikationen
Optodenmembranen mit 100 mol% an MTDDAC1 eingesetzt Dadurch
konnte verhindert werden, dass nach der Deprotonierung des
Chromoionophors ein Uberschuss an freien Ionentauscherzentren
vorliegt
Die Verbindung ETHT 5005 zeigte keine pH-abhangigen spektralen Ver¬
änderungen, was auf das Fehlen eines Protons in a-Stellung zum Amin-
Stickstoff zurückgeführt wurde Der Indikator diente daher als wichtiger
Hinweis für die Deprotonierung am zuvor postulierten Kohlenstoff-
Zentrum Ferner wurden nützliche Informationen für die Struktur-
aufklarung der Reihe von Farbstoffen gewonnen [145]
Im weiteren wurde versucht, durch Einfuhrung einer Seitenkette mit
einem positiv geladenen Phosphin-Zentrum als Substituent am Amin-
7 7 Reduzierte Dtcyanovinyl-Farbstoffe 171
Stickstoff einen lipophilen kationischen Chromoionophor (ETHT 5006) zu
erhalten Damit sollte erreicht werden, dass im Gegensatz zu ETHT 5003
und 5004 kein Zusatz von lipophilen kationischen Komponenten zum
Chromoionophor in der Membranphase notwendig ist, um diesen zu
deprotonieien, sondern eine intramolekulare Stabilisierung der resul
tierenden negativen Ladung in Form eines Betains erfolgt Es gelang
jedoch nicht, die Struktur der Verbindung ETHT 5006 schlussig zu
ermitteln und zu bestätigen Dennoch wurde der Indikator in Optoden
membranen eingesetzt Die entsprechenden Spektren mit ETHT 5006 als
Chromoionophor ohne weitere Zusätze sind in Abbildung 7 26
wiedergegeben
pH 11 5
0 12-^""""^ pH 11 0
^2__pH 10 5
0 11- —pH 10 0
uon ^^H|{ pH 9 5
c 0 10- »feä^5—pH 8 9
LU ^LvGL-pH 8 5
0 09- >^Lph 80
yyf PH 7 5
0 08- ETHT 5006^V\\,,-<G#^lpH7 0
DOS / PVC N^Jfy^Z-vH <o §
•^^—pHO 1
500 600 700 800 900 1000
Wellenlange / nm
Abb 7 26 Titration von ETHT 5006 mit Universalpuffer (pH 6 0 - 11 5,
HjBO, / KH2P04 / KCl / KOH) in einer Sensormembran der Zusammen¬
setzung M22
172 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIR FARBSTOFFEN
Mit dem Chromoionophor ETHT 5006 ist eine Deprotonierung in der
apolaren Membranphase ohne den Zusatz von MTDDA+ möglich
geworden Gegenüber einer Sensormembran mit den Chromoionophoren
ETHT 5003 oder 5004 benotigt man eine Membrankomponente weniger
Dadurch gewinnt man den Vorteil, dass keine kationischen Zentren aus
der Membranphase ausgewaschen werden können und die Signalstabilitat
zusatzlich erhöht wird
Für die drei experimentell untersuchten Chromoionophore ETHT 5003,
5004 und 5006 ergab sich in allen Fallen das Problem der sehr hohen
Basizitat der korrespondierenden Base Erst der Zusatz der lipophilen
Kationen MTDDA+ oder die intramolekulare Stabilisierung in der Form
eines Betains ermöglichte es, die Chromoionophore in den Sensor¬
membranen reversibel zu deprotomeren Die somit erhaltenen pH
sensitiven Optoden zeichneten sich allerdings durch eine hervorragende
Signalstabilitat und durch eine hohe Sensttivitat im physiologischen pH-
Bereich aus
Um einen kationenselektiven optischen Sensor zu realisieren, ist es aber
nicht sinnvoll, ein hpophiles, kationisches Additiv in der Membranphase
mit einem kationenselektiven Liganden zu kombinieren, da dadurch die
Extraktion von Analyt-Kationen behindert wurde Es war zu erwarten,
dass eine Substitution mit einem Elektronenakzeptor am Amin-Stickstoff
zu einer erhöhten Aciditat des Protons am Kohlenstoff-Zentrum C-2
fuhren sollte Dies gab den Anlass zur Synthese der drei Chromo
lonophore ETHT 5007, 5008 und 5009
Die Indikatoren ETHT 5007 und 5008 zeigten gegenüber der Stammver¬
bindung ETHT 5003 eine deutlich reduzierte Basizitat Dies äusserte sich
dann, dass sich beide Chromoionophore in einer Membran ohne den
Zusatz von lipophilen, ladungsstabilisierenden Kationen MTDDA+ in die
anionische, deprotonierte Form überfuhren hessen Dazu war es aber
notwendig, mit konzentrierter Lauge (1 mol L'
KOH) zu arbeiten Unter
7 7 Reduzierte Dicyanovinyl Farbstoffe 173
gemassigteren Bedingungen war eine Deprotonierung nicht möglich
Kombinierte man hingegen die Farbstoffe mit dem Amonentauschersalz
MTDDACl, wurde die scheinbare Aciditat in der Membranphase derart
erhöht, dass der Indikator bereits bei pH-Werten unterhalb von pH 7 0
vollständig in der deprotonierten Form vorlag
Die Einfuhrung eines Sulfonsubstituenten, wie dies im Chromoionophor
ETHT 5009 realisiert wurde, vermochte die Aciditat des Indikators in
einem Ausmass zu erhohen, dass es möglich war, in weichgemachten
PVC-Membranen ohne weitere Zusätze zu arbeiten Fugte man das
Amonentauschersalz MTDDACl zu, wurde es sogar unmöglich, die
korrespondierende Base C mit 0 01 mol L'HCl zu protomeren, weil
dadurch die deprotonierte, anionische Form stark stabilisiert wurde In
Abbildung 7 27 sind die Spektren für einen pH-sensitiven Sensor
basierend auf ETHT 5009 dargestellt Wie daraus zu entnehmen ist, wurde
durch den Sulfonsubstituenten nicht nur die Basizitat des Indikators stark
beeinflusst, sondern es trat auch eine hypsochrome Verschiebung des Ab¬
sorptionsmaximums von etwa 100 nm gegenüber der Ausgangsverbindung
ETHT 5003 auf Da die Absorptionsbanden der reduzierten Dicyanovinyl-
Verbindungen aber sehr breit sind, konnte auch mit ETHT 5009 noch bei
Wellenlangen oberhalb von 700 nm gearbeitet werden
174 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIR-FARBSTOFFEN
500 600 700 800 900
Wellenlänge / nm
Abb. 7.27: Titration von ETHT 5009 mit Universalpuffer (pH 6.0 - 8.5;
H,BO, / KH2P04 / KCl / KOH) in einer Sensormembran der Zusammen¬
setzung M23.
Die Untersuchung des Ansprechverhaltens zeigte, dass mit diesem Sensor¬
typ eine sehr gute Kurzzeitreproduzierbarkeit erreicht werden konnte
(vgl. Abbildung 7.28). Die beobachteten Signale waren sehr stabil.
7.7 Reduzierte Dtcyanovinyl-Farbstoffe 175
0.12
Ec
m 0^i-
£.
|o.£
X
LU
.10-
08-
0.06-
0.04-^
ETH 5009/DOS/PVC
0.113 0.113 0.113 0.113 0.113
-*!
y^J
m /—i
0.01 mol L1
KOH
-1
0.01 mol L HCl
u u u L0.047 0.047 0.047 0.047 0.047
—T"
20
l
40
Zeit / min
i
60
~l
80
Abb. 7.28: Kurzzeitreproduzierbarkeit einer Optode der Zusammen¬
setzung M23 mit Chromoionophor ETHT 5009 bei kontinuierlichem Lö¬
sungswechsel. Die angegebenen Extinktionswerte wurden unmittelbar vor
dem Probenwechsel gemessen.
Mit ETHT 5009 konnte ein Sensor realisiert werden, der ohne den Zusatz
von lipophilen kationischen Zentren R+ seine maximale pH-Empfind¬
lichkeit im physiologischen pH-Bereich aufweist. Die breite Absorptions¬
bande gestattet eine flexible Wahl der Messwellenlänge bis an die Grenze
des NIR-Spektralbereichs. Der relativ geringe Extinktionskoeffizient
könnte sich zudem als Vorteil erweisen, wenn eine Sensormembran auf
einem miniaturisierten Mach-Zehnder-Interferometer eingesetzt wird
(vgl. Kapitel 7.8.).
176 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BAS IS VON NIR FARBSTOFFEN
Für den Chromoionophor ETHT 5009 konnte die Basizitat in der
Membranphase nach dem Verfahren von Bakker et al P2] experimentell
ermittelt werden Der pKa-Wert in einer DOS-weichgemachten PVC-
Membran ohne Zusatz von lipophilen Kationen betrug 7 5 ± 0 2 Für die
übrigen Indikatoren der Reihe war es aufgrund der sehr geringen Aciditat
nicht möglich, einen pKj-Wert in der Membranphase zu bestimmen Es ist
auch in Kombination mit dem lipophilen, kationischen Zusatz nicht
gelungen, die Verbindungen in der Membran vollständig in ihre
deprotonierte Form zu überfuhren Ihre relative Basizitat innerhalb der
Reihe konnte aber durch direkte Gegenüberstellung der Titrationskurven
bei Verwendung identischer Pufferlosungen bestimmt werden Dazu
wurde in den Titrationskurven die Steigung als Funktion des pH Wertes
der Pufferlosungen analysiert Auf diese Art war es möglich, einen
Wendepunkt und damit einen Schatzwert für den scheinbaren pK, zu
bestimmen, obwohl der Endpunkt der Titrationskurve in der Regel nicht
erreicht wurde Die zugehörigen Werte sind in Tabelle 7 7
zusammengestellt
Der scheinbare pKa-Wert darf nicht mit dem eigentlichen pKa-Wert in der
Membranphase verwechselt und direkt verglichen werden Im Gegensatz
zum letzteren ist er nur für die Membran einer bestimmten Zusammen¬
setzung in Kontakt mit dem verwendeten Universalpuffer gültig, wahrend
sich beispielsweise der zuvor ermittelte Wert für ETHT 5009 auch auf
Sensoren mit unterschiedlichen Liganden in beliebiger Probelosung
anwenden lasst
7 7 Reduzierte Dicyanovinyl Farbstoffe 177
Tabelle 7 7 Gegenüberstellung von relativen, scheinbaren Aciditaten der
Chromoionophore ETHT 5003 - 5009 (ohne 5005) in DOS-weich¬
gemachten Optodenmembranen mit 100 mol% MTDDACl (in Bezug zum
Chromoionophor)
Chromoionophor scheinbarer pKa Beobachtungs-
(Membran- Wellenlange
Zusammensetzung) [nm]
Membran
ETHT5003 (Ml6) 88 734 R+ / DOS / PVC
ETHT5004(M17) 95 774 R+ / DOS / PVC
ETHT 5006 (M22) 85 760 DOS/PVC
ETHT 5007 (M24) 48 700 R+ / DOS / PVC
ETHT 5008 (M25) <6 0 700 R+ / DOS / PVC
ETHT 5009 (M23) <2 0 700 R+ / DOS / PVC
Es muss beachtet werden, dass die angegebenen Werte für die Aciditat nur
für Membranen gelten, in denen der Chromoionophor durch ein kat-
lonisches Additiv oder eine intramolekulare ionische Wechselwirkung in
seiner anionischen Form stabilisiert wird
7 7 3 Ca2+-selektive Optode für den Einsatz im NIR-Spektralbereich
Der Chromoionophor ETHT 5009 eignete sich aufgrund seiner
Aciditatskonstante in Kombination mit dem Ca2+-Ionophor ETH 1001 für
die Erfassung der Ca2+-Konzentration in Losungen bei tiefen (pH < 3) pH-
Werten Eine Bestimmung der totalen Konzentration von Ca,+ in
verdünnter, gepufferter physiologischer Probe war somit möglich Die
übrigen Chromoionophore der Serie wiesen zu hohe Aciditatskonstanten
auf, um in Kombination mit einem lonenselektiven Liganden eingesetzt
178 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIR-FARBSTOFFEN
werden zu können Abbildung 7 29 zeigt die Absorptionsspektren einer
Optode, die mit verschiedenen Ca2+-haltigen, bei pH 2 7 gepufferten
Losungen äquilibriert wurde Im Gegensatz zur Ca2+-selektiven Optode
mit dem Tnmethinium-Farbstoff (vgl Abb 7 16) ist für diesen Sensor
kein Zusatz eines anionischen Additivs notwendig Das für diesen Fall
gültige Optodenmodell entspricht der Abbildung 5 2b In diesem Modell
steht der deprotonierte Chromoionophor C zur Kompensation der
Ladung der extrahierten Kationen Ca2+ zur Verfugung
400 500 600 700 800 900
Wellenlänge/ nm
Abb 7 29 Absorptionsspektren einer Optode der Zusammensetzung M26,
die mit verschiedenen Ca2+-haltigen, bei pH 2 7 gepufferten Losungen
äquilibriert wurde.
7 7 Reduzierte Dicyanovinyl Farbstoffe 179
Die deutlichen isosbestischen Punkte weisen auf eine Messung ohne den
Verlust von Chromoionophor hin Nach einer Standzeit von 3 Tagen,
wahrend denen der Sensor in 0 01 mol L'HCl aufbewahrt worden war,
konnten dieselben absoluten Signalintensitaten wiedergefunden werden In
Abbildung 7 30 ist die zu den Spektren zugehörige, berechnete
Kalibrationskurve dargestellt
1 On
08-
DCOi_
a>w
c
a>
c
o
o\—
06-
04-
02-
-4
log aCaa
ETH 5009
ETH 1001
DOS/PVC
Ameisensaure-
puffer pH 2 7
i
0
Abb 7 30 Kalibrationskurve für eine Ca2+-selektive Optode der Zusam
mensetzung M26 in Kontakt mit verschiedenen Ca'+-haltigen, bei pH 2 7
gepufferten Losungen Die ausgezogenen Kurve wurde nach GleichungrCaL
5 15 mit log Krrh2 = 1 9 berechnet
Das experimentelle Verhalten steht in guter Übereinstimmung mit der
Theorie Nur in sehr verdünnten Losungen kann eine schwache
Interferenz durch K+-Ionen aus der Pufferlosung beobachtet werden
180 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIR FARBSTOFFEN
0 095
0 090
0 085-1
8 0 080 HCD-
o 0 075
~ 0 070
LU
0 065-
0 060-
ETH 5009/ETH 1001 /DOS/PVC
10~3 mol L~1 CaCI2 in Puffer
0 086 0 085 0 084
0 064 0 064
10-4 mol L1
CaCI2 in Puffer
0 20 40
Zeit / min
60
0 064
80
Abb 7 31 Kurzzeitreproduzierbarkeit einer Ca'+ selektiven Optode der
Zusammensetzung M26 mit Chromoionophor ETHT 5009 und lonophor
ETH 1001 bei kontinuierlichem Losungswechsel (pH der Pufferlosung
2 7) Die angegebenen Extinktionswerte wurden unmittelbar vor dem
Probenwechsel gemessen
Abbildung 7 31 zeigt die Ansprechgeschwindigkeit und die Kurzzeitre¬
produzierbarkeit, wie sie mit der Ca2+-selektiven Optode im kontinuier¬
lichen Durchflussbetneb gemessen wurde Im Vergleich zum Ca,+-Sensor
mit dem Trimethimum Chromoionophor stellt man eine deutliche Reduk¬
tion der Ansprechgeschwindigkeit fest Diese lasst sich wiederum mit der
langsameren Protonierungs-Kinetik von C-Sauren (ETHT 5009) im
Vergleich zu einer Verbindung, die am Stickstoff-Zentrum protoniert
oder deprotoniert wird (Tnmethinium-Indikator) begründen
7 7 Reduzieite Dtcyanovinyl-Farbstoffe 181
7 7 4 Schlussfolgerungen
Mit dem Chromoionophor ETHT 5003 und den substituierten
Derivaten ETHT 5004 - 5009 wurde eine Spezies von Farbstoftmolekulen
gefunden, die sich vom Aufbau des Chromophors her nicht den bisher
bekannten Gruppen zuordnen lasst und eine neue Klasse von Farbstoffen
repräsentiert Obwohl es im Rahmen dieser Arbeit nicht möglich war, das
spektroskopische Verhalten der Verbindungen vollständig zu erklaren,
wurden die Farbstoffe aufgrund ihrer besonderen Eigenschaften als
Chromoionophore in Optodenmembranen eingesetzt und charakterisiert
Die Indikatoren zeichnen sich durch eine äusserst hohe Stabilität sowohl
gegenüber saurer, wie auch gegenüber basischer Losung aus Eine
Deprotonierung am Kohlenstoff-Zentrum C-2 des Indansystems fuhrt zu
einer breiten, langwelligen Absorptionsbande, die in Abhängigkeit des
Substituenten am Amin-Stickstoff bis in den NIR-Spektralbereich reicht
Die Aciditat der Chromoionophore wird zu einem hohen Ausmass durch
die chemische Umgebung des Farbstoffes bestimmt In weichgemachten
PVC-Membranen lassen sich die Indikatoren ETHT 5003 und 5004 nur in
der Gegenwart des lipophilen kationischen Salzes MTDDACl depro-
tomeren Der Chromoionophor ETHT 5006 vermag die resultierende
negative Ladung der korrespondierenden Base als Betain intramolekular
zu stabilisieren Eine Substitution am Amin-Stickstoff mit elektronen¬
ziehenden Substituenten fuhrt zu einer gesteigerten Aciditat der Chromo¬
ionophore (ETHT 5007, 5008 und 5009) Gleichzeitig wird aber eine
starke hypsochrome Verschiebung der Absorptionsbande der deproto¬
nierten Spezies beobachtet
Ein bis anhin nicht erwähnter Vorzug der Chromoionophore vom Typ
ETHT 5003 hegt in der chemischen Funktionalitat der Verbindung Wie
für die Synthese der Derivate ETHT 5004 - 5009 angewendet, lasst sich
die sekundäre Aminogruppe der Grundstruktur ETHT 5003 für kovalente
182 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIR-FARBSTOFFEN
Bindungen nutzen, ohne dass die Grundstruktur des Chromophors dabei
verändert wird Dies bietet beispielsweise Möglichkeiten zur kovalenten
Immobilisierung des Indikators an Polymere [147]
7.8. Das miniaturisierte Mach-Zehnder-Interferometer
In Abschnitt 7 1 wurde darauf verwiesen, dass sich chemische
Sensormembranen mit einer maximalen optischen Empfindlichkeit im
NIR-Spektralbereich für die Verwendung auf optischen Chips, gefertigt
aus III-V Halbleitermatenahen eignen Nachdem nun eine Reihe von
Chromoionophoren mit maximaler Lichtabsorption im langwelligen
Spektralbereich in Optodenmembranen charakterisiert worden waren
wurde in einigen Experimenten untersucht, wie sich eine NIR-aktive
Sensorschicht auf einem miniaturisierten Mach-Zehnder-Interferometer
[148] als Messplattform verhalt Abbildung 7 32 zeigt den schematischen
Aufbau des optischen Messsystems
Phasenmodulator
Laser
Sensorfeld
Detektor
Abb 7 32 Schematische Darstellung eines monolithisch-integrierten,
chemischen Sensors in Form eines miniaturisierten Mach-Zehnder-Inter-
ferometers Reproduziert mit Genehmigung nach [149]
7 8 Das miniaturisierte Mach-Zehnder Interferometer 183
Das vom Laser emittierte Licht wird auf die zwei Teilarme des Mach-
Zehnder-Interferometers aufgeteilt Im Sensorfeld des Messarms werden
Änderungen im Brechungsindex des benachbarten Mediums, in diesem
Fall der Sensormembran, durch Änderungen der Phasengeschwindigkeit
der optischen Mode registriert Die Interferenz mit dem Licht im
Referenzarm wird am Detektor in ein elektrisches Signal umgewandelt
[149] Dieser Messaufbau ermöglichte es, Brechungsindexdifferenzen in
Flüssigkeiten mit einer Auflosung von An=l 3 x 10s
zu erfassen
Ändert sich aufgrund einer chemisch selektiven Wechselwirkung das Ab¬
sorptionsspektrum einer Optodenmembran, fuhrt dies gleichzeitig zu
einer Änderung des Dispersionsspektrums Somit können Änderungen des
Brechungsindex in der Optodenmembran direkt mit Variationen in der
Aktivität eines Analyten in der Probelosung in Verbindung gebracht
werden, wie auch experimentell von Freiner et al gezeigt wurde [35] Die
Anwendung der Kramers-Kronig-Transformation auf gemessene Absorp¬
tionsspektren erlaubte die Abschätzung der Wellenlange maximaler
Empfindlichkeit für die Erfassung von Brechungsindexanderungen in
Optodenmembranen [150]
Mit einer pH-sensitiven Membran der Zusammensetzung M9 mit dem
Dicyanovinyl-Indikator als Chromoionophor, wurden erste Messungen
auf einem miniaturisierten Mach-Zehnder-Interferometer (Lange 2 mm)
mit einem externen Detektor vorgenommen Die Sensorschicht wurde
durch Tropfbeschichtung mit einer Micropipette auf den Chip
aufgetragen Als Lichtquelle diente eine externe Laserdiode mit einer
Emissionswellenlange von 830 nm Bei dieser Wellenlange wurden für die
eingesetzte Membran die intensivsten Änderungen im Brechungsindex
erwartet Dies ging aus berechneten Dispersionsspektren (Abb 7 33)
hervor, die aus den gemessenen Absorptionsspektren (Abb 7 13) mittels
eines Computerprogramms [151], basierend auf den Kramers-Kronig-
Relationen erhalten wurden. Es ist zu beachten, dass mit dieser Berech-
184 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIR-FARBSTOFFEN
nungsmethode nur die erwarteten Änderungen An im Brechungsindex
beschrieben werden und nicht die Absolutwerte.
400 500 600 700 800 900
Wellenlänge / nm
Abb. 7.33: Nach Kramers-Kronig berechnete pH-abhängige Dispersions¬
spektren (Änderungen des Brechungsindex) einer Optode der Zusammen¬
setzung M9 (vgl. Abb. 7.13) mit dem Dicyanovinyl-Farbstoff als Chro¬
moionophor in einer DOS-weichgemachten PVC-Membran.
Im Verlauf der Experimente stiess man auf ein grundsätzliches Problem.
Der hohe molare dekadische Extinktionskoeffizient des Chromoionophors
führte in Kombination mit der relativ hohen Konzentration in der
Optodenmembran zu starken Intensitätsverlusten im Lichtwellenleiter.
Diese lagen im Bereich von 50 bis 100 dB cm"' und waren damit zu stark,
um auf dem Detektor eine genügende Intensität zu registrieren. Idealer¬
weise sollte die Dämpfung der Lichtintensität einen Wert von 20 dB cm"'
7 8 Das miniaturisierte Mach Zehnder Interterometer 185
nicht überschreiten, was für einen Wellenleiter aus Titandioxid mit einer
Kerndicke von 70 nm einer Extinktion von 15 cm'
entspricht [152] Eine
Reduktion der Verluste wäre nur dann möglich, wenn die Konzentration
des Farbstoffes verringert wurde, was zu Lasten der Sensitivitat fallen
wurde Bei zukunftigen retraktometnschen Sensoren konnte der Sensi-
tivitatsverlust durch ein höheres Auflösungsvermögen kompensiert
werden Eine weitere Möglichkeit besteht dann, Chromoionophore mit
niedrigeren Extinktionskoeffizienten einzusetzen ohne dass die Konzen¬
tration erniedrigt werden muss Von diesem Standpunkt aus betrachtet
wurden sich die reduzierten Dicyanovinyl-Farbstoffe ETHT 5003 - 5009
anbieten Gegenüber einer Verringerung der Konzentration des Farbstoffs
haben die Chromoionophore ETHT 5003 5009 den Vorteil, dass die
chemische Empfindlichkeit des Sensors unverändert bleibt, die optische
Dichte der Membranschichten aber gleichzeitig reduziert wird
Aut weitere Messungen musste im Rahmen dieser Arbeit verzichtet
werden, da sich das interferometrische Messsystem selbst noch im Aufbau
befand Vor allem war es noch nicht möglich, mit einer integrierten
Lichtquelle und einem integrierten Detektor zu arbeiten Dadurch war das
Auflösungsvermögen für die erwarteten kleinen Brechungsindexanderun-
gen der Sensormembranen bei reduzierter Farbstoffmenge noch nicht
genügend
186
187
8. Ausblick
Unsicherheiten beim Einsatz von chemischen Sensoren für klinische
Messungen treten vor allem dann auf wenn die Analysenbefunde direkt
mit Resultaten aus konventionellen Gesamtkonzentrationsbestimmungen
verglichen werden Viele der beschriebenen Probleme konnten eliminiert
werden, indem auf einen direkten Methodenvergleich verzichtet wurde,
was aber die Einfuhrung einer neuen physikalischen Grosse mit einem
neuen Referenzintervall und die Bereitstellung der zugehörigen Referenz-
matenahen erfordern wurde Ob sich auf dem Gebiet der klinischen
Elektrolytanalytik die biologisch wichtige Grosse der aktiven Molalität
durchsetzten wird, ist abzuwarten Sicher ist, dass bis heute kein bewusstes
Umdenken stattgefunden hat und weiterhin Resultate aus direkten und
indirekten Elektrolytmessungen unkritisch einander gegenübergestellt
werden Auch in Expertenkreisen herrscht noch keine Einigkeit So
wurden die Empfehlungen der IFCC [59] wahrend mehreren Jahren
immer wieder abgeändert und angepasst Die IFCC verfasste bereits im
Jahre 1986 einen Entwurf für den internen Gebrauch, der sich mit diesem
Themenkreis befasste [58]
Im Rahmen der Weiterentwicklung der optischen Messtechnik werden
sich neue Möglichkeiten ergeben Mikrooptische Systeme basierend auf
optischen Wellenleitern aus Polymermatenalien wie zum Beispiel Poly-
carbonat sind inzwischen entwickelt worden [153] Diese sind sehr kosten¬
günstig in der Herstellung und eignen sich für die Serienproduktion in
grossen Stuckzahlen Eine weitergehende Integration aller Komponenten
auf einem Chip wird die Grosse und die Kosten der Sensorsysteme
zusätzlich reduzieren Der niedrige Preis durfte es gestatten, in Zukunft
auch an die Konstruktion von Wegwerfmodulen (disposable chips) zu
denken Die Entwicklung einer Disk ("Chemical Disk", CD) mit einer
188 AUSBLICK
Reihe von optischen chemischen Sensoren in Form eines integrierten
Sensorarrays, die von einem Gerat analog zu einem Compact-Disk Spieler
gelesen werden kann wird für die Zukunft vorgeschlagen [154]
Vermehrt werden neue, kostengünstige Laserdioden als Lichtquellen
verfugbar Die Emissionswellenlange dieser Dioden ruckt immer weiter
in den sichtbaren Wellenlangenbereich voi Dennoch wird die Nachfrage
nach NIR-Indikatoren bestehen bleiben, da ihre maximale optische Emp¬
findlichkeit ausserhalb des Absorptionsbereichs von interferierenden
Komponenten in biologischen Proben hegt
Die Forschung auf dem Gebiet der optischen chemischen Sensoren wird
sich mit der Problematik der pH- und der Ionenstarkeabhangigkeit
befassen müssen Zwar weisen Optoden basierend auf dem Ionen¬
austausch- und Koextraktionspnnzip eine Vielzahl von Vorteilen auf
Dazu zahlen besonders die grosse Auswahl an Liganden und die
Flexibilität bei der Wahl der Chromoionophore und der dadurch
ermöglichten Anpassung des dynamischen Messbereiches Für den Einsatz
für klinische Direktmessungen sind sie aber nur dann geeignet, wenn
adäquate Methoden zur optischen pH-Erfassung zur Verfugung stehen
Anstrengungen zur Entwicklung von direkten optischen Systemen, die
nicht auf Ionenaustausch oder Koextraktion beruhen, sind im Gang Diese
Art von Sensoren bedingt allerdings die Verwendung von selektiven,
weitgehend pH-unempfindlichen Chromoionophoren [155] für jeden
Analyten [156-163] Ferner kann in diesem Fall nicht mehr mit einem auf
Ionenaustausch basierenden Membransystem (wassnge Probephase und
organische Membranphase) gearbeitet werden, was spezielle Anforde¬
rungen an die Selektivität der Chromoionophore stellt
189
9. Experimenteller Teil
9.1. Klinische Untersuchungen
9 1 1 Probanden
Proben wuiden von 36 freiwilligen Probanden der ETH Zürich,
sowie des Untversitatsspitals Zürich, welche sich als gesund bezeichneten,
unter den folgenden Bedingungen entnommen Die Spender fanden sich
morgens um 8 Uhr mit nüchternem Magen und ohne den Konsum von
Alkohol wahrend der vorangehenden 12 Stunden ein Weiter wurde Blut
von 18 Patienten mit Nierenbeschwerden unmittelbar vor der Behandlung
durch Hämodialyse und von 15 Patienten nach dei Behandlung durch
Hämodialyse entnommen Schliesslich standen Pioben von 15 Patienten
aus der Intensivstation für innere Medizin, welche an verschiedenen Herz¬
problemen litten oder sich einer Herzoperation zu unterziehen hatten
(Herzinfarkt, instabile Angina Pectoris, Einsatz eines aortokoronaren
Bypasses und perkutane, transluminale koronare Angioplastik) zur
Verfugung Von den insgesamt 82 Blutspendern waren 52 männlich und
30 weiblich Die Altersverteilung variierte je nach Probandengruppe und
lag zwischen 21 und 50 Jahren bei den Gesunden, 28 und 76 Jahren bei
den Hamodialysepatienten und zwischen 42 und 80 Jahren bei den
Patienten mit Herzbeschwerden
9 1 2 Probenahme
Alle Proben wurden in hepannisierten (Li-Hepannat, 143 USP
Einheiten) 10ml Vacutainer-Rohrchen (Becton-Dickmson, Rutherford NJ,
USA) gesammelt, wahrend die Probanden sassen oder lagen An¬
schliessend erfolgte eine Markierung mit Strichcoden, um
190 EXPERIMENTELLER TEIL
Verwechslungen auszuschhessen Die Entnahmerohrchen wurden rotiert,
um eine vollständige Durchmischung mit dem Heparmat zu gewährleisten
Plasma wurde entweder unmittelbar nach oder vor der Analyse der Probe
auf dem Laborautomaten (siehe Abschnitt 9 13) ungefähr eine Stunde
nach der Zentnfugation abgetrennt Anaerobe Probenhandhabung war aus
technischen Gründen nicht möglich Die Plasmaproben wurden bis zur
weiteren Analyse bei 4 °C gelagert Nach der Beendung aller Analysen
wurden die Proben mit flussigem Stickstoff schockgefroren und unterhalb
von -20 °C aufbewahrt
9 1 3 Verwendete Gerate und Methoden
Die im folgenden aufgeführten Analysen wurden auf einem
Hitachi 747 Analyzer (Boehnnger Mannheim Diagnostics Ine, Houston,
TX, USA) ausgeführt Totale Ionenkonzentrationen von Natrium, Kalium,
Calcium, Magnesium und Chlorid, Gesamtprotein, Cholesterin, Glucose,
Hainstoff und Triglyceride Die Phosphohpide wurden auf einem COBAS
FARA Gerat (Hoffmann LaRoche Diagnostica, Basel) bestimmt Die
freien Ionenkonzentrationen von Natrium und Kalium bestimmte man mit
einem AVL 985-S Elektrolytanalyzer (AVL List GmbH, Graz,
Osterreich) wahrend die freien Ionenkonzentrationen von Calcium und
Magnesium, sowie der pH-Wert mit einem AVL-988 Analyzer erfasst
wurden Die angewandten analytischen Methoden sind in Tabelle 9 1
zusammengefasst Alle Tests wurden gemäss den Vorschriften der
jeweiligen Geratehersteller durchgeführt
9 1 Klinische Untersuchungen 191
Tabelle 9 1 Klinische Analysemethoden Alle Tests wurden bei 37 °C
nach den Anweisungen des Gerateherstellers durchgeführt
Analyt Methode
Natrium Gesamtkonz
Natrium freie lonenkonz
Kalium Gesamtkonz
Kalium freie lonenkonz
Calcium Gesamtkonz
Calcium freie lonenkonz
Magnesium Gesamtkonz
Magnesium freie lonenkonz
Chlorid
Cholesterin
Gesamtproteine
Glucose
Harnstoff
Triglyceride
Phosphohpide
pH
Indirekte Potentiometrie (ISE)
Direkte Potentiometrie (ISE)
Indirekte Potentiometrie (ISE)
Direkte Potentiometrie (ISE)
Photometnsch (546 nm)
o-Kresolphthaleinkomplex
Direkte Potentiometrie (ISE)
Photometrisch (505 nm)
Xylidylblaukomplex
Direkte Potentiometrie (ISE)
Indirekte Potentiometne (ISE)
Enzymatisch, photometrisch (505 nm)
Cholestennoxidase-PAP-Methode
Photometnsch (546 nm)
Biuret-Methode
Enzymatisch, photometnsch (505 nm)
Peridochrom® (Boehnnger Mannheim)
Glukoseoxidase-PAP-Methode
Enzymatisch, kinetischer UV-Test (340 nm)
Urease-GLDH
Enzymatisch, photometnsch (505 nm)
GPO-PAP
Enzymatisch, photometnsch (505 nm)
Phosphohpase D, Chohnoxidase, Peroxidase
Direkte Potentiometrie (ISE)
192 EXPERIMENTELLER TEIL
9 1 4 Kahbrationsmethoden
Der Hitachi 747 Analyzer wurde durch eine Einpunktkahbration
mit einem biologischen (Serum) Standard kalibriert (Calibrator for Auto
mated Systems Nr 759350, Boehnnger Mannheim GmbH, Mannheim
Deutschland) Das COBAS FARA Gerat zut Phosphohpidbestimmung
wurde ebenfalls durch eine Einpunktkahbration mit einem Standardserum
kalibriert (Wako Chemicals GmbH, Neuss Deutschland) Im Falle der
AVL Elektrolytgerate erfolgte die Kalibration an mindestens 2 Punkten
durch wassnge Standardlosungen (AVL Standard A, B, C und D)
9 1 5 Qualitätskontrolle
Die Präzision und die Richtigkeit der Analysen am klinischen
Laboratorium des Universitatsspitals Zürich wird routinemassig mittels
Kontrollseren Precinorm0 U und Precipath0 U (Boehnnger Mannheim
GmbH, Mannheim, Deutschland), mittels sekundären, zertifizierten Refe-
renzmatenahen für lonenselektive Elektroden (Pferdeserum) (Chemicals
Inspection & Testing Institute, Tokyo, Japan, Lot No W 90-1) sowie
durch Vergleiche mit anderen Labors überwacht Die erhaltenen Mess¬
werte für Quahtatskontrollproben, welche regelmassig analysiert wurden,
lagen alle innerhalb ihrer vorgegebenen Toleranzintervalle Für den
AVL-988 Analyzer wurden zusatzlich wassnge Standardlosungen für die
Richtigkeitskontrolle verwendet Zur Sicherung der Präzision wurde ein
Poolplasma, hergestellt durch Mischung von frischen Humanplasmen, ab
gefüllt in Portionen zu wenigen Millilitern und gelagert unterhalb -20 °C
eingesetzt Für die Analyse wurde jeweils eine Probe aufgetaut, zen
tnfugiert und insgesamt 5 bis 15 mal (in Abhängigkeit des Analyten)
wahrend der gesamten experimentellen Phase vor und nach einer Serie
von unbekannten Proben analysiert Die analytische Variation des Hitachi
9 2 Zusammensetzung und Herstellung von Optodenmembranen 193
747 Analyzers wurde durch Auswertung der Resultate der Poolplasmen
über die gesamte experimentelle Phase abgeschätzt Sie lag unterhalb von
einem Prozent (95% Vertrauensintervall) für Natrium, Kalium, Chlorid,
Gesamtprotein und Cholesterin und mit Ausnahme von Harnstoff (3 9%,
95% Vertrauensintervall) unterhalb von zwei Prozent für alle anderen
Analyte Für die AVL Elektrolytanalyzer erhielt man Variationen
unterhalb einem Prozent für Natrium und für Kalium wahrend sie für
Calcium und Magnesium zwei Prozent betrugen
9.2. Zusammensetzung und Herstellung von Optodenmem¬
branen
9 2 1 Optodenmembranen basierend auf PVC und OH-PVC
Als Membranbestandteile verwendete man Liganden, Weichmacher
und Zusätze der Qualitatsstufe Selectophore0 der Firma Fluka AG (CH
9470 Buchs) Die eingesetzten Farbstoffe stammten aus der eigenen
Synthese oder wurden als Proben zur Verfugung gestellt Die Ver¬
bindungen IR-125 (Eastman Kodak, Rochester NY, USA) und HITCI
(Aldrich, CH 9470 Buchs) wurden bei den genannten Herstellern bezogen
Sämtliche Membrankomponenten wurden in ein Glaschen mit Gewinde-
verschluss eingewogen Die detaillierte Zusammensetzung findet man im
Anhang 1 Der Weichmacher und die Polymermatrix wurden immer im
Gewichtsverhaltnis 2 1 eingesetzt Das Gesamtgewicht aller Membranbe-
standtede (mit Ausnahme des Losungsmittels) betrug 167 mg Falls nicht
anders vermerkt, wurde jeweils 1 ml frisch destilliertes THF zugesetzt
und bis zur vollständigen Losung auf einem Schuttler gemischt Von der
resultierenden Losung wurden ca 0 4 ml mit einer Glasspritze auf¬
gezogen und mit Hilfe eines Spin on Gerätes [164] auf eine rotierende
194 EXPERIMENTELLER TEIL
Tragerscheibe aus Herasd® Quarzglas (Moller AG, CH-8050 Zürich)
aufgespritzt Durch Variation der Rotationsgeschwindigkeit oder der Vis¬
kosität des Membrancocktads, war es möglich, die Membrandicke zu
beeinflussen [80] In der Regel wurde mit Membranen von 2-3 pm Dicke
gearbeitet Die Herstellung der Sensormembranen erfolgte in einer
Laminarfluss-Zelle vom Typ Biocyt Modell 95 (Flufrance, Wissous,
Frankreich), welche eine weitgehend staubfreie Umgebung gewährleistete
Jeweils 2 Membranen auf 2 Tragerscheiben wurden in einer Durchfluss-
messzelle [81] zu einem Sensor kombiniert
Fui Messungen im ATR-Modus wurde ein Saphir-Reflexionselement von
1 mm Dicke und 52 mm Lange mit der Optodenmembran beschichtet und
in eine spezielle Durchflussmesszelle eingesetzt [165] Beide Typen von
Durchflussmesszellen waren für Messungen in kommerziellen UV/VIS-
Spektrophotometern (Kap 9 4) adaptiert
9 2 2 Optodenmembranen aus Nafion
400 pl einer 0 001 mol L~' Losung des zu untersuchenden
Farbstoffes (siehe Anhang 1) in Methanol wurden mit 600 pl einer ge¬
brauchsfertigen 5% Nafion Losung in niedrigen aliphatischen Alkoholen
und Wasser (Aldnch, CH-9470 Buchs) gemischt Von dem resultierenden
Membrancocktail wurden dann 200 pl mit Hilfe einer Spritzennadel
gleichmassig über eine Quarz-Tragerplatte verteilt Diese wurden gegen
Licht und Staub geschützt abgedeckt, und man liess das Losungsmittel
über Nacht verdampfen Obwohl diese Membranschichten nicht die
gleiche Homogenitat wie mit dem Spin-on-Verfahren hergestellte Mem¬
branen aufwiesen, waren sie für optische Absorptionsmessungen geeignet
9 3 Messlosungen und Kalibratoren 195
9.3. Messlösungen und Kalibratoren
Für die Herstellung von Pufferlosungen und Kalibratoren verwen¬
dete man Metallsalze von höchstmöglicher Reinheit der Firmen Fluka AG
(CH-9470 Buchs), sowie Merck (D-6100 Darmstadt, Deutschland) Alle
Losungen wurden mit zweifach destilliertem Wasser mit einer Leitfähig¬
keit unter 1 uS / cm angesetzt, das mit einer Destdlationsanlage vom Typ
Buchi Fontavapor 285 (Buchi Laboratoriums-Technik, CH-9230 Flawd)
aufbereitet wurde Die Zusammensetzung der wassrigen, sowie der
methanohschen Pufferlösungen wurde in den meisten Fallen aus dem
Werk von Pernn und Dempsey [166] entnommen
Für die Ca2+-Bestimmung in Vollblut wurden wassnge Kalibratoren mit
physiologischem lonenhintergrund eingesetzt Die Konzentrationen orien¬
tierten sich an den mittleren physiologischen Molalitäten, wie sie in Hu¬
manplasmen angetroffen wurden (Na+ 150 mmol kg"', K+ 4 3 mmol kg ',
Mg2+ 0 51 mmol kg ') Alle Ionen wurden in Form der Chlondsalze
eingebracht Zur Stabilisierung des pH-Wertes wurde die Losung mit
10 mmol kg'HEPES auf pH 7 40 gepuffert Es wurden die folgenden
Ca2+-Konzentrationen eingestellt Kl 0 54 mmol kg"', K2 1 18 mmol kg'
und K3 2 68 mmol kg"1 Die Vollblutproben wurden auf analoge Weise
entnommen, wie im Abschnitt 9 1 2 beschrieben Es wurde ausschliesslich
das eigene Blut verwendet
Die Universalpuffer (Kapitel 7 7) wurden aus einer Stammlosung ange¬
setzt (HßO,, KH,P04 und KCl je 1 mol L"') und der gewünschte pH-Wert
mit 1 mol L'KOH eingestellt Anschliessend verdünnte man auf eine
Konzentration von 0 1 mol L"1
196 EXPERIMENTELLER TEIL
9.4. Messgerate
Alle Einwaagen wurden auf Präzisionswaagen der Firma Mettler-
Toledo (Mettler-Toledo AG, CH-8606 Greifensee) durchgeführt Für die
Einwaage von Optodenmembrancocktails wurde ein Gerat mit einer
Genauigkeit von ±0 01 mg (AT261 Delta Range") eingesetzt Für die pH-
Einstellung der Pufferlosungen verwendete man ein Orion Modell 920 A
pH-Meter mit einer Glaselektrode vom Typ 8103 Ross° (ATI Orion,
Boston MA, USA) Für die Aufzeichnung der Absorptionsspektren
benutzte man ein UV/VIS-Zweistrahl-Spektrophotometer vom Typ
Uvikon942 (Kontron Instruments, CH-8010 Zürich) oder Hitachi U3210
(Hitachi Ltd, Tokyo, Japan) mit den adaptierten Durchflussmesszellen
Die Forderung der Probelosungen im Schlauchsystem der Durchfluss-
messzelle erfolgte mit einer Penstaltikpumpe des Typs Perpex Jubile
(Guldener, CH 8047 Zürich) in der Regel mit einer Geschwindigkeit von
1 5 ml min'
9.5. Computersoftware und -hardware
Die Verarbeitung der aufgezeichneten spektralen Daten erfolgte mit
den Softwarepaketen Igor Pro 3 03 (WaveMetncs Ine,Lake Oswego,
Oregon, USA) oder teilweise auch Microsoft Excel 5 0 (Microsoft Corp ,
Seattle, USA) Für die statistische Datenauswertung verwendete man
Systat 5 2 1 (Systat, Ine,Evanston IL, USA) In allen Fallen wurden
Personal Computer vom Typ Apple Macintosh (Apple Computer Ine,
Cupertino CA, USA) eingesetzt PPP-Berechnungen wurden mit dem
Programm QCPE (Quantum chemistry program exchange) Nr 641 [167]
auf einer Silicon Graphics Indigo 2xz Workstation (Silicon Graphics Ine,
Mountain View CA, USA) durchgeführt
9 6 Verwendete Abkürzungen 197
9.6. Verwendete Abkürzungen
Abkürzung Bedeutung
ATR Abgeschwächte Totalreflexion (attenuated total reflection)
C Chromoionophor, Farbstoff
Cl Configuration Interactwn
Crocontum- 2-[4-(Diethylamino)-2-hydroxyphenyl]-5-[4-(l,l-diethyl-
Indikator ammonium)-2-hydroxy-2,5-cyclohexadienyhden]-3,4-
dioxo-1 -cyclopenten-1 -olat
Dicyanovinyl- l,3-Bis(dicyanomethylen)-2-[4'-(A,A'-diethylamino)-
Indikator phenyhmino]indan
DOS Bis(2-ethylhexyl)sebacat, Membranweichmacher
EMK Elektromotorische Kraft
ETH 1001 [(-MR^-^A'-Bis-tlHethoxycarbonyDundecylJ-AgV'-
4,5-tetramethyl-3,6-dioxaoctandiamid, Calciumionophor
ETH 5350 MAf-(Diethyl)-5-[(2-octyldecyl)imino]-5//-benzo[a]-
phenoxazin-9-amin
ETHT 5003 2-[3-Dicyanomethylen-2-(4-[bis-(2-ethylhexyl)amino]-
phenylamino)indan-1 -yliden]malononitnl
ETHT 5004 2-{2-[{4-[Bis-(2-ethylhexyl)amino]phenyl }-(4-tert-butyl-
phenyl)amino]-3-dicyanomethylenindan-1 -yliden}malono-
nitnl
ETHT 5005 Spiro[{ l,3-bis-dicyanomethylemndan}-2,2'-{ l'-(4-[bis-
(2-ethylhexyl)amino]phenyl)pipendin} ]
ETHT5006 [4-((l,3-Bis-dicyanomethylenindan-2-yl)-{4-[bis-(2-ethyl-
hexyl)amino]phenyl}amino)butyl]tnphenylphosphonium-
lodid
198 EXPERIMENTELLER TEIL
ETHT 5007 V-Adamantan-l-yl-A7'-(l,3-bis-dicyanomethylenindan-2
yl)-A/'-{4-[bis-(2-ethylhexyl)amino]phenyl)malonamid
ETHT 5008 N-Adamantan-1 -y\-N-( 1,3-bis-dicyanomethylenindan-2-
yl)-Ar-{4-[bis-(2-ethylhexyl)amino]phenyl}-A-methyl-
malonamid
ETHT 5009 V-(l,3-Bis-dicyanomethylemndan-2-yl)-A'-{4-[bis-(2-
ethylhexyl)amino]phenyl}-2,4,6-trnsopropylbenzolsulfon-
amid
GLDH Glucosedehydrogenase
GPO Glycerophosphatoxidase
HITCI 1,1 ',3,3,3',3'-Hexamethyl-2,2'-indotncarbocyaniniodid
IFCC International Federation ofClinital Chemistrv
IR-125 Anhydro-1,1 -dimethyl-2-[7-[ 1,1 -dimethyl-3-(4-sulfo-
butyl)-2(l//)-benz[elindohnyhden]-l,3,5-heptatnenyl]-3-
(4-sulfobutyl)-l//-benz[e]indohumhydroxid Natriumsalz
ISE lonenselektive Elektrode
KTFPB Kahum-tetrakis[3,5-bis(trifluorornethyl)phenyl]borat, R
L lonophor, Ligand
MTDDACl Methyltridodecylammomumchlorid, R+
NaTFPB Natnum-tetrakis[3,5-bis(tnfluoromethyl)phenyl]borat, R
NIR Nahes Infrarot
OH-PVC Hydroxy-poly(vinylchlond)
«-NPOE 2-Nitrophenyloctylether, Membranweichmacher
PAP p-Aminophenazon
PDCC104 [l,5-Bis(p-dimethylaminophenyl)-2,4-
pentadienyljcarbeniumperchlorat
9 6 Verwendete Abkürzungen 199
pHCOOHBr 5-Carboxy-2-(2- {3-[2-(5-carboxy- 1-ethyl-1,3-dihydro-
3,3-dimethylmdol-2-yliden)ethyliden]-2-chloro-1 -cyclo-
hexen-1 -yl} vinyl)-1 -ethyl-3,3-dimethyl-3//-indohum-
bromtd
PPP Panser-Parr-Pople
Propylen- 4-Methyl-l,3-dioxolan-2-on, Membranweichmacher
carbonat
PVC Poly(vinylchlond)
QCPE Quantum chemistry program exchange
R+ Lipophiler kationischer Zusatz (in der Regel MTDDACl)
R Lipophiler anionischer Zusatz (in der Regel KTFPB oder
NaTFPB)
Squann- 2- [2,2-Diethyl-1,2-dihydro-6//-penmidinium-6-yliden]-4-
Indikator [2,2-diethyl-2,3-dihydro-1 //-penmidin-6-yl]-3-oxo-1-
cyclobuten-1-olat
THF Tetrahydrofuran
Trimethimum- [6-(2-(9-Acndinyl)vinyl)-7,8,9,10-tetrahydro-5-oxa-
Indikator cyclohepta[b]naphthahn-3-yl]diethylamin
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2)2
9(siehe
Nafion
2)
29
(siehe
Nafion
PVC
DOS
2)2
9(s
iehe
pHCOOH+
2)2
9(s
iehe
PDC+
50
117
38
NaTFPB
1001
ETH
5350
ETH
M3
M2
Ml
Polymer
Weichmacher
']kg
[mmol
Additiv
kg
[mmol
']kg
[mmol
Ligand
Chromoionophor
Membran-Typ
69
Abschnitt
siehe
Abkürzungen
Für
Membran
der
Gesamtmasse
die
auf
sich
beziehen
Konzentrationsangaben
Alle
Optodenmembranen
der
Zusammensetzung
1Anhang
oz>X>
PVC
OH-PVC
OH-PVC
PVC
PVC
Polymer
25
DOS
KTFPB
26
o-NPOE
NaTFPB
26
o-NPOE
NaTFPB
50
o-NPOE
NaTFPB
42
o-NPOE
NaTFPBkg
"']
[mmol
Weichmacher
Additiv
20
Squarin
31
10
5234
ETH
pHCOOH+
31
10
5234
ETH
PDC+
117
38
1001
ETH
pHCOOH+
58
19
1001
ETH
PDC+
M8
M7
M6
M5
M4
kg"
[mmol
kg"1
][mmol
Ligand
Chromoionophor
Membran-Typ
25
PVC
Propylencarbonat
KTFPB
25
PVC
Propylencarbonat
KTFPB
25
PVC
o-NPOE
KTFPB
25
PVC
o-NPOE
KTFPB
25
PVC
DOS
KTFPB
kg"1
][mmol
Polymer
Weichmacher
Additiv
Dicyanovinyl
M13
20
Squarin
M12
20
Dicyanovinyl
Mll
20
Squarin
MIO
20
Dicyanovinyl
M9
kg"'
][mmol
kg"'
][mmol
Ligand
Chromoionophor
Membran-Typ
10
PVC
DOS
MTDDAC1
2
PVC
DOS
MTDDAC1
o20
£PVC
DOS
MTDDAC1
20
PVC
DOS
NaTFPB
16
PVC
DOS
KTFPB
kg"1
][mmol
Polymer
Weichmacher
Additiv
20
5004
ETHT
Ml8
20
5004
ETHT
M17
20
ETHT5003
M16
45
17
1001
ETH
Trimethinium
5Ml
15
Trimethinium
M14
kg"']
[mmol
kg"'
][mmol
Ligand
Chromoionophor
Membran-Typ
PVC
DOS
PVC
DOS
PVC
PVC
PVC
40
DOS
MTDDAC1
30
DOS
MTDDAC1
20
DOS
MTDDAC1
']kg
[mmol
Polymer
Weichmacher
Additiv
20
5009
ETHT
M23
13
5006
ETHT
M22
20
5004
ETHT
M21
20
5004
ETHT
M20
20
5004
ETHT
M19
kg"']
[mmol
kg"'
][mmol
Ligand
Chromoionophor
Membran-Typ
PVC
DOS
20
PVC
DOS
MTDDAC1
20
PVC
DOS
MTDDAC1
kg"1
][mmol
Polymer
Weichmacher
Additiv
1001
ETH
ETHT5009
M26
20
5008
ETHT
M25
20
5007
ETHT
M24
kg"'
][mmol
kg"'
][mmol
Ligand
Chromoionophor
Membran-Typ
225
Anhang 2
Tabelle 1 Gemessene Rohdaten für Blutplasma von 82 Probanden, Status G = gesunde
Probanden VD = Patienten vor der Hämodialyse, ND = Patienten nach der Hämodialyse,
HV = Patienten mit Heizbeschwerden auf der Intensivstation für innere Medizin, Jhg
Jahrgang des Piobanden, t* b°Totale Ionenkonzentration gemessen mit Hitachi 747
Analyzer in mmol L,', llx, c,'4' Aktive Molalitat gemessen auf AVL-Elektrolytanalyzer in
mmol kg,,' „und gerateintern transformiert zur freien Ionenkonzentration, ausgedruckt
in mmol L,'r ht,Hkt Hamatoknt-Wert, Osmol Osmolalitat
Nr Status Sex Jhg c\h c [' c\b c^K c'[^[mmol L '] [mmol L '] [mmol L '] [mmol L '] [mmol L ']
1 G m 65 140 0 147 1 3 8 40 105
2 G 1 59 140 0 146 9 44 4 6 107
3 G m 69 140 0 147 7 4 1 4 3 104
4 G m 60 142 0 148 2 3 5 3 7 107
5 G m 67 141 0 148 7 3 7 3 8 107
6 G m 67 142 0 148 1 44 46 104
7 G m 63 144 0 149 7 4 1 4 2 105
8 G f 65 142 0 148 3 39 4 1 108
9 G 1 62 141 0 148 6 37 3 9 107
10 G m 62 142 0 149 1 3 8 40 105
11 G f 61 1390 145 1 39 4 1 107
12 G m 66 141 0 149 3 37 3 9 106
13 G f 68 140 0 147 2 3 9 4 2 105
14 G m 67 142 0 149 8 3 8 40 106
15 G f 66 140 0 148 0 4 3 45 105
16 G m 66 141 0 148 3 3 8 4 0 107
17 G m 65 143 0 150 3 4 1 4 3 105
18 G m 65 141 0 148 7 37 3 9 104
19 G m 63 145 0 151 5 4 2 4 4 110
20 G m 65 140 0 147 5 4 3 45 103
21 G m 62 140 0 146 6 43 45 102
22 G m 69 141 0 148 2 4 1 43 107
23 G m 67 142 0 149 1 3 2 3 9 103
24 G m 67 1410 149 5 39 40 104
25 G f 57 140 0 148 3 4 1 43 107
26 G f 63 141 0 149 8 42 45 106
27 G f 43 141 0 148 2 3 8 40 103
28 G f 71 141 0 146 1 44 46 102
29 G f 70 142 0 146 8 44 46 108
30 G f 72 140 0 145 9 4 1 4 3 104
31 G f 71 143 0 148 6 4 3 4 5 109
32 G f 70 140 0 146 7 43 4 5 108
226 ANHANG 2
Tabelle 1 Fortsetzung
Nr Status Sex Jhg c\^ < ;_' c"^ < ^ c'uh[mmol L '] [mmol L '] [mmol L '] [mmol L '] [mmol L ']
33 G f 68 139 0 144 8 44 4 6 106
34 G f 71 140 0 147 1 37 3 9 105
35 G m 72 142 0 147 5 40 4 1 108
36 G f 70 141 0 147 2 3 8 39 108
37 VD m 36 133 8 139 4 5 7 59 99
38 VD m 26 135 9 143 0 63 66 103
39 VD m 41 138 6 146 5 48 5 1 104
40 VD m 32 138 7 146 2 47 49 103
41 VD f 34 139 2 147 4 5 6 60 106
42 VD f 49 134 0 140 8 54 5 8 93
43 VD m 31 135 9 144 7 6 1 66 98
44 VD m 22 135 8 144 1 57 6 1 97
45 VD f 43 134 2 140 6 6 1 64 98
46 VD f 58 137 2 142 5 70 7 3 100
47 VD m 17 136 9 143 7 44 47 98
48 VD m 50 140 6 147 6 48 5 1 104
49 VD f 59 140 6 146 4 45 4 7 103
50 VD m 64 140 5 148 0 50 5 3 104
51 VD m 67 139 8 146 9 46 48 96
52 VD m 47 135 2 142 0 6 9 7 3 102
53 VD f 58 138 2 145 5 5 9 62 102
54 VD m 65 141 4 148 8 5 0 5 2 108
55 ND m 41 140 3 148 9 4 1 4 4 101
56 ND m 26 138 0 144 7 3 9 4 1 100
57 ND m 32 140 0 149 1 37 40 100
58 ND m 36 1394 145 6 32 3 5 102
59 ND m 31 140 0 148 0 3 6 3 8 102
60 ND m 22 138 2 146 7 49 5 2 101
61 ND t 49 138 2 146 1 3 9 4 1 99
62 ND f 34 139 5 146 6 43 45 102
63 ND f 43 136 4 142 1 47 49 100
64 ND m 67 139 8 149 8 3 6 3 9 101
65 ND m 47 138 7 148 8 4 1 44 101
66 ND m 64 139 6 148 0 43 48 104
67 ND f 58 138 8 149 1 4 1 43 100
68 HV m 51 131 0 135 5 44 46 102
69 HV f 26 137 0 143 1 4 1 43 101
70 HV m 24 139 0 145 7 4 1 43 103
71 HV m 13 132 0 135 9 42 44 96
72 HV f 28 142 0 150 1 42 44 105
73 HV m 16 135 0 141 3 4 8 5 1 100
74 HV t 26 129 0 136 1 43 46 93
75 HV m 28 134 0 147 8 34 4 1 98
76 HV m 28 133 0 145 3 3 8 46 94
77 HV m 38 137 0 144 6 4 3 4 1 105
78 HV m 25 140 0 147 8 45 48 111
•-^
r
-uo
o
^33
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r
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<-*
o^oat^vl^>J-OON(^vJ-JOOOvOOv0^vJiM^vJ-vjvJ~4!>sJ^^^^
W-JU-J
W>0
4^
fJ\m'0-JvJvJn\iTs-J-JOOt>00-sJvJvlQO-J-Jvl^l-ja\sJ^]>JvlsJvl-sJ^'JsjNjsJ
ooooooooooooooooooooooooooooooooooo—
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loiOvj^ijitooo-hJcovjwo'-'i^aioo
00^\OWvl4^-t'K)0\OM^O^aoo--
MN)MMtOK)bJWW|gWK)MK)K)WWlNJK)tOS)|OIOhJtO|01JtOtOK)|OIOK)K)|si
OOOOOOQQOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO
sOOO-JONLA^OJNJ'—
228 ANHANG 2
Tabelle 1 Fortsetzung
Nr Status Sex Jhg (fth <" <p'h <
" ,' h
[mmol L '] [mmol L '] [mmol L '] [mmol L '] [mmol L ']
36 G 2 29 1 17 0 68 0 47 73 45
37 VD 2 12 1 00 0 53 0 35 58 3 9
38 VD 2 43 1 11 061 0 42 66 3 5
39 VD 2 56 1 19 081 0 52 77 5 5
40 VD 2 13 0 98 0 42 0 27 70 4 5
41 VD 2 16 0 99 0 90 0 59 69 4 8
42 VD 2 38 1 07 0 72 0 48 70 7 5
43 VD 2 62 1 21 0 76 0 50 77 5 2
44 VD 2 49 1 21 0 89 0 57 71 62
45 VD 2 34 1 06 0 75 0 47 74 3 3
46 VD 2 26 1 05 1 00 0 68 66 7 6
47 VD 1 97 091 0 63 041 71 44
48 VD 2 74 1 31 0 87 0 53 75 5 7
49 VD 2 19 1 00 0 96 0 62 67 54
50 VD 2 88 1 34 0 77 0 43 69 4 3
51 VD 2 53 1 08 0 89 0 54 72 43
52 VD 2 64 1 25 0 54 0 33 69 5 1
53 VD 2 55 1 21 091 0 59 71 64
54 VD 2 02 0 92 081 0 53 64 4 8
55 ND 2 94 1 32 0 39 0 19 86 60
56 ND 2 74 1 27 0 36 0 18 68 3 6
57 ND 2 62 1 19 0 30 0 13 81 5 1
58 ND 2 62 1 20 0 50 0 30 73 4 8
59 ND 2 78 1 27 061 0 33 83 56
60 ND 2 68 1 31 0 48 0 26 76 69
61 ND 2 69 1 04 0 34 0 17 79 86
62 ND 2 58 1 22 0 45 0 24 75 5 3
63 ND 2 36 1 13 0 60 0 38 71 3 2
64 ND 2 87 1 23 0 62 0 34 84 49
65 ND 2 90 1 34 0 48 0 23 79 60
66 ND 2 89 1 38 0 36 0 15 74 45
67 ND 2 75 1 36 0 53 0 29 77 70
68 HV 1 91 1 03 1 Ol 0 79 66 23
69 HV 2 26 1 12 0 88 0 56 71 59
70 HV 2 12 1 00 0 89 0 59 72 37
71 HV 201 1 04 0 59 0 40 58 36
72 HV 2 09 1 08 0 87 0 57 69 47
73 HV 2 12 1 15 0 89 0 64 66 33
74 HV 2 29 1 07 0 79 0 49 73 46
75 HV 2 12 1 03 081 0 54 71 46
76 HV 2 18 1 03 0 72 0 46 66 65
77 HV 2 15 1 10 0 76 0 53 68 5 2
78 HV 2 19 1 10 0 77 0 48 66 50
79 HV 2 12 1 05 0 80 051 72 56
80 HV 2 03 1 08 0 63 0 43 64 4 1
81 HV 2 09 1 04 1 07 0 73 65 44
82 HV 2 09 1 03 0 79 0 53 70 39
Tabelle 1 229
Tabtlle 1 Fottset/ung
Nr Statusr
tph '
( u
it pH Hkr Osmol
[mmol t ] [mmol L '] [mmol L ] [mmol L ] [mmol kg ']
1 G 1 63 2 6 4 2 4 3 761 0 46 285i G 0 55 2 8 4 5 2 8 7 55 0 42 272
3 G 2 17 2 8 45 46 7 73 0 50 277
4 G 1 00 2 3 3 8 8 8 7 53 0 46 289
5 G 1 12 2 3 5 2 45 7 62 0 48 284
6 G 0 52 2 4 40 5 1 7 63 0 47 280
7 G 0 62 2 4 49 4 3 7 55 0 49 289
8 G 0 54 20 3 7 5 1 7 46 0 42 277
9 G 0 99 3 1 40 3 7 7 53 0 43 276
10 G 1 18 2 4 54 4 3 7 52 0 45 280
11 G 1 05 2 2 6 1 2 6 7 59 0 37 275
12 G 071 2 0 4 9 4 8 7 57 0 42 281
13 G 1 09 2 8 3 8 4 1 7 59 0 38 274
14 G 0 79 2 1 44 5 5 7 66 0 46 288
15 G 1 06 2 8 40 3 2 7 57 0 46 287
16 G 1 01 2 1 4 4 46 7 70 0 45 282
17 G 1 05 2 2 4 1 5 9 7 55 291
18 G 1 14 2 5 5 1 4 1 7 56 0 46 287
19 G 0 59 24 40 4 8 7 66 041 286
20 G 1 39 2 5 5 0 3 8 7 55 0 48 287
21 G 0 49 1 7 40 5 4 7 59 041 283
22 G 0 45 2 0 3 7 59 7 59 0 46 289
23 G 0 97 2 1 39 5 3 7 78 0 45 288
24 G 0 75 2 1 37 3 5 7 57 0 48 287
25 G 1 22 2 6 3 9 4 3 7 75 0 44 282
26 G 0 42 2 2 3 2 5 1 7 75 0 42 291
27 G 1 52 3 2 4 3 3 0 7 55 0 42 287
28 G 1 85 4 2 7 7 3 7 7 54 0 48 285
29 G 0 60 3 1 4 5 3 8 7 53 0 40 284
30 G 1 02 3 8 47 3 5 7 52 0 42 277
31 G 0 82 2 9 44 3 7 7 49 0 40 278
32 G 1 85 3 7 3 9 4 3 7 54 0 44 278
33 G 0 80 3 3 49 5 3 7 52 041 278
34 G 0 98 24 4 7 3 8 7 53 0 40 281
35 G 0 83 2 3 48 5 9 7 55 0 46 285
36 G 071 3 1 45 3 5 7 55 0 42 288
37 VD 1 39 3 3 5 2 129 781 0 36 290
38 VD 1 17 2 3 8 7 199 7 70 0 35 304
39 VD 1 73 3 5 4 1 21 8 7 67 0 38 310
40 VD 3 14 29 65 24 0 7 68 0 28 309
41 VD 1 67 3 0 5 6 26 6 7 66 0 38 317
42 VD 2 82 45 63 22 3 7 65 0 36 306
43 VD 1 77 29 5 1 29 7 7 55 031 318
44 VD 4 93 3 7 5 5 22 1 7 55 0 36 312
45 VD 1 18 2 5 4 2 21 5 7 64 041 301
46 VD 1 72 49 5 2 25 4 7 65 0 35 311
230 ANHANG 2
Tabelle 1 Fortsetzung
Nr Status p k
S TrüvLU dec
Ph v|ti hrmk
Pr Ik
'.GIlK «.
Pl tlL
ti Humi II pH Hkr Osmol
[mmol L '] [mmol L"1] [mmol L" '] [mmol L"' ] [mmol kg ']
47 VD 0 78 29 95 17 9 7 73 0 34 307
48 VD 2 50 3 7 4 8 21 6 7 62 0 35 316
49 VD 2 25 3 3 66 160 7 67 0 35 307
50 VD 1 64 2 7 49 27 9 771 0 39 319
51 VD 2 57 29 45 23 3 7 75 0 33 311
52 VD 2 16 3 1 63 30 8 7 64 0 37 317
53 VD 2 25 45 47 25 3 7 67 0 33 317
54 VD 1 22 3 4 3 3 169 7 80 0 29 306
55 ND 0 88 3 6 6 1 67 7 77 299
56 ND 0 79 2 3 5 0 7 6 7 86 292
57 ND 2 76 3 4 5 4 11 6 7 55 304
58 ND 1 55 40 60 4 8 7 86 294
59 ND 1 67 3 2 74 11 5 7 85 300
60 ND 3 95 3 9 7 9 9 8 7 56 298
61 ND 2 56 5 2 8 7 7 1 771 299
62 ND 1 75 3 6 70 10 8 7 62 300
63 ND 1 11 2 6 5 0 11 5 771 296
64 ND 1 87 3 1 62 87 7 92 301
65 ND 1 66 3 5 7 1 120 7 62 303
66 ND 1 44 2 8 5 7 11 2 7 78 303
67 ND 1 30 4 8 7 1 5 5 7 62 303
68 HV 1 96 2 1 3 0 32 1 7 35 0 37 289
69 HV 1 79 3 4 4 6 5 2 7 67 0 37 284
70 HV 1 03 23 70 8 1 7 74 0 47 289
71 HV 1 48 2 4 6 9 12 3 7 59 0 34 282
72 HV 3 72 3 8 11 5 10 4 7 48 0 36 307
73 HV 1 76 2 6 6 2 10 0 7 64 0 36 292
74 HV 1 81 29 5 5 5 5 7 58 0 43 268
75 HV 1 90 3 5 7 9 122 7 63 0 42 286
76 HV 2 33 3 6 11 3 109 7 58 0 42 290
77 HV 2 28 34 6 1 92 7 53 0 44 289
78 HV 1 18 3 1 7 8 94 7 55 0 44 292
79 HV 2 78 3 5 48 8 1 7 55 041 288
80 HV 1 04 23 37 9 3 8 7 49 0 34 292
81 HV 1 61 29 66 43 7 66 0 44 276
82 HV 1 96 3 1 57 48 7 63 0 38 274
^^^^cNcMCNCMtNC^CNCNCNCNrococ<icocor^rororoco^^^^^
——
^—
. iNr^^^\o^ooa\0^oin^io^r^coao^(Nrn^in^r-ooONO^rNrn't
-(NfN'tinohx^
oooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooo
cNcor^rorocororocNr^cococororororococococNtocMr^
o^^a^o^Ttro^o^O^-nOM(NOO^^C^^nc^^ooO^^J^Ono^^0^^fnnooo\n>n--0^0
^^oc^o^o^()OOa^c^MC^iC^O^OOO^O^OO^O--o^tNO^oooooo^^rl»ooo^o^^^^
—oco^ooocrs
oosooaN~^oo—'r-oc^cMONOrooinooo—-oo—'-h—'—'Orooooa\—lO(N^oa^^o,tM^
o^o^ONcoo^ONO\^in(NOON^^ONO^nco^^h^nOhn^ooM^fNirirN'to\r^--iN-'ta\
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cororororocN-^coc^cN^rococMcoror>)ro-^rocorocMroc^
^in^cNTfooocjO^^cNr^^^^oo^cocNOc^cMOooooor^cM^O
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oo
oo
oo
oo
oo
oo
oo
oo
oo
oo
oo
oo
oo
oo
oo
oo
oo
oo
oo
oo
oo
72787275
72947267
72807268
72867307
72657262
72707273
72637253
72667260
72637261
72617264
72667259
72647266
72677244
72637251
72657268
72587271
72657280
72587263
72657249
72597268
72657268
72707268
oo
oo
oo
oo
oo
oo
oo
©o
oo
oo
oo
oo
oo
oo
oo
oo
oo
oo
oo
oo
oo
oo
34303428
34513420
34383420
34423468
34193415
34253428
34163405
34203413
34173414
34133416
34203413
34173420
34213395
34163403
34183422
34113426
34193436
34113417
34193401
34123423
34193423
34243422
oo
oo
oo
oo
oo
oo
oo
oo
oo
oo
oo
oo
oo
oo
oo
oo
oo
oo
oo
oo
oo
oo
35193517
35393509
35283510
35313555
35093505
35153517
35063496
35103503
35073504
35043507
35113504
35083511
35113486
35063494
35093512
35023516
35093525
35023507
35093492
35033513
35103513
35143512
232 ANHANG 2
Tabelle 2 Fortsetzung
Nr Status~
T"" 7"""~ ~ ~ ~
[kg L '] [mmol L '] [mmol kg '](6 2) (6 7a) (6 7b) (6 10a) (6 10a) (6 10a) (6 10a)
45 VD 0 933 144 9 155 3 0 7452 0 7291 0 3448 0 3536
46 VD 0 934 149 4 159 9 0 7433 0 7268 0 3420 03510
47 VD 0 934 145 3 155 5 0 7453 0 7290 0 3450 0 3539
48 VD 0 929 150 9 162 5 0 7423 0 7255 0 3405 0 3495
49 VD 0 935 150 0 160 4 0 7432 0 7265 0 3419 0 3509
50 VD 0 936 150 8 161 2 0 7428 0 7261 03412 0 3502
51 VD 0 932 149 2 160 1 0 7433 0 7267 0 3421 03511
52 VD 0 934 146 8 157 2 0 7444 0 7282 0 3436 0 3525
53 VD 0 931 149 5 160 6 0 7430 0 7264 0 3415 0 3505
54 VD 0 939 150 8 160 6 0 7431 0 7265 0 3420 0 3510
55 ND 0 922 148 9 161 5 0 7428 0 7261 0 3415 0 3505
56 ND 0 938 146 3 156 0 0 7450 0 7287 0 3445 0 3534
57 ND 0 925 147 7 159 7 0 7436 0 7270 0 3426 0 3516
58 ND 0931 147 1 158 1 0 7441 0 7277 0 3433 0 3522
59 ND 0 924 148 4 160 5 0 7432 0 7265 0 3420 03510
60 ND 0 926 147 8 159 6 0 7435 0 7270 0 3424 03514
61 ND 0 923 145 8 157 9 0 7443 0 7279 0 3438 0 3527
62 ND 0 930 148 2 159 4 0 7436 0 7271 0 3426 03516
63 ND 0 935 145 7 155 8 0 7451 0 7288 0 3445 0 3534
64 ND 0 924 148 2 160 4 0 7432 0 7265 0 3419 0 3509
65 ND 0 926 147 5 159 2 0 7437 0 7272 0 3427 03517
66 ND 0 932 148 5 159 4 0 7436 0 7271 0 3425 03515
67 ND 0 927 147 8 159 5 0 7435 0 7270 0 3424 03513
68 HV 0 938 140 9 150 1 0 7473 07316 0 3475 03561
69 HV 0 932 146 1 156 7 0 7446 0 7283 0 3439 0 3527
70 HV 0 934 147 8 158 3 0 7441 0 7276 0 3431 0 3521
71 HV 0 944 140 5 148 9 0 7480 0 7324 0 3487 0 3573
72 HV 0 932 151 2 162 1 0 7425 0 7257 0 3410 0 3500
73 HV 0 938 145 2 154 8 0 7454 0 7293 0 3448 0 3536
74 HV 0 932 138 0 148 1 0 7483 0 7327 0 3490 0 3576
75 HV 0 933 142 1 152 3 0 7465 0 7305 0 3465 0 3552
76 HV 0 935 141 3 151 1 0 7471 07312 0 3473 0 3560
77 HV 0 935 146 2 156 4 0 7448 0 7285 0 3441 0 3529
78 HV 0 937 149 2 159 2 0 7437 0 7271 0 3426 0 3516
79 HV 0 931 148 5 159 5 0 7436 0 7270 0 3425 03515
80 HV 0 940 135 5 144 2 0 7500 0 7347 03515 0 3599
81 HV 0 938 146 4 156 1 0 7449 0 7286 0 3441 0 3529
82 HV 0 934 143 9 154 0 0 7458 0 7297 0 3455 0 3543
Tabelle 2 233
Tabelle 2 Fortsetzung
Nr Status Y, at a
M E(|['%] [%] [mV]
(6 10a) (5 4)
1 G 0 7450 48 3 59 7 -0 77
2 G 0 7451 50 0 68 0 -0 79
3 G 0 7449 45 5 61 0 -0 74
4 G 0 7448 49 3 65 8 -0 79
5 G 0 7450 47 9 62 3 -0 79
6 G 0 7442 46 1 61 6 -0 72
7 G 0 7434 48 5 62 2 -0 73
8 G 0 7447 50 0 63 4 -0 80
9 G 0 7446 48 7 64 9 -0 80
10 G 0 7442 48 1 65 4 -0 76
11 G 0 7460 49 5 64 0 -0 80
12 G 0 7448 47 8 65 8 -0 78
13 G 0 7452 48 5 64 7 -0 76
14 G 0 7442 49 1 64 8 -0 77
15 G 0 7450 48 5 63 4 -0 76
16 G 0 7448 48 7 66 2 -0 79
17 G 0 7436 48 3 65 8 -0 74
18 G 0 7447 47 4 62 3 -0 75
19 G 0 7431 48 5 65 1 -0 81
20 G 0 7449 47 1 63 2 -0 72
21 G 0 7448 47 3 64 9 -0 71
22 G 0 7447 48 9 64 9 -0 79
23 G 0 7444 47 0 63 8 -0 73
24 G 0 7447 46 2 62 7 -0 74
25 G 0 7447 50 4 65 0 -0 80
26 G 0 7444 49 6 65 8 -0 77
27 G 0 7445 49 6 65 8 -0 73
28 G 0 7445 48 7 66 1 -0 70
29 G 0 7442 50 9 69 2 -0 79
30 G 0 7449 49 1 68 9 -0 75
31 G 0 7437 50 7 67 6 -0 81
32 G 0 7447 50 2 68 8 -0 81
33 G 0 7454 50 7 69 3 -0 78
34 G 0 7451 49 3 66 7 -0 77
35 G 0 7445 50 9 69 6 -0 80
36 G 0 7448 51 1 69 1 -0 81
37 VD 0 7478 47 2 66 0 -0 65
38 VD 0 7462 45 7 68 9 -0 70
39 VD 0 7450 46 5 64 2 -0 74
40 VD 0 7455 46 0 64 3 -0 71
41 VD 0 7447 45 8 65 6 -0 75
42 VD 0 7470 45 0 66 7 -0 57
43 VD 0 7455 46 2 65 8 -0 64
44 VD 0 7458 48 6 64 0 -0 63
45 VD 0 7466 45 3 62 7 -0 64
234 ANHANG 2
Tabelle 2 Fortsetzung
Nr Status y,a V, «,M. E„
[%] [%] [mV]
(6 10a) (5 4)
46 VD 0 7449 46 5 68 0 -0 64
47 VD 0 7465 46 2 65 1 -0 64
48 VD 0 7441 47 8 60 9 -0 74
49 VD 0 7448 45 7 64 6 -0 71
50 VD 0 7445 46 5 55 8 -0 73
51 VD 0 7449 42 7 60 7 -0 60
52 VD 0 7458 47 3 61 1 -0 68
53 VD 0 7447 47 5 64 8 -0 69
54 VD 0 7445 45 5 65 4 -0 77
55 ND 0 7443 44 9 48 7 -0 70
56 ND 0 7464 46 4 50 0 -0 68
57 ND 0 7448 45 4 43 3 -0 68
58 ND 0 7457 45 8 60 0 -0 72
59 ND 0 7448 45 7 54 1 -0 73
60 ND 0 7450 48 9 54 2 -0 70
61 ND 0 7455 38 7 50 0 -0 66
62 ND 0 7450 47 3 53 3 -0 71
63 ND 0 7465 47 9 63 3 -0 67
64 ND 0 7448 42 9 54 8 -0 70
65 ND 0 7453 46 2 47 9 -0 70
66 ND 0 7451 47 8 41 7 -0 75
67 ND 0 7452 49 5 54 7 -0 69
68 HV 0 7492 53 9 78 2 -0 76
69 HV 0 7464 49 6 63 6 -0 71
70 HV 0 7456 46 9 65 7 -0 73
71 HV 0 7494 51 7 67 8 -0 64
72 HV 0 7441 51 7 65 5 -0 75
73 HV 0 7472 54 0 71 9 -0 70
74 HV 0 7499 46 7 62 0 -0 62
75 HV 0 7481 48 6 66 7 -0 69
76 HV 0 7486 47 2 63 9 -0 61
77 HV 0 7464 51 2 69 7 -0 78
78 HV 0 7452 50 2 62 3 -0 85
79 HV 0 7452 49 5 63 8 -0 68
80 HV 07516 53 2 68 3 -0 68
81 HV 0 7467 49 8 68 2 -0 78
82 HV 0 7474 49 3 67 1
235
Curriculum Vitae
von
Daniel Citterio
1967 Geboren am 17 12 67 als Sohn von Viktor und Christa
Otteno-Labitzke in Zürich, Burger von Zürich
1974-1979 Primarschule in Zürich
1980-1986 Literargymnasium Ramibuhl in Zürich, Matura
Typus B
1986-1987 Certificate of Proficiency in Enghsh an der McGdl
University Montreal (Kanada)
1987 Militärdienst (Februar-November)
1987-1992 Studium an der Eidgenossischen Technischen Hoch
schule (ETH) Zürich, Abt IV (Chemie)
1991 Ausbildung zum Strahlenschutzsachverstandigen am
Paul-Scherrer-Institut (PSI) Wurenlingen
1992 Diplom der ETH Zürich, Diplomarbeit in der
Arbeitsgruppe von Prof Dr Wilhelm Simon
1992-1993 Anstellung bei der ANAWA AG in Wangen (ZH),
Pharmakokinetische Studien (GC / HPLC)
kommerzieller Pharmaka
1993-1997 Doktorarbeit in der Arbeitsgruppe von Prof Dr Gerd
Folkers unter der Leitung von PD Dr Ursula E
Spichiger am Zentrum für Chemische Sensoren, ETH
Zürich
1996 Stipendiat der Masuda Foundation in der Arbeitsgruppe
von Prof Dr Yoshio Umezawa (August-November),
School of Science, University of Tokyo (Japan)
236 LEBENSLAUF
1994-1997 Praktikumsassistent in analytisch-chemischen Praktika
an der ETH Zürich sowie der Ingenieurschule
Wadenswd (ISW)
1998- Postdoktorat in der Arbeitsgruppe von Prof Dr Koji
Suzuki, Keio University, Yokohama (Japan)