Einfluss von α8-Integrin auf das Zytoskelett und auf ... · MC and VSMC in glomerulonephritis and...
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Einfluss von α8-Integrin auf das Zytoskelett und
auf zellbiologische Aktivitäten in mesenchymalen Zellen
Der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.
vorgelegt von
Gudrun Volkert
aus Hünfeld
Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung: 23.11.2011 Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. Rainer Fink Erstberichterstatter: Prof. Dr. Robert Slany Zweitberichterstatter: Prof. Dr. Karl Hilgers
Meinen Eltern
Was wir wissen, ist ein Tropfen,
was wir nicht wissen, ein Ozean
ISAAK NEWTON (1643-1727)
Inhaltsverzeichnis
I
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis.............................................................................................I
Zusammenfassung.........................................................................................VI
Summary ...................................................................................................... VII
1 Einleitung ...................................................................................................... 1
1.1 Aufbau und Funktion der Niere................................................................................. 1
1.2 Pathologische Veränderungen im Glomerulus .......................................................... 2
1.3 Aufbau und Funktion arterieller Gefäße.................................................................... 3
1.4 Pathologische Veränderungen der Gefäßwand.......................................................... 4
1.5 Mesenchymale Zellen in Niere und Gefäßen ............................................................ 5
1.5.1 Mesangiumzellen (MZ) .......................................................................................... 5
1.5.2 Vaskuläre glatte Muskelzellen (VSMZ).................................................................. 6
1.6 Integrine und ihre Funktionen ................................................................................... 6
1.6.1 Struktur und Aufbau der Integrine......................................................................... 7
1.6.2 Ligandenbindung und Aktivierung der Integrine................................................... 8
1.6.3 Integrine und fokale Kontakte.............................................................................. 10
1.6.4 Integrine und das Zytoskelett ............................................................................... 11
1.6.5 Integrine und Matrix-Metalloproteinasen (MMP) .............................................. 13
1.6.6 Integrine und Connective tissue growth factor (CTGF)...................................... 13
1.7 Integrine der mesenchymalen Zellen....................................................................... 14
1.8 α8β1-Integrin ........................................................................................................... 15
1.9 Zielsetzung............................................................................................................... 18
2 Ergebnisse ................................................................................................... 19
2.1 Isolation und Charakterisierung von Maus-Mesangiumzellen (MMZ)................... 19
2.1.1 Generierung der Primärkulturen......................................................................... 19
2.1.2 Charakterisierung der Zellen............................................................................... 20
Inhaltsverzeichnis
II
2.2 Etablierung eines siRNA-vermittelten transienten „knockdown“ von α8-Integrin in Ratten-Mesangiumzellen (RMZ)......................................................................... 22
2.3 Charakterisierung der isolierten vaskulären glatten Muskelzellen (VSMZ) aus Aorten von WT- und α8-/--Mäusen.......................................................................... 23
2.4 Einfluss von α8-Integrin auf das Zytoskelett........................................................... 25
2.4.1 Vergleichende Darstellung der F-Aktine............................................................. 25
2.4.2 Vergleichende immunzytochemische Darstellung der Stressfasern .................... 27
2.4.3 Nachweis der α-SMA Expression in mesenchymalen Zellen ............................... 29
2.5 Einfluss von α8-Integrin auf die Bildung fokaler Kontakte .................................... 30
2.6 Vergleich mesenchymaler und epithelialer Marker................................................. 33
2.6.1 Expression mesenchymaler und epithelialer Marker .......................................... 33
2.6.2 Immunzytochemische Desmin-Färbung von siRNA transfizierten RMZ ............. 34
2.7 Zellbiologische Untersuchungen zur Funktion von α8-Integrin.............................. 35
2.7.1 Einfluss von α8-Integrin auf Adhäsion und Ausbreitung..................................... 35
2.7.2 Einfluss von α8-Integrin auf Migration ............................................................... 36
2.7.2.1 Migration im Wundheilungstest (Scratch Assay) ......................................... 37
2.7.2.2 Migration im Barriere-Assay........................................................................ 38
2.7.2.3 Migration in der Boydenkammer (Boyden Chamber Assay)........................ 39
2.7.3 Einfluss von α8-Integrin auf das Zellüberleben................................................... 40
2.7.3.1 Apoptose im Caspase-3 Assay ...................................................................... 41
2.7.3.2 Hoechst-Apoptoseassay ................................................................................ 42
2.7.4 Einfluss von α8-Integrin auf das Wachstumsverhalten von Zellen...................... 44
2.8 Untersuchungen zur Interaktion von α8-Integrin mit seinem potentiellen Liganden Fibrillin .................................................................................................... 46
2.8.1 Adhäsions- und Ausbreitungsassays.................................................................... 46
2.8.2 Adhäsionsassay mit cRGD-Peptiden ................................................................... 48
2.9 Expression potentiell kompensatorischer Integrine................................................. 50
2.9.1 Bestimmung der RNA-Expression potentiell kompensatorischer Integrine ........ 50
Inhaltsverzeichnis
III
2.9.2 Untersuchung zur Funktion von α2- und α6-Integrin beim Zellüberleben.......... 51
2.10 Einfluss von α8-Integrin auf die Matrix-Metalloproteinasen (MMP) ..................... 53
2.11 CTGF Expression in mesenchymalen Zellen .......................................................... 54
2.12 Untersuchungen des RhoA/Rho-Kinase (ROCK)-Signalwegs ............................... 55
3 Diskussion ................................................................................................... 58
3.1 Einfluss von α8-Integrin auf Zellmorphologie, Zytoskelett und fokale Kontakte .... 58
3.2 Die Bedeutung von α8-Integrin für zellbiologische Aktivitäten ............................. 60
3.2.1 Einfluss von α8-Integrin auf Adhäsion und Ausbreitung..................................... 60
3.2.2 Einfluss von α8-Integrin auf Zellüberleben, Proliferation und Migration .......... 61
3.3 Mögliche Kompensatorische Mechanismen............................................................ 63
3.3.1 α2- und α6-Integrin.............................................................................................. 63
3.3.2 Funktion von α2- und α6-Integrin beim Zellüberleben in α8-/--MMZ ................. 65
3.4 α8β1-Integrin und mesenchymale Marker............................................................... 66
3.4.1 Vermehrte Bildung von Vimentin in α8-/--MMZ .................................................. 67
3.5 Einfluss von α8-Integrin auf Matrix-Metalloproteinasen (MMP) ........................... 68
3.6 Welche Rolle spielt der Rho/ROCK–Signalweg? ................................................... 69
3.7 Die Interaktion von Fibrillin-1 und α8β1-Integrin .................................................. 71
4 Material und Methoden............................................................................. 72
4.1 Material.................................................................................................................... 72
4.1.1 Chemikalien ......................................................................................................... 72
4.1.2 Kits ....................................................................................................................... 74
4.1.3 Verbrauchsmaterialien ........................................................................................ 75
4.1.4 Geräte und Zubehör............................................................................................. 75
4.1.5 Puffer und Lösungen............................................................................................ 77
4.1.5.1 Zellkultivierung............................................................................................. 77
4.1.5.2 Kultivierung von MZ aus den Glomeruli .......................................................... 78
4.1.5.3 VSMZ-Isolation aus der Mausaorta ................................................................. 78
Inhaltsverzeichnis
IV
4.1.5.4 Proteinisolierung und –auftrennung................................................................. 79
4.1.5.5 Immunzytochemische Fluoreszenzfärbung ....................................................... 81
4.1.5.6 Adhäsions- und Ausbreitungsassay .................................................................. 82
4.1.5.7 Migration in der Boydenkammer...................................................................... 82
4.1.5.8 Proliferationsassay ........................................................................................... 82
4.1.5.9 Caspase-3-Aktivität-Assay ................................................................................ 82
4.2 Methoden ................................................................................................................. 84
4.2.1 Zellkultur.............................................................................................................. 84
4.2.1.1 Einfrieren von Zellen .................................................................................... 84
4.2.1.2 Auftauen der Zellen ...................................................................................... 84
4.2.1.3 Zellisolation von Ratten-Mesangiumzellen (RMZ)....................................... 85
4.2.1.4 Zellisolation von Maus-Mesangiumzellen (MMZ) ....................................... 85
4.2.1.5 Zellisolation von Maus-vaskulären glatten Muskelzellen (VSMZ)............... 86
4.2.2 Elektronenmikroskopie ........................................................................................ 86
4.2.3 Proteinanalyse ..................................................................................................... 86
4.2.3.1 Proteinisolation ............................................................................................ 86
4.2.3.2 Protein-Konzentrationsbestimmung ............................................................. 87
4.2.3.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE ) ................................ 87
4.2.3.4 Immunoblot-Verfahren ................................................................................. 88
4.2.4 Immunzytochemische Färbungen ........................................................................ 90
4.2.4.1 Charakterisierung der Mesangiumzellen ..................................................... 90
4.2.4.2 Hämatoxylinfärbung..................................................................................... 91
4.2.4.3 Fluoreszenzfärbungen .................................................................................. 92
4.2.5 Zellbiologische Untersuchungen ......................................................................... 93
4.2.5.1 Adhäsions- und Ausbreitungsassay .............................................................. 94
4.2.5.2 Migration ...................................................................................................... 94
4.2.5.3 Apoptosemessungen...................................................................................... 96
Inhaltsverzeichnis
V
4.2.5.4 Proliferationsassay....................................................................................... 99
4.2.5 RNA-Methoden................................................................................................... 100
4.2.5.1 Grundlagen des Real-Time-RT-PCR-Verfahrens....................................... 100
4.2.5.2 RNA-Extraktion .......................................................................................... 100
4.2.5.3 Reverse Transkription................................................................................. 101
4.2.5.4 Taqman Real-Time-RT-PCR....................................................................... 102
4.2.6 siRNA Silencing ................................................................................................. 103
4.2.7.6 Transiente Transfektion von RMZ .............................................................. 104
4.2.7 Statistische Auswertung ..................................................................................... 105
5 Literaturverzeichnis................................................................................. 106
6 Abbildungsverzeichniss ........................................................................... 121
7 Tabellenverzeichnis.................................................................................. 123
8 Abkürzungsverzeichnis............................................................................ 124
9 Anhang ...................................................................................................... 129
Publikationen..............................................................................................VIII
Danksagung..................................................................................................... X
Zusammenfassung
VI
Zusammenfassung
Die α8-Integrinkette ist Bestandteil des heterodimeren Matrixrezeptors α8β1-Integrin und
wird überwiegend in Zellen mesenchymaler Herkunft wie vaskulären glatten Muskelzellen
(VSMZ) und renalen Mesangiumzellen (MZ) exprimiert. Integrine beeinflussen zahlreiche
grundlegende zellbiologische Funktionen wie Adhäsion, Proliferation, Migration und
Zellüberleben, die bei pathologischen Veränderungen sowohl in der Niere als auch im
Gefäßsystem eine große Rolle spielen. In vivo ist α8-Integrin bei proliferativen
Erkrankungen der Niere (z.B. Glomerulonephritis) und der Gefäße (z.B. Arteriosklerose)
verändert exprimiert vorzufinden. Es gibt Hinweise dafür, dass α8-Integrin bei diesen
Erkrankungen eine funktionelle Rolle spielt, wobei die Mechanismen noch unklar sind.
In der vorliegenden Arbeit wurde die Hypothese untersucht, dass die α8-Integrinkette
grundlegende Funktionen mesenchymaler Zellen mitreguliert.
Hierzu wurden im Rahmen dieser Arbeit MZ und VSMZ aus Wildtyp (WT)- und α8-
Integrin knockout (α8-/-)-Mäusen kultiviert und miteinander verglichen. Zusätzlich wurde
die siRNA-Technik zur transienten Herunterregulation von α8-Integrin in MZ etabliert.
Sowohl transienter als auch dauerhafter Mangel an α8-Integrin führte in MZ zur
Umstrukturierung des Zytoskeletts und zum Verlust des mesenchymalen Phänotyps. Des
Weiteren konnte mittels zellbiologischer Untersuchungen eine abgeschwächte Adhäsion
und ein erhöhtes Zellüberleben dokumentiert werden. Allerdings wiesen MZ mit
transienter und dauerhafter α8-Integrin Defizienz Unterschiede im Proliferationsverhalten
auf. Im Gegensatz zu MZ führte der Verlust von α8-Integrin in VSMZ weder zu
morphologischen noch strukturellen Veränderungen. Zudem zeigten α8-/--VSMZ im
Vergleich zu WT-VSMZ, außer in der Migrationsrate, keine Unterschiede in den
zellbiologischen Prozessen wie Adhäsion, Proliferation und Überlebensfähigkeit.
Aus diesen Befunden schließen wir, dass α8-Integrin die strukturellen Veränderungen und
zellbiologischen Funktionen von MZ und VSMZ bei der Glomerulonephritis und der
Arteriosklerose zelltypspezifisch beeinflussen kann. Die zelltypabhängigen Befunde sind
nicht durch unterschiedliche Aktivierbarkeit des Rho/ROCK-Weges, ein potentieller
Signalweg von α8-Integrin, erklärbar. Hingegen kann die zelltypspezifische Funktion von
α8-Integrin zum Teil auf zelltypabhängige kompensatorische Mechanismen zurückgeführt
werden.
Summary
VII
Summary
The α8-integrin chain is a component of the heterodimeric matrix receptor α8β1 and is
predominantly expressed in cells of mesenchymal origin such as vascular smooth muscle
cells (VSMC) and renal mesangial cells (MC). Integrins influence many fundamental cell
biological functions such as adhesion, proliferation, migration and cell survival, which play
a major role in pathological alterations in both the kidney and the vasculature. In vivo α8-
integrin expression is altered in proliferative diseases of the kidney, like in
glomerulonephritis, and of the vessels, like in atherosclerosis. Some evidence exists that
α8-integrin plays a functional role in these diseases, but the mechanisms are still unclear.
In the present work the hypothesis that the α8-integrin chain modulates basic functions of
mesenchymal cells is tested.
For this purpose MC and VSMC were cultivated from wild type (WT) and α8-integrin
knockout (α8-/-) mice and compared with each other. Additionally, siRNA technology was
established in MC for a transient down regulation of α8-integrin.
Transient absence or constant lack of α8-integrin in MC led to reorganisation of the
cytoskeleton and loss of the mesenchymal phenotype. Furthermore, attenuated adhesion
and spreading as well as increased cell survival were documented in cell biological studies.
However, MC with transient and permanent α8-Integrin deficiency differed in their
proliferative behaviour. In contrast, the transient loss of α8-integrin in VSMC led to neither
morphological nor to structural changes. In α8-/--VSMC no changes in cell biological
processes such as adhesion, proliferation and survival could be detected, only alterations in
cell migration were observed. Based on these findings, we conclude that α8-integrin can
influence cell type-specifically the structural alterations and cell biological functions of
MC and VSMC in glomerulonephritis and arteriosclerosis. The cell type-dependent results
cannot be explained by different activation of the Rho/ROCK pathway, a potential
pathway of α8-integrin. In contrast, the cell type-specific function of α8-integrin can be
partially attributed to cell type-dependent compensatory mechanisms.
Einleitung
1
1 Einleitung
1.1 Aufbau und Funktion der Niere
Die dreizonig aufgebaute Niere ist ein bohnenförmiges, paariges Organ und befindet sich
im Retroperitonealraum. Im Innern der Niere liegt das Nierenbecken, mittig das fein
gestreifte Nierenmark und ganz außen die Nierenrinde [1]. Die kleinste funktionelle
Einheit der Niere ist das Nephron, das sich aus dem Glomerulus (Nierenkörperchen) und
dem Tubulusapparat zusammensetzt. Proximaler und distaler Tubulus sind durch die
Henle`sche Schleife miteinander verbunden [2]. Im Glomerulus wird durch Ultrafiltration
der Primärharn aus dem Blut gebildet [3]. Die Tubuli sind für die Rückresorption von
gelösten Stoffen und Wasser aus dem Primärharn zuständig. Dieser fließt durch den Ureter
(Harnleiter) in die Harnblase und wird schließlich durch die Harnröhre als Urin
ausgeschieden [2]. Das Vas afferens ist die blutzuführende Arteriole und verzweigt sich im
Nephron zum Kapillarknäuel, dem eigentlichen Glomerulus. Abschließend vereinigt sich
das Kapillarkonvolut wieder im abführenden Vas efferens [2]. Der Glomerulus besteht aus
einer Anhäufung von ca. 30 Kapillarschlingen, die durch Mesangiumzellen (MZ) und die
von ihnen gebildete mesangiale Matrix gestützt werden (Abb. 1 (B)). Diese Struktur wird
von der Bowman’schen Kapsel umgeben (Abb. 1 (A)). Die Kapillarschlingen sind von
außen mit Podozyten überzogen. Deren Fortsätze greifen ineinander und bilden zusammen
mit der Basalmembran und dem gefensterten Endothel der Kapillaren eine
Filtrationsbarriere (Abb. 1 (B)) [3]. Das Blut wird im Kapillarkonvolut durch den
glomerulären Filter als Primärharn in den Kapselraum filtriert. Zelluläre Bestandteile und
größere Proteine werden dabei zurückgehalten [2].
Einleitung
2
Abb. 1: Glomerulus und Kapillarschlinge.
(A) Elektronenmikroskopische Aufnahme eines glomerulären Kapillarkonvolutes nach [4]. (B) Schema einer
glomerulären Kapillarschlinge. EN: Endothelzelle, GBM: glomeruläre Basalmembran, M: Makrophage,
MES: Mesangiumzelle, MM: mesangiale Matrix, pEP: parietale Epithelzelle, POD: Podozyten, THR:
Thrombozyten nach [5].
Eine der wichtigsten Funktionen der Niere ist die Ausscheidung von Giftstoffen und
Stoffwechselprodukten. Sie dient aber auch als Regulator des Flüssigkeits-, Säure-, Basen-
und Elektrolythaushaltes. Als Renin-produzierendes Organ wirkt die Niere auf das Renin-
Angiotensin-System ein und besitzt damit eine wichtige Blutdruck-regulierende Funktion.
Zudem fördert die Niere durch Erythropoetinsynthese die Bildung der Blutkörperchen und
ist im Knochenstoffwechsel an der Vitamin D-Synthese beteiligt [1, 2, 6].
1.2 Pathologische Veränderungen im Glomerulus
Der Verlust von gesundem und funktionsfähigem Gewebe stellt ein pathologisches
Ereignis sowohl einer akuten als auch einer chronischen Niereninsuffizienz dar. Aufgrund
des Verlustes entwickelt sich ein fibrotisches, vernarbtes und funktionsloses Gewebe und
in Folge daraus die Niereninsuffizienz. Unabhängig von der Ätiologie und der Art der
Glomerulopathien ist der Prozess der renalen Fibrose durch überschießende
Zellvermehrung sowie durch eine gesteigerte Ablagerung von Matrixproteinen
gekennzeichnet [7-9]. Im gesunden Glomerulus dagegen proliferieren die Zellen nur in
geringem Maße und es besteht ein Gleichgewicht zwischen Matrixaufbau und -abbau. Die
Regulation des Gleichgewichtes zwischen Matrixauf- und -abbau erfolgt durch
Proteinasen, den zinkabhängigen Matrix-Metalloproteinasen (MMP) und Serin-Proteinasen
(Plasminogen Aktivatoren), sowie deren Inhibitoren [10]. Veränderte Expressionen und
Einleitung
3
Aktivitäten von MMP wurden in zahlreichen renalen Erkrankungen beschrieben, so dass
für MMP eine bedeutende Rolle in der Entstehung von unterschiedlichen
Glomerulopathien diskutiert wird [10, 11]. Inflammatorische Zellen wie Makrophagen und
Lymphozyten infiltrieren bei vielen glomerulären Erkrankungen in den Glomerulus und
gehen mit fibrotischen Veränderungen einher. Im Glomerulus sezernieren die
inflammatorischen Zellen proinflammatorische Faktoren wie platelet-derived growth factor
(PDGF), transforming growth factor-beta (TGF-β) und Interleukin-1 (IL-1), die MZ-
Proliferation und vermehrte Matrixablagerung induzieren [12-15]. Sowohl glomeruläre
Zellanhäufung, an der auch MZ beteiligt sind, als auch die Vernarbung durch
fortschreitende Matrixexpansion führen zur Zerstörung des Glomerulus und final zum
Verlust der Nierenfunktion [8].
1.3 Aufbau und Funktion arterieller Gefäße
Das kardiovaskuläre System, ein Netz aus Blutgefäßen, dient dem Blutkreislauf als ein
weitverzweigtes Transportsystem. Der Stoffaustausch zwischen dem Blut und dem
Gewebe findet nur in den Kapillaren statt. Die Aufgaben des Blutkreislaufes sind zahlreich
und beinhalten die Regulation des Gasaustausches, Transport der Nährstoffe und
Abtransport der Stoffwechsel– und Abfallprodukte. Zudem werden durch das
kardiovaskuläre System Botenstoffe wie z.B. Hormone, Zellen des Immunsystems und
Blutgerinnungsfaktoren an ihren Zielort befördert [16].
Prinzipiell bestehen die Wände aller Arterien aus drei Schichten: Der Intima, der Media
und der Adventitia. Die Intima stellt die innere, dem Blutstrom zugewandte Schicht dar.
Sie wird aus flachen Endothelzellen gebildet, die für einen möglichst reibungslosen
Blutfluss sorgen. Zudem erfüllt die Intima die Funktion einer Barriere und ist auch am
transzellulären Stofftransport beteiligt. Die mittlere Schicht setzt sich aus glatten
Muskelzellen (VSMZ), der Membrana elastica externa sowie der Membrana elastica
interna zusammen. VSMZ und elastisch vernetzte Fasern beeinflussen die Hämodynamik
durch Kontraktion bzw. Dilatation des Arteriendurchmessers. Die nach außen abgrenzende
Adventitia wird hauptsächlich aus Bindegewebe gebildet. Sie dient der Versorgung der
Arterienwand, indem sie Gefäßnerven und kleinste Blutgefäße führt, die bis in die Media
eindringen [17].
Einleitung
4
1.4 Pathologische Veränderungen der Gefäßwand
Eine typische pathologische Veränderung der Gefäßwand ist die Arteriosklerose. Die
Pathogenese der Arteriosklerose ist ein komplexer, lang andauernder und noch nicht
vollständig aufgeklärter Vorgang. Zahlreiche Faktoren, zu denen auch genetische
Dispositionen und umweltbedingte Einflüsse zählen, lösen die Bildung des
morphologischen Symptomkomplexes aus. Sie beeinflussen zudem den zeitlichen Verlauf
und das Ausmaß der Schädigung [18, 19]. Während der Entwicklung einer Arteriosklerose
manifestieren sich in der Intima arteriosklerotische Plaques, die aus Fetten,
Blutbestandteilen, aktivierten Endothelzellen, Makrophagen und eingewanderten VSMZ
gebildet werden (Abb. 2 (B) und (D)). Das Gefäßlumen wird durch die arteriosklerotischen
Plaques verengt, sodass der Blutstrom lokal vermindert wird [17, 20]. Arteriosklerotische
Veränderungen können zu irreversiblen Gefäßschädigungen führen, die den vollständigen
Gefäßverschluss mit tödlichem Verlauf nach sich ziehen können [19].
Abb. 2: Querschnitt durch ein gesundes Gefäß und ein arteriosklerotisches Gefäß mit Plaque.
(A) Skizzenhafter und (C) mikroskopischer Querschnitt durch ein gesundes Gefäß. (B) Skizze und (D)
mikroskopische Darstellung einer Gefäßlumeneinengung durch arteriosklerotische Plaques (Skizzen
modifiziert aus [20]. Fotos wurden mit freundlicher Genehmigung von Frau Dr. Nada Cordasic; Department
für Nephrologie und Hypertensiologie, Universitätsklinikum Erlangen, zur Verfügung gestellt).
Die „Response-to-injury“-Hypothese [21] und die „Lipoprotein-induced-atherosclerosis“-
Hypothese [22] werden als die wahrscheinlichsten Mechanismen bei der Entstehung einer
Einleitung
5
Arteriosklerose angesehen. Obwohl sie sich in ihren Ursachen unterscheiden, die eine
Arteriosklerose auslösen können, sind sie im weiteren Verlauf identisch. In der Gefäßwand
kommt es zu einer erhöhten Lipidaufnahme und Adhäsion von Monozyten und
Thrombozyten. Die Monozyten dringen in die Intima ein und werden in Makrophagen
umwandelt. Die Makrophagen phagozytieren LDL (low-density lipoprotein) und wandeln
sich wiederum zu Schaumzellen um. Durch chemotaktische Faktoren der Mono- und
Thrombozyten migrieren die VSMZ aus der Media in die Intima, wo sie durch
Wachstumsfaktoren zur Proliferation angeregt werden. Zusätzlich wird vermehrt
extrazelluläre Matrix (ECM) gebildet und abgelagert. In Folge dieser Ablagerungen wird
das Lumen der Arterie immer enger. Das Endstadium dieses Prozesses wird
umgangssprachlich als „Arterienverkalkung“ bezeichnet [17, 23].
Zelladhäsion, -migration, -proliferation, -überleben sowie Matrixvermehrung sind
grundlegende Prozesse, die bei pathologischen Veränderungen, sowohl in der Niere als
auch im Gefäßsystem, eine große Rolle spielen.
1.5 Mesenchymale Zellen in Niere und Gefäßen
1.5.1 Mesangiumzellen (MZ)
MZ gehören wie VSMZ und Fibroblasten zu den mesenchymalen Zellen [24]. Im
physiologisch gesunden Zustand der Niere bilden die verzweigten MZ ein lockeres Netz
[25]. Einerseits vermitteln sie dem Glomerulus mechanische Stabilität, andererseits
regulieren sie mittels ihrer kontraktilen Eigenschaft den Blutfluss der Kapillarschlingen
[6]. Zudem produzieren MZ die sie umgebende ECM selbst [7]. Sie sezernieren
hauptsächlich Kollagen IV, Fibronektin, Laminin, Proteoglykane [25] und zu geringen
Teilen Vitronektin sowie Tenascin-C [26]. Bei vielen glomerulären Erkrankungen, wie
einer Glomerulonephritis, werden die Proteine der ECM verstärkt sezerniert [7] oder wie
die interstitiellen Kollagene, Kollagen I und III de novo produziert [27]. Da MZ zudem in
der Lage sind, entzündliche Mediatoren und Wachstumsfaktoren zu sezernieren, die
sowohl parakrin als auch autokrin wirken können, tragen sie somit zur Aufrechterhaltung
lokaler Entzündungsreaktionen bei [28].
Einleitung
6
1.5.2 Vaskuläre glatte Muskelzellen (VSMZ)
VSMZ sind unter physiologischen Bedingungen für die Elastizität sowie für die
Kontraktion der Gefäße verantwortlich. Sie sorgen damit für die Aufrechterhaltung des
Gefäßtonus. Entsprechend ihrer Funktion sind VSMZ mit einem kontraktilen Apparat
ausgestattet. Dazu gehören zahlreiche Proteine des Zytoskeletts wie das α-Glattmuskel-
Aktin (α-SMA), Subtypen der schweren Ketten des Myosins (myosin heavy chains),
Desmin, Vimentin, Calponin, Caldesmon, SM 22α und Smoothelin [29, 30].
Normalerweise vermehren sich die VSMZ nur gering. In diesem nicht-mobilen Zustand
sind die VSMZ in der Media lokalisiert und befinden sich in einem ausdifferenzierten und
kontraktilen Phänotyp [29, 31]. VSMZ können eine reversible Modifikation zwischen
ausdifferenziertem und dedifferenziertem Zustand durchlaufen [32]. Während der
Reparatur nach einem vaskulären Schaden sowie bei krankhaften Veränderungen der
Gefäßwand kommt es zur Dedifferenzierung der ruhenden, kontraktilen VSMZ in einen
proliferativen, migratorischen Typ, der große Mengen an ECM-Proteinen synthetisieren
kann (sekretorischer Phänotyp). Die Proliferation der VSMZ spielt eine wichtige Rolle bei
der Entstehung von okklusiven Gefäßerkrankungen, wie z.B. bei der Bildung von
arteriosklerotischen Plaques oder bei einer Restenose nach Angioplastie [29, 31-33].
Aktivierte VSMZ zeigen veränderte Expressionen der Adhäsionsrezeptoren, zu denen auch
die Integrine zählen. Weiterhin weisen sie eine Umorganisation des Aktinzytoskeletts auf
[31, 34].
1.6 Integrine und ihre Funktionen
Der Kontakt zwischen ECM und MZ wird durch Zelloberflächen-Rezeptoren vermittelt.
Zu den wichtigsten Adhäsionsrezeptoren zählt neben den Cadherinen, den Selektinen und
der IgCAMs (immunoglobulin cell adhesion molecules), die Familie der Integrine [35].
Integrine sorgen nicht nur für eine Verankerung der Zellen, sondern sind darüber hinaus
auch an zahlreichen Signal-Transduktionswegen beteiligt [5, 35]. Integrine sind eine große
Familie von membranständigen Zelladhäsionsmolekülen, die in Zell-Zell- und Zell-Matrix-
Interaktionen involviert sind. Sie verbinden Matrixproteine wie z.B. Kollagene,
Fibronektin und Laminine mit dem Zytoskelett [36-38]. Integrine tragen somit zur
Regulation von Adhäsion, Migration, Proliferation, Differenzierung und Apoptose der
Zellen bei [39]. Neben der Zell-ECM-Interaktion sind Integrine auch bidirektional an der
Einleitung
7
Weiterleitung von Signalen beteiligt. So vermitteln sie sowohl Informationen aus der ECM
in die Zelle (outside-in signaling) als auch intrazelluläre Signale in die Zellumgebung
(inside-out signaling) [38].
1.6.1 Struktur und Aufbau der Integrine
Das Integrin ist ein heterodimeres Glykoprotein, das sich aus einer α-Integrinkette und
einer nichtkovalent gebundenen β-Untereinheit zusammensetzt. Jede Kette besteht aus
einer langen extrazellulären (700 bis 1100 AS), einer membrandurchspannenden und einer
relativ kurzen zytoplasmatischen Domäne (30 bis 50 AS). Eine Ausnahme stellt die β4-
Kette dar, die mit der α6-Integrinkette ein Hetereodimer bildet. α6β4-Integrin ist ein
Bestandteil der Hemidesmosomen und trägt durch die sehr große zytoplasmatische
Domäne der β4-Kette (ca. 1000 AS) zu der Verankerung von Intermediärfilamenten bei
[38, 40]. Die zellinnere Domäne der Integrinketten enthält in der Nähe des
transmembranösen Bereiches eine konservierte Sequenz. Bei den α-Untereinheiten ist es
das KXGFFKR-Motiv und bei fast allen β-Untereinheiten das KLLX4D-Motiv. Diese
Regionen sind wichtig für die Aktivierung und Deaktivierung der Integrinkette, indem sie
über die Ausbildung und Dissoziation einer Salzbrücke die Interaktion zwischen der α- und
der β-Kette regulieren [41]. Die meisten α-Ketten bestehen aus einer leichten und schweren
Kette, die durch eine Disulfidbrücke miteinander verbunden sind. Die extrazelluläre
Domäne der α-Kette zeigt N-terminal sieben homologe Wiederholungen auf, die sich zu
einer sogenannten ß-Propeller-Struktur falten. Einige α-Integrinketten besitzen zwischen
der 2. und 3. Wiederholung des ß-Propellers eine unabhängige gefaltete Region aus ca. 200
AS, die inserted (I) Domäne oder auch A-Domäne genannt wird. Die I/A-Domäne ist
häufig in die Ligandenerkennung involviert. In α-Integrinketten ohne I/A-Domäne wird die
Ligandenbindung über den ß-Propeller, der mit einer I-ähnlichen Domäne (I-like Domäne)
der ß-Integrinkette kooperiert, vermittelt Zusätzlich trägt N-terminal die β-Integrin-
Untereinheit eine als PSI-Domäne (Plexin, Semaphorin und Integrin) bezeichnete Region,
die Sequenz-Homologie mit Membranproteinen wie Plexin und Semaphorin besitzt. Das
erste der sieben Cysteine dieser Region bildet eine Disulfidbrücke mit der C-terminalen
Cystein-reichen Region der β-Untereinheit aus (Abb. 3) [38, 40, 41].
Einleitung
8
Abb. 3: Schematische Darstellung des Aufbaus der Integrine.
Die N-terminale Kopfgruppe der α-Untereinheit besteht aus einem siebenblättrigen β-Propeller. Viele α-
Untereinheiten besitzen zwischen dem zweiten und dritten Propellerblatt eine zusätzliche, eingeschobene,
sogenannte inserted (I) Domäne bzw. I/A-Domäne. Die β-Untereinheit kann eine I-ähnliche Domäne
aufweisen, die über die PSI-Domäne an die C-terminale cysteinreiche Region verbunden ist (modifiziert nach
M. J. Humphries, 2000 [40]).
1.6.2 Ligandenbindung und Aktivierung der Integrine
In Vertebraten wurden bisher 24 verschiedene Integrin-Heterodimere nachgewiesen, die
aus 18 α- und 8 β-Untereinheiten gebildet werden [38, 42]. Integrine werden nach ihrer
Ligandenspezifität und Zelltyp-spezifischen Expression in vier Gruppen eingeteilt:
Kollagen-, Laminin-, RGD- und Leukozyten-spezifische Rezeptoren (Abb. 4) [38]. Das
RGD- (Arg-Gly-Asp) Motiv befindet sich in zahlreichen ECM-Proteinen wie Fibronektin,
Vitronektin, Tenascin-C und vielen weiteren Proteinen [42, 43] und stellt eine
Bindesequenz dar, die von vielen Integrinen erkannt wird [44]. Zusätzlich ist die
Ligandenbindung von divalenten Kationen wie Ca2+, Mg2+ und Mn2+ abhängig. Putative
divalente Kationen-Bindestellen, die MIDAS (metal ion dependent adhesion site), befinden
sich im N-terminalen Bereich der α- und ß-Kette [40, 45]. Für die korrekte
Integrinfunktion sind demnach beide Ketten notwendig [46]. Die α-Kette ist für die
Spezifität des Rezeptors und die β-Kette für die Verbindung mit dem Zytoskelett
zuständig. Eine gut untersuchte ECM-Integrin Interaktion ist die Bindung von Fibronektin
an αvβ3-Integrin, die Migration und Adhäsion beeinflussen kann [47].
Einleitung
9
Abb. 4: Die Familie der Integrine.
18 α- und 8 β-Untereinheiten bilden 24 verschiedene Heterodimere, die aufgrund ihrer Spezifität für
bestimmte Liganden und Zelltyp-Expression in vier Hauptgruppen eingeteilt werden (modifiziert nach R.O.
Hynes, 2002 [38]).
Viele Integrine interagieren mit mehr als einem Liganden und einige Matrixproteine
können von mehreren Integrinen gebunden werden. Dadurch wird einer Zelle ermöglicht,
eine große Vielzahl von Integrin-Matrix-Interaktionen auszubilden [38]. Die Aktivierung
der Integrine ist bis heute nicht eindeutig geklärt. Ligandenbindung, Kationen und
Proteine, die an den intrazellulären Bereich binden, beeinflussen die Aktivierung bzw.
Deaktivierung der Integrine. Integrine können verschiedene Konformationszustände
annehmen. In ruhenden Zellen liegen die Integrine in einer nicht-adhäsiven Form vor und
zeigen eine niedrige Liganden-Affinität. Eine Ligandenbindung an das N–terminale Ende
beider Integrinketten führt zu einer Konformationsänderung des Integrins. Das Integrin
befindet sich nun in einem aktivierten Status mit hochaffiner Bindung an den Liganden
[38, 48]. Während die Ausbildung einer Salzbrücke zu einem inaktiven, geschlossenen
Zustand führt, wird durch eine Konformationsänderung die Dissoziation beider Ketten
herbeigeführt. Es erfolgt die Streckung und damit die Aktivierung des Integrins mit der
Fähigkeit zur Ligandenbindung [41].
Einleitung
10
1.6.3 Integrine und fokale Kontakte
Aktivierte Integrine liegen in der Zelle meist in Clustern vor und bilden Zell-Matrix
Adhäsionen aus [39, 49]. In migrierenden Zellen unterliegen Adhäsionen dynamischen und
hierarchischen Prozessen, an denen zahlreiche Zelloberflächen- und Matrix-assoziierte
Moleküle beteiligt sind. Diese sind sowohl räumlich als auch zeitlich reguliert und aktiv.
Integrin-vermittelte Adhäsionen können in drei Formen unterteilt werden, die sich in ihrer
molekularen und morphologischen Zusammensetzung unterscheiden: die fokalen
Kontakte, fibrillären Adhäsionen und Fokalkomplexe [50]. Die Fokalkomplexe treten
kurzzeitig in den protusiven Lamellipodien und Filopodien auf. Hierbei handelt es sich um
Zellfortsätze, die sich während der Fortbewegung (Protrusion) an der vorderen Zellfront
migrierender Zellen bilden [51]. Die Mehrheit dieser Fokalkomplexe löst sich während des
Zurückziehens der Zellfortsätze (Retraktion) wieder auf [50]. Somit unterliegen
migrierende Zellen einem ständigen Wechsel aus Neubildung und Auflösung von
Adhäsionen (turnover) [49, 52]. Durch die Rekrutierung weiterer Ankerproteine wie
Zyxin, aber auch Vinculin, können Fokalkomplexe zu fokalen Kontakten ausreifen. Fokale
Kontakte sind für die stabile Bindung an die ECM verantwortlich und deshalb vor allem in
festsitzenden (sessilen) Zellen vorzufinden [50, 53].
Abb. 5: Schematische Darstellung von fokalen Kontakten.
Neben strukturgebenden Proteinen befinden sich in den fokalen Kontakten viele signalübertragende Proteine
wie die c-Src (Tyrosinkinase Src) oder FAK (focal adhesion kinase). Nach der Bindung des Integrinrezeptors
an die RGD-Bindungsstelle in der Matrix kommt es zur Rekrutierung der FAK–Moleküle und in Folge zur
Ausbildung einer Signalkaskade [39].
Einleitung
11
In vitro konnte gezeigt werden, dass die Ligandenbindung auf extrazellulärer Seite der
Integrine zu einer Ausbildung von fokalen Kontakten führt (Abb. 5). Auf der
intrazellulären Seite der transmembranösen Integrine ist die β-Untereinheit über
Adapterproteine wie z.B. Talin, α-Aktinin und Vinculin mit den Aktinfilamenten sowie mit
Kinasen verbunden [39, 49]. Das 116kDa große Vinculin wurde zuerst in Zellen des
Hühnermagens identifiziert und ist seitdem in vielen anderen Zellarten von Säugetieren
nachgewiesen worden [54-56].
1.6.4 Integrine und das Zytoskelett
Das Zytoskelett einer Zelle besteht aus drei strukturellen Einheiten: den Mikrotubuli, den
Intermediärfilamenten und den Aktin-haltigen Mikrofilamenten. Zusammen mit ihren
assoziierten Proteinen bilden sie ein komplexes intrazelluläres System [57]. Das
Zytoskelett spielt eine entscheidende Rolle in der Ausbildung der Zellform, Organisation
des Zytoplasmas, Zellteilung, Zellbewegung und -differenzierung [58-60]. Insbesondere
die Organisation des Aktin-Zytoskeletts wirkt sich auf Adhäsion, Ausbreitung, Migration,
Proliferation, Morphologie und das Zellüberleben aus. An der Regulation von Aktin-
Vernetzung, Aktin-Treadmilling und der Neubildung von Aktinfilamenten sind unter
anderem auch die kleinen GTPasen, wie z.B. Rho, beteiligt [61].
Sechs verschiedene Isoformen des globulären, sogenannten G-Aktins sind im Menschen
vorzufinden. Neben α-Skelettmuskel-, α-Herzmuskel-, γ-Glattmuskel-, sowie β- und γ-
Nichtmuskel-Aktin, existiert das α-Glattmuskel-Aktin (α-SMA) [62]. α-SMA ist
typischerweise in mesenchymalen Zellen vorzufinden. Aus dem ca. 42kDA monomeren
Molekül entsteht eine filamentöse Form des Aktins (F-Aktin). F-Aktine können sich
zusammenlagern und Stressfasern bilden [63, 64]. Stressfasern sind durch ihre beiden
Enden mit fokalen Kontakten verbunden und stabilisieren dabei die Integrin-Cluster und
damit die Integrität der fokalen Kontakte [49, 52]. Die Formierung von Stressfasern wird
durch Rho Aktivierung initiiert [53, 65]. Wie Rho gehören Rac und Cdc42 zur Familie der
kleinen GTP-bindenden Proteine und beeinflussen sich in migrierenden Zellen gegenseitig
in einem Signalnetzwerk [35] (Abb. 6). Rac ist wichtig beim Aufbau und bei der
Ausbildung der peripheren Lamellipodien [51]. Cdc42 beeinflusst die Entstehung
aktinreicher Fortsätze, den sogenannten Filopodien [66]. Zudem spielen beide eine Rolle in
der Bildung von kurzzeitigen Fokalkomplexen. Der Übergang von Fokalkomplexen
(assoziiert mit Lamellipodien) zu fokalen Kontakten (assoziiert mit Stressfasern) wird
Einleitung
12
durch die Verlagerung des Integrin-vermittelten Signalweges von Rac zu Rho gesteuert
[65, 67]. Damit nimmt die Familie der kleinen GTPasen eine Schlüsselposition bei der
Verknüpfung von Signalwegen und der Organisation des Aktin-Zytoskeletts ein. Aber
auch die Rho-assoziierte Kinase (ROCK), ein wichtiger Effektor von Rho, beeinflusst
gemeinsam mit mDia1-Protein, einem weiteren Effektor der RhoA, die
Zusammenlagerung von F-Aktinbündeln [35]. Neben dem MAPK-, PI-3K-PKB/Akt- und
NF-κB-Signalweg, ist der Rho/GTPase-Weg einer der Hauptsignalwege, die durch die
Integrin-Liganden Interaktion (outside-in-signaling) direkt aktiviert werden kann [68].
Abb. 6: Der Integrin-vermittelte Rho/GTPase-Weg.
Integrine können durch die Ligandenbindung direkt auf die Aktivität von Rho, Rac und cdc42 einwirken.
Rho ist zum einem über die Rho Kinase (ROCK) und zum anderen über mDia1 an der Formation von
Stressfasern beteiligt. Rac kann über zwei Signalkaskaden (IRSp53, WAVE, Arp2/3-Komplex und PAK,
LIMK, Cofilin) die Bildung von Lamellipodien modulieren. cdc42 wirkt über den WASP-Arp2/3-Komplex
und den PAK-LIMK-Cofilin-Weg auf die Filopodien Formation ein. IRSp53 = insulin receptor tyrosine
kinase substrate p53, WAVE = WASP family Verprolin-homologous protein, WASP= Wiskott-Aldrich
syndrome protein, Arp = actin-related proteins, LIMK = LIM domain kinase, LIM = localized leukocyte
mobilization, PAK = p21-activated protein kinase, MLC = myosin light chain, mDia1 = mammalian
Diaphanous-related formin 1 [35].
Einleitung
13
1.6.5 Integrine und Matrix-Metalloproteinasen (MMP)
Integrine können über outside-in-signaling nicht nur die Organisation des Zytoskeletts
beeinflussen, sondern können ebenso regulierend auf die Synthese der MMP (Matrix-
Metalloproteinasen) einwirken [69]. Es sind über 20 verschiedene MMP-Spezies bekannt,
die sich je nach Zielmatrix und nach Sequenzhomologie in sechs verschiedene Gruppen
einteilen lassen: Die Kollagenasen (z.B. MMP-1), die Gelatinasen (z.B. MMP-2 und
MMP-9), die Stromelysine (z.B. MMP-3), die Matrilysine (MMP-7 und MMP-26), die
Membrane-Type (MT) MMP (z.B. MMP-14) und die MMP-Gruppe, die die restlichen
MMP beinhaltet, die sich weder durch ihre Sequenz noch durch ihre Substratspezifität in
eine der fünf vorangegangen Gruppen klassifizieren lassen (z.B. MMP-11) [70]. MMP sind
Zn2+-abhängige Endopeptidasen und können regulierend auf zahlreiche biologische
Prozesse der Zelle einwirken, indem sie neben dem Abbau der ECM Moleküle weitere
Nicht-Matrixmoleküle wie z.B. andere Proteinasen, Proteinase-Inhibitoren,
Wachstumsfaktoren sowie Zelloberflächenmoleküle wie z.B. Integrine und andere
Rezeptoren degradieren [71]. Der begleitende lokale Abbau der ECM durch MMP ist
essentiell für eine gerichtete Zellmigration. MMP können dadurch eine entscheidende
Funktion in embryonalen, physiologischen und pathologischen Prozessen wie
Angiogenese, Wundheilung sowie Inflammation einnehmen [72, 73]. Alle MMP (außer
den MT-MMP und MMP-11) werden in einer inaktiven Proform sezerniert. Bei der
Enzymaktivierung wird das ca. 80AS große N-terminale Propeptid abgespalten und erst
dann kann Zn2+ gebunden werden, welches die proteolytische Aktivität von MMP
reguliert. Aber auch die Familie der TIMP (tissue inhibitors of metalloproteinases),
natürlich vorkommende Inhibitoren der MMP, spielen eine entscheidende Rolle in der
Regulation der MMP-Aktivitäten [74, 75]. Die vier Mitglieder (TIMP-1, -2, -3 und -4) der
TIMP-Familie besitzen in der Regel eine hohe Affinität für bestimmte MMP. So bindet
TIMP-1 bevorzugt MMP-9 [76] und TIMP-2 inhibiert hauptsächlich MMP-2 [77].
1.6.6 Integrine und Connective tissue growth factor (CTGF)
Ebenso wie die MMP und TIMP beeinflussen zahlreiche Zytokine wie z.B. TGF-β [78, 79]
und CTGF (Connective tissue growth factor) Bildung und Deposition der ECM [80-82].
CTGF kann zudem durch seine Bindung an Oberflächenrezeptoren wie Integrine
zahlreiche Signalwege initiieren und somit einen regulatorischen Einfluss auf
Einleitung
14
zellbiologische Prozesse wie Adhäsion, Migration, Proliferation und Zellüberleben
einnehmen [79][83]. CTGF ist ein 38kDa großes sezerniertes, matrizelluläres Protein,
welches 1991 erstmals für HUVEC (human vascular endothelial cells) beschrieben wurde
[84] und bildet mit CCN1/CYR61 (Cysteine-rich 61), CCN2/NOV (Nephroblastoma
overexpressed), CCN4/WISP-1 (Wnt-induced secreted proteins-1), CCN5/WISP-2 und
CCN6/WISP-3 die CCN-Familie. CCN steht für Cyr61, CTGF und NOV, welche die
ersten drei bekannten Proteine dieser Familie darstellen [85, 86]. Außer in zahlreichen
Organen, wie Leber, Herz, Lunge sowie Niere ist CTGF/CCN2 auch in Blutgefäßen
nachgewiesen worden und ist an physiologischen und pathologischen Prozessen wie
Embryogenese, Wundheilung, Angiogenese, Arteriosklerose und Fibrosevorgängen
beteiligt [85, 87, 88].
1.7 Integrine der mesenchymalen Zellen
Im Mesangium der gesunden Niere exprimieren MZ eine Vielzahl von Integrinketten, wie
α1, α2, α3, α5, α6, α8, αv sowie β1, β3 und β5 [7]. In zahlreichen glomerulären
Erkrankungen ist eine veränderte mesangiale Expression dieser Integrine zu beobachten
(Beispiele s. Tab. 1).
Integrinketten Glomeruläre Erkrankungen
α1, α2, α3, αv, β1, β3 und β5 (erhöht)
Diabetische Nephropathie [89]
αv, β3 (erhöht) Membranoproliferative Glomerulonephritis Typ I [90]
α1, α5, αv, β1 (erhöht) IgA-Nephropathie [78, 91]
α1, α5, α8, β1 (erhöht) α3 (reduziert)
Mesangioproliferative Anti-Thy1.1 Nephritis im Rattenmodell [92, 93]
Tab. 1: Integrine und glomeruläre Erkrankungen.
Beispielhafte Übersicht der Integrine, deren Expression während glomerulärer Erkrankungen der Niere
induziert wird. Eine Ausnahme stellt das α3-Integrin dar, das während der Mesangioproliferativen Anti-
Thy1.1 Nephritis reprimiert wird.
Normalerweise liegen in der Media der Gefäße die VSMZ im differenzierten, kontraktilen
Phänotyp vor und exprimieren überwiegend α1-, α3-, α5-, α7-, α8-, α9-, αv- sowie β1- und
Einleitung
15
β3-Integrinketten [31]. Die Dedifferenzierung zu invasiven VSMZ korreliert in vitro mit
erhöhter α5-, αv-, β1- und β3-Integrin Expression [94] und de novo Expression von α4β1-
Integrin [95]. Gefäßschäden lösen unterschiedliche Expressionsänderungen zahlreicher
Integrine aus (Beispiele s. Tab. 2).
Integrinketten Vaskuläre Schäden
αv, β3 und β5 (erhöht) Neointima Formation im Kaninchenmodell [96] Aorten Ballon-Verletzung im Rattenmodell [97]
α5, β1 (erhöht) sowie α8 (reduziert)
Ballon-Verletzung einer Karotisarterie im Rattenmodell [98, 99]
aktiviertes β1 (reduziert) Ballon-Verletzung der Vena saphena magna im Pavianmodell [100]
α4β1-Integrin (de novo) arteriosklerotische Intimaverdickung [95]
Tab. 2: Integrine und vaskuläre Schäden.
Beispielhafte Übersicht der Integrine, deren Expression durch vaskuläre Schäden verändert ist.
Indem Integrine Migration, Proliferation und Apoptose von MZ und VSMZ, sowie die
Synthese von ECM und deren Zusammensetzung regulieren, sind sie für die Entwicklung
vaskulärer und glomerulärer Erkrankungen von großer Bedeutung [7, 101].
1.8 α8β1-Integrin
α8β1-Integrin ist im Nervensystem von Hühnerembryonen erstmals identifiziert und
beschrieben worden [45]. Es ist ein Rezeptor für Tenascin-C, Fibronektin und Vitronektin
sowie für Osteopontin und Nephronektin, wobei die Bindung der Liganden Tenascin-C,
Fibronektin und Vitronektin an α8β1-Integrin durch die RGD Bindesequenz erfolgt [26,
102-105]. Das cysteinreiche 350kDA Glykoprotein Fibrillin-1 wird auch als ein
potentieller Ligand von α8β1-Integrin diskutiert [106, 107]. Fibrillin-1 stellt die
Hauptkomponente von elastischen Mikrofibrillen dar [108] und ist sowohl in elastischen
als auch in unelastischen Geweben wie Haut, Auge, Gefäße und Niere vorzufinden [109].
In der Media der Gefäße sowie in der mesangialen Matrix des Glomerulus kann Fibrillin-1
nachgewiesen werden [110]. Degradation, Überexpression, aber auch Mutationen von
Fibrillin-1 führen zu zahlreichen Erkrankungen wie z.B. dem Marfan-Syndrom (MFS)
Einleitung
16
[111]. In vitro fördert Fibrillin-1 Adhäsion, Ausbreitung, Migration und Proliferation von
MZ [112]. Fibrillin-1 ist bereits als ein Ligand von α5β1-und αvβ3-Integrin bekannt [107].
α8β1-Integrin wird von neuronalen und mesenchymalen Zellen exprimiert und konnte in
der Niere von Maus, Ratte und Mensch spezifisch in MZ und im Gefäßsystem in VSMZ
nachgewiesen werden [93, 113]. Es ist bekannt, dass α8β1-Integrin mit fokalen Kontakten
assoziiert ist. Adaptive Zytoskelettmoleküle wie Vinculin stellen die Verbindung zwischen
α8β1-Integrin und dem Aktinzytoskelett her [93, 114-116]. α8β1-Integrin wird auch in den
sensorischen Haarzellen des Innenohrs exprimiert. Fehlt α8β1-Integrin, ist die
Differenzierung dieser Zellen gestört. Der Mangel an α8β1-Integrin führt in α8-Integrin
defizienten Mäusen (α8-/--Mäuse) zu Gleichgewichtsstörungen [117]. In Neuronen wird
die Adhäsion, das Ausbreiten der Zellen sowie die Ausbildung von Neuriten durch α8β1-
Integrin verstärkt [118].
α8-/--Mäuse zeigen einen renalen Phänotyp. α8-Integrin wird früh während der
Nephrogenese exprimiert und besitzt eine wichtige Funktion in der Nierenentwicklung.
Mangelt es an α8-Integrin, so liegt eine eingeschränkte Wechselwirkung zwischen Epithel
und Mesenchym vor. Die Interaktion zwischen Ureterknospe und umgebendem
Mesenchym ist daher gestört. Ein großer Teil der α8-/--Mäuse entwickelt keine Nieren und
stirbt. Überlebende neugeborene α8-/--Mäuse werden mit einer annähernd normal großen
oder zwei kleineren Nieren geboren [119, 120]. Diese Tiere weisen im Vergleich zu WT-
Mäusen eine signifikante Reduktion der Nierenmasse auf. Sie haben einen leicht erhöhten
Blutdruck sowie eine reduzierte Urinkonzentrationsfähigkeit [120]. In der adulten Niere
wird die α8-Integrinkette speziell in glomerulären MZ und in VSMZ exprimiert. Die
Glomeruli der α8-/--Mäusenieren zeigen im Vergleich zu WT-Mäusen histologisch zwar
kaum auffällige Veränderungen, aber morphometrische Untersuchungen belegen, dass
mehr glomeruläre MZ und eine etwas verbreiterte mesangiale Matrix vorliegen. So ist eine
erhöhte Ablagerung von Kollagen IV sowie Fibronektin und eine de novo Expression von
Kollagen I und III festzustellen. Während in α8-/--Mäusen die Gefäßwände der kortikalen
Arterien unverändert sind, sind die Kapillaren des peritubulären Netzwerkes etwas
geweitet. Obwohl α8-Integrin üblicherweise im Mesangium und in Gefäßen stark
exprimiert wird und α8-/--Mäuse enorme Nierenfehlbildungen aufzeigen, sind die
histologischen und morphometrischen Veränderungen im Verhältnis gering [27]. Jedoch
führen Induktionen experimenteller Glomerulopathien, wie z.B. der HABU-Nephritis oder
der Desoxycorticosteron(DOCA)-Salz Hypertonie-vermittelten Glomerulosklerose, in α8-/-
Einleitung
17
-Mäusen zu einer verzögerten Ausheilung bzw. zu einem schwereren Krankheitsverlauf
[120-122]. Sowohl in α8-/-- als auch in WT-Mäusen kann durch eine DOCA-Salz
Behandlung Bluthochdruck induziert werden. In Folge entwickeln die Tiere eine
hypertensive Nephrosklerose. Obwohl α8-Integrin in DOCA-behandelten Mäusen
vermehrt im Glomerulus exprimiert wird, kann für α8-Integrin kein profibrotischer
Einfluss beobachtet werden, da α8-/-- und WT-Mäuse einen vergleichbaren Grad an
Nephrosklerose aufweisen [122]. Dagegen wird α8β1-Integrin in vielen anderen Organen
als ein profibrotischer Faktor beschrieben. So wird α8-Integrin im Verlauf einer
experimentellen Lungenfibrose in interstitiellen Fibroblasten vermehrt exprimiert.
Desweiteren kann eine de novo Expression von α8β1-Integrin während einer induzierten
Lebererkrankung in aktivierten sternförmigen Leberzellen, die mit Myofibroblasten
vergleichbar sind, nachgewesen werden [123]. In kardialen Fibroblasten kann eine α8-
Integrin Expression detektiert werden, die im fibrotischen und vernarbten Myokard
hochreguliert ist [114, 124].
In vitro Untersuchungen zeigen, dass α8-Integrin eine Rolle in der Regulation des
mesangialen Phänotyps spielt und die Adhäsion von MZ fördert, aber Migration und
Proliferation zu hemmen scheint [125]. Zudem ist die α8-Integrin Expression für das
Überleben von MZ essentiell [121]. In VSMZ wird α8β1-Integrin als ein
Differenzierungsmarker angesehen. Die Modulation zu einer dedifferenzierten Zelle geht
mit Veränderungen in der Morphologie von einem spindelförmigen zu einem mehr
ausgebreiteten Phänotyp einher. Dabei erfolgt eine Umorganisation der Aktinfilamente zu
einer parallelen Anordnung und einem veränderten Expressionsmuster von Vinculin [126].
Diese Prozesse sind reversibel, denn eine Überexpression von α8-Integrin führt vom
dedifferenzierten zum differenzierten Phänotyp mit reduzierter Migration [127], während
eine erhöhte Migrationsrate durch die akute Herunterregulation von α8-Integrin erzielt
werden kann [124]. Somit stellt α8β1-Integrin in VSMZ nicht nur einen Marker für den
Differenzierungszustand dar, sondern ist auch am Prozess der Umdifferenzierung beteiligt
[127].
Einleitung
18
1.9 Zielsetzung
Aufgrund dieser Vorbefunde war von Interesse, die Bedeutung von α8-Integrin für den
Phänotyp von renalen MZ und VSMZ zu klären. Für die Untersuchungen wurden zum
einen MMZ und VSMZ genutzt, die aus WT- und α8-/--Mäusen isoliert wurden, zum
anderen wurde die α8-Integrin Expression in WT-Zellen (RMZ) mittels siRNA blockiert.
Durch siRNA-vermittelte Herunterregulation von α8-Integrin war es möglich, Effekte
einer akuten α8-Integrin Defizienz zu untersuchen.
1. Welchen Einfluss hat α8-Integrin auf die Organisation des Aktinzytoskeletts und
fokaler Kontakte und somit auf die Zellmorphologie? Welche Rolle spielt der
Rho/ROCK–Signalweg?
2. Inwieweit werden Adhäsion, Migration, Zellüberleben und Proliferation durch
akuten bzw. dauerhaften Mangel an α8-Integrin beeinflusst?
3. Existieren kompensatorische Mechanismen für das Fehlen von α8-Integrin?
4. Verändert sich durch den Mangel an α8-Integrin das Expressionsmuster
mesenchymaler Marker?
Ergebnisse
19
2 Ergebnisse
2.1 Isolation und Charakterisierung von Maus-Mesangiumzellen (MMZ)
2.1.1 Generierung der Primärkulturen
Aus den Glomeruli von α8-Integrin defizienten (α8-/-)- und Wildtyp (WT)-Mäusen
(erhalten von Dr. Ulrich Müller, Scripps Institute, La Jolla, CA, USA) wurden wie von
Hartner A. et al., 2002 [120] beschrieben, mesangiale Zellen isoliert und in eine
Primärkultur überführt. Aus isolierten Glomeruli wuchs zunächst eine Mischung
unterschiedlicher Zelltypen aus. Die Kultivierung in einem Selektivmedium für MMZ
führte zum Absterben der anderen Zelltypen. Das Vorliegen einer reinen MMZ-Kultur
wurde mit Hilfe von Antikörpern für unterschiedliche zelltypspezifische Marker wie
Faktor VIII, MECA-32, Zytokeratin 18, WT-1 und F4/80 überprüft. Die
immunzytochemische Färbung der isolierten Zellen gegen zellspezifische Epitope (Tab. 3)
zeigte, dass weder Endothel-, Epithelzellen, Podozyten noch Makrophagen in den Isolaten
vorzufinden waren.
Zellen Zellspezifische Marker Detektion in Primärkultur
Endothelzellen Faktor VIII, MECA-32 (-)
Epithelzellen Zytokeratin 18 (-)
Podozyten Wilms Tumor 1 (WT-1) (-)
Makrophagen F4/80 (-)
Mesangiumzellen (WT) α-Glattmuskel-Aktin (α-SMA), α8-Integrin (+), (+)
Tab. 3: Übersicht der verwendeten Oberflächenmarker zur Charakterisierung der Zelltypen.
(+) = positive und (-) = negative immunzytochemische Färbung.
Ergebnisse
20
2.1.2 Charakterisierung der Zellen
Antikörperfärbungen zur Identifizierung von mesangialen Markern wie α-Glattmuskel-
Aktin (α-SMA) und α8-Integrin führten in WT-Zellen zu positiven Ergebnissen und
verifizierten sie somit als mesangiale Zellen. Dagegen erfolgte mit denselben Antikörpern
in isolierten Zellen aus α8-/--Mäusen keine positive Färbung (Daten werden nicht gezeigt).
Zudem zeigten lichtmikroskopische Aufnahmen morphologische Unterschiede zwischen
den aus den Glomeruli von WT- und α8-/--Mäusen isolierten Zellen (Abb. 7 (A) und (B)).
WT-MMZ wiesen ein typisch mesenchymales Wachstum auf. Sie lagen überwiegend
vereinzelt vor und stellten Zellkontakte über ihre zahlreichen, stark ausgebreiteten
Zellausläufer her. α8-/--Zellen waren dagegen kompakter und mit wenigen und kurzen
Fortsätzen ausgestattet. Sie bildeten sogenannte Cluster, in denen die Zellen angehäuft in
Gruppen vorlagen. Sie ähnelten damit eher den für Epithelzellen typischen
pflastersteinartigen Zellverbänden. Aufgrund der untypischen Morphologie und der nicht
eindeutigen immunzytochemischen Identifizierung der α8-/--Zellen als mesangiale Zellen,
erfolgte mit Hilfe der Transmissionselektronenmikroskopie eine weitere Analyse. Im
Vergleich zu den bereits als mesangial identifizierten WT-Zellen wurden die α8-/--Zellen
auf MZ-spezifische Merkmale wie Einschlusskörperchen (phagozytotische Vesikel) und
ovaler Zellkern mit Heterochromatin hin untersucht. In beiden Aufnahmen (Abb. 7 (C) und
(D)) sind die für mesenchymale Zellen typischen ovalen Zellkerne mit Heterochromatin
(schwarze Pfeile), sogenannten Kernflecken, zu erkennen. Des Weiteren konnten sowohl
in WT- als auch in α8-/--Zellen phagozytotische Vesikel (weiße Pfeile) identifiziert
werden. Somit konnte für die aus den Glomeruli der α8-/--Maus isolierten Zellen, wie
schon für die WT-Zellen, der mesenchymale Ursprung nachgewiesen werden.
Ergebnisse
21
Abb. 7: Morphologischer Vergleich zwischen WT- und α8-/--MMZ.
WT- und α8-/--MMZ wiesen unterschiedliche Morphologie auf. (A) und (B) Hämatoxylinfärbung (HE): Die
WT- und α8-/--Zellen wurden dazu auf unbeschichtete Chamberslides ausgesät und nach der Färbung
erfolgten lichtmikroskopische Aufnahmen in 200-facher Vergrößerung. (C) und (D)
Elektronenmikroskopische Aufnahmen von isolierten und kultivierten Zellen aus den Glomeruli von WT-
und α8-/--Mäusen in 2156-facher Vergrößerung. Die für mesenchymale Zellen charakteristischen ovalen
Zellkerne (schwarze Pfeile) und phagozytotischen Vesikel (weiße) Pfeile konnten sowohl in den WT-Zellen
(C) als auch in den α8-/--Zellen (D) identifiziert werden und bewies für beide Zellen ihre mesenchymale
Herkunft. (Mit freundlicher Unterstützung von Frau Prof. Schlötzer-Schrehardt, Augenklinik,
Universitätsklinikum Erlangen).
Die Expression von α8-Integrin wurde in WT- und α8-/--MMZ mittels Real-Time-RT-PCR
und Western Blot bestimmt. Dazu wurden Protein- und RNA-Lysate gewonnen und
jeweils die Konzentration bestimmt. In α8-/--MMZ konnte auf RNA-Ebene nur eine
geringe und auf Proteinebene keine Expression von α8-Integrin nachgewiesen werden. In
WT- MMZ dagegen zeigte sich sowohl auf RNA- als auch auf Proteinebene eine starke
Expression von α8-Integrin (Abb. 8).
Ergebnisse
22
(A) Real-Time-RT-PCR
00,20,40,60,8
11,21,4
WT α8-/-
rela
tive
Indu
ktio
n
*
(B) Western Blot
- α8-Integrin(160kDa)
Abl
WT α8-/-
(A) Real-Time-RT-PCR
00,20,40,60,8
11,21,4
WT α8-/-
rela
tive
Indu
ktio
n
*
(A) Real-Time-RT-PCR
00,20,40,60,8
11,21,4
WT α8-/-
rela
tive
Indu
ktio
n
*0
0,20,40,60,8
11,21,4
WT α8-/-
rela
tive
Indu
ktio
n
*
(B) Western Blot
- α8-Integrin(160kDa)
Abl
WT α8-/-
(B) Western Blot
- α8-Integrin(160kDa)
Abl
WT α8-/-
- α8-Integrin(160kDa)
Abl
WT α8-/-
Abb. 8: Messung der α8-Integrin Expression in MMZ.
α8-/--MMZ (α8-/-) exprimierten im Vergleich zu WT-MMZ (WT) signifikant weniger α8-Integrin mRNA und
kein α8-Integrin Protein. (A) Real-Time-RT-PCR: Die Darstellung der relativen Induktion erfolgte in Bezug
auf 18S. (n=6, * p< 0,05 vs. WT). (B) Western Blot: Die Beladungskontrolle erfolgte über
Amidoschwarzfärbung (Abl).
2.2 Etablierung eines siRNA-vermittelten transienten „knockdown“ von
α8-Integrin in Ratten-Mesangiumzellen (RMZ)
RMZ wurden nach der Siebmethode [93] isoliert und ähnlich den WT-MMZ
charakterisiert. Parallel zu den dauerhaft α8-Integrin defizienten MMZ (α8-/--MMZ),
wurden RMZ mit einer transienten Reduktion der α8-Integrin Expression durch siRNA
Silencing („knockdown“) untersucht. Diese Methode erlaubt die Effekte einer akuten und
transienten Verminderung von α8-Integrin in RMZ zu untersuchen. Ein Vergleich dieser
Zellen mit MZ aus α8-/--Mäusen sollte Aufschluss darüber geben, inwieweit mögliche
kompensatorische Mechanismen bei einer dauerhaften Defizienz von α8-Integrin zum
Tragen kommen. Vor allem die kompensatorische Induktion anderer Integrine könnte
Effekte haben, die direkte Effekte der α8-Integrin Defizienz verdecken könnten. Zunächst
wurde überprüft, ob die spezifische siRNA (si itga8) die Expression des Zielgens α8-
Integrin in RMZ herunterregulieren kann. α8-Integrin mRNA-Expression wurde in einem
Zeitverlauf von 24h bis 96h nach der Transfektion bestimmt. Zur Kontrolle wurden
parallel die Zellen mit einer siRNA (si Ko) behandelt, deren Zielsequenz nicht in
eukaryontischen Zellen vorzufinden ist. Mit der si Ko sollte es somit zu keinen messbaren
spezifischen Effekten in den transfizierten RMZ kommen. Bereits 24 h nach der
Transfektion wurde α8-Integrin in siRNA transfizierten Zellen tendenziell und ab 48h
signifikant herunterreguliert (Abb. 9 (A)). Der Western Blot mit Lysaten 96h nach der
Transfektion bestätigte den Verlust an α8-Integrin Proteinen in si itga8 RMZ im Vergleich
Ergebnisse
23
zu si Ko RMZ (Abb. 9 (B)). Die Bandenintensität der si Ko RMZ entsprach der von
unbehandelten RMZ (Daten nicht gezeigt).
(B) Western Blot(A) Real-Time-RT-PCR
0,00,20,40,60,81,01,2
si Ko siitga8
si Ko siitga8
si Ko siitga8
si Ko siitga8
24 h 48 h 72 h 96 h
rela
tive
Indu
ktio
n
* **
si Ko si itga8
- α8-Integrin(160kDa)
- α-Tubulin(55kDa)
(B) Western Blot(A) Real-Time-RT-PCR
0,00,20,40,60,81,01,2
si Ko siitga8
si Ko siitga8
si Ko siitga8
si Ko siitga8
24 h 48 h 72 h 96 h
rela
tive
Indu
ktio
n
* **
0,00,20,40,60,81,01,2
si Ko siitga8
si Ko siitga8
si Ko siitga8
si Ko siitga8
24 h 48 h 72 h 96 h
rela
tive
Indu
ktio
n
* **
si Ko si itga8
- α8-Integrin(160kDa)
- α-Tubulin(55kDa)
si Ko si itga8
- α8-Integrin(160kDa)
- α-Tubulin(55kDa)
si Ko si itga8si Ko si itga8
- α8-Integrin(160kDa)
- α-Tubulin(55kDa)
- α8-Integrin(160kDa)
- α-Tubulin(55kDa)
Abb. 9: Messung der α8-Integrin Expression in si RNA transfizierten RMZ.
α8-Integrin wurde durch siRNA Transfektion in RMZ sowohl auf Transkriptions- als auch auf
Translationsebene transient herunterreguliert. (A) Real-Time-RT-PCR diente zur quantitativen Bestimmung
der zeitabhängigen (24h, 48h, 72h und 96h nach der Transfektion) α8-Integrin mRNA Herunterregulation
durch siRNA Behandlung von RMZ. Zur Normierung wurde 18S verwendet. Die gemessene RNA
Expression in α8-Integrin siRNA transfizierten RMZ (si itga8) wurde in Bezug auf die RNA aus Zellen
gesetzt, die mit unspezifischer Kontroll-siRNA behandelt wurden (si Ko). Die relative Induktion wurde auf
der Y-Achse dargestellt. (n=6, * p< 0,05 vs. si Ko). (B) Western Blot Analyse der si Ko und si itga8 RMZ
Proteinlysate mit einem Antikörper gegen α8-Integrin. α-Tubulin diente als Beladungskontrolle. (n=3).
In den folgenden Untersuchungen wurden Lysate aus Zellen mit 96h Transfektionszeit
verwendet. Alle folgenden siRNA-Untersuchungen wurden durch eine weitere spezifische
siRNA für α8-Integrin (s. Methodenteil) überprüft und bestätigt (Daten werden nicht
gezeigt).
2.3 Charakterisierung der isolierten vaskulären glatten Muskelzellen
(VSMZ) aus Aorten von WT- und α8-/--Mäusen
Ähnlich wie bei Strehlow K. et al., 2003 [128] beschrieben, wurden die Aorten aus WT-
und α8-/--Mäusen präpariert, VSMZ isoliert und in eine Primärkultur überführt.
Lichtmikroskopisch waren keine auffälligen morphologischen Unterschiede zwischen WT-
und α8-/--VSMZ zu sehen (Abb. 10). Der mesenchymale Charakter blieb, mit Bildung
eines netzartigen Zellverbandes und zahlreichen lang gestreckten Ausläufern, auch beim
Fehlen von α8-Integrin in den Zellen erhalten.
Ergebnisse
24
Abb. 10: Morphologischer Vergleich zwischen WT- und α8-/--VSMZ.
WT- und α8-/--VSMZ zeigten keine Unterschiede in ihrer Morphologie. Die Zellen wurden auf
unbeschichtete Zellkulturschalen ausgesät, mit 100% Methanol fixiert und mit Hämatoxylin (HE) gefärbt.
Die lichtmikroskopischen Aufnahmen erfolgten in 200-facher Vergrößerung.
Die Expressionsstärke von α8-Integrin wurde in VSMZ überprüft. Aus den frisch isolierten
Zellkulturen wurden Protein- und RNA-Lysate gewonnen und Protein und RNA
Konzentration gemessen. Der Nachweis des α8-Integrin Proteins erfolgte mittels Western
Blot. Parallel wurden RNA Messungen durchgeführt. In frisch isolierten α8-Integrin
defizienten VSMZ konnte im Western Blot kein α8-Integrin Protein detektiert werden
(Abb. 11 (B)). Im Vergleich zu WT-Zellen war die α8-Integrin RNA Expression in α8-/--
VSMZ bis auf eine geringe basale Expression signifikant herunterreguliert (Abb. 11 (A)).
In Zellen aus der Aorta der WT-Maus konnte dagegen die α8-Integrin Expression sowohl
auf RNA- als auch auf Protein-Ebene nachgewiesen werden.
(A) Real-Time-RT-PCR (B) Western Blot
0,00,20,40,60,81,01,21,4
WT α8-/-
rela
tive
Indu
ktio
n
*
- α8-Integrin(160kDa)
Abl
WT α8-/-
(A) Real-Time-RT-PCR (B) Western Blot(A) Real-Time-RT-PCR (B) Western Blot
0,00,20,40,60,81,01,21,4
WT α8-/-
rela
tive
Indu
ktio
n
*
- α8-Integrin(160kDa)
Abl
WT α8-/-
- α8-Integrin(160kDa)
Abl
WT α8-/-WT α8-/-
Abb. 11: Messung der α8-Integrin Expression in VSMZ.
α8-/--VSMZ (α8-/-) exprimierten im Vergleich zu WT-VSMZ (WT) signifikant weniger α8-Integrin mRNA
und kein α8-Integrin Protein. (A) Mittels Real-Time-RT-PCR wurde die mRNA Expression in WT-und α8-/--
Zellen gegen den 18S normiert. (n=3; * p< 0,05 vs. WT). (B) Der Protein Nachweis erfolgte mittels Western
Blot Analyse. Die Färbung mit Amidoschwarz (Abl) diente als Beladungskontrolle. (n=3).
Ergebnisse
25
2.4 Einfluss von α8-Integrin auf das Zytoskelett
2.4.1 Vergleichende Darstellung der F-Aktine
Inwieweit die Struktur und Organisation des Zytoskeletts durch α8-Integrin beeinflusst
wurde, wurde mittels Fluoreszenzfärbungen analysiert. F-Aktin wurde durch Rhodamin-
Phalloidin, ein interkalierendes Phallotoxin, an das ein fluoreszierender Farbstoff
gebunden ist, visualisiert. Die angefärbten Aktinfilamente ließen in WT-MMZ (Abb. 12
(A)) eine dichte netzartige Struktur erkennen, die sich durch die gesamte Zelle zog. Das
„Netz“ aus Aktinfilamenten zeigte zum Teil parallel angeordnete, aber auch quer
verlaufende Fasern. An der Peripherie der Zellen konnte eine Verdichtung der F-Aktine
(intensivere Fluoreszenz) detektiert werden. In α8-/--MMZ (Abb. 12(B)) dagegen waren
die Aktinfilamente überwiegend nur noch randständig und parallel angeordnet lokalisiert.
Die charakteristische netzartige Organisation der F-Aktine hatte sich vollständig aufgelöst
(Abb. 12 (B)). Die zuvor nach HE-Färbung lichtmikroskopisch sichtbare Veränderung der
α8-/--MMZ Morphologie (Abb. 7 (B)) spiegelte sich in der zytochemischen Analyse wider.
Der Mangel an α8-Integrin in VSMZ (Abb. 12 (D)) zeigte im Vergleich zum Wildtyp der
Zellen (Abb. 12 (C)) keinen Einfluss auf die Aktinfilamente. Passend zur Morphologie
(Abb. 10) ließen sich in WT- und α8-/--VSMZ keine Unterschiede in der Organisation des
Zytoskeletts nachweisen. Die transiente Herunterregulation von α8-Integrin in RMZ (si
itga8 RMZ) führte zu einer veränderten Verteilung der Aktinfilamente ähnlich der
Veränderung, wie sie in α8-/--MMZ zu beobachten war. In si itga8 RMZ waren die
Aktinfilamente überwiegend parallel und randständig angeordnet (Abb. 12 (F)). Zeitgleich
wurden RMZ mit nicht funktionaler siRNA (si Ko) transfiziert und ließen einen
unveränderten, den WT-MMZ (Abb. 12 (A)) vergleichbaren Phänotyp erkennen (Abb. 12
(E)).
Ergebnisse
26
Abb. 12: Vergleichende Fluoreszenzfärbungen der Aktinfilamente.
(B) α8-/--MMZ und (F) si itga8 RMZ wiesen im Vergleich zu (A) WT-MMZ bzw. (E) si Ko RMZ eine
veränderte Organisation der F-Aktinfilamente auf. (C) WT- und (D) α8-/--VSMZ zeigten keine Veränderung
in der netzartigen Struktur der F-Aktine. 2000 Zellen/Well wurden auf einen unbeschichteten 8-Kammer
Objektträger in 500µl D10+ ausgesät, mit 100% Methanol fixiert und F-Aktin mit interkalierendem
Rhodamin-Phalloidin sichtbar gemacht. (A) WT- und (B) α8-/--MMZ in 400-facher Vergrößerung. (C) WT-
und (D) α8-/--VSMZ in 200-facher Vergrößerung. (E) si Ko- und (F) si itga8 RMZ in 400-facher
Vergrößerung.
Ergebnisse
27
2.4.2 Vergleichende immunzytochemische Darstellung der Stressfasern
Während Rhodamin-Phalloidin durch seine interkalierende Eigenschaft generell alle Arten
von F-Aktinfilamenten visualisieren kann, dient die Untersuchung der α-SMA Expression
der spezifischen Analyse der Stressfasern. In WT-MMZ war α-SMA in charakteristischen
Stressfasern angeordnet, die sich über die gesamte Zelle verteilten (Abb. 13 (A)). In α8-/--
MMZ waren dagegen nur wenige einzelne Zellen gefärbt (mit einem langen weißen Pfeil
markiert). In diesen Zellen konnten die Stressfasern überwiegend nur kortikal
nachgewiesen werden. Die Mehrheit der Zellen konnte durch den α-SMA-Antikörper nicht
angefärbt werden (kleine weiße Pfeile) (Abb. 13 (B)). WT- und α8-/--VSMZ zeigten keine
Unterschiede in der Organisation der mit α-SMA-Antikörper detektierten Stressfasern.
Diese durchzogen gleichmäßig die gesamte Zelle (Abb. 13 (C) und (D)). In
Übereinstimmung mit den oben gezeigten F-Aktin Färbungen (Abb. 13 (F)), waren die
Stressfasern in si itga8 RMZ vermehrt parallel und in der Nähe des Zellrandes lokalisiert
(langer weißer Pfeil) und dokumentierten damit den Verlust der netzförmigen Struktur
(Abb. 13 (F)). Ähnlich der α8-/--MMZ (Abb. 13 (B)) konnten durch den Mangel an α8-
Integrin nur noch in wenigen vereinzelten si itga8 RMZ Stressfasern angefärbt werden
(kleine weiße Pfeile) (Abb. 13 (F)). Die Stressfasern in si Ko RMZ waren dagegen keiner
erkennbaren Veränderung unterworfen (Abb. 13 (E)).
Ergebnisse
28
Abb. 13: Vergleichende Immunzytochemie der Stressfasern (α-SMA).
Nicht in allen (B) α8-/--MMZ und (F) si itga8 RMZ konnten im Vergleich zu (A) WT-MMZ bzw. (E) si Ko
RMZ noch Stressfasern nachgewiesen werden (ungefärbte Zellen werden mit kurzen, weißen Pfeile
markiert). In den wenigen, vereinzelten (B) α8-/--MMZ und (F) si itga8 RMZ, in denen Stressfasern
ausgebildet wurden, lagen diese in einer veränderten Organisation und Lokalisation vor (lange weiße Pfeile).
(C) WT- und (D) α8-/--VSMZ waren in der Organisation ihrer Stressfasern unverändert. (A) und (B)
Immunzytochemie von Stressfasern in WT- vs. α8-/--MMZ in 200-facher Vergrößerung. (C) und (D) WT–
und α8-/--VSMZ in 400-facher Vergrößerung. (E) si Ko und (F) si itga8 transfizierte RMZ in 200-facher
Vergrößerung.
Ergebnisse
29
2.4.3 Nachweis der α-SMA Expression in mesenchymalen Zellen
Ergänzend dazu wurde die RNA- und Proteinexpression von α-SMA in den untersuchten
Zelltypen bestimmt. Die Durchführung der Nachweise für α-SMA-RNA und -Protein
erfolgte aus identisch behandelten Zellen. Auf mRNA-Ebene konnte im Vergleich zu WT-
MMZ in α8-/--MMZ eine signifikant geringere α-SMA Expression detektiert werden. Im
Gegensatz zu WT-MMZ konnte in α8-/--MMZ kein α-SMA Protein nachgewiesen werden
(Abb. 14 (A)). Dagegen war kein Unterschied in der α-SMA mRNA und Protein
Expressionsstärke zwischen WT- und α8-/--VSMZ zu detektieren (Abb. 14 (B)). Im
Vergleich zu si Ko RMZ wurde in einer Zeitkinetik von 24h bis 96h nach der Transfektion
in si itga8 RMZ ab 48h eine signifikante Verringerung der α-SMA RNA Expression
ermittelt (Abb. 14 (C)). Die Befunde des Western Blots wiesen auf eine verminderte α-
SMA Protein in den si itga8 RMZ hin und unterstützten die in der Real-Time PCR
erhobenen Daten (Abb. 14 (C)). Diese Beobachtungen deuteten darauf hin, dass das Fehlen
von α8-Integrin in den Mesangiumzellen den Aufbau und die Verteilung der
Aktinfilamente beeinflusst und eine morphologische Veränderung der Zelle zur Folge
haben kann. Dagegen konnte in den VSMZ durch das Fehlen von α8-Integrin keine
Beeinflussung des Zytoskeletts und der Zellform gezeigt werden.
Ergebnisse
30
Real-Time-RT-PCR Western Blot
(A) MMZ
0,00,20,40,60,81,01,21,4
WT α8-/-
rela
tive
Indu
ktio
n
* Abl
- α-SMA(42kDa)
WT α8-/-
0,00,20,40,60,81,01,21,4
WT α8-/-
real
tive
Indu
ktio
n
(B) VSMZWT α8-/-
Abl
- α-SMA(42kDa)
00,20,40,60,8
11,21,4
si K
osi itg
a8si
Ko
si itga8
si K
osi itga8
si K
osi itg
a8
24h 48h 72h 96h
rela
tive
Indu
ktio
n
** *
(C) si RMZ
- α-Tubulin(55kDa)
- α-SMA(42kDa)
si itga8si Ko
Real-Time-RT-PCR Western Blot
(A) MMZ
0,00,20,40,60,81,01,21,4
WT α8-/-
rela
tive
Indu
ktio
n
* Abl
- α-SMA(42kDa)
WT α8-/-
Real-Time-RT-PCR Western Blot
(A) MMZ
0,00,20,40,60,81,01,21,4
WT α8-/-
rela
tive
Indu
ktio
n
*0,00,20,40,60,81,01,21,4
WT α8-/-
rela
tive
Indu
ktio
n
* Abl
- α-SMA(42kDa)
WT α8-/-
Abl
- α-SMA(42kDa)
WT α8-/-
Abl
- α-SMA(42kDa)
Abl
- α-SMA(42kDa)
WT α8-/-WT α8-/-
0,00,20,40,60,81,01,21,4
WT α8-/-
real
tive
Indu
ktio
n
(B) VSMZWT α8-/-
Abl
- α-SMA(42kDa)
0,00,20,40,60,81,01,21,4
WT α8-/-
real
tive
Indu
ktio
n
(B) VSMZWT α8-/-
Abl
- α-SMA(42kDa)
WT α8-/-WT α8-/-
Abl
- α-SMA(42kDa)
Abl
- α-SMA(42kDa)
00,20,40,60,8
11,21,4
si K
osi itg
a8si
Ko
si itga8
si K
osi itga8
si K
osi itg
a8
24h 48h 72h 96h
rela
tive
Indu
ktio
n
** *
(C) si RMZ
- α-Tubulin(55kDa)
- α-SMA(42kDa)
si itga8si Ko
00,20,40,60,8
11,21,4
si K
osi itg
a8si
Ko
si itga8
si K
osi itga8
si K
osi itg
a8
24h 48h 72h 96h
rela
tive
Indu
ktio
n
** *
00,20,40,60,8
11,21,4
si K
osi itg
a8si
Ko
si itga8
si K
osi itga8
si K
osi itg
a8
24h 48h 72h 96h
rela
tive
Indu
ktio
n
00,20,40,60,8
11,21,4
si K
osi itg
a8si
Ko
si itga8
si K
osi itga8
si K
osi itg
a8
24h 48h 72h 96h
rela
tive
Indu
ktio
n
** *
(C) si RMZ
- α-Tubulin(55kDa)
- α-SMA(42kDa)
si itga8si Ko
- α-Tubulin(55kDa)
- α-SMA(42kDa)
si itga8si Ko si itga8si Ko
Abb. 14: α-SMA Expression in mesenchymalen Zellen.
Der Nachweis der α-SMA Expression erfolgte vergleichend zwischen (A) WT- und α8-/--MMZ, (B) WT- und
α8-/--VSMZ, sowie (C) si Ko und si itga8 RMZ. Im Vergleich zu (A) WT-MMZ bzw. (C) si Ko RMZ wurde
α-SMA mRNA sowohl in α8-/--MMZ als auch in si itga8 RMZ 48h, 72h und 96h nach der Transfektion
signifikant geringer exprimiert. Der Mangel an α8-Integrin führte in α8-/--MMZ zum Verlust des Proteins (A)
und in si itga8 RMZ im Vergleich zu si Ko RMZ zu einer geringeren Expression des Proteins (C). Dagegen
führte der Mangel an α8-Integrin in VSMZ weder auf mRNA noch auf Proteinebene zu einer veränderten α-
SMA Expression (B). Real-Time-RT-PCR: Die mRNA Messdaten des Zielgens wurden gegen 18S normiert.
Die relative Induktion wird auf der Y-Achse dargestellt. (n=3, * p< 0,05 vs. WT bzw. si Ko). Die Western-
Blot-Analyse wurde zur Detektion vom α-SMA Protein angewendet. Amidoschwarz (Abl) und α-Tubulin
dienten als Beladungskontrolle (n=3).
2.5 Einfluss von α8-Integrin auf die Bildung fokaler Kontakte
Ergebnisse
31
Die beobachtete Umorganisation des Zytoskeletts führte zu der Frage, inwieweit die
Bildung fokaler Kontakte durch das Fehlen von α8-Integrin beeinflusst wurde. Es ist
bekannt, dass in vitro Stressfasern mit fokalen Kontakten verbunden sind [52, 129].
Vinculin ist ein wichtiges Adaptermolekül zwischen fokalen Kontakten und F-
Aktinfilamenten [55]. Deshalb können fokale Kontakte mit Hilfe eines Vinculin-
Antikörpers visualisiert werden. Dafür wurden Zellen auf 8-Kammer Objektträger ausgesät
und zum einen mit dem Vinculin-Antikörper allein sowie zusammen mit einem
Fluoreszenzfarbstoff-konjugiertem Phalloidin (Doppelfärbungen) immunzytochemisch
untersucht. Die immunzytochemischen Doppelfärbungen verdeutlichten, dass die
Aktinfilamente mit Vinculin verbunden in fokalen Kontakten enden (Abb. 15 (A), (B), (G)
und (H)). Während die Menge an Vinculin zwischen WT- und α8-/--MMZ nicht
unterschiedlich war (Abb. 15 (I)), konnte für Vinculin ein veränderte Lokalisation gezeigt
werden. So waren nach der Vinculin-Antikörperfärbung in WT-MMZ (Abb. 15 (A))
vereinzelte Strukturen zu sehen, die sich gleichmäßig über die Gesamtzelle verteilten,
während in α8-/--MMZ (Abb. 15 (B)) geclusterte Bündel detektiert wurden. Diese Befunde
korrelierten mit dem Verlust der ursprünglichen netzartigen Struktur und der Neuordnung
der Aktinfilamente zu mehr parallel und randständig lokalisierten Strukturen (s. Kapitel
2.4.1). In WT- und α8-/--VSMZ erfolgte die Analyse von Vinculin ebenfalls mit einem
spezifischen Antikörper und dokumentierte eine gleich aussehende Verteilung der fokalen
Kontakte (Abb. 15 (C) und (D)). VSMZ aus WT- und α8-/--Mäusen waren demzufolge in
ihrem morphologischen Erscheinungsbild, in der Organisation des Zytoskeletts und in der
Lokalisation von Vinculin unverändert. Der transiente Mangel an α8-Integrin in MZ (Abb.
15 (E) und (F)) führte zu vergleichbaren Ergebnissen wie in α8-/--MMZ (Abb. 15 (A) und
(B)). So waren die Vinculin-positive fokalen Kontakte in si Ko-RMZ als längliche Struktur
zu erkennen, die gleichmäßig über die Zellen verteilt waren (Abb. 15 (E)). Hingegen
konnte häufig eine Bündelung der nun gedrungenen Strukturen beobachtet werden, wenn
in RMZ α8-Integrin durch siRNA-Transfektion transient herunterreguliert war (Abb. 15
(F)). Durch die Doppelfärbungen von Vinculin und F-Aktin wurde vor allem die
morphologische Veränderung, hinsichtlich der strukturellen Umorganisation der
Aktinfilamente und dem Verteilungsmuster von Vinculin, deutlich (Abb. 15 (G) und (H)).
Die Herunterregulation von α8-Integrin in RMZ führte zu abgerundeten Zellen mit kurzen
und wenigen Zellausläufern (Abb. 15 (H)) wie sie auch in α8-/--MMZ (Abb. 15 (B))
vorlagen.
Ergebnisse
32
Abb. 15: Vergleichende Immunzytochemie für Vinculin.
Die Lokalisation von Vinculin war in den (B) α8-/--MMZ und (F) und (H) si itga8 RMZ deutlich gegenüber
den (A) WT-MMZ bzw. (E) und (G) si Ko RMZ verändert. Dagegen führte der Mangel an α8-Integrin in den
VSMZ (D) zu keiner veränderten Lokalisation von Vinculin im Vergleich zu (E) WT-VSMZ. (A) und (B)
Immunzytochemie-Doppelfärbung von MMZ in 400-facher Vergrößerung. Vinculin (rot) wurde mittels eines
Primärantikörpers detektiert. Die F-Aktinfilamente (grün) wurden mit Hilfe von Phalloidin sichtbar gemacht.
(C) und (D) Vergleichende Lokalisation von Vinculin (rot) in VSMZ in 800-facher Vergrößerung. In (E) si
Ko- und (F) si itga8 RMZ wird die Lokalisation von Vinculin (grün) in 400-facher Vergrößerung
gegenübergestellt. (G) und (H) Doppelfärbung (Vinculin (grün) und F-Aktin (rot)) in den siRNA
transfizierten RMZs. (I) Proteinlysate aus WT- und α8-/--MMZ wurden mit einem Primärantikörper gegen
Vinculin inkubiert. Amidoschwarzfärbung (Abl) diente als Beladungskontrolle.
Ergebnisse
33
2.6 Vergleich mesenchymaler und epithelialer Marker
2.6.1 Expression mesenchymaler und epithelialer Marker
Um die Veränderungen in der MZ-Morphologie durch den Verlust von α8-Integrin genauer
zu beleuchten, wurden zunächst auf RNA-Ebene neben α-SMA die Expression weiterer
typischer mesenchymaler Marker wie Vimentin, Desmin und Fibronektin (FN) analysiert.
Mit E-Cadherin wurde zudem ein epithelialer Marker hinsichtlich seiner Expression in MZ
untersucht. In α8-/--MMZ konnten Desmin und FN im Vergleich zu WT-MMZ signifikant
geringer exprimiert nachgewiesen werden. E-Cadherin dagegen zeigte eine ca. dreifach
und Vimentin eine ca. sechsfach erhöhte mRNA Expression (Abb. 16 (A)). Im Vergleich
zu si Ko RMZ lagen die mesenchymalen Marker FN, Vimentin und Desmin in si itga8
RMZ signifikant geringer exprimiert vor. Ebenso konnte für den epithelialen Marker E-
Cadherin eine signifikant verminderte Expression nachgewiesen werden (Abb. 16 (B)).
0,00,20,40,60,81,01,21,4
si Ko siitga8
si Ko siitga8
si Ko siitga8
si Ko siitga8
Vimentin Desmin FN E-Cadherin
rela
tive
Indu
ktio
n
* *
**
(B) si RMZ
0,01,02,03,04,05,06,07,08,0
WT α8-/- WT α8-/- WT a8-/- WT α8-/-
Vimentin Desmin FN E-Cadherin
rela
tive
Indu
ktio
n
*
*
* *
(A) MMZ
0,00,20,40,60,81,01,21,4
si Ko siitga8
si Ko siitga8
si Ko siitga8
si Ko siitga8
Vimentin Desmin FN E-Cadherin
rela
tive
Indu
ktio
n
* *
**
(B) si RMZ
0,00,20,40,60,81,01,21,4
si Ko siitga8
si Ko siitga8
si Ko siitga8
si Ko siitga8
Vimentin Desmin FN E-Cadherin
rela
tive
Indu
ktio
n
* *
**
(B) si RMZ
0,01,02,03,04,05,06,07,08,0
WT α8-/- WT α8-/- WT a8-/- WT α8-/-
Vimentin Desmin FN E-Cadherin
rela
tive
Indu
ktio
n
*
*
* *
(A) MMZ
0,01,02,03,04,05,06,07,08,0
WT α8-/- WT α8-/- WT a8-/- WT α8-/-
Vimentin Desmin FN E-Cadherin
rela
tive
Indu
ktio
n
*
*
* *0,01,02,03,04,05,06,07,08,0
WT α8-/- WT α8-/- WT a8-/- WT α8-/-
Vimentin Desmin FN E-Cadherin
rela
tive
Indu
ktio
n
*
*
* *
(A) MMZ
Abb. 16: Messung mesenchymaler und epithelialer Marker.
Ergebnisse
34
(A) Im Vergleich zu WT-MMZ (WT) führte der Verlust von α8-Integrin in α8-/--MMZ (α8-/-) zu einer
signifikanten Hochregulation von Vimentin (6-fach) und E-Cadherin (3-fach), während Desmin und FN
signifikant geringer exprimiert wurden. (B) In si itga8 RMZ (si itga8) waren alle untersuchten Marker im
Bezug auf si Ko RMZ (si Ko) signifikant reprimiert vorzufinden. RNA wurde aus (A) WT- und α8-/--MMZ
und aus (B) mit siRNA behandelten RMZ isoliert und mit Real-Time-RT-PCR quantifiziert. Die mRNA
Messdaten der Zielgene wurden gegen 18S normiert. (n=3; *p> 0,05 vs. (A) WT und (B) si Ko).
2.6.2 Immunzytochemische Desmin-Färbung von siRNA transfizierten RMZ
Inwieweit Proteinsynthese und intrazelluläre Verteilung von Desmin durch die reduzierte
α8-Integrin Expression beeinflusst wurden, wurde mittels immunzytochemischer Analyse
96h nach siRNA Transfektion in RMZ untersucht. In si Ko-Zellen war eine starke Färbung
von Desmin detektierbar (Abb. 17). In si itga8 RMZ konnte Desmin nicht mehr in allen
Zellen nachgewiesen werden (Abb. 17). Vergleichbare Veränderungen wurden auch in α8-
/--MMZ beobachtet (nicht gezeigt). Somit konnte neben α-SMA (Abb. 13 und Abb. 14)
auch für den mesenchymalen Marker Desmin eine Reduktion der Expression auf
Proteinebene gezeigt werden (Abb. 17).
Abb. 17: Beispielhafte Desmin/F-Aktin Doppelfärbung von siRNA transfizierten RMZ.
Die transiente Herunterregulation von α8-Integrin in RMZ mittels der siRNA-Silencing-Methode (si itga8)
führte auch auf Proteinebene zu einer geringeren Expression von Desmin im Vergleich zu si Ko behandelten
RMZ (si Ko). Die Färbung der F-Aktinfilamente erfolgte mit interkalierendem Rhodamin-Phalloidin (rot)
und wurde in einer 200-fachen Vergrößerung aufgenommen.
Ergebnisse
35
2.7 Zellbiologische Untersuchungen zur Funktion von α8-Integrin
2.7.1 Einfluss von α8-Integrin auf Adhäsion und Ausbreitung
Bekanntermaßen sind Integrine an ECM-Zell-Interaktionen beteiligt. Inwieweit der
Mangel an α8-Integrin zu einem veränderten adhäsiven Verhalten führt, wurde im
Folgenden untersucht. Eine Voraussetzung für die Ausbreitung ist die Adhäsion. Somit
dient die Bestimmung der Ausbreitung der Zellen zusätzlich als Hinweis für eine feste
Anhaftung der Zellen an ihre Umgebung. Während Fibronektin (FN) einer der
Hauptliganden von α8-Integrin darstellt, ist Kollagen I (Col I) kein Bindungspartner. 2%
BSA wurde als Negativkontrolle verwendet. Im Vergleich zu WT-MMZ adhärierten α8-/--
MMZ auf Col I unverändert. Bei dem Liganden FN lag eine verminderte Anhaftung der
α8-/--MMZ vor (Abb. 18 (A)). WT-MMZ breiteten sich auf FN und auf Col I geringer aus
als α8-/--MMZ (Abb. 18 (B)). In unbeschichteten Kontroll-Wells (PL) konnte weder ein
Unterschied im Adhäsionsverhalten noch in der Ausbreitung beobachtet werden (Abb. 18
(A) und (B)). VSMZ adhärierten auf FN am stärksten, während die Adhäsion auf PL und
auf Col I ähnlich gering war. Mit demselben Versuchsansatz wurde auch die Ausbreitung
der VSMZ analysiert. So breiteten sich diese Zellen unabhängig von der α8-Integrin
Expression am stärksten auf FN aus. Der Mangel an α8-Integrin führte in VSMZ sowohl
hinsichtlich der Adhäsion als auch der Ausbreitung zu keiner signifikanten Veränderung
(Abb. 18 (C) und (D)). Verglichen mit si Ko RMZ adhärierten si itga8 RMZ auf FN
geringer. Auf Col I und auf PL war kein Unterschied im Adhärenz-Verhalten zu
beobachten (Abb. 18 (E)). Wurden si itga8 RMZ mit si Ko RMZ hinsichtlich der
Ausbreitungsrate gegenübergestellt, so zeigte sich auf FN ein geringerer Anteil an
ausgebreiteten Zellen. Auf PL und auf Col I ausgesäte Zellen zeigten insgesamt weniger
Ausbreitung und es konnte kein signifikanter Unterschied zwischen si itga8 RMZ und si
Ko RMZ ermittelt werden (Abb. 18 (F)).
Ergebnisse
36
020406080
100120
WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-
Col I FN PL
Adh
äsio
n (%
)
*
(A) MMZ
020406080
100120
WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-
Col I FN PL
Aus
brei
tung
(%)
*
*
(B) MMZ
020406080
100120
WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-
Col I FN PLA
usbr
eitu
ng (%
)
(D) VSMZ
020406080
100120
WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-
Col I FN PL
Adh
äsio
n (%
)
(C) VSMZ
020406080
100120
si Ko si itga8 si Ko si itga8 si Ko si itga8
Col I FN PL
Aus
brei
tung
(%)
*
(F) si RMZ
020406080
100120
si Ko si itga8 si Ko si itga8 si Ko si itga8
Col I FN PL
Adh
äsio
n (%
)
*
(E) si RMZ
020406080
100120
WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-
Col I FN PL
Adh
äsio
n (%
)
*
(A) MMZ
020406080
100120
WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-
Col I FN PL
Adh
äsio
n (%
)
*
020406080
100120
WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-
Col I FN PL
Adh
äsio
n (%
)
*
(A) MMZ
020406080
100120
WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-
Col I FN PL
Aus
brei
tung
(%)
*
*
(B) MMZ
020406080
100120
WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-
Col I FN PL
Aus
brei
tung
(%)
*
*
020406080
100120
WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-
Col I FN PL
Aus
brei
tung
(%)
*
*
(B) MMZ
020406080
100120
WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-
Col I FN PLA
usbr
eitu
ng (%
)
(D) VSMZ
020406080
100120
WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-
Col I FN PLA
usbr
eitu
ng (%
)
(D) VSMZ
020406080
100120
WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-
Col I FN PL
Adh
äsio
n (%
)
(C) VSMZ
020406080
100120
WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-
Col I FN PL
Adh
äsio
n (%
)
(C) VSMZ
020406080
100120
si Ko si itga8 si Ko si itga8 si Ko si itga8
Col I FN PL
Aus
brei
tung
(%)
*
(F) si RMZ
020406080
100120
si Ko si itga8 si Ko si itga8 si Ko si itga8
Col I FN PL
Aus
brei
tung
(%)
*
020406080
100120
si Ko si itga8 si Ko si itga8 si Ko si itga8
Col I FN PL
Aus
brei
tung
(%)
*
(F) si RMZ
020406080
100120
si Ko si itga8 si Ko si itga8 si Ko si itga8
Col I FN PL
Adh
äsio
n (%
)
*
(E) si RMZ
020406080
100120
si Ko si itga8 si Ko si itga8 si Ko si itga8
Col I FN PL
Adh
äsio
n (%
)
*
020406080
100120
si Ko si itga8 si Ko si itga8 si Ko si itga8
Col I FN PL
Adh
äsio
n (%
)
*
(E) si RMZ
Abb. 18: Adhäsions- und Ausbreitungsassays.
α8-/--MMZ (α8-/-) (A) adhärierten und (B) breiteten sich auf FN geringer aus als WT-MMZ (WT). WT- und
α8-/--VSMZ zeigten keine signifikanten Unterschiede in der (C) Adhäsion und in der (D) Ausbreitung. Die
transiente Herunterregulation von α8-Integrin in RMZ (si itga8) führte auf FN zu verminderter (E) Adhäsion
und (F) Ausbreitung im Vergleich zu si Ko RMZ (si Ko). Adhärente Zellen wurden mit HE angefärbt,
gezählt und prozentual gegen die Gesamtzahl ausgesäter Zellen ausgewertet. Die prozentuale Auswertung
ausgebreiteter Zellen erfolgte im gleichen Versuchsansatz. (n=4, * p< 0,05 vs. WT-MMZ bzw. si Ko).
2.7.2 Einfluss von α8-Integrin auf Migration
In vitro wurde der Einfluss von mangelnder α8-Integrin Expression auf die Migration der
zu untersuchenden Zellen mittels dreier Methoden, des Wundheilungstests, des Barriere-
Assays [130] und des Boydenkammer Assays untersucht.
Ergebnisse
37
2.7.2.1 Migration im Wundheilungstest (Scratch Assay)
Um das Wanderungsverhalten von MMZ zu beobachten, wurden die Zellen auf
unbeschichtete 6cm Petrischalen konfluent ausgesät. Mittels einer gelben Pipettenspitze
wurde ein Kratzer durch den Zellrasen gezogen (“Scratchen“). Zum Zeitpunkt 0h sowie
nach 4h, 19h, 27h und 48h wurde der Spalt an zuvor markierten Stellen fotografiert.
Nach dem Verletzen des Monolayers war zu Beginn des Versuches (0h) ein klar definierter
Spaltrand zu erkennen. Nach 4h waren bereits mehr WT-MMZ als α8-/--MMZ in den Spalt
eingewandert. Nach 19h Versuchszeit kehrte sich diese Beobachtung um. Nach 48h waren
α8-/--MMZ konfluent gewachsen, während bei WT-MMZ noch ein restlicher Spalt zu
erkennen war (Abb. 19).
Abb. 19: Migration im Wundheilungstest.
Beispielhafte Fotos des zur Einwanderung der Zellen in den durch „Scratchen“ hergestellten Spalts im
konfluenten Zellrasen. Nach dem Versuchsende (48h) war der Zellrasen mit (B) α8-/--MMZ wieder konfluent
geschlossen, während im Ansatz mit (A) WT-MMZ noch ein restlicher Spalt zu erkennen war. In der oberen
Reihe sind die Spaltränder der WT-MMZ und in der unteren Reihe die der α8-/--MMZ abgebildet. Die Fotos
wurden bei 10-facher Vergrößerung lichtmikroskopisch aufgenommen.
Wir konnten nicht eindeutig feststellen, ob die zu einem späteren Zeitpunkt vermehrte
Migration der α8-/--MMZ wirklich allein auf den Mangel von α8-Integrin zurückzuführen
war. Zum einen konnte der Anteil an proliferierenden Zellen nicht bestimmt werden und
zum anderen war die Spaltgröße zu Versuchsbeginn nicht immer gleich. Zudem kann beim
Scratch Assay die Matrix-Beschichtung durch das Ritzen des Zellrasens mit einer
Ergebnisse
38
Pipettenspitze zerstört und somit die matrixabhängige Wanderung der Zellen verfälscht
werden. Die Unversehrtheit der Matrix-Beschichtung sowie eine genormte Spaltbreite
konnte durch die Verwendung des Barriere-Assays gewährleistet werden [130].
2.7.2.2 Migration im Barriere-Assay
Auf FN und auf Col I beschichteten 6cm Petrischalen und auf PL wurde durch eine
Barriere in konfluent ausgesäten MMZ bzw. mit siRNA transfizierten RMZ ein Spalt
freigehalten, der eine lichtmikroskopische und fotografische Auswertung (0h, 24h und
48h) von eingewanderten Zellen zuließ. Anschließend wurde ein BrdU-Assay
durchgeführt, um proliferierende Zellen prozentual zu bestimmen. Somit sollte abgeschätzt
werden, wie groß der Anteil der proliferierenden Zellen an der Gesamtzahl der sich im
Spalt befindenden Zellen war. Ein Ziel dieser Methode war, die Migrations- und
Proliferationseffekte zu trennen. Unabhängig von der Beschichtung der Kulturschalen
waren im Spalt nach 48h Migrationszeit tendenziell mehr α8-/--MMZ zu erkennen als im
vergleichenden Ansatz des WT-Phänotyps. Hierfür lag aber kein signifikanter Unterschied
vor (Abb. 20 (A)). Auf Col I und auf PL waren bezüglich si Ko-RMZ 48h nach der
Transfektion signifikant vermehrt si itga8 RMZ in den Spalt eingewandert. Auf FN konnte
kein Unterschied bestimmt werden (Abb. 20 (B)). Die Proliferation der Zellen wurde
mittels BrdU-Assay nach 48h Migration bestimmt. Hierzu wurde in den letzten 2 Stunden
des Migrationsversuches BrdU (1:1000) in das Medium dazugegeben. α8-/--MMZ
proliferierten auf Col I und FN mehr als WT-MMZ (Abb. 20 (C)). Auf PL konnte dagegen
ein tendenziell vermindertes Wachstumsverhalten beobachtet werden. Si itga8 RMZ
proliferierten in der Barriere auf FN und auf PL schneller als RMZ mit si Ko RNA
behandelt. Auf Col I konnte keine signifikante Veränderung im Proliferationsverhalten
bestimmt werden (Abb. 20 (D)).
Ergebnisse
39
020406080
100120
si Ko si itga8 si Ko si itga8 si Ko si itga8
Col I FN PL
Mig
ratio
n (%
)0
20406080
100120
si Ko si itga8 si Ko si itga8 si Ko si itga8
Col I FN PL
Prol
ifera
tion
(%)
**
(D) si RMZ Barriere Proliferation
* *
(B) si RMZ Barriere Migration
020406080
100120
WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-
Col I FN PL
Prol
ifera
tion
(%)
*
(C) MMZ Barriere Proliferation
020406080
100120
WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-
Col I FN PL
Mig
ratio
n (%
)(A) MMZ Barriere Migration
020406080
100120
si Ko si itga8 si Ko si itga8 si Ko si itga8
Col I FN PL
Mig
ratio
n (%
)
020406080
100120
si Ko si itga8 si Ko si itga8 si Ko si itga8
Col I FN PL
Mig
ratio
n (%
)0
20406080
100120
si Ko si itga8 si Ko si itga8 si Ko si itga8
Col I FN PL
Prol
ifera
tion
(%)
**
(D) si RMZ Barriere Proliferation
020406080
100120
si Ko si itga8 si Ko si itga8 si Ko si itga8
Col I FN PL
Prol
ifera
tion
(%)
**
020406080
100120
si Ko si itga8 si Ko si itga8 si Ko si itga8
Col I FN PL
Prol
ifera
tion
(%)
**
(D) si RMZ Barriere Proliferation
* *
(B) si RMZ Barriere Migration
* *
(B) si RMZ Barriere Migration
020406080
100120
WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-
Col I FN PL
Prol
ifera
tion
(%)
*
(C) MMZ Barriere Proliferation
020406080
100120
WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-
Col I FN PL
Prol
ifera
tion
(%)
*
020406080
100120
WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-
Col I FN PL
Prol
ifera
tion
(%)
*
(C) MMZ Barriere Proliferation
020406080
100120
WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-
Col I FN PL
Mig
ratio
n (%
)(A) MMZ Barriere Migration
Abb. 20: Migration im Barriere-Assay.
Grafische Darstellung der migrierenden (A) WT- und α8-/--MMZ und (B) si Ko- und si itga8 transfizierten
RMZ. Der prozentuale Anteil an proliferierenden Zellen, die sich nach dem Versuchsende (48h) im Spalt
befanden, wurden grafisch für (C) MMZ und (D) si RMZ dargestellt. Mittels MetaVue wurde die Spaltfläche
vermessen und die Spaltbreite nach einer 48-stündigen Versuchszeit berechnet. Die Differenz zwischen der
Spaltbreite nach Versuchsende (48h) und der Spaltbreite zu Versuchsbeginn (0h) wurde bestimmt. Je größer
die Differenz der Spaltbreite, umso mehr Zellen befanden sich im Spalt. Der prozentuale Differenzwert
wurde berechnet und auf der Y-Achse dargestellt. (n=3, * p< 0,05 vs. WT bzw. si Ko). WT = WT-MMZ; α8-/-
= α8-/--MMZ; si Ko = si Ko RMZ; si itga8 = si itga8 RMZ.
Wie anhand der Grafiken (Abb. 20) deutlich wird, nahmen die proliferierenden Zellen nach
der 48-stündigen Versuchszeit einen großen Anteil an den im „Spalt“ befindlichen Zellen
ein. Somit eignete sich diese Methode nur eingeschränkt, um das migratorische Verhalten
der MMZ und RMZ zu bestimmen. Um eine sichere Aussage über das
Wanderungsvermögen der Zellen zu erhalten, musste eine Methode mit einer deutlich
kürzeren Versuchszeit gewählt werden, um Proliferationseffekte ausschließen zu können.
2.7.2.3 Migration in der Boydenkammer (Boyden Chamber Assay)
In der Boydenkammer wandern die Zellen chemotaktisch durch eine Membran in Richtung
des Attraktans. Für den Versuchsansatz wurden Col I (30µg/ml) und FN (40µg/ml) als
Ergebnisse
40
Attraktantien verwendet und in die Vertiefungen der unteren Kammer vorgelegt.
Chemotaxismedium (Ko) wurde als Negativkontrolle mitgeführt. Bei Verwendung von FN
als Attraktans, migrierten α8-/--MMZ mehr als WT-MMZ. Für Col I und die Ko konnte
keine erhöhte Migrationsrate der α8-/--MMZ gegenüber den WT-MMZ bestimmt werden,
wobei MMZ insgesamt auf Col I wesentlich geringer migrierten als auf FN (Abb. 21 (A)).
FN stimulierte α8-/--VSMZ zu einer signifikant höheren Migrationsrate als WT-VSMZ.
Col I übte auf VSMZ im Vergleich zum α8-Integrin Liganden FN eine deutlich geringere
chemotaxische Wirkung aus. Für α8-/-- und WT-VSMZ konnte auf Col I kein signifikanter
Unterschied protokolliert werden. (Abb. 21 (B)).
020406080
100120
WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-
Col I FN Ko
Mig
ratio
n (%
)
*
(A) MMZ
020406080
100120
WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-
Col I FN Ko
Mig
ratio
n (%
)*
(B) VSMZ
020406080
100120
WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-
Col I FN Ko
Mig
ratio
n (%
)
*
020406080
100120
WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-
Col I FN Ko
Mig
ratio
n (%
)
*
(A) MMZ
020406080
100120
WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-
Col I FN Ko
Mig
ratio
n (%
)*
020406080
100120
WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-
Col I FN Ko
Mig
ratio
n (%
)*
(B) VSMZ
Abb. 21: Migration in der Boydenkammer.
Auf FN wanderten sowohl die (A) α8-/--MMZ (α8-/-) als auch die (B) α8-/--VSMZ (α8-/-) signifikant mehr als
die jeweiligen WT-Zellen (WT). Auf Col I konnte weder für (A) MMZ noch für (B) VSMZ ein signifikanter
Unterschied im Wanderungsverhalten beobachtet werden. Vergleichende Analyse der migrierenden (A) WT-
und α8-/--MMZ und (B) WT- und α8-/--VSMZ. FN und Col I wurden als Attraktans verwendet. Ko steht für
die Verwendung des Chemotaxismediums ohne Zugabe von Attraktantien und wurde als Negativkontrolle
verwendet. Pro Ansatz wurden Tripletts angelegt, je drei Gesichtsfelder ausgezählt und prozentual auf der Y-
Achse dargestellt. (n=3, * p< 0,05 vs. WT).
2.7.3 Einfluss von α8-Integrin auf das Zellüberleben
Da Integrine auf die Apoptose von Zellen modulierend einwirken können [39], wurde in
den folgenden Versuchen in MMZ und VSMZ Apoptose mittels Serumentzug (D0) oder
cis-Platin Gabe ausgelöst, um herauszufinden, ob und inwieweit das Zellüberleben von α8-
Integrin abhängig ist.
Ergebnisse
41
2.7.3.1 Apoptose im Caspase-3 Assay
Die Aktivierung der Effektorcaspase-3 gilt als ein früher Marker des programmierten
Zelltodes. Der Caspase-3-Assay stellt eine Methode dar, mit deren Hilfe die Aktivität der
Caspase-3 gemessen werden kann. In Bezug zu unstimulierten Kontrollen (Ko) wiesen
sowohl WT- als auch α8-/--MMZ nach Apoptosestimulation mit 50µM cis-Platin (50µM)
auf allen Matrices eine signifikant höhere Apoptoserate auf (mit * markiert). Dabei zeigten
stimulierte WT-MMZ auf FN einen ca. 10-fachen und auf PL einen über 6-fachen
signifikanten Anstieg der Caspase-3-Aktivität im Vergleich zur Ko (Abb. 22 (A)).
Bezüglich stimulierter WT-MMZ konnte auf FN und auf PL mittels cis-Platin in α8-/--
MMZ eine signifikant geringere Apoptoserate induziert werden (mit # markiert). Dagegen
war auf Col I kein Unterschied zwischen stimulierten WT- und α8-/--MMZ festzustellen
(Abb. 22 (A)). Diese Ergebnisse konnten mit serumfreiem Medium (D0) als
Apoptosestimulans reproduziert werden. Auch erste Untersuchungen mit si RMZ zeigten
aufgrund der Herunterregulation der α8-Integrin Expression auf FN eine geringere
Apoptoserate. Caspase-3-Aktivitäts-Messungen in VSMZ erfolgten mit cis-Platin in zwei
Konzentrationen (50µM und 100µM). Wie auch in MMZ führte die Stimulation sowohl
der WT- als auch der α8-/--VSMZ im Vergleich zur unstimulierten Ko zu einer signifikant
vermehrten Apoptose (mit * markiert). Aber im Gegensatz zu MMZ konnte in der
Apoptoserate zwischen stimulierten WT- und α8-/--VSMZ kein Unterschied detektiert
werden (Abb. 22 (B)). Die Ergebnisse der Stimulation mit 50µM und 100µM cis-Platin
waren vergleichbar (Daten mit 100µM cis-Platin werden nicht gezeigt).
Ergebnisse
42
(B) VSMZ
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM
WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-
Cas
pase
-3-A
ktiv
ität
Col I PLFN
**
* ** *
(A) MMZ
Col I PLFN
0
5000
10000
15000
20000
25000
Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM
WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-
Casp
ase-
3- A
ktiv
ität
*
*
* * * *
# #
(B) VSMZ
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM
WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-
Cas
pase
-3-A
ktiv
ität
Col I PLFN
**
* ** *
(B) VSMZ
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM
WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-
Cas
pase
-3-A
ktiv
ität
Col I PLFN
**
* ** *
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM
WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-
Cas
pase
-3-A
ktiv
ität
Col I PLFN
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM
WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-
Cas
pase
-3-A
ktiv
ität
Col I PLFNCol I PLFN
**
* ** *
(A) MMZ
Col I PLFN
0
5000
10000
15000
20000
25000
Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM
WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-
Casp
ase-
3- A
ktiv
ität
*
*
* * * *
# #
(A) MMZ
Col I PLFN
0
5000
10000
15000
20000
25000
Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM
WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-
Casp
ase-
3- A
ktiv
ität
*
*
* * * *
# #
Col I PLFN
0
5000
10000
15000
20000
25000
Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM
WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-
Casp
ase-
3- A
ktiv
ität
Col I PLFNCol I PLFN
0
5000
10000
15000
20000
25000
Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM
WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-
Casp
ase-
3- A
ktiv
ität
*
*
* * * *
# #
Abb. 22: Apoptose im Caspase-3 Assay.
Sowohl in (A) MMZ als auch in (B) VSMZ führte die Stimulation mit 50µm cis-Platin zu einem
signifikanten Anstieg der Apoptoserate (mit * markiert). (A) Im Vergleich zu stimulierten WT-MMZ (WT)
führte der Mangel an α8-Integrin in stimulierten MMZ (α8-/-) sowohl auf FN als auch auf PL zu einem
signifikant besseren Zellüberleben (mit # markiert). (B) Stimulierte WT-VSMZ zeigten im Vergleich zu
stimulierten α8-/--VSMZ keinen Unterschied im Zellüberleben. (A) WT- und α8-/--MMZ sowie (B) WT- und
α8-/--VSMZ wurden auf FN (40µg/ml), Col I (30µg/ml) und auf PL mittels 50µM cis-Platin (50µM) zur
Apoptose stimuliert. Zellen, die nicht mit einem Apoptosestimulans behandelt wurden, dienten als Kontrolle
(Ko). (n=3, * p< 0,05 vs. unstimulierte Ko; # p< 0,05 vs. stimulierte WT-MMZ).
2.7.3.2 Hoechst-Apoptoseassay
Durch das Anfärben von Chromatin mittels Hoechstfarbstoff konnten die MMZ ermittelt
werden, die sich im Spätstadium des programmierten Zelltodes befanden.
Ergebnisse
43
Abb. 23: Hoechstfärbung nach cis-Platin Behandlung.
Die Fotos zeigen beispielhaft WT- und α8-/--MMZ auf FN ausgesät und durch 50µM cis-Platin in die
Apoptose überführt. In den mit einem weißen Pfeil (beispielhaft) gekennzeichneten Zellkernen liegt das
Chromatin kondensiert vor und stellt damit ein spätes Stadium des programmierten Zelltodes dar. Die Bilder
wurden in 100-facher Vergrößerung aufgenommen.
Hierbei konnten die erhobenen Befunde aus dem Caspase-Assay für MMZ wie in Kapitel
2.7.3.1 beschrieben (Abb. 22) mit dem Hoechst-Assay bestätigt werden. So zeigten alle
untersuchten Zellen nach der Stimulation mit 50µM cis-Platin eine erhöhte Apoptose im
Vergleich zur unstimulierten Kontrollansatz (mit * markiert). Sowohl auf FN als auch auf
PL zeigten stimulierte α8-/--MMZ bezüglich stimulierter WT-MMZ ein geringeres
Zellsterben (mit # markiert). Auf Col I konnte kein signifikanter Unterschied in der
Apoptoserate zwischen stimulierten WT- und stimulierten α8-/--MMZ bestimmt werden
(Abb. 24).
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM
WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-
Apo
ptos
e (%
)
Col I PLFN
* *
*
*
*
#
*
#
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM
WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-
Apo
ptos
e (%
)
Col I PLFN
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM Ko 50µM
WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-
Apo
ptos
e (%
)
Col I PLFNCol I PLFN
* *
*
*
*
#
*
#
*
#
*
#
Ergebnisse
44
Abb. 24: Hoechst-Apoptoseassay.
α8-/--MMZ (α8-/-) auf FN und auf PL wiesen im Vergleich zu WT-MMZ (WT) ein erhöhtes Zellüberleben
auf. Grafische Darstellung des prozentualen Anteils an apoptotischen Zellen im Bezug auf die Gesamtzahl
der Zellen (Y-Achse). Die Zellen wurden mit cis-Platin (50µM) zur Apoptose stimuliert. Pro Ansatz wurden
3 Gesichtsfelder und jeweils 500 Zellen gezählt. Die Untersuchung erfolgte mit den Matrixmolekülen FN
und Col I, sowie auf unbeschichteten Kulturschalen (PL). (n=4, * p< 0,05 vs. unstimulierte Ko; # p< 0,05 vs.
stimulierte WT-MMZ).
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass in WT-MMZ die Apoptose stärker induziert
werden konnte als in MMZ, denen α8-Integrin dauerhaft fehlte (α8-/--MMZ). Hierbei
spielte es keine Rolle, ob die Zellen auf PL oder auf FN gewachsen waren. Col I bildete
eine Ausnahme, denn in beiden Methoden war die Induzierbarkeit der WT- und α8-/--
Zellen etwa gleich groß. Für VSMZ konnte keine veränderte Induzierbarkeit der Apoptose
in Abhängigkeit der Matrices oder α8-Integrin nachgewiesen werden.
2.7.4 Einfluss von α8-Integrin auf das Wachstumsverhalten von Zellen
Integrine sind als Oberflächenrezeptoren u.a. an der Proliferation und Migration von
VSMZ beteiligt [31]. Im Verlauf von entzündlichen glomerulären Erkrankungen spielt die
Proliferation neben der Adhäsion von MZ eine wesentliche Rolle [12]. Inwieweit dabei das
α8-Integrin eine regulatorische Funktion einnimmt, sollte durch den Vergleich der
Proliferation von WT- und α8-/--Zellen auf verschiedenen Matrixproteinen im BrdU-Assay
durch Stimulation mit 10% FCS untersucht werden. Unabhängig von der Existenz von α8-
Integrin, zeigten Zellen auf PL keinen Unterschied im Wachstumsverhalten (Abb. 25).
Dagegen wuchsen α8-/--MMZ auf Col I tendenziell etwas geringer als WT-MMZ. α8-/--
MMZ auf FN wiesen dagegen gegenüber WT-MMZ eine signifikante Steigerung der
Proliferationsrate um 20% auf (Abb. 25 (A)). Im Vergleich zu WT-VSMZ konnte für α8-/--
VSMZ auf Col I ebenfalls ein geringeres Wachstum protokolliert werden. Auf FN und auf
PL zeigte die Proliferationsrate von α8-/--VSMZ und WT-VSMZ keinen nennenswerten
Unterschied (Abb. 25 (B)). Auf FN zeigten si itga8 RMZ (si itga8) gegenüber si Ko RNA
(si Ko) eine verminderte Proliferation. Auf PL und auf Col I dagegen ergab sich kein
signifikanter Unterschied (Abb. 25 (C)).
Ergebnisse
45
020406080
100120
si Ko si itga8 si Ko si itga8 si Ko si itga8
Col I FN PL
Prol
ifera
tion
(%)
*
(C) si RMZ
(A) MMZ
0204060
80100120
WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-
Col I FN PL
Prol
ifera
tion
(%)
*
0
20
40
60
80
100
120
WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-
Col I FN PL
Prol
ifera
tion
(%)
(B) VSMZ
*
020406080
100120
si Ko si itga8 si Ko si itga8 si Ko si itga8
Col I FN PL
Prol
ifera
tion
(%)
*
(C) si RMZ
(A) MMZ
0204060
80100120
WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-
Col I FN PL
Prol
ifera
tion
(%)
*
0
20
40
60
80
100
120
WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-
Col I FN PL
Prol
ifera
tion
(%)
(B) VSMZ
0
20
40
60
80
100
120
WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-
Col I FN PL
Prol
ifera
tion
(%)
(B) VSMZ
*
Abb. 25: Proliferationsassay.
(A) WT- und α8-/--MMZ, (B) WT- und α8-/--VSMZ und (C) RMZ mit Ko (si Ko) und α8-Integrin siRNA (si
itga8) behandelt, wurden hinsichtlich ihres Wachstumsverhaltens auf verschiedenen Matrixproteinen
untersucht. Im Vergleich zu WT-Zellen führte der Mangel an α8-Integrin auf FN zu einer erhöhten
Proliferation der (A) MMZ, zu einer geringeren Proliferation der (C) si itga8 RMZ und bis auf Col I zu
keinem veränderten Wachstumsverhalten der (B) VSMZ. Mit Hilfe des Einbaus von BrdU in die DNA
wurden proliferierende Zellen von nicht proliferierenden Zellen unterschieden. Der prozentuale Anteil wurde
berechnet und auf der Y–Achse dargestellt. Die Stimulation erfolgte mit 10% FCS. (n=4, * p< 0,05 vs. WT
bzw. si Ko). WT = (A) WT-MMZ bzw. (B) WT-VSMZ; α8-/- = (A) α8-/--MMZ bzw. (B) α8-/--VSMZ; si Ko = si
Ko RMZ; si itga8 = si itga8 RMZ.
Ergebnisse
46
2.8 Untersuchungen zur Interaktion von α8-Integrin mit seinem
potentiellen Liganden Fibrillin
Integrine, die zu der Gruppe der RGD-spezifischen Rezeptoren gehören, interagieren mit
ihren Matrixmolekülen ausschließlich über eine bestimmte Bindesequenz, dem RGD (Arg-
Gly-Asp)-Motiv [38]. Eine RGD-Bindestelle ist auch im Fibrillinmolekül vorzufinden. Es
ist bekannt, dass die Zelladhäsion an Fibrillin-1 mit αvβ3-Integrin über das RGD-Motiv
vermittelt werden kann [107]. Inwieweit α8β1-Integrin mit Fibrillin überhaupt interagiert,
und ob diese Interaktion über die RGD-Sequenz verläuft, war bisher noch ungeklärt und
war Gegenstand der folgenden Untersuchungen.Zwei Fibrillinfragmente, rF6H mit der
RGD-Bindesequenz und rF16 ohne Bindesequenz (Abb. 26), wurden für die folgenden
Untersuchungen in der Konzentration 15µg/ml eingesetzt.
Abb. 26: Schematische Darstellung des Fibrillin-1 Proteins und seiner Fragmente.
rF6H beinhaltet die einzige RGD-Bindestelle (*), die Fibrillin-1 besitzt. Die Fragmente rF16 und rF6H
decken die Aminosäuresequenz des Gesamtmoleküls Fibrillin-1 ab. (aus Porst M., et al., 2006 [112],
modifiziert nach Reinhardt D. P. et al., 1996 [131] und Jensen S. A., 2001 [132]).
2.8.1 Adhäsions- und Ausbreitungsassays
MMZ und VSMZ wurden auf Fibrillinfragmenten-beschichteten Platten ausgesät und
Adhäsion und Ausbreitung in Abhängigkeit von RGD-Bindesequenz und α8-Integrin
Expression studiert. Als Negativkontrolle wurde 2%iges BSA eingesetzt und im
Versuchsansatz mitgeführt. Sowohl MMZ, VSMZ als auch si RMZ zeigten unabhängig
von der Anwesenheit des α8-Integrins auf dem rF16-Fragment eine signifikant geringere
Adhäsion und Ausbreitung als auf dem Fibrillinfragment mit der RGD-Bindesequenz
(rF6H) mit # markiert). Wurden α8-/--MMZ mit WT-MMZ verglichen, so adhärierten und
breiteten sie sich sowohl auf rF6H als auch auf rF16 signifikant geringer aus (mit *
markiert) (Abb. 27 (A) und (B)). Im Vergleich zu WT-VSMZ führte der Mangel an α8-
Ergebnisse
47
Integrin in VSMZ zu keiner signifikanten Veränderung der Adhäsion (Abb. 27 (C)). Auf
rF16 zeigten α8-/--VSMZ gegenüber WT-VSMZ eine signifikant geringere Ausbreitung
(mit * markiert), während auf rF6H keine signifikanten Unterschiede beobachtet werden
konnten (Abb. 27 (D)). In Bezug zu si Ko RMZ wiesen si itga8 RMZ auf dem rF16-
Fragment eine signifikant geringere Adhäsion und Ausbreitung auf als auf rF6H (mit *
markiert) (Abb. 27 (E) und (F)).
020406080
100120
WT α8-/- WT α8-/-
rF6H rF16
Adh
äsio
n(%
)
*
*
(A) MMZ
#
#
020406080
100120
WT α8-/- WT α8-/-
rF6H rF16A
usbr
eitu
ng (%
)
**
(B) MMZ
#
#
020406080
100120
si Ko si itga8 si Ko si itga8
rF6H rF16
Adhä
sion
(%)
##
*
(E) si RMZ
020406080
100120
si Ko si itga8 si Ko si itga8
rF6H rF16
Aus
brei
tung
(%)
*
# #
(F) si RMZ
(D) VSMZ
020406080
100120
WT α8-/- WT α8-/-
rF6H rF16
Adh
äsio
n (%
)
# #
(C) VSMZ
020406080
100120
WT α8-/- WT α8-/-
rF6H rF16
Aus
brei
tung
(%)
#
#
*
020406080
100120
WT α8-/- WT α8-/-
rF6H rF16
Adh
äsio
n(%
)
*
*
(A) MMZ
#
#
020406080
100120
WT α8-/- WT α8-/-
rF6H rF16A
usbr
eitu
ng (%
)
**
(B) MMZ
#
#
020406080
100120
WT α8-/- WT α8-/-
rF6H rF16
Adh
äsio
n(%
)
*
*
(A) MMZ
#
#
020406080
100120
WT α8-/- WT α8-/-
rF6H rF16
Adh
äsio
n(%
)
*
*
(A) MMZ
020406080
100120
WT α8-/- WT α8-/-
rF6H rF16
Adh
äsio
n(%
)
*
*0
20406080
100120
WT α8-/- WT α8-/-
rF6H rF16
Adh
äsio
n(%
)
*
*
(A) MMZ
#
#
020406080
100120
WT α8-/- WT α8-/-
rF6H rF16A
usbr
eitu
ng (%
)
**
(B) MMZ
#
#
020406080
100120
WT α8-/- WT α8-/-
rF6H rF16A
usbr
eitu
ng (%
)
**
(B) MMZ
020406080
100120
WT α8-/- WT α8-/-
rF6H rF16A
usbr
eitu
ng (%
)
**
020406080
100120
WT α8-/- WT α8-/-
rF6H rF16A
usbr
eitu
ng (%
)
**
(B) MMZ
#
#
020406080
100120
si Ko si itga8 si Ko si itga8
rF6H rF16
Adhä
sion
(%)
##
*
(E) si RMZ
020406080
100120
si Ko si itga8 si Ko si itga8
rF6H rF16
Aus
brei
tung
(%)
*
# #
(F) si RMZ
020406080
100120
si Ko si itga8 si Ko si itga8
rF6H rF16
Adhä
sion
(%)
##
*
(E) si RMZ
020406080
100120
si Ko si itga8 si Ko si itga8
rF6H rF16
Adhä
sion
(%)
##
*
020406080
100120
si Ko si itga8 si Ko si itga8
rF6H rF16
Adhä
sion
(%)
##
*
(E) si RMZ
020406080
100120
si Ko si itga8 si Ko si itga8
rF6H rF16
Aus
brei
tung
(%)
*
# #
(F) si RMZ
020406080
100120
si Ko si itga8 si Ko si itga8
rF6H rF16
Aus
brei
tung
(%)
*
# #0
20406080
100120
si Ko si itga8 si Ko si itga8
rF6H rF16
Aus
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tung
(%)
*
# #
(F) si RMZ
(D) VSMZ
020406080
100120
WT α8-/- WT α8-/-
rF6H rF16
Adh
äsio
n (%
)
# #
(C) VSMZ
020406080
100120
WT α8-/- WT α8-/-
rF6H rF16
Aus
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(%)
#
#
*
(D) VSMZ
020406080
100120
WT α8-/- WT α8-/-
rF6H rF16
Adh
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n (%
)
# #
(C) VSMZ
020406080
100120
WT α8-/- WT α8-/-
rF6H rF16
Aus
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#
#
*0
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100120
WT α8-/- WT α8-/-
rF6H rF16
Adh
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n (%
)
# #
(C) VSMZ
020406080
100120
WT α8-/- WT α8-/-
rF6H rF16
Adh
äsio
n (%
)
# #
020406080
100120
WT α8-/- WT α8-/-
rF6H rF16
Adh
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n (%
)
# #
(C) VSMZ
020406080
100120
WT α8-/- WT α8-/-
rF6H rF16
Aus
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(%)
#
#
*0
20406080
100120
WT α8-/- WT α8-/-
rF6H rF16
Aus
brei
tung
(%)
#
#
020406080
100120
WT α8-/- WT α8-/-
rF6H rF16
Aus
brei
tung
(%)
#
#
*
Abb. 27: Adhäsions- und Ausbreitungsassay auf Fibrillinfragmenten.
Auf dem Fibrillinfragment ohne RGD-Bindesequenz (rF16) adhärieren und breiten sich MMZ, VSMZ und
siRNA behandelte RMZ geringer aus als auf dem Fragment mit RGD-Motiv (rF6H) (mit # markiert). Die
Zellen wurden in rF6H- und rF16-beschichteten 8-Kammer Objektträgern 1h adhärieren gelassen. Mit einer
parallel laufenden Real-Time-RT-PCR wurde verifiziert, dass die Herunterregulation von α8-Integrin durch
siRNA erfolgreich durchgeführt wurde. (n=3; * p< 0,05 vs. WT-Zellen bzw. si Ko RMZ; # p< 0,05 vs. auf
rF6H ausgesäten Zellen). WT = (A) und (B) WT-MMZ bzw. (C) und (D) WT-VSMZ; α8-/- = (A) und (B) α8-/--
MMZ bzw. (C) und (D) α8-/--VSMZ; si Ko = si Ko RMZ; si itga8 = si itga8 RMZ.
Ergebnisse
48
Zusammengefasst konnte damit gezeigt werden, dass das Vorhandensein sowohl des α8-
Integrins als auch des RGD–Bindemotivs die Adhäsion und Ausbreitung von MZ auf dem
Matrixprotein Fibrillin beeinflussen kann. Für VSMZ scheint dagegen weniger α8-Integrin
als die RGD-Bindesequenz eine essentielle Rolle in der Adhäsion und Ausbreitung
einzunehmen.
2.8.2 Adhäsionsassay mit cRGD-Peptiden
Anhand des vorherigen Versuchsaufbaues konnte nicht eindeutig nachgewiesen werden, ob
α8-Integrin direkt bei der RGD-vermittelten Interaktion in den MZ eine essentielle Rolle
spielt (Abb. 27). Um diesen Aspekt noch näher zu untersuchen, wurden WT- und α8-/--
MMZ mit cyclischen RGD-Peptiden (cRGD) inkubiert und auf Vitronektin (VN) und
Fibrillinfragmenten ausgesät. Cyclische RGD-Peptide blockieren spezifisch den αvβ3-
Integrinrezeptor (RGDdFV-Peptid, kurz cRGD) [133, 134] und erlauben somit die
Erforschung der Zelladhäsion unter Ausschluss des αvβ3-Integrins vermittelten Beitrags
zur Zelladhäsion. αvβ3-Integrin ist ein Adhäsionsrezeptor von VN, FN und Fibrillin-1,
dessen Bindung über die RGD-Sequenz dieser Matrixmoleküle vermittelt wird. Deshalb
wurden zur Kontrolle zunächst die zuvor mit cRGD behandelten Zellen auf VN
beschichtete Platten ausgesät. Die Adhäsion von WT- und α8-/--MMZ war auf VN nach
der Behandlung mit dem Kontrollpeptid, einem durch einen Aminosäureaustausch des
cRGD nicht blockierenden cyclischen Peptid (cRADdFV-Peptid, kurz cRAD), unverändert
gleich hoch. Mit zunehmender cRGD Konzentration (5µM bis 250µM) sank, sowohl in
WT- als auch in α8-/--MMZ, die Anhaftungsrate bis auf einen basalen Wert. WT- und α8-/--
MMZ wurden vergleichbar stark durch das blockierende cRGD-Peptid in ihrer Adhäsion
an VN gehemmt (Abb. 28).
Ergebnisse
49
0
20
40
60
80
100
120
5µM 50µM 250µM 5µM 50µM 250µM
cRGD cRAD
Adh
äsio
n (%
)
(B) α8-/--MMZ auf Vitronektin mit cRGD
0
20
40
60
80
100
120
5µM 50µM 250µM 5µM 50µM 250µM
cRGD cRAD
Adh
äsio
n (%
)
(A) WT-MMZ auf Vitronektin mit cRGD
0
20
40
60
80
100
120
5µM 50µM 250µM 5µM 50µM 250µM
cRGD cRAD
Adh
äsio
n (%
)
(B) α8-/--MMZ auf Vitronektin mit cRGD
0
20
40
60
80
100
120
5µM 50µM 250µM 5µM 50µM 250µM
cRGD cRAD
Adh
äsio
n (%
)
(A) WT-MMZ auf Vitronektin mit cRGD
Abb. 28: Adhäsionsassay auf Vitronektin mit cRGD-Peptiden.
WT- und α8-/--MMZ wurden auf Vitronektin (VN) ausgesät und der prozentuale Anteil an adhärenten Zellen
im Vergleich nach cRAD- und cRGD-Behandlung bestimmt. In direkter Abhängigkeit der cRGD-Dosis
adhärierten sowohl (A) WT- als auch (B) α8-/--MMZ geringer. Die Zellen wurden zuvor mit cyclischen
Peptiden in steigender Konzentration (5µM-250µM) inkubiert. cRGD ist ein αvβ3-Integrin blockierendes
cyclisches RGDdFV-Peptid. cRADdFV (cRAD) wurde als Kontrollpeptid verwendet. (n=3).
Es folgten Untersuchungen mit cRGD-Peptid behandelten WT- und α8-/--MMZ, die auf
dem Fibrillinfragment rF6H ausgesät wurden. Es zeigte sich, dass ähnlich dem Verhalten
der mit cRGD-Peptid behandelten Zellen auf VN, mit steigender Peptidkonzentration
(3,125µM bis 50µM) eine kontinuierliche Abnahme sowohl der adhärenten WT- als auch
α8-/--MMZ zu beobachten war. Der Prozentsatz der adhärenten Zellen war nach
Behandlung mit cRGD geringer als nach Behandlung mit dem Kontrollpeptid (cRAD). Es
konnte kein signifikanter Unterschied zwischen der Adhäsion von WT-MMZ und von α8-/-
-MMZ nachgewiesen werden (Abb. 29).
Ergebnisse
50
020406080
100120140
3,12
5µM
6,25
µM
12,5
µM
50µM
3,12
5µM
6,25
µM
12,5
µM
50µM
cRGD cRAD
Adh
äsio
n (%
)
(A) WT-MMZ auf Fibrillinfragmente mit cRGD
020406080
100120140
3,12
5µM
6,25
µM
12,5
µM
50µM
3,12
5µM
6,25
µM
12,5
µM
50µM
cRGD cRAD
Adh
äsio
n (%
)
(B) α8-/--MMZ auf Fibrillinfragmente mit cRGD
020406080
100120140
3,12
5µM
6,25
µM
12,5
µM
50µM
3,12
5µM
6,25
µM
12,5
µM
50µM
cRGD cRAD
Adh
äsio
n (%
)
(A) WT-MMZ auf Fibrillinfragmente mit cRGD
020406080
100120140
3,12
5µM
6,25
µM
12,5
µM
50µM
3,12
5µM
6,25
µM
12,5
µM
50µM
cRGD cRAD
Adh
äsio
n (%
)
(B) α8-/--MMZ auf Fibrillinfragmente mit cRGD
Abb. 29: Adhäsionsassay auf Fibrillin mit cRGD-Peptiden.
WT- und α8-/--MMZ wurden auf RGD-haltigen Fibrillinfragmenten (rF6H) ausgesät und der prozentuale
Anteil an adhärenten Zellen im Vergleich zu cRAD- und cRGD-Behandlung bestimmt. In direkter
Abhängigkeit der cRGD-Dosis adhärierten sowohl (A) WT- als auch (B) α8-/--MMZ geringer. Die Zellen
wurden zuvor mit cyclischen Peptiden in steigender Konzentration (3,125µM-50µM) inkubiert. cRGD ist ein
αvβ3-Integrin blockierendes cyclisches RGDdFV-Peptid. cRADdFV (cRAD) wurde als Kontrollpeptid
verwendet. (n=3).
2.9 Expression potentiell kompensatorischer Integrine
2.9.1 Bestimmung der RNA-Expression potentiell kompensatorischer Integrine
Obwohl α8-Integrin sowohl in MZ als auch in VSMZ exprimiert wird, konnten in α8-/--
Mäusen hauptsächlich im glomerulären Mesangium histologische und morphometrische
Veränderungen beobachtet werden, während die renalen Blutgefäße kaum betroffen waren
Ergebnisse
51
[27]. Dies führte zur Hypothese, dass MZ und VSMZ durch den Mangel an α8-Integrin
unterschiedlichen kompensatorischen Mechanismen unterworfen sind. In kultivierten α8-/--
MMZ konnte bereits eine Hochregulation von α2- und α6-Integrinketten gezeigt werden
[125, 135]. Deshalb sollte mit den folgenden Untersuchungen die Frage geklärt werden, ob
die Hochregulation von α2- und α6-Integrinketten in α8-/--MMZ direkt auf den Mangel
von α8-Integrin zurückzuführen ist. Hierzu wurden mittels Real-Time-RT-PCR die
Expression von α2- und α6-Integrinketten in α8-/--MMZ der Expression in si itga8 RMZ
gegenübergestellt. Untersuchungen im Rahmen dieser Arbeit konnten diese
Beobachtungen in MMZ bezüglich der Veränderungen der Expression von α2- und α6-
Integrin-Untereinheit verifizieren. So wurde in α8-/--MMZ eine ca. 40-fach erhöhte
Expression von α2- und ein 18-facher Anstieg der Expression der α6-Integrin Untereinheit
auf mRNA Ebene ermittelt (Abb. 30 (A)). Im Gegensatz zu den Befunden in α8-/--MMZ
wurde durch den transienten Knockdown von α8-Integrin in RMZ sowohl für die α2- als
auch für die α6-Integrinkette eine um fünffach verringerte RNA-Expression detektiert
(Abb. 30 (B)).
(A) MMZ
01020
304050
WT α8-/- WT α8-/-
α2 α6
rela
tive
Indu
ktio
n
*
*
0,00,20,40,60,81,01,21,4
si Ko si itga8 si Ko si itga8
α2 α6
rela
tive
Indu
ktio
n
* *
(B) si RMZ(A) MMZ
01020
304050
WT α8-/- WT α8-/-
α2 α6
rela
tive
Indu
ktio
n
*
*
01020
304050
WT α8-/- WT α8-/-
α2 α6
rela
tive
Indu
ktio
n
*
*
0,00,20,40,60,81,01,21,4
si Ko si itga8 si Ko si itga8
α2 α6
rela
tive
Indu
ktio
n
* *
0,00,20,40,60,81,01,21,4
si Ko si itga8 si Ko si itga8
α2 α6
rela
tive
Indu
ktio
n
* *
(B) si RMZ
Abb. 30: α2- und α6-Integrin Expression in MZ.
α2- und α6-Integrin Expression in (A) WT- und α8-/--MMZ und in (B) RMZ mit Ko- und α8-Integrin siRNA
behandelt. Während in (A) α8-/--MMZ (α8-/-) die Expression von α2- und α6-Integrin bezüglich WT-MMZ
(WT) um ein signifikant Vielfaches erhöht vorzufinden war, wurden (B) α2- und α6-Integrin durch den
transienten Mangel an α8-Integrin in RMZ (si itga8) im Vergleich zu si Ko RMZ (si Ko) signifikant
schwächer exprimiert. Anhand von Real-Time-RT-PCR Untersuchungen wurde die RNA Expression
ermittelt und gegen 18S normiert. (n= 4, * p< 0,05 vs. WT bzw. si Ko).
2.9.2 Untersuchung zur Funktion von α2- und α6-Integrin beim Zellüberleben
Da α2- und α6-Integrin an der Regulation des Zellüberlebens beteiligt sein können und in
Vorbefunden mit MMZ und HEK [(human embryonic kidney–Zellen] in vitro divergente
Ergebnisse
52
Ergebnisse hinsichtlich des Einflusses von α8-Integrin auf das Zellüberleben erhoben
worden waren, stellte sich die Frage, inwieweit sich die vermehrte Expression von α2- und
α6-Integrin in α8-/--MMZ auf die Apoptoseinduktion in diesen Zellen auswirken kann.
Hierzu wurden α8-/--MMZ vor der Durchführung des Caspase-3-Assays mit α2- und α6-
Integrin blockierenden Antikörpern vorbehandelt. Mit blockierenden Antikörpern
behandelte, unstimulierte Zellen (Ko) zeigten ein gleich niedriges Niveau an Caspase-3-
Aktivität. Im Versuchsansatz mit blockierenden Antikörpern gegen α2- (+ 2) bzw. α2- mit
α6-Integrin (+ 2, + 6) kombiniert konnte gegenüber der unstimulierten Ko in stimulierten
Zellen nur eine leicht erhöhte Caspase-3-Aktivität detektiert werden. Zellen, die nur mit
dem Antikörper gegen die α6-Integrin Kette vorinkubiert waren, zeigten eine bis zu 3-
fache signifikante Aktivitätszunahme des Caspase-3-Enzyms (Abb. 31). Die Ergebnisse
konnten mit serumfreiem Medium (D0) als Apoptosestimulans reproduziert werden (Abb.
31).
010002000300040005000600070008000
+ a2 + a6 +a2+a6
+ a2 + a6 +a2+a6
+ a2 + a6 +a2+a6
Ko D0 50µM
Cas
pase
-3-A
ktiv
ität
**
α8-/--MMZ mit blockierenden Antikörpern
010002000300040005000600070008000
+ a2 + a6 +a2+a6
+ a2 + a6 +a2+a6
+ a2 + a6 +a2+a6
Ko D0 50µM
Cas
pase
-3-A
ktiv
ität
**
010002000300040005000600070008000
+ a2 + a6 +a2+a6
+ a2 + a6 +a2+a6
+ a2 + a6 +a2+a6
Ko D0 50µM
Cas
pase
-3-A
ktiv
ität
**
α8-/--MMZ mit blockierenden Antikörpern
Abb. 31: Caspase-3-Assay mit blockierenden Antiköpern.
Caspase-3-Assay mit α8-/--MMZ nach Behandlung mit α2- und α6-Integrin blockierenden Antiköpern. Nur
die stimulierten α8-/--MMZ, die mit dem Antikörper gegen α6-Integrin (+ a6) blockiert wurden, wiesen eine
signifikant erhöhte Apoptoserate zu den unstimulierten Ko auf. Der jeweilige Einsatz von blockierenden
Antikörpern wird mit + α2 bzw. + α6 markiert. Ko = ohne Apoptosestimulans, D0 = Serumentzug, 50µM =
Behandlung mit 50µM cis-Platin. Die Messung und Auswertung der Caspase-3-Aktivität erfolgte nach dem
Standardprotokoll. (n=3, * p <0,05 vs. Ko).
Ergebnisse
53
2.10 Einfluss von α8-Integrin auf die Matrix-Metalloproteinasen (MMP)
MMP übernehmen in zahlreichen biologischen Prozessen wie Adhäsion, Migration,
Proliferation und Zellüberleben eine wichtige regulatorische Funktion [71]. Da MMP-2
und MMP-9 am häufigsten im Glomerulus vorzufinden sind [136] und eine
Expressionshemmung von MMP-2 und MMP-9 durch blockierte α4-, α5- und αv-Integrine
erfolgen kann [137], wollten wir untersuchen, ob die Expression von MMP-2 und MMP-9,
und ihre speziellen Inhibitoren TIMP-1 und TIMP-2 auch von α8-Integrin abhängig ist.
Dazu wurde die Expression von MMP-2, MMP-9, TIMP-1 und TIMP-2 mittels Real-
Time- RT-PCR sowohl in α8-/--MMZ als auch in si itga8 RMZ im Vergleich zu WT-
MMZ bzw. si Ko bestimmt. Im Vergleich zu WT-MMZ war in α8-/--MMZ die MMP-2,
MMP-9 und TIMP-1 mRNA Expression reduziert. TIMP-2 wurde dagegen unverändert
transkribiert (Abb. 32 (A)). Ebenso konnte in si itga8 RMZ bezüglich si Ko RMZ neben
einer verminderten TIMP-2 auch eine verminderte MMP-2 und MMP-9 mRNA Expression
bestimmt werden. Für TIMP-1 konnte kein Unterschied gemessen werden (Abb. 32 (B)).
0,00,20,40,60,81,01,21,41,6
WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-
MMP-2 MMP-9 TIMP-1 TIMP-2
rela
tive
Indu
ktio
n
**
*
(A) MMZ
0,00,20,40,60,81,01,21,41,6
si Ko siitga8
si Ko siitga8
si Ko siitga8
si Ko siitga8
MMP-2 MMP-9 TIMP-1 TIMP-2
rela
tive
Indu
ktio
n
* **
(B) si RMZ
0,00,20,40,60,81,01,21,41,6
WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-
MMP-2 MMP-9 TIMP-1 TIMP-2
rela
tive
Indu
ktio
n
**
*
0,00,20,40,60,81,01,21,41,6
WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/- WT α8-/-
MMP-2 MMP-9 TIMP-1 TIMP-2
rela
tive
Indu
ktio
n
**
*
(A) MMZ
0,00,20,40,60,81,01,21,41,6
si Ko siitga8
si Ko siitga8
si Ko siitga8
si Ko siitga8
MMP-2 MMP-9 TIMP-1 TIMP-2
rela
tive
Indu
ktio
n
* **
0,00,20,40,60,81,01,21,41,6
si Ko siitga8
si Ko siitga8
si Ko siitga8
si Ko siitga8
MMP-2 MMP-9 TIMP-1 TIMP-2
rela
tive
Indu
ktio
n
* **
(B) si RMZ
Ergebnisse
54
Abb. 32: Expression von MMP und TIMP.
MMP-2, MMP-9, TIMP-1 und TIMP-2 RNA Expression in (A) WT- und α8-/--MMZ und in (B) RMZ mit si
Ko- und si itga8 behandelt. Im Vergleich zu (A) WT-MMZ (WT) bzw. (B) si Ko RMZ (si Ko) wurden bei
Mangel an α8-Integrin MMP-2, MMP-9 und TIMP-1 in (A) α8-/--MMZ (α8-/-) bzw. (B) si itga8 RMZ (si
itga8) geringer exprimiert. TIMP-2 wurde nur in (B) si itga8 RMZ (si itga8) signifikant geringer exprimiert.
Real-Time-RT-PCR wurde zur Bestimmung der quantitativen mRNA Expression durchgeführt. Die
Ermittlung der Kopienzahl erfolgte in Bezug auf 18S als Referenz. (n=3, * p< 0,05 vs. WT bzw. si Ko).
2.11 CTGF Expression in mesenchymalen Zellen
Für VSMZ [138] und für MZ [139] wird ein Zusammenhang zwischen CTGF-Expression
und Migration beschrieben. Daher wurde die CTGF-Protein Expression der WT- und α8-/--
Zellen miteinander verglichen, indem Western Blot- bzw. mittels RT-PCR-Messungen
durchgeführt wurden. Sowohl auf Protein- als auch auf RNA-Ebene konnte in WT-MMZ
CTGF nachgewiesen werden. Dagegen war CTGF in α8-/--MMZ auf einen geringen
basalen mRNA Level reduziert und im Western Blot konnte kein CTGF mehr detektiert
werden (Abb. 33 (A)). In α8-/--VSMZ konnte im Vergleich zu WT-VSMZ eine vermehrte
CTGF mRNA-Expression detektiert werden. CTGF Protein war in WT- und α8-/--VSMZ
nachweisbar (Abb. 33 (B)).
(A) CTGF in MMZ
Real-Time-RT-PCR
0,00,40,81,21,62,0
WT α8-/-
rela
tive
Indu
ktio
n
Western Blot
- CTGF(36kDa)
- β-Aktin(42kDa)
WT α8-/-
(B) CTGF in VSMZ
0,00,51,01,52,02,53,0
WT α8-/-
rela
tive
Indu
ktio
n
- CTGF(36kDa)
- β-Aktin(42kDa)
WT α8-/-
*
*
(A) CTGF in MMZ
Real-Time-RT-PCR
0,00,40,81,21,62,0
WT α8-/-
rela
tive
Indu
ktio
n
Western Blot
- CTGF(36kDa)
- β-Aktin(42kDa)
WT α8-/-
(B) CTGF in VSMZ
0,00,51,01,52,02,53,0
WT α8-/-
rela
tive
Indu
ktio
n
- CTGF(36kDa)
- β-Aktin(42kDa)
WT α8-/-
(A) CTGF in MMZ
Real-Time-RT-PCR
0,00,40,81,21,62,0
WT α8-/-
rela
tive
Indu
ktio
n
Western Blot
- CTGF(36kDa)
- β-Aktin(42kDa)
WT α8-/-
- CTGF(36kDa)
- β-Aktin(42kDa)
- CTGF(36kDa)
- β-Aktin(42kDa)
WT α8-/-WT α8-/-
(B) CTGF in VSMZ
0,00,51,01,52,02,53,0
WT α8-/-
rela
tive
Indu
ktio
n
- CTGF(36kDa)
- β-Aktin(42kDa)
WT α8-/-
- CTGF(36kDa)
- β-Aktin(42kDa)
WT α8-/-WT α8-/-
*
*
Ergebnisse
55
Abb. 33: CTGF Expression.
Während der Mangel an α8-Integrin in (A) MMZ zu einer reduzierten CTGF Expression führte, war die
CTGF Expression in (B) VSMZ signifikant erhöht. Quantitative CTGF mRNA Analyse mittels Real-Time-
RT-PCR in (A) WT- und α8-/--MMZ und in (B) WT- und α8-/--VSMZ. Western Blot Analyse von CTGF
Expression in (A) MMZ und in (B) VSMZ. β-Aktin wurde als Beladungskontrolle verwendet. (n=3, * p<
0,05 vs. WT).
2.12 Untersuchungen des RhoA/Rho-Kinase (ROCK)-Signalwegs
Wie bereits in der Einleitung beschrieben, sind die kleinen GTPasen wie RhoA an der
Bildung der Stressfasern beteiligt und beeinflussen somit die Organisation des
Aktinzytoskeletts [35]. Bekanntermaßen kann das Aktin-Zytoskelett Adhäsion,
Ausbreitung, Migration, Proliferation, Morphologie und das Zellüberleben beeinflussen. Es
war deshalb von Interesse zu untersuchen, ob und inwieweit α8-Integrin über den
RhoA/ROCK-Signalweg direkt oder indirekt auf die Formierung der Stressfasern bzw.
Expression von α-SMA einwirkt. Desweiteren wurde in humanen Nierenfibroblasten
gezeigt, dass auch die Induktion von CTGF (connective tissue growth factor) über RhoA
und ROCK verläuft [140]. Da bereits für MZ ein direkter Zusammenhang zwischen CTGF
Expression und Aktin-Abbau und somit auf den Umbau des Zytoskeletts beschrieben
wurde [139], wurden WT- und α8-/--MMZ sowie WT- und α8-/--VSMZ 24h nach der
Behandlung mit 10µM Y-27632 (Endkonzentration) hinsichtlich der CTGF- und α-SMA-
Expression mit unbehandelten Zellen (Ko) verglichen. Y-27632 ist ein synthetisch
hergestelltes Pyridinderivat, das an ROCK, einen direkten Effektor der GTPase RhoA,
bindet und diesen inaktiviert. Folglich werden Signalwege gehemmt, die durch RhoA
induziert werden [141]. Es bietet somit eine Möglichkeit in den uns vorliegenden Zellen zu
untersuchen, ob der RhoA/ROCK-Signalweg eine Rolle in der α8-Integrin vermittelten
Signalweiterleitung spielt. Mit dem ROCK-Inhibitor behandelte WT-MMZ wiesen im
Vergleich zu den unbehandelten WT-MMZ (Ko) eine signifikante Herunterregulation von
α-SMA- und CTGF-mRNA auf (Abb. 34 (A)). Hingegen zeigten VSMZ im Vergleich zu
MMZ hinsichtlich der Expression von α-SMA und CTGF nach der Behandlung mit Y-
27632 eine unterschiedliche Reaktion. So war nach der Inhibition von ROCK die α-SMA-
Expression bezüglich der unbehandelten Ko sowohl in WT- als auch in α8-/--VSMZ
geringer. Im Gegensatz dazu führte die ROCK-Inhibition mit Y-27632 in α8-/--VSMZ
zwar zu einer Reduktion der CTGF-Expression im Vergleich zur Kontrolle (Ko), in WT-
Ergebnisse
56
VSMZ konnte dagegen keine Veränderung in der CTGF-mRNA Expression beobachtet
werden (Abb. 34 (B)).
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
Ko + Y Ko + Y Ko + Y Ko + Y
WT α8-/- WT α8-/-
rela
tive
Indu
ktio
n
α-SMA CTGF
*
*
*
(B) VSMZ
0,0
0,4
0,8
1,2
1,6
Ko + Y Ko + Y Ko + Y Ko + Y
WT α8-/- WT α8-/-
rela
tive
Indu
ktio
n
**
α-SMA CTGF
(A) MMZ
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
Ko + Y Ko + Y Ko + Y Ko + Y
WT α8-/- WT α8-/-
rela
tive
Indu
ktio
n
α-SMA CTGF
*
*
*
(B) VSMZ
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
Ko + Y Ko + Y Ko + Y Ko + Y
WT α8-/- WT α8-/-
rela
tive
Indu
ktio
n
α-SMA CTGF
*
*
*
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
Ko + Y Ko + Y Ko + Y Ko + Y
WT α8-/- WT α8-/-
rela
tive
Indu
ktio
n
α-SMA CTGF
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
Ko + Y Ko + Y Ko + Y Ko + Y
WT α8-/- WT α8-/-
rela
tive
Indu
ktio
n
α-SMA CTGFα-SMA CTGF
*
*
*
(B) VSMZ
0,0
0,4
0,8
1,2
1,6
Ko + Y Ko + Y Ko + Y Ko + Y
WT α8-/- WT α8-/-
rela
tive
Indu
ktio
n
**
α-SMA CTGF
(A) MMZ
0,0
0,4
0,8
1,2
1,6
Ko + Y Ko + Y Ko + Y Ko + Y
WT α8-/- WT α8-/-
rela
tive
Indu
ktio
n
**
α-SMA CTGF
0,0
0,4
0,8
1,2
1,6
Ko + Y Ko + Y Ko + Y Ko + Y
WT α8-/- WT α8-/-
rela
tive
Indu
ktio
n
**
0,0
0,4
0,8
1,2
1,6
Ko + Y Ko + Y Ko + Y Ko + Y
WT α8-/- WT α8-/-
rela
tive
Indu
ktio
n
**
α-SMA CTGF
(A) MMZ
Abb. 34: Expression von α-SMA und CTGF nach Inhibition von ROCK.
α-SMA- und CTGF-Expression nach ROCK Inhibition mit Y-27632 (+ Y) in (A) WT- und α8-/--MMZ im
Vergleich mit (B) WT- und α8-/--VSMZ. (A) Während α-SMA- und CTGF mRNA in α8-/--MMZ (α8-/-) nur
gering basal exprimiert wurden und somit eine Inhibition der Rho-Kinase (ROCK) zu keiner signifikanten
messbaren Veränderung in der Expression führte, konnte durch die Behandlung von WT-MMZ (WT) mit
dem ROCK-Inhibitor Y-27632 eine signifikant geringere Expression sowohl von α-SMA als auch CTGF
bezüglich der unbehandelten Kontrollen (Ko) beobachtet werden. (B) Im Vergleich zu den Ko führte die
ROCK Inhibition sowohl in WT- als auch α8-/--VSMZ zu einer signifikant reduzierten Expression von α-
SMA. Desweiteren konnte die CTGF Expression in α8-/--VSMZ (α8-/-) signifikant reprimiert vorgefunden
werden. Dagegen konnte für WT-VSMZ (WT) im Vergleich mit den Ko durch die Behandlung mit Y-27632
keine Veränderung in der CTGF mRNA Expression gezeigt werden. Die 18S wurde als Bezugsgröße zur
Bestimmung der relativen mRNA Induktion verwendet (Y-Achse). (n=6, * p< 0,05 vs. Ko).
Ergebnisse
57
Wie bereits beschrieben, führte im Vergleich zu WT-MMZ der Verlust von α8-Integrin in
MMZ sowohl für α-SMA (Abb. 14 (A)) als auch für CTGF (Abb. 33 (A)) zu einer
Reduktion der mRNA Expression auf einen basalen geringen Level. Dagegen wiesen α8-/--
VSMZ im Vergleich zu WT-VSMZ keine veränderte α-SMA- (Abb. 14 (B)) und CTGF-
Expressionen auf (Abb. 33 (B)). Die basal schon geringe α-SMA- und CTGF mRNA
Produktion in α8-/--MMZ, wurde nach der Behandlung mit dem ROCK Inhibitor Y-27632
nicht nachweisbar verändert. Zur besseren Veranschaulichung wurden die mRNA-Werte
der unbehandelten α8-/--MMZ auf 1 normiert und verdeutlichen die unveränderte
Expression an α-SMA und CTGF (Abb. 35).
0,00,20,40,60,81,01,2
Ko + Y Ko + Y
α-SMA CTGF
rela
tive
Indu
ktio
n
ROCK Inhibition auf α8-/- -MMZ
0,00,20,40,60,81,01,2
Ko + Y Ko + Y
α-SMA CTGF
rela
tive
Indu
ktio
n
ROCK Inhibition auf α8-/- -MMZ
Abb. 35: Normierte Expression von α-SMA und CTGF nach Inhibition von ROCK.
Normierte α-SMA- und CTGF-Expression nach ROCK Inhibition mit Y-27632 (+ Y) in α8-/--MMZ. Sowohl
α-SMA als auch CTGF blieben in α8-/--MMZ im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollen (Ko) nach der
Behandlung mit dem ROCK inhibierenden Y-27632 (+ Y) in ihrer Expression unverändert. Hierbei wurden
die ursprünglichen geringen basalen Werte der unbehandelten α8-/--MMZ auf 1 normiert. Die Befunde
stammen aus dem zuvor beschriebenen Versuch (siehe Abb. 34 (A)).
Diskussion
58
3 Diskussion
Vorbefunde aus unserer Arbeitsgruppe hatten bereits Hinweise auf einen Einfluss einer
dauerhaften α8-Integrin Defizienz auf Adhäsion, Migration, Proliferation [125] und das
Überleben von Maus-Mesangiumzellen (MMZ) ergeben [142]. Diese Befunde konnten von
mir im Zuge meiner vorliegenden Arbeit verifiziert und vervollständigt werden. Zusätzlich
wurden Untersuchungen in vaskulären glatten Muskelzellen aus der Mausaorta (VSMZ)
mit und ohne α8-Integrin Defizienz durchgeführt. Die Etablierung eines in vitro–Modells
für den transienten „knockdown“ von α8-Integrin (siRNA Transfektion) im Rahmen
meiner Doktorarbeit gab uns eine weitere Möglichkeit, die Funktion von α8-Integrin in den
MZ zu analysieren. Eine reproduzierbare Transfektion der MMZ mit siRNA gegen α8-
Integrin konnte, im Gegensatz zu Ratten-Mesangiumzellen (RMZ), bisher nicht in unserem
Labor etabliert werden. Daher wurden alle siRNA Transfektionen in RMZ durchgeführt.
Diese Tatsache muss bei dem Vergleich zwischen transienter und dauerhafter α8-Integrin
Defizienz in MZ berücksichtigt werden. Es ist durchaus vorstellbar, dass auch Spezies-
Unterschiede auftreten können, obwohl Maus und Ratte für α8-Integrin eine 92%ige
Homologie der Gensequenz und eine 96%ige Homologie für das Protein aufzeigen
(Sequenzvergleich s. Anhang).
3.1 Einfluss von α8-Integrin auf Zellmorphologie, Zytoskelett und fokale
Kontakte
Eine Studie beschreibt, dass nach transienter Herunterregulation von α8-Integrin in Ratten-
VSMZ (siRNA Silencing) neben der drastischen Modulation des Phänotyps von einer
differenzierten, kontraktilen Zelle zu einer dedifferenzierten, migrierenden Zelle, sowohl
eine Änderung der Morphologie als auch eine Umstrukturierung der Aktinfilamente und
der fokalen Kontakte stattfand [126]. Diese Befunde mit si RNA behandelten VSMZ [126]
konnten wir mit kultivierten VSMZ aus α8-/--Mäusen nicht bestätigen. Der dauerhafte
Mangel an α8-Integrin führte in VSMZ (α8-/--VSMZ) zu keiner morphologischen
Veränderung. α-Glattmuskel-Aktin (α-SMA), ein Marker für Stressfasern, wurde
unvermindert exprimiert und die Organisation des Aktinzytoskeletts entsprach dem der
WT-VSMZ. In MZ dagegen führte sowohl transiente (siRNA Silencing) als auch
dauerhafte α8-Integrin (α8-/--) Defizienz zum Verlust des mesenchymalen Charakters.
Diskussion
59
Zudem war die Bildung der F-Aktinfilamente erheblich gestört. Obwohl α8-/--MMZ im
Vergleich zu WT-MMZ eine veränderte Lokalisation von Vinculin aufwiesen, war die
Expression des Vinculinproteins nicht reduziert. Es ist bekannt, dass α8β1-Integrin mit
fokalen Adhäsionen assoziiert ist und die Verbindung an das Aktinzytoskelett über
adaptive Zytoskelettmoleküle wie Vinculin hergestellt wird [99]. Die genauen
regulatorischen Zusammenhänge zwischen α8-Integrin und Vinculin sind aber bis dato
noch unklar. Da mangelndes α8-Integrin in den MZ zu keiner Reduzierung der Vinculin
Expression führte, scheint α8-Integrin weder einen direkten noch indirekten
regulatorischen Einfluss auf die Expression von Vinculin in MZ zu nehmen. Dagegen
konnte durch den Mangel an α8-Integrin neben der veränderten Lokalisation von Vinculin
auch eine strukturelle Veränderung der fokalen Kontakte in MZ initiiert werden. In
normalen MZ lagen die fokalen Kontakte als längliche Strukturen vor. Aufgrund der α8-
Integrin Defizienz konnten die fokalen Kontakte nur noch als gedrungene Strukturen, die
sich zu Bündel zusammengelagert hatten, sichtbar gemacht werden. Vinculin nimmt
hinsichtlich der Regulation der Bildung fokaler Kontakte eine zentrale Rolle ein [49, 56].
Fibroblasten, die kein Vinculin produzieren, wiesen kleinere fokale Kontakte auf als
normale Fibroblasten [143]. Bekanntermaßen erfolgt die Rekrutierung des
Adaptermoleküls Vinculin in fokale Kontakte erst nach der Ligandenbindung an einen
Oberflächenrezeptor wie z.B. Integrin [144]. Deshalb vermuteten wir, dass mangelndes α8-
Integrin in den MZ zu einer gestörten Liganden-Integrin Interaktion führt und infolge
dessen es zu einer veränderten Lokalisation von Vinculin kommt. Vinculin kann aber
sowohl in einer aktiven als auch in einer inaktiven Form vorliegen, wobei nur die aktive
Form in fokalen Kontakten und die inaktive Form im Zytosol vorzufinden ist [56]. Somit
könnte auch die Verfügbarkeit von Vinculin bzw. die der aktiven Form mitverantwortlich
für die Lokalisation und für die Struktur der fokalen Kontakte sein. Die inaktive Form
entsteht durch eine Interaktion des Kopf- und Schwanzbereiches der primären
Proteinsequenz und maskiert alle Bindesequenzen des Moleküls. Somit können nur an der
offenen, aktiven Struktur Interaktionen wie z.B. die Bindung von F-Aktin an Vinculin
stattfinden [56] Da Vinculin nicht nur eine zentrale Schlüsselfunktion in der Regulation
von fokalen Kontakten einnimmt [49, 56], sondern auch die Bildung der kontraktilen
Stressfasern reguliert [144] und Vinculin-/--Zellen auch morphologischen Veränderungen
unterworfen waren [143, 144], wäre damit ein direkter Zusammenhang zwischen den
massiven Veränderungen bei den fokalen Kontakten, der Umstrukturierung der F-
Diskussion
60
Aktinfilamente sowie der Modifizierung der Zellmorphologie, wie wir sie in MZ durch
mangelndes α8-Integrin vorliegen haben, erklärt.
Im Gegensatz dazu zeigten VSMZ aus α8-/--Mäusen keine derartigen Veränderungen. Es
ist zu vermuten, dass die mangelnde α8-Integrin-Liganden Interaktion von anderen
Adhäsionsrezeptoren kompensatorisch übernommen wird oder α8-Integrin per se keine
wesentliche Rolle in der Ligandenbindung in VSMZ einnimmt. Wir vermuten daher, dass
die regulatorische Funktion von α8-Integrin vom Zelltyp abhängig ist. Diese in vitro
Befunde könnten auch erklären, warum in α8-/--Mäusen mehr Auffälligkeiten in der Niere
als in den Gefäßen auftreten [27].
3.2 Die Bedeutung von α8-Integrin für zellbiologische Aktivitäten
3.2.1 Einfluss von α8-Integrin auf Adhäsion und Ausbreitung
Einer der wichtigsten Aspekte, wie sich Zellen in einem Organismus in ihrer Umgebung
orientieren, ist die adhäsive Interaktion mit dem Substrat. Für zahlreiche Zellaktivitäten,
wie Zellüberleben, Proliferation, Differenzierung und Migration ist die Bildung von
adhäsiven Kontakten der Zellen an die ECM erforderlich [145]. Bereits 1995 konnte
Müller U. et al. zeigen, dass α8-Integrin die Adhäsion und Ausbreitung von
Hühnerfibroblasten fördern kann [116]. Dieser Effekt des RGD-abhängigen Integrins
wurde in den folgenden Jahren in weiteren mesenchymalen Zellen beschrieben [118, 125,
127]. Befunde zur Matrix-abhängigen Regulation von Adhäsion, Migration, Proliferation
[125] und Zellüberleben von WT- im Vergleich zu α8-/--MZ [142] wurden bereits in
unserer Arbeitsgruppe erhoben und publiziert. Im Zuge meiner Arbeit konnte ich
verifizieren, dass die α8-Integrin die Adhäsion und das Ausbreiten der MZ auf Fibronektin
fördert. Die akute Herunterregulation von α8-Integrin in RMZ (si itga8) führte wie die
dauerhafte α8-Integrin Defizienz in MMZ zu einer geringeren Adhäsion und Ausbreitung
der Zellen. Dies lässt somit auf einen direkten Einfluss von α8-Integrin auf die Adhäsion
von MZ schließen. Im Gegensatz dazu konnte auf keiner der untersuchten Matrices ein
unterschiedliches adhäsives Verhalten zwischen WT- und α8-/--VSMZ beobachtet werden.
Adhäsion ist eine Voraussetzung für eine gute Ausbreitung der Zellen, um eine korrekte
Lokalisation von Vinculin für eine vollständig ausgereifte Bildung der fokalen Kontakte zu
erreichen. Denn nur dann kommt es zur notwendigen Integrin-Zytoskelett-Bindung, in
deren Folge sich die Zelle auf ihrem Untergrund ausbreiten kann [146]. Xu W. et al. zeigte
Diskussion
61
1998 bereits, dass Fibroblasten (MEF), die kein Vinculin produzierten, weniger adhärent
waren, weniger ausgebreitet und mehr migrierten [143]. Das würde auch erklären, warum
wir in α8-/--MMZ bzw. si itga8 RMZ trotz unveränderter Vinculin-Expression, veränderte
Ausbreitungs- und Adhäsionsaktivitäten der Zellen beobachten konnten: die Zellen
konnten durch das fehlende α8-Integrin vermutlich weniger Integrin-ECM Interaktionen
mit dem Zytoskelett und ihrer Umgebung eingehen. In Folge dessen kam es, wie bereits
diskutiert, zu weniger und unausgereifteren Formierungen der fokalen Kontakte. Dies
resultierte in einer verminderten Lokalisation von Vinculin in den fokalen Kontakten und
folglich zum vermehrten Abbau und Umorganisation der Stressfasern. Dadurch adhärierten
die Zellen schwächer und breiteten sich geringer aus. Dagegen war in α8-/--VSMZ im
Vergleich mit WT-VSMZ die Struktur des Aktin-Zytoskeletts, die Bildung der fokalen
Kontakte, die Adhäsion und Ausbreitung nicht betroffen. Das deutet darauf hin, dass α8-
Integrin in VSMZ bei der Adhäsion an ECM keine so essentielle Rolle wie in MZ spielt.
3.2.2 Einfluss von α8-Integrin auf Zellüberleben, Proliferation und Migration
Apoptose, der programmierte Zelltod, ist wie auch die Proliferation ein wichtiger eng
regulierter Vorgang im Organismus, um die Zellzahl und die Gewebegröße während der
Embryonalentwicklung sowie in physiologischen und pathologischen Prozessen zu
kontrollieren. Der gezielte Abbau überzähliger und anormaler Zellen trägt somit zur
Aufrechterhaltung der Gewebshomöostase bei [147, 148]. So ist das Verhältnis zwischen
Zellproliferation und Apoptose im Glomerulus entscheidend über den Ausgang zahlreicher
Glomerulonephritiden [149]. Die Proliferation von MZ ist dabei ein Kennzeichen
zahlreicher glomerulärer Erkrankungen. Desweiteren kann das Überleben der MZ ein
wichtiger Faktor für die glomeruläre Funktion und Struktur in gesunden sowie in
erkrankten Nieren sein [150]. Auch während der Entwicklung einer Arteriosklerose spielen
bei der Bildung von arteriosklerotischen Plaques Proliferation und Zelltod von VSMZ eine
entscheidende Rolle [151, 152]. Wie bereits publiziert, wirkte α8-Integrin in MMZ anti-
proliferativ [125]. In si itga8 RMZ dagegen hatte α8-Integrin eine wachstumsfördernde
Funktion. Es gibt Studien, die einen regulatorischen Zusammenhang zwischen α2- und α6-
Integrin und Zellwachstum beschreiben [153, 154]. Somit könnte die konträre Funktion
von α8-Integrin im Vergleich von transient zu dauerhaft defizienten MZ auf die
unterschiedliche Expression von α2- und α6-Integrinen zurückgeführt werden. Dagegen
führte der Mangel an α8-Integrin in VSMZ zu keinem veränderten Proliferationsverhalten.
Diskussion
62
Vorbefunde wiesen darauf hin, dass α8-Integrin das Überleben der MMZ begrenzt [142].
Durch Analyse der Caspase-3-Aktivität und Zellkernkondensation (Hoechstfärbung)
konnte ich im Rahmen meiner Arbeit sowohl auf FN als auch auf PL ein besseres
Überleben der α8-/--MMZ gegenüber den WT-MMZ nachweisen. Erste Daten aus siRNA
behandelten RMZ deuten ebenfalls darauf hin, dass die α8-Integrinkette die
Apoptosesensibilität in RMZ erhöhen könnte. Für eine signifikante Aussage müssen noch
weitere Untersuchungen durchgeführt werden. Durch Überexpression von α8-Integrin in
verschiedenen Zelllinien [155] sowie in HEK (human embryonic kidney)-Zellen [142]
wurde dagegen eine pro-apoptotische Wirkung von α8-Integrin postuliert. In VSMZ
wiederum war weder eine pro- noch anti-apoptotische Wirkung der α8-Integrinkette
nachweisbar. Somit ist anscheinend der Einfluss von α8-Integrin auf das Zellüberleben
vom Zelltyp abhängig. Wie in der Einleitung schon erwähnt, konnte α8β1-Integrin als ein
Differenzierungsmarker von VSMZ identifiziert werden und ist zudem an der Regulation
der Umdifferenzierung der VSMZ beteiligt. Mittels siRNA-Silencing herunterreguliertes
α8-Integrin ließ VSMZ vermehrt migrieren, aber geringer proliferieren [99, 127]. Im
Gegensatz dazu konnte in der vorliegenden Arbeit kein α8-Integrin abhängiger
Unterschied im Proliferationsverhalten von VSMZ beobachtet werden, während die
Migration α8-Integrin abhängig erschien. Für einen direkten Einfluss von α8-Integrin
spräche, dass sowohl ein akuter [99, 127] als auch ein dauerhafter Mangel an α8-Integrin
in VSMZ eine erhöhte Migrationsrate induzieren kann. So würde in vivo der Mangel an
α8-Integrin durch eine erhöhte Migration direkt Einfluss auf die Bildung von
arteriosklerotischen Plaques einnehmen. Dieser in vivo Funktion von α8-Integrin
widersprechen aber die Befunde der geringeren bzw. unveränderten Proliferation von
VSMZ mit akuter und dauerhafter α8-Integrin Defizienz. Eine erhöhte Migration der
VSMZ aus der Media in die Intima der Gefäßwand geht immer mit einer erhöhten
Proliferation einher, sodass beide biologische Prozesse eine Voraussetzung für die Bildung
von Plaques sind [29, 31-33]. Die für α8-Integrin postulierte hemmende Wirkung auf die
Migration kultivierter MMZ [125] konnte zwar tendenziell durch den Scratchassay und
Migrations-Barrieresassay gezeigt werden, jedoch war bei diesen beiden Methoden die
Bestimmung der anteiligen proliferierenden an den migrierenden Zellen schwierig. Zudem
kann beim Scratch Assay die Matrix-Beschichtung durch das Ritzen des Zellrasens mit
einer Pipettenspitze zerstört und somit die matrixabhängige Wanderung der Zellen
verfälscht werden. Da „Scratchen“ eine invasive Methode ist und die Zellen zum Teil
Diskussion
63
verletzt werden, vermuteten wir, dass durch die Ausschüttung von Zytokinen und weiteren
Wachstumsfaktoren ein Reparaturprozess zur Ausheilung angeregt wurde. Es ist nicht
sicher, inwieweit Zytokine und Wachstumsfaktoren von WT- und α8-/--MMZ in
unterschiedlichem Maß sezerniert werden. Wir konnten deshalb nicht eindeutig feststellen,
ob die zu einem späteren Zeitpunkt vermehrte Migration der α8-/--MMZ wirklich allein auf
den Mangel von α8-Integrin zurückzuführen war oder vielleicht auf den Einfluss von
unterschiedlich viel sezernierten Zytokinen und Wachstumsfaktoren. Aufgrund kürzerer
Versuchszeiten waren Proliferationseffekte im Boydenkammer-Assay vernachlässigbar. In
diesen Untersuchungen bestätigten sich die Vorbefunde aus den vorherigen
Migrationsassays. Unterexpression von α8-Integrin führte auch hier zu einer erleichterten
Migration der Zellen. Im Gegensatz dazu werden in der Literatur Integrine wie z. B avß3-
[156], α1β1- und α2β1-Integrin [157] als pro-migratorische Effektoren beschrieben. Aber
gerade für α8-Integrin existieren viele widersprüchliche Publikationen, die sowohl pro-
[158] als auch anti-migratorische Effekte [127, 159] postulieren. Daher wurde der Begriff
des “Tensegrins” eingeführt [158]. Das Konzept schreibt α8-Integrin eine duale Rolle in
der Migration zu. Es scheint zudem so, dass Zellen eine optimale Kontraktilität und
entsprechende Zugkraft für die Migration benötigen. α8β1-Integrin fördert die Migration
bei Zellen, die sich zunächst in einem weniger optimalen kontraktilen Zustand befinden
wie z. B. in Neuralleistenzellen [158] und reduziert die Migration von kontraktilen Zellen
[129]. Somit wäre die regulatorische Funktion von α8β1-Integrin nicht allein vom Zelltyp
abhängig, sondern auch vom Kontraktionsvermögen der Zelle.
3.3 Mögliche Kompensatorische Mechanismen
3.3.1 α2- und α6-Integrin
Zahlreiche Studien mit Knockout-Mäusen für verschiedene Integrine belegen die
essentielle Rolle von Integrinen für die Entwicklung und Differenzierung von Organen [94,
160]. Weiterhin wurde durch Knockout-Untersuchungen gezeigt, dass einige Integrine
kompensatorische Fähigkeiten besitzen und fehlende Integrine in ihrer Funktion ersetzen
können [161]. Hingegen können andere Integrine in ihrer Funktion nicht ersetzt werden
und ihre Abwesenheit führt zu embryonalem oder perinatalem Tod [161]. In einigen
Geweben stehen für einen Liganden mehr als ein Integrin zur Verfügung. Wird in diesem
Fall ein Integrin nicht exprimiert, so kann alternativ ein anderes Integrin den Liganden
Diskussion
64
binden und somit die Funktion des fehlenden Integrins übernehmen oder zumindest
teilweise kompensieren. Während bei mangelnder Kompensation das Fehlen eines
Integrins zu massiven Auswirkungen auf den Organismus führen kann, zeigen Gewebe, in
denen kompensatorische Mechanismen wirken, geringere Schäden [37]. So ist zwar die
Sterberate neonataler α8-/--Mäuse aufgrund embryonaler, zum Teil ausgeprägter
Nierenfehlbildungen groß und die überlebenden Nachkommen besitzen mit nur einer oder
zwei kleineren Nieren eine insgesamt geringere Nierenmasse als WT-Mäuse [119, 120],
dennoch sind die glomerulären Veränderungen, angesichts der starken Expression von α8-
Integrin im Mesangium von WT-Mäusen, verhältnismäßig gering [27]. Es ist aber noch
nicht geklärt, ob die de novo Expression der Kollagene und die vermehrte glomeruläre
Expression von α2-Integrin in den Glomeruli dieser Mäuse zur Aufrechterhaltung der
glomerulären Struktur beiträgt. α2β1-Integrin ist ein überwiegend Kollagen-bindendes
Protein mit sehr hoher Affinität für Kollagen I [162, 163]. Eine Hochregulation von α2-
Integrin konnte ebenso von Bieritz B et al., 2003 in kultivierten α8-/--MMZ gezeigt werden
[125]. Marek I wies 2006 erstmals eine Hochregulation von α6-Integrinketten in α8-/--
MMZ nach [142]. α6-Integrin ist ein Hauptrezeptor für Laminine. α6-Integrin kann sowohl
mit der β1- als auch mit der β4-Integrinkette Heterodimere bilden, die jeweils spezifisch
für bestimmte Laminine sind [162, 163]. Die mögliche kompensatorische Hochregulation
von α3-, α5-. αV-und β1-Integrin konnte zudem ausgeschlossen werden. In α8-/--VSMZ
lag dagegen keines der untersuchten Integrine induziert vor [125, 135]. α2- und α6-
Integrinketten werden normalerweise in MZ gering exprimiert [164], denn α2β1, α6β1 und
α6β4 sind Integrine, die meist in Zellen mit epithelialer Herkunft präsent sind [162, 163].
Sowohl die geringe Expression in WT-MMZ als auch die Hochregulation der beiden
Integrinketten in α8-/--MMZ konnte in unseren Untersuchungen bestätigt werden. Im
Gegensatz dazu waren weder α2- noch α6-Integrine in α8-/--VSMZ kompensatorisch
induziert [125, 135]. Diese Befunde führten zunächst zu der Hypothese, dass sich die
Unterschiede in der Morphologie und bei zellbiologischen Aktivitäten zwischen α8-/--
MMZ und α8-/--VSMZ auf die unterschiedlich exprimierten α2- und α6-Integrinketten
zurückzuführen sind. Da aber in den si itga8 RMZ die α2- und α6-Integrinketten reduziert
exprimiert vorlagen, aber trotzdem Unterschiede in der Morphologie und bei
zellbiologischen Aktivitäten gegenüber der si Ko RMZ gezeigt werden konnten, scheint
sich in MZ der direkte Zusammenhang von α8-Integrin und erhöhter Expression von α2-
noch α6-Integrin nicht zu bestätigen. Es ist aber noch zu klären, ob ein transienter
Diskussion
65
Knockdown von α8-Integrin mit einem limitierten Zeitraum (in unserem Beispiel 96h) sich
in seinem kompensatorischen Potential generell von einem dauerhaften knockout
unterscheidet und andere Integrinketten als α2 noch α6 den Mangel an α8-Integrin
kompensatorisch ausgleichen. Dazu müssen die Expressionen weiterer Integrinketten wie
z.B. α3, α5, αV und β1 nach einem transienten Knockdown von α8-Integrin untersucht
werden. Um den direkten Einfluss von α8-Integrin auf die Expression von α2- und α6-
Integrinketten in MZ genauer zu untersuchen, könnten Überexpressionsversuche in WT-
MZ oder Rescue-Versuche mit einem α8-Integrin Konstrukt in α8-/-- bzw. si RNA
behandelten MZ durchgeführt werden.
3.3.2 Funktion von α2- und α6-Integrin beim Zellüberleben in α8-/--MMZ
Sowohl für α2-Integrin [165] als auch für α6-Integrin [166] wurde eine anti-apoptotische
Wirkung postuliert. Um zu überprüfen, ob und inwieweit die vermehrt exprimierten α2-
und α6-Integrine in α8-/--MMZ an der Regulation des Zellüberlebens beteiligt sind, wurde
das Zellüberleben der α8-/--MMZ nach Behandlung mit blockierenden Antikörpern für α2-
und α6-Integrin untersucht. Stimulierte α8-/--MMZ zeigten nach der Inhibition von α6-
Integrin eine erhöhte Apoptoserate, während die Blockierung von α2-Integrin zu keiner
Veränderung im Zellüberleben führte. Damit würde die anti-apoptotische Wirkung von α6-
Integrin in α8-/--MMZ bestätigt werden, während α2-Integrin in α8-/--MMZ keine anti-
apoptotische Eigenschaft besitzt. Allerdings führten erstaunlicherweise kombinierte α2-
und α6-Integrin Inhibitionen zu keiner erhöhten Apoptoserate. Es ist bekannt, dass
Integrine die Aktivität und Expression weiterer Integrine beeinflussen können [37]. Sun H.
et al., 1998 zeigte, dass eine Re-Expression von α2β1-Integrin in gering differenzierten
Brustkrebszelllinien (Mm5MT) zu einer Hochregulation von α6- und β4-Integrin-UE, aber
nicht von α1-, α3-, α5- oder β1-Integrin führte [167]. Angelehnt an die Publikation von
Sun H. et al., 1998 wäre somit für α2-Integrin eine regulatorische Funktion auf die
Expression der α6-Integrinkette denkbar. Die α2β1-Integrin Expression löste zudem die
Differenzierung der Brustkrebszellen zu einem ausdifferenzierten, epithelialen Phänotyp
aus [167].Wir stellen daher die Hypothese auf, dass die Hochregulation des α6-Integrins
das Zellüberleben sichert und α2-Integrin dagegen keinen direkten Einfluss auf das
Zellüberleben der α8-/--MMZ einnimmt. Die Tatsache, dass in α8-/--MMZ aufgrund der
erhöhten α2-Integrin Expression ein Kollagenrezeptor vermehrt vorliegt und Kollagen I de
novo sezerniert wird, ließ im Vergleich zur WT-MMZ eine erhöhte Adhäsion von α8-/--
Diskussion
66
MMZ auf Kollagen I erwarten. Allerdings zeigten α8-/--MMZ eine geringere Ausbreitung
und Adhäsion auf Kollagen I, ähnlich wie auf Fibronektin. Wie schon zuvor in diesem
Kapitel diskutiert, spricht auch dieser Befund für eine eher regulatorische als direkte
Funktion von α2-Integrin.
3.4 α8β1-Integrin und mesenchymale Marker
Passend zu der unveränderten mesenchymalen Morphologie der VSMZ (Abb. 10), wurden
sowohl die mesenchymalen Marker wie α-SMA, Desmin und Vimentin sowie der
epitheliale Marker E-Cadherin in den WT- und α8-/-VSMZ gleich stark exprimiert [125,
135]. Im Gegensatz dazu unterlaufen α8-/--MMZ eine starke Veränderung des WT-
Phänotyps zu einer mehr epithelial-ähnlichen Zellstruktur. Zudem ist die Expression von
mesenchymalen Markern wie α-SMA und Desmin herunterreguliert, während der
epitheliale Marker E-Cadherin leicht erhöht exprimiert wird. Eine mögliche Deutung wäre,
dass die MMZ durch den Verlust von α8-Integrin eine MET (mesenchymale-epitheliale
Transition), den reversiblen Prozess der EMT (epitheliale-mesenchymale Transition)
durchlaufen. Beide Prozesse spielen eine wesentliche Rolle in der Embryonalentwicklung
und in der Entstehung einer Fibrose. In vitro konnte gezeigt werden, dass die
Herunterregulation von E-Cadherin mit dem Verlust des epithelialen Phänotyps direkt
korrelierten und mesenchymale Marker wie Vimentin, Fibronektin und α-SMA die
Transition von epithelialen zu mesenchymalen Zellen (EMT) kennzeichnen [168]. Dieses
Phänomen ist in Modellen von renalen fibrotischen Erkrankungen häufig anzutreffen. Die
Reversion dieses Prinzips wird MET genannt und stellt die Transition von mesenchymalen
Zellen zu epithelialen Zellen dar [169, 170]. Bis heute ist dieser Vorgang mehrfach
beschrieben worden, wobei keine einheitlichen Marker zur Charakterisierung der EMT
bekannt sind. Yang und Liu unterteilen die EMT in vier Abschnitte, die für die Vollendung
der EMT auf zellulärem Level nötig sind [171]. Nicht in allen Punkten können unsere
Daten den reversen Prozess der EMT, die MET widerspiegeln. So ist z.B. Vimentin als ein
mesenchymaler Marker in den α8-/--MMZ nicht herunterreguliert, sondern liegt vermehrt
exprimiert vor. Eine mögliche Erklärung wäre eine Art Übergangsphase im Verlauf der
MET, wie sie von Strutz F. et al., 1996 für EMT beschrieben wurde. In diesem Stadium
der EMT exprimieren die Zellen eine Kombination aus epithelialen und mesenchymalen
Markern [172]. Ein weiterer Widerspruch ergibt sich aus der erhöhten Migrationsrate von
Diskussion
67
α8-/--MMZ bezüglich der WT-MMZ. Denn die MET geht mit dem Verlust von
kontraktilen und migratorischen Fähigkeiten einher [173, 174]. Zahlreiche Studien der
letzten Jahre untersuchten den Einfluss der EMT auf renale fibrotische Läsionen [175,
176], aber der Zweifel wächst, ob dieser Prozess in vivo überhaupt existiert und eine Rolle
spielt [177]. Angelehnt an den regulatorischen Einfluss des α8-Integrins auf den
Differenzierungszustand von VSMZ [99, 126, 127] und Epithelzellen [115] wäre auch
denkbar, dass der Mangel an α8-Integrin zu einer Dedifferenzierung der MZ führt. Somit
würden die MZ keinen epithelialen, sondern vielmehr einen undifferenzierten, den
mesenchymalen Stammzellen ähnlichen Phänotyp annehmen. Es bleibt aber die Frage
ungeklärt, warum in den uns vorliegenden kultivierten VSMZ α8-Integrin weder als
Marker noch als Regulator des Differenzierungszustands fungiert, wie es in transient α8-
Integrin defizienten VSMZ (si itga8 VSMZ) beschreiben wurde [99, 127]. Möglicherweise
tragen noch unbekannte kompensatorische Mechanismen der α8-/--VSMZ zu den
unterschiedlichen Befunden mit si itga8 VSMZ bei (s. 3.3 Kompensatorische
Mechanismen).
3.4.1 Vermehrte Bildung von Vimentin in α8-/--MMZ
Vimentin ist ein ca. 57 kDa großes Zytoskelettprotein. Es gehört wie Desmin zu dem Typ-
3 Intermediärfilament und ist typischerweise in mesenchymalen Zellen, wie Fibroblasten,
Endothelzellen, MZ und VSMZ vorzufinden [179]. Studien zeigten, dass Vimentin u.a. am
Nukleus, am endoplasmatischem Retikulum (eR) und an Mitochondrien binden kann und
somit anscheinend eine wichtige Funktion in der Verankerung der Organellen im Zytosol
einnimmt. Zudem wurde publiziert, dass Intermediärfilamente zusammen mit den
Mikrotubuli das Aktinzytoskelett verstärken und dadurch die polygonalen Aktin-
Netzwerke organisieren, die für die Filopodien-Formierung während der Migration einer
Zelle notwendig sind [180]. In Ingber D. E. et al., 1994 wird das Modell der Tensegrity
beschrieben, d.h. die drei Zytoskelettstrukturen, Aktinfilamente, Mikrotubuli und
Intermediärfilamente, bilden ein Netzwerk, dass sich gegenseitig stabilisiert ohne
miteinander (zwingend) verbunden zu sein [180]. Integrine spielen eine regulatorische
Funktion in der Signalweiterleitung durch mechanischen Stress auf das Zytoskelett im
Tensegrity-Modell [181]. Im Vergleich zu den WT-MMZ unterliegen α8-/--MMZ einer
erhöhten Migrationsrate. Erhöhte Migration bedeutet erhöhte Zug- und Scherkräfte, die auf
die Zelle und ihre Organellen ausgeübt werden. Somit könnte in den betroffenen MMZ
Diskussion
68
mehr Vimentin exprimiert werden, um den Zug- und Scherkräften, durch ein stabileres
Zytoskelett, entgegenzuwirken. Passend dazu konnte in Fibroblasten aus Vimentin
knockout Mäusen im Vergleich zu Fibroblasten aus Vimentin WT-Mäusen gezeigt werden,
dass der Verlust des Vimentin-Netzwerkes im Zytoskelett zu einer geringeren
mechanischen Stabilität führt. Zudem ist eine geringere Migrationsrate in Vimentin
knockout- im Vergleich zu WT-Fibroblasten vorzufinden [178].
3.5 Einfluss von α8-Integrin auf Matrix-Metalloproteinasen (MMP)
Der Einfluss unterschiedlicher Matrixmoleküle auf Ausbreitung, Adhäsion, Migration,
Proliferation und Apoptose, wie er in der vorliegenden Arbeit auf Fibronektin, Kollagen I
und Fibrillin untersucht wurde, ist zudem beeinflusst von einem ständig stattfindenden
Umbau der ECM. Nur ein Gleichgewicht von ECM-Neusynthese und Abbau durch
Proteasen erhält die Gewebshomöostase [182]. MMP und TIMP (tissue inhibitors of
metalloproteinases) spielen eine entscheidende Rolle in der embryonalen Entwicklung
sowie in zahlreichen physiologischen Prozessen. Aber auch in pathologischen Vorgängen
wie Entzündungen und Krebserkrankungen nehmen sie eine essentielle Funktion ein [182].
MMP-2 (Gelantinase A) und MMP-9 (Gelatinase B) sind die häufigsten exprimierten
MMP im Glomerulus [136]. MMP-2 und MMP-9 sind Typ IV Kollagenasen, deren
Aktivierung und Aktivität jeweils durch einen speziellen Inhibitor reguliert wird. So wirkt
TIMP-2 hauptsächlich auf MMP-2 [77] und TIMP-1 mit hoher Affinität auf MMP-9
inhibierend [76]. So sind auch MMP-2 und MMP-9 sowie ihre Inhibitor an der
Nephrogenese sowie an Nierenerkrankungen beteiligt [183]. In vivo Untersuchungen in
Mäusen mit einer experimentell induzierten Fibrose dokumentierten, dass durch eine
verringerte MMP-2 und MMP-9 Aktivität eine Inhibition der ECM Degradierung ausgelöst
wird und dass eine zusätzliche Störung des MMP- und TIMP-Gleichgewichtes zu einer
Verschlechterung des Krankheitsbildes führte [184]. Die Befunde dieser Publikation und
meine Daten, die zeigen, dass α8-/-- und si itga8 MZ eine verminderte Expression von
MMP-2, -9 und TIMP-1 aufweisen, könnten erklären, dass es im Glomerulus der α8-/--
Mäusen im Vergleich zu WT-Mäusen zu Veränderungen bei der Matrixablagerung kommt
[27] und glomeruläre Schäden in α8-/--Mäusen schlechter ausheilen [122]. Dass der
Mangel an α8-Integrin in MZ direkt zu einer reduzierten Expression von MMP-2 und
Diskussion
69
MMP-9 führen kann, wird durch die Studie unterstützt, die zeigt, dass es infolge einer
Inhibition von Integrinen zu einer geringeren Expression dieser zwei MMP kommt [137].
MMP und ihre natürlichen Inhibitoren TIMP sind aber auch wichtige Regulatoren für
zelluläre Prozesse wie Adhäsion, Migration und Proliferation. Eine Voraussetzung für
Migration ist die zelluläre Bewegung durch das dichte Netz der ECM. Deshalb ist eine der
wichtigsten Aufgaben von MMP, den Zellen einen Durchtritt durch die ECM durch
lokalen Abbau der Matrix zu ermöglichen. Die Inhibition von MMP verhinderten
Zellmigration und Invasion [185]. Überproduktion von MMP führten dagegen zu einer
erhöhten Invasion von Zellen [186, 187]. Daher war es überraschend, dass α8-/--MMZ trotz
erniedrigter Expression von MMP leichter migrierten. Neben MMP kann auch CTGF
(connective tissue growth factor) auf die Migration sowohl von VSMZ [138] als auch von
MZ [139] einwirken. Zudem induziert CTGF in renalen Fibroblasten eine erhöhte MMP-2
Aktivität und Expression [188]. Da CTGF in α8-/--MMZ sowohl auf Transkriptions- als
auch auf Translationsebene bis auf ein geringes basales Niveau herunterreguliert war,
könnte es somit zu einer geringeren Expression von MMP-2 und MMP-9 geführt haben.
Die erhöhte Migrationsrate in α8-/--VSMZ könnte mit der vermehrten CTGF Expression
erklärt werden. Denn eine Überexpression von CTGF in VSMZ führt zu einer einer
gesteigerten Migration [189]. Ob und inwieweit die α8-Integrin abhängigen
regulatorischen Aktivitäten durch MMP oder TIMP in den VSMZ stattfinden, muss noch
untersucht werden.
3.6 Welche Rolle spielt der Rho/ROCK–Signalweg?
Da Integrine als bidirektionale Signaltransduktoren agieren, gelangen extrazelluläre
Informationen über die Integrin-vermittelte ECM-Verankerung an das Zytoskelett und
intrazelluläre Signale können die Integrin-ECM Bindung induzieren [35, 39, 190].
Integrine tragen über outside-in signaling zur Aufrechterhaltung des Phänotyps einer Zelle
bei. Dabei werden Signale aus der ECM von Transmembranrezeptoren wie Integrinen an
das Zytoskelett weitergeleitet. Kleine GTPasen aus der Rho-Familie spielen dabei eine
bedeutende Rolle [53, 191]. Sie übernehmen aber nicht nur die Weiterleitung des Integrin-
abhängigen Signals zur Kontrolle der Organisation des Zytoskeletts, sondern regulieren
auch die Expression von CTGF [192, 193]. In MZ wurde ein direkter Zusammenhang
zwischen CTGF und Aktin-Abbau und somit auf den Umbau des Zytoskeletts beschrieben.
Diskussion
70
Durch den Abbau der Stressfasern erfolgte eine Inhibition der CTGF Expression [139,
194]. In Fibroblasten wurde bereits nachgewiesen, dass die Induktion von CTGF
(connective tissue growth factor) über ROCK verläuft und durch die Inhibition von ROCK
CTGF geringer exprimiert wird [140, 195]. Eine Arbeit in epithelialen Darmzellen
(intestinal crypt cells) zeigte zudem eine α8-Integrin abhängige Aktivierung des
RhoA/ROCK Signalweges sowie den Einfluss dieser Aktivierung auf Stressfasern [115].
Deshalb wurde die Rolle der kleinen GTPase RhoA bei der Regulation der α-SMA- und
CTGF-Expression in Abhängigkeit von α8-Integrin evaluiert. Die Behandlung der Zellen
mit dem ROCK Inhibitor Y 27632 zeigte, dass die Inhibition des RhoA/ROCK-Weges in
WT-MMZ zu einer reprimierten Expression von CTGF und α-SMA führte. α-SMA und
CTGF wurden in α8-/--MMZ so gering exprimiert, dass die anscheinend unveränderte
Expression durch die ROCK-Inhibition nicht wirklich beurteilt werden kann. So konnten
wir zwar zeigen, dass der RhoA/ROCK-Signalweg bei der CTGF Expression sowie bei der
Bildung und Organisation der Stressfasern in WT-MMZ beteiligt ist, aber ein Einfluss von
α8-Integrin konnte in diesem Zusammenhang nicht nachgewiesen werden. Dagegen wurde
durch die Blockierung des RhoA/ROCK-Weges CTGF in WT-VSMZ unverändert
exprimiert und widerspricht einer ROCK-regulierten CTGF-Expression. Einerseits kann
der RhoA/ROCK Signalweg in VSMZ zwar die CTGF-Expression beeinflussen, ist aber
dafür nicht unbedingt zwingend notwendig. Die Regulation von CTGF über p38 MAP-
Kinase wird als eine mögliche Alternative diskutiert. Zudem wird die CTGF-Expression
bereits als zellspezifisch reguliert beschrieben [193]. Warum der Mangel an α8-Integrin
wieder zu einer Rho/ROCK beeinflussten CTGF-Expression führt, bleibt in diesem
Zusammenhang noch unklar. Ebenso konnte in VSMZ zwar eine RhoA/ROCK abhängige
Regulation von α-SMA nachgewiesen werden, wobei aber α8-Integrin keine Rolle zu
spielen scheint. Möglich ist, dass andere Integrine als α8-Integrin an der Aktivierung des
Rho/ROCK -Weges beteiligt sind. So kann auch α5β1-Integrin über den Rho/ROCK Weg
auf die Zellmigration Einfluss nehmen [196] und somit auch auf die α-SMA Expression.
Denn Stressfasern, die aus α-SMA gebildet werden, sind typischerweise in Zellen mit
migratorischen bzw. kontraktilen Fähigkeiten vorzufinden [63]. Desweiteren sind auch
Signaltransduktionswege ohne Integrin-Liganden Bindung aktivierbar. Ebenso können
Assoziationen mit weiteren Rezeptoren wie z.B. Rezeptor-Tyrosin-Kinasen (RTK,
„receptor tyrosine kinase“) und Verknüpfungen mit weiteren Signalwegen wie z.B. dem
Ras/MAPK-Weg eine Rolle spielen (siehe Überblick [35]). In puncto Regulation der
Diskussion
71
Stressfaserformierung und der CTGF-Expression bleiben noch viele Fragen offen.
Hinsichtlich meiner Befunde erscheint aber zu diesem Zeitpunkt gesichert, dass sich die
Regulation in MZ von der in VSMZ unterscheidet.
3.7 Die Interaktion von Fibrillin-1 und α8β1-Integrin
Fibrillin-1 wird sowohl in der Media der Arterie als auch in der mesangialen Matrix des
Glomerulus exprimiert [108]. Dort wird Fibrillin-1 nicht nur von den glomerulären MZ
sezerniert [110], sondern ist auch in der Lage Adhäsion, Ausbreitung, Migration und
Proliferation von MZ zu fördern [112]. Zudem konnte Fibrillin-1 während einer
glomerulären Erkrankung in Glomeruli vermehrt detektiert werden [112]. Im Gegensatz
dazu führte eine verringerte Fibrillin-1 Expression nach Induktion eines glomerulären
Schadens zu milderen Nierenschäden [197] und zu einer reduzierten Proliferation [112].
Weiterhin wird Fibrillin-1 als ein möglicher Ligand von α8-Integrin angesehen [106]. Über
welche Bindesequenz diese zwei Moleküle miteinander verbunden sind, ist noch nicht
geklärt. Da bereits für die RGD-bindenden Integrine α5β1 und αvβ3 nachgewiesen wurde,
dass sie über das RGD-Motiv an Fibrillin-1 binden können [107], war zu erwarten, dass
sich α8-Integrin ebenfalls RGD-abhängig an Fibrillin-1 haftet. Es konnte zunächst gezeigt
werden, dass die Adhäsion und Ausbreitung der MMZ, VSMZ und siRNA behandelten
RMZ mit Fibrillin-1 von der Anwesenheit des RGD-Motivs beeinflusst war. Allerdings
schien die Anwesenheit von α8-Integrin für die Adhäsion und Ausbreitung nur in MZ eine
Rolle zu spielen. Jedoch zeigten weitere Untersuchungen mit blockierenden cRGD-
Peptiden im Vergleich zwischen WT- und α8-/--MMZ auf, dass die Adhäsion von MMZ
nicht von α8-Integrin abhängig war. Demnach erscheint es wahrscheinlich, dass Fibrillin-1
über seine RGD-Bindesequenz über seine bereits bekannten Integrinrezeptoren wie α5β1
und αvβ3 mit den Zellen interagiert und kein Ligand von α8-Integrin ist. Dennoch könnte
eine direkte oder indirekte Interaktion zwischen α8-Integrin und Fibrillin-1 existieren Wie
anhand von α5β1-vermittelter Interaktion von Zellen mit Fibrillin gezeigt werden konnte,
wird die Zelladhäsion durch EGF-like Domänen extrem verstärkt [107]. Da wir nur mit
Fibrillinfragmenten gearbeitet haben, könnten diese notwendigen synergen Regionen
fehlen. Durch Untersuchungen mit einem Gesamtmolekül von Fibrillin-1 könnte die
Beteiligung von synergen Regionen an der Adhäsion und Ausbreitung abgeklärt werden.
Material und Methoden
72
4 Material und Methoden
4.1 Material
4.1.1 Chemikalien
Chemikalien und Medien Bezugsquelle
β-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Acrylamid-Bis Lösung (Rotiphorese30) Roth, Karlsruhe
Amidoschwarz Merck, Darmstadt,
Ammoniumpersulfat (APS) Sigma-Aldrich, Taufkirchen
BCA Protein Assay Pierce, Rockford, IL,USA
Hoechstfarbe Hoechst, Frankfurt
Bromphenolblau Serva, Heidelberg
BSA A7030 Sigma-Aldrich, Taufkirchen
3-[3-Cholamidopropyl)-Dimethyl-ammonio]-1-Propansulfonat (Chaps)
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
(SP-4-2)-Diammindichloroplatin(II) (cis-Platin)
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Kollagen I (3,25 mg/ml) Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA
Kollagenase Type I Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Complete Protease Inhibitor Cocktail Tabletten
Roche, Mannheim
Coomassie Brilliant Blue G 250 Serva, Heidelberg
cyclisches RAD (Cyclo(-Arg-Ala-Asp-D-Phe-Val)
Bachem, Weil a. Rhein
cyclisches RGD (Cyclo(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val)
Bachem, Weil a. Rhein
DEVD-AMC Biomol, Plymouth Meeting, PA, USA
Dimethylsulfoxid (DMSO) Merck, Darmstadt
DMEM Medium High Glucose PAA, Cölbe
DMF (Dimethylformamid) Merck, Darmstadt
Material und Methoden
73
Elastase aus Schweinepankreas (200 U/mg) Serva, Heidelberg
Essigsäure 100% Merck, Darmstadt
Ethanol Roth, Karlsruhe
Ethylendiaminotetraessigsäure (EDTA) Merck, Darmstadt
Fibronektin (rein) aus menschlichem Plasma Roche, Mannheim
Fötales Rinderserum (FCS) PAA, Cölbe
Gelatine G1890 Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Glycin Merck, Darmstadt
Hämatoxylin-Lösung modifiziert nach Gill III für die Mikroskopie
Merck, Darmstadt
HiPerFect Transfection Reagent Qiagen, Hilden
Insulin aus Rinderpankreas Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Isopropanol Merck, Darmstadt
ITS-Supplement Roche, Mannheim
L-Glutamin 100x 200mM PAA, Cölbe
Magermilchpulver Lasana Humana Milchunion eG, Herford
Magnesiumchlorid (MgCl2) Merck, Darmstadt
Methanol Merck, Darmstadt
Mowiol Merck, Darmstadt
Natrium-Azid Merck, Darmstadt
Natriumchlorid (NaCl) Merck, Darmstadt
Natriumdodecylsulfat (SDS) Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Natriumhydroxid (NaOH) Merck, Darmstadt
PageRuler Plus Prestained Protein Ladder Fermentas,St.Leon-Rot
PageRuler Prestained Protein Ladder Fermentas,St.Leon-Rot
PBS Dulbecco Pulver Biochrom AG, Berlin
Penicillin/Streptomycin 100x PAA, Cölbe
Paraformaldehyd (PFA) Merck, Darmstadt
Pferdeserum PAA, Cölbe
Oligonukleotide (Primer) MWG Biotech, Ebersberg
Material und Methoden
74
Opti-MEM Invitrogen, Darmstadt
Protease Inhibitor Tabletten Roche Diagnostics GmbH, Mannheim
Quick Diff Lösungen 1 und 2 Dade Behring Marburg GmbH, Marburg
Roti-Block 10x Konzentrat Roth, Karlsruhe
Rotiphorese Gel 30 Roth, Karlsruhe
Salzsäure (HCl) Merck, Darmstadt
SYBR Green PCR Mastermix Applied Biosystems, Darmstadt
Taq DNA-Polymerase Qiagen, Hilden
Tetramethylethylendiamin (TEMED) Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris) Merck, Darmstadt
Triton-X 100 Serva, Heidelberg
Trypsin Inhibitor Type-II-S Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Trypsin/EDTA 10x PAA, Cölbe
Tween 20 (Polyoxyethylensorbit-Monolaurat)
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Vitronektin-100 Nutacon, Leimuiden, NL
Y-27632 (ROCK-Inhibitor) Sigma-Aldrich, Taufkirchen
4.1.2 Kits
Kits Bezugsquelle
5-Bromo-2`-deoxyuridine Labeling und Detektion Kit II
Roche, Mannheim
ECL Plus Western Blotting Detektion Reagenz, Amersham
GE Healthcare, Uppsala, Schweden
QIAshredder Qiagen, Hilden
RNase-freie DNase Set Qiagen, Hilden
RNeasy Mini Kit Qiagen, Hilden
Taq PCR Core Kit Qiagen, Hilden
Material und Methoden
75
4.1.3 Verbrauchsmaterialien
Materialbezeichnung Bezugsquelle
Chamberslide VWR International, Darmstadt
Deckgläser VWR International, Darmstadt
Eppendorf-Reaktionsgefäße (Eppendorfcups)
Eppendorf, Hamburg
Fettstift (Liquid Blocker) Science Services, München
Hybond- ECL Nitrocellulose Membrane, Amersham
GE Healthcare, Uppsala, Schweden
Hybond-P PVDF Membrane Amersham GE Healthcare, Uppsala, Schweden
Kryoröhrchen Greiner Bio-One, Frickenhausen
8-Kammer Objektträger BD Falcon, Heidelberg
Petrischalen versch. Größen BD Falcon, Heidelberg
Röntgenfilm Fuji Medical Super RX Fuji Foto, Tokyo, Japan
Zellkulturplatten, 96-Well PAA, Cölbe
Tyler Siebe (versch. Porengröße) VWR International GmbH, Darmstadt
Whatman-Papier Hartenstein, Würzburg
Zellkulturflaschen Greiner Bio-One, Frickenhausen
Zellschaber 25cm steril Sarstedt, Nümbrecht
4.1.4 Geräte und Zubehör
Materialbezeichnung Bezugsquelle
ABI PRISM 7000 Sequence Detection System
Applied Biosystems, Weiterstadt
AIDA Image Analyzer 2.1 Auswertungs-Software
Raytest, Berlin
Anatomische Pinzetten für Aorta Fine Science Tools, Heidelberg
Biophotometer (DNA) Eppendorf, Hamburg
Boydenkammer Neuro Probe, Inc., Gaithersburg, USA
Brutschrank Hera Cell 240 Heraeus, Hanau
Kryo Einfrierbox, Nalgene Thermo Scientific, Bonn
Material und Methoden
76
Elektrophoresekammer (DNA-Gele) Biorad, München
Elektrophorese Power Supply Consort, Turnhout, Belgien
Elisareader Dynatech MR700 Dynatech, Denkendorf
Fluoreszenzmikroskop Nikon, Düsseldorf Leica, München,
Gefrierschrank -80°C Forma Scientific, Frankfurt
Gel-Dokumentation Biometra, Göttingen
GraphPad Prism 5 Software GraphPad, San Diego, CA, USA
Heizblock Thermomixer 5436 Eppendorf, Hamburg
Kühlschränke Bosch, Stuttgart Liebherr, Ochsenhausen
Kühl-Tischzentrifuge, Heraeus ThermoFisher, Bonn
Leica DC 200 Kamera Leica, Herbrugg, Schweiz
Leica DC Viewer Software Leica, Herbrugg, Schweiz
Leica Lichtmikroskop Leica, Bensheim
Lumi Imager Fujifilm, Düsseldorf
Magnetrührer RCT Basic IKA Labortechnik, Staufen
Membran für Boydenkammer: PVP frei, 25x80mm, 8µm Poren
Neuro Probe, Inc., Gaithersburg, USA
Mastercycler (PCR) Eppendorf, Hamburg
MetaVue imaging Software Molecular Devices, Ismaning
Mikrotest Platte 96-Well F Sarstedt, Nümbrecht
Mikrowelle Sharp Electronics, Hamburg
Neubauer Zählkammer Hartenstein, Würzburg
Olympus CK40 Mikroskop Olympus, Hamburg
pH-Meter CG 812 Schott Geräte, Ludwigshafen
Pipetten Greiner Bio-One, Frickenhausen
Pipettierhilfe Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt
Power Pac 300 Bio-Rad, München
Primer express version 2.0 Software Applied Biosystems, Darmstadt
Röntgenkassette (X-Omatic screen) Kodak, Stuttgart
Material und Methoden
77
Scanner Scan Jet 6300C Hewlett-Packard GmbH, Nürnberg
Schere für Aorta Fine Science Tools, Heidelberg
Schütteltisch KS250 IKA Labortechnik, Staufen
Spektrometer Spectra Fluor Tecan, Salzburg, Österreich
SPSS Software SPSS Inc., Chicago, USA
Sterilbank BDK Luft- und Reinraumtechnik GmbH, Sonnenbühl-Genkingen
Thermocycler T1 Biometra, Göttingen
Transblot SD semidry transfer cell Bio-Rad, München
Ultraschallgerät Sonoplus HD 70 BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlin
Vortexer MS1 Minishaker IKA Labortechnik, Staufen
Waage Sartorius universal Sartorius, Göttingen
Wasserbad Köttermann Labortechnik, Uetze
Zellzähler Cell Counter Countess Invitrogen, Darmstadt
Zentrifuge 5810R Eppendorf, Hamburg
Zentrifuge CR 322 ThermoFisher, Schwerte
4.1.5 Puffer und Lösungen
4.1.5.1 Zellkultivierung
Penicillin/Streptomycin-Stammlösung 10000U/ml Streptomycin
10000U/ml Penicillin
Insulin-Stammlösung: 5mg/ml 100mg in 20ml 2% Essigsäure lösen
D10+-Medium 500ml DMEM
50ml FCS
5ml Penicillin/Streptomycin
0,5ml Insulin
D20+-Medium 500ml DMEM
Material und Methoden
78
100ml FCS
5ml Penicillin/Streptomycin
0,5ml Insulin
D0.1+-Medium (Hungermedium) 500ml DMEM
5ml FCS
5ml Penicillin/Streptomycin
0,5ml Insulin
Einfriermedium jeweiliges Wachstumsmedium mit 10% DMSO versetzen
1x Trypsin/EDTA 10x Trypsin/EDTA mit 1xPBS verdünnen
4.1.5.2 Kultivierung von MZ aus den Glomeruli
ITS-Supplement (Insulin-Transferrin-Selen)-Stammlösung
50mg in 1ml dH2O lösen
Kultivierungslösung 500 ml D20
100µl ITS-Stammlösung
(Endkonzentration: 5µg/ml Insulin, 5µg/ml Transferrin, 5ng/ml Selen)
4.1.5.3 VSMZ-Isolation aus der Mausaorta
Enzymlösung 24mg Kollagenase Typ I
8mg Elastase
8mg Trypsin Inhibitor
24ml D20+
Waschpuffer 1% Penicillin/Streptomycin in 1xPBS
Material und Methoden
79
4.1.5.4 Proteinisolierung und –auftrennung
RIPA-Proteinlysepuffer 50mM HEPES pH 7,4
150mM NaCl
1% Triton X-100
1mM EDTA
+ Protease-Inhibitor Cocktail
10% SDS-Lösung 10g SDS
ad 100ml dH2O
Lower Tris 4x 1,5M Tris
0,4% SDS (aus 10% Stammlösung)
pH 8,8 mit 12N HCL
Upper Tris 4x 0,5M Tris
0,4% SDS (aus 10% Stammlösung)
pH 6,8
10% APS 100g/l Ammoniumperoxydisulfat
lösen in dH2O
Sammelgel Rotiphorese Gel30
0,5M Upper Trispuffer, pH 6,7
10% APS Lösung
ad dH2O
Trenngel Rotiphorese Gel 30
3M Lower Trispuffer, pH 8,9
Material und Methoden
80
TEMED
10% APS Lösung
ad dH2O
Reservoirpuffer 10x (Gel-Laufpuffer) 1M Tris
0,77M Glycin pH 8,3
1% SDS
TBS 10x 0,5M Tris Base
1,5M NaCl, pH 7,6
TBS/T 10% 10x TBS
0,06% Tween 20
Proben-Puffer 10mM EDTA
(bei reduzierten Bedingungen vor dem Gebrauch frisch mit β-Mercaptoethanol versetzen)
300mM Tris, pH 6,9
10M Harnstoff
0,1% SDS
einige Tropfen gesättigte
Bromphenolblau - Lösung
Towbin-Puffer 4x 768mM Glycin
100mM Tris/HCl, pH 8,3
5,2mM SDS
Blotpuffer 25% Towbin Puffer
20% Methanol
Material und Methoden
81
Blockierungslösung 1x Rotiblock in TBS/T,
5 % Magermilch in TBS/T
oder 5% Pferdeserum in TBS/T
Amidoschwarz-Färbelösung 0,1% Amidoschwarzpulver
25% Isopropanol
10% Eisessig
Entfärberlösung für Amidoschwarz 25% Isopropanol
10% Eisessig
Coomassielösung 1,25g Coomassie Brilliant Blau (R250)
450ml Methanol/dH20 1/1
50ml Eisessig
Entfärberlösung für Coomassie 450ml Methanol/dH20 1/1
50ml Eisessig
Stripp-Puffer 5x, pH 2,5 37,5g Glycin
73,05g NaCl
ad 500ml dH2O
4.1.5.5 Immunzytochemische Fluoreszenzfärbung
Blockierungslösung 2% BSA in 1xPBS, sterilfiltriert
80°C, 30min hitzeinaktiviert
Verdünnungslösung für Antikörper 1% FCS in 1xPBS, sterilfiltriert
Material und Methoden
82
4.1.5.6 Adhäsions- und Ausbreitungsassay
Blockierungslösung 2% BSA in 1xPBS, sterilfiltriert
80°C, 30min hitzeinaktiviert
Inhibitorische Peptide 10mM cRGD-Peptid in dH2O/1xPBS (2:3)
10mM cRAD-Peptid in dH2O/1xPBS (2:3)
4.1.5.7 Migration in der Boydenkammer
Gelatinelösung 0,1mg/ml Gelatine in 0,1% Essigsäure
Chemotaxismedium 500ml DMEM
5ml Penicillin/Streptomycin
0,5ml Insulin
0,1% BSA
4.1.5.8 Proliferationsassay
1x Trypsin/EDTA 10x Trypsin/EDTA mit 1xPBS verdünnen
Waschpuffer 1xPBS
Ethanol Fixans pH 2,0 70% Ethanol in 50mM Glycinpuffer
Substratpuffer pH 9,5 100mM Tris/HCL
100mM NaCl
50mM MgCl2
4.1.5.9 Caspase-3-Aktivität-Assay
cis-Platin-Stammlösung 25mg/ml in DMF
D0 (serumfreies DMEM) 500ml DMEM
5ml Penicillin/Streptomycin
Material und Methoden
83
0,5ml Insulin
DTT-Stammlösung 1M DTT
Lyse- und Messpuffer, pH 7,5 100mM HEPES
10% Sucrose
0,1% Chaps
1mM EDTA
Fluoreszenzsubstrat 7,2mM DEVD-AMC in DMSO
Material und Methoden
84
4.2 Methoden
4.2.1 Zellkultur
Für die Durchführung der Experimente wurden die Zellen in 10cm Petrischalen kultiviert
und expandiert. Je nach Zelltyp wurden die Zellen ein– bis zweimal pro Woche unter
keimfreien Bedingungen in einer sterilen Arbeitsbank passagiert. Dafür wurden die Zellen,
nachdem das Zellkulturmedium entfernt worden war, einmal mit sterilem 1xPBS
gewaschen und mit 3ml Trypsin/EDTA behandelt, um die Zellen von der Kulturschale zu
lösen. Die enzymatische Reaktion wurde nach fünfminütiger Inkubationszeit bei 37°C mit
gleichvolumigem FCS-haltigem Medium gestoppt. Die Zellsuspension wurde in ein
Falcon-Tube überführt, mit 1000rpm bei Raumtemperatur abzentrifugiert und anschließend
im entsprechenden Zellmedium resuspendiert und zur Weiterzucht verdünnt ausgesät. In
der Regel wurden die Zellen 1 Tag vor den Versuchen dementsprechend behandelt und die
dafür benötigte Zellzahl mittels Neubauer-Zellkammer bzw. Cell Counter bestimmt.
4.2.1.1 Einfrieren von Zellen
Zum Einfrieren der Zellen wurden die Zellen wie oben beschrieben in eine Zellsuspension
überführt und abzentrifugiert. Das Zellpellet wurde in einer 1:1 Mischung aus FCS und
DMSO/FCS (20%) resuspendiert und in Kyroröhrchen überführt. Diese wurden in mit
Isopropanol gefüllte Einfrierboxen bei -80°C eingefroren, wobei die Einfrierbox garantiert,
dass die Temperatur kontrolliert 1°C/h heruntergekühlt wird, um Kristallisierung zu
vermeiden. Einfriermedium, Kyroröhrchen und Zentrifuge wurden zur Verwendung
heruntergekühlt. Nach wenigen Tagen können die Röhrchen zur längeren Aufbewahrung
in den flüssigen Stickstoff umgelagert werden.
4.2.1.2 Auftauen der Zellen
Zum Auftauen der Zellen wurden die in Stickstoff gelagerten Kyroröhrchen möglichst
rasch erwärmt; dies erfolgte am besten im 37°C warmen Wasserbad. Die aufgetaute
Zellsuspension wurde in das entsprechende Zellmedium überführt, kurz abzentrifugiert und
mit frischem Medium in eine Zellkulturschale überführt.
Material und Methoden
85
4.2.1.3 Zellisolation von Ratten-Mesangiumzellen (RMZ)
Die männlichen Sprague-Dawley Ratten wurden von Charles River (Deutschland)
bezogen.
RMZ wurden nach der Siebmethode [93] aus der Niere von Sprague Dawley Ratten
isoliert. Nieren männlicher Sprague-Dawley Ratten von ca. 150g Körpergewicht wurden
unter sterilen Bedingungen entnommen und die Glomeruli mittels Siebtechnik isoliert.
Dazu wurden die Nieren entkapselt, das Nierenbecken und Mark entfernt und das
restliche Gewebe mit Hilfe einer Rasierklinge zerkleinert. Diese Nierenmasse wurde dann
durch Tyler Siebe unterschiedlicher Porengrößen von 106µm, 180µm und 75µm passiert.
Ca. 9000 der in dem 75µm Sieb angereicherten Glomeruli wurden in eine 75cm2
Zellkulturflasche mit D20+-Medium überführt. Zur Kultivierung wurde das D20+-Medium
mit 5µg/ml Transferrin und 5ng/ml Selen (ITS Supplement) versetzt und bei 5% CO2,
100% Luftfeuchtigkeit und 37°C gehalten. Aus den kultivierten Glomeruli wuchsen im
Verlauf einer Woche Zellen aus, die zunächst ein Gemisch aus Epithel-, wenig Endothel-
und RMZ darstellten. Nach der 3. Passage blieben nahezu ausschließlich MZ in der
Kultur erhalten. Für die Weiterkultur wurde dem Medium kein Selen und Transferrin
mehr zugefügt und die FCS Konzentration auf 10% gesenkt (D10+). Für die folgenden
Versuche wurden nur die Zellen aus dem Isolat 19 von Passage 5 bis 18 verwendet.
4.2.1.4 Zellisolation von Maus-Mesangiumzellen (MMZ)
Mäuse mit einer genetischen Deletion der α8-Integrinkette wurden uns von Prof. Uli
Müller (Scripps Institute, La Jolla, CA, USA) zur Verfügung gestellt und in unserem
Tierstall als heterozygote Zucht gehalten.
MMZ wurden wie von Hartner A. et al., 2002 [122] beschrieben, aus α8-Integrin
defizienten (α8-/-) und Wildtyp (WT)-Mäuseglomeruli nach der Siebmethode isoliert.
Nieren männlicher Wildtyp und α8-/--Mäuse von ca. 15g Körpergewicht wurden analog
der Rattennieren behandelt. Hier wurden jedoch Siebe der Porengrößen 63µm, 75µm und
38µm verwendet. Die Kulturbedingungen entsprachen den Bedingungen für die
Rattenzellen. Aus den Glomeruli wuchsen nach wenigen Tagen Zellen aus und nach
einigen Wochen der Kultivierung begannen dann die MMZ zu proliferieren, während
andere Zelltypen abstarben. Die verbliebenen Zellen wurden nach dem Auswachsen und
der Vermehrung mittels Immunzytochemie wie von Bieritz B. et al., 2003 beschrieben
Material und Methoden
86
und Elektronenmikroskopie charakterisiert. Für die folgenden Versuche wurde das Isolat
1 der WT-MMZ und das Isolat 8 der α8-/--MMZ jeweils von Passage 4 bis 19 verwendet.
4.2.1.5 Zellisolation von Maus-vaskulären glatten Muskelzellen (VSMZ)
VSMZ wurden aus der Mausaorta ähnlich wie aus der Rattenaorta, wie bei Strehlow K. et
al., 2003 beschrieben, frisch aus WT- und α8-/--Mäuseaorten isoliert, kultiviert und nur von
Passage 1 bis 2 verwendet. Alle Schritte erfolgten soweit nicht anders angegeben auf Eis
und mit gekühlten sterilen Lösungen.
Die Aorten wurden präpariert und für weitere Bearbeitung in gekühltes 1xPBS mit 1%
Penicillin/Streptomycin überführt. Unter der Sterilbank wurden die Aorten mittels Pinzetten
von Fett- und Bindegewebe befreit. Anschließend wurden die Aorten in eine Enzymlösung
überführt und für 15min bis 20min bei 37°C im Brutschrank inkubiert. Die angedauten
Aorten wurden in 1xPBS mit Penicillin/Streptomycin gewaschen und die Adventitia mit 2
anatomischen Pinzetten gelöst. Die Aorten wurden mit einer Schere in möglichst kleine
Stücke geschnitten und erneut in die Enzymlösung überführt und unter ständigem Schütteln
bei 37°C verdaut, bis die Aorten kaum noch sichtbare Struktur zeigten (max. 1h). Die
Zellsuspension wurde für 2min bei 5000rpm abzentrifugiert, das Zellpellet in 1ml D20+
aufgenommen und in eine 3cm Zellkulturschale ausgesät. Die Charakterisierung der Zellen
erfolgte über Immunfärbung mit α-Glattmuskel-Aktin (α-SMA) Antikörper.
4.2.2 Elektronenmikroskopie
Für elektronenmikroskopische Analysen wurden Nierengewebe oder kultivierte Zellen in
3% Glutaraldehyd fixiert und in Epon-Araldit eingebettet. Davon wurden mit einem
Diamantmesser Ultradünnschnitte (0,08µm) angefertigt, die in einem Zeiss
Elektronenmikroskop EM107 (Zeiss, Oberkochen) ausgewertet wurden.
4.2.3 Proteinanalyse
4.2.3.1 Proteinisolation
Die zu erntenden Zellen wurden im Medium abgekratzt, in ein Falconröhrchen überführt
und bei 1000rpm abzentrifugiert. Das Zellpellet wurde zweimal mit kaltem 1xPBS
gewaschen und in 100µl Lysepuffer aufgenommen und in ein Eppendorfcup transferiert.
Material und Methoden
87
Für 15min bis 30min folgte die Lyse auf Eis, wobei zwischendurch gevortext wurde. Nach
zehnminütigem Zentrifugieren bei 13.0000rpm wurde der proteinhaltige Überstand
aliquotiert und bei -20°C gelagert.
4.2.3.2 Protein-Konzentrationsbestimmung
Die Konzentrationsbestimmung der Proteine erfolgte mit dem BCA-Assay von Pierce in
einer Doppelbestimmung. Diese Nachweismethode beruht auf einer Farbreaktion durch
Ausbildung eines Biuretkomplexes (blau-violett), dessen Absorptionsspektrum bei 550nm
ein Maximum besitzt. Durch das Mitführen einer Standardreihe konnte auf den
Proteingehalt der Proben geschlossen werden, wobei der jeweilige Verdünnungsfaktor
berücksichtigt werden musste. Nach einer Inkubationszeit von 30min bei 37°C erfolgte die
photometrische Messung in 96-Well-Platten.
4.2.3.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE )
Um die Proteine der Größe nach aufzutrennen, wurde die Methode der sogenannte SDS-
Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) gewählt. Das Detergenz Sodium-Dodecyl-
Sulfat (SDS) führt zu einer vollständigen Denaturierung der Proteine, so dass die
Wanderungsgeschwindigkeiten der Proteine nur noch von ihrem Molekulargewicht
abhängig sind.
Die polymerisierten Gele mit 1,5mm Dicke wurden in eine Vertikallaufkammer
eingespannt. Vor dem Auftragen auf das Gel wurden die Proben in der gewünschten
Konzentration (30µg-100µg) auf 20-40µl Volumen mit dH2O aufgefüllt und anschließend
mit 5x Probenpuffer versetzt.
Die Proteinlösungen wurden 5min bei 95°C denaturiert und nach Abkühlung in die
entsprechenden Geltaschen pipettiert. Die gelelektrophoretische Auftrennung der Proteine
erfolgte für ca. 90min bei 25mA pro Gel. Zur Größenzuordnung wurde ein
Molekularstandard mitgeführt.
Material und Methoden
88
Substanzen Trenngel Sammelgel
Mengenangabe für je 4 Gele 6% 8% 10% alle
RotiphoreseGel30 9 ml 12 ml 15ml 2 ml
3M Upper Tris (pH 8,9) 5,6 ml
1M Lower Tris (pH 6,7) 2 ml
dH2O 30 ml 27 ml 24ml 11,7 ml
TEMED 67,5 µl 24 µl
10% APS 225 µl 200µl
Tab. 4: Zusammensetzung der SDS-PAGE-Gele.
4.2.3.4 Immunoblot-Verfahren
Mit Western Blotting wird der Transfer von Proteinen auf eine Nitrozellulose- oder PVDF-
Membran bezeichnet.
Hierzu wurde das sogenannte Semidry-Verfahren benutzt. Die Membranen und die 2x3
Lagen Whatman-Papier wurden in eine Mischung aus 1 Teil Methanol und 4 Teilen
Blotpuffer (4xTowbin) äquilibriert. Bei Verwendung von PVDF-Membranen wurden diese
zur Hydratisierung zuvor in Methanol eingelegt.
Das Gel wurde im Sandwich-Verfahren zwischen je 3 Lagen Whatman-Papier mit der
äquilibrierten Membran luftblasenfrei bedeckt. Der Aufbau erfolgte so, dass der
Proteintransfer in der SemiDry Transfer Zell-Kammer bei konstanter Stromstärke von
1,0mA/cm2 Gelfläche nur in Richtung der Anode erfolgen konnte. Nach dem Blotten
wurde die Membran für 1h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4°C in Blockierungs-
Lösung geschwenkt, um unspezifische Bindungsstellen abzusättigen.
Danach wurde die Membran einmalig mit TBS/T gewaschen und über Nacht bei 4°C mit
dem Primärantikörper in der angegebenen Verdünnung (Tab. 6) unter leichtem Schwenken
inkubiert.
Material und Methoden
89
Primärantikörper Bezugsquelle Verdünnung Blockierungs- und Verdünnungslösung
Maus Anti-Human α-Glattmuskel-Aktin
DAKO, Hamburg 1:1000 in 1xRotiblock
1xRotiblock
Kaninchen Anti-Maus Vinculin
Santa Cruz, Heidelberg
1:1000 in 1% FCS/1xPBS
5% Magermilchpulver
Kaninchen Anti-Maus β-Tubulin
Abcam, Cambridge, UK
1:5000 in 1% FCS/1xPBS
5% Magermilchpulver
Ziege Anti-Maus CTGF Santa Cruz, Heidelberg
1:500 in 1% FCS/1xPBS
1xRotiblock oder 5% Pferdeserum
Ziege Anti-Maus α8-Integrin
R&D Systems, Wiesbaden
1:1000 in 1xRotiblock
1xRotiblock
Kaninchen Anti-Maus α8-Integrin
Dr. Müller, Scripps Institute, La Jolla, CA, USA
1:500 in 1% FCS/1xPBS 5% Magermilchpulver
Tab. 5: Übersicht der Primärantikörper für Immunoblot.
Am folgenden Tag wurde die Membran dreimal 5min mit TBS/T gewaschen und für
45min bis 60min mit dem Horseradish-Peroxidase-(HRP-)konjugierten Sekundärantikörper
(Tab. 7) in TBS/T bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubiert.
Sekundärantikörper Bezugsquelle Verdünnungslösung
Huhn Anti-Kaninchen IgG-HRP Santa Cruz, Heidelberg
1:10.000 in TBS-T
Huhn Anti-Maus IgG-HRP Santa Cruz, Heidelberg
1:10.000 in TBS-T
Esel Anti-Ziege IgG-HRP Santa Cruz, Heidelberg
1:50.000 in TBS-T
Tab. 6: Übersicht der Sekundärantikörper für Immunoblot.
Nicht gebundener Antikörper wurde im nächsten Waschzyklus entfernt und die Membran
für 5min in ECL Plus (Amersham) im Dunkeln inkubiert. Bei dieser Reaktion wird ein
lumigenes Substrat durch die Meerrettich-Peroxidase (HRP) des Sekundärantikörpers
oxidiert, wodurch eine Chemolumineszenz entsteht. Die Detektion erfolgte in einer
Röntgenkassette durch Auflegen eines Röntgenfilms. Nach einer bestimmten
Material und Methoden
90
Inkubationszeit (30sek bis 15min) erfolgte abhängig von der Signalintensität eine
abschließende Entwicklung (1min entwickeln, 1min wässern, 3min fixieren).
Sollte die Membran anschließend noch mit einem weiteren Primärantikörper inkubiert
werden, wurden die bereits gebundenen Antikörper durch Schwenken in Stripp -Puffer bei
50°C für 1h entfernt. Danach wurde die Membran zweimal mit je 100ml TBS-T
gewaschen und erneut blockiert. Die weitere Behandlung mit einem neuen Antikörper
entsprach dem oben genannten Vorgehen.
Um eine gleichmäßige Beladung der Proteine nachzuweisen, wurde das Gel nach dem
Blot-Verfahren über Nacht in Coomassielösung eingelegt. Zur Quantifizierung der
Proteinmenge wurden zusätzlich sogenannte „Housekeeper“-Proteine, wie z.B. β-Tubulin
oder α-Aktin, als Beladungskontrolle auf den Membranen detektiert. Alternativ dazu
wurde eine irreversible Amidoschwarzfärbung der Membran durchgeführt. Hierfür wurde
die PVDF-Membran für wenige Minuten in die Färbelösung eingelegt und anschließend
zwei- bis dreimal mit der Entfärberlösung solange geschwenkt, bis sich die angefärbten
Banden deutlich vom Hintergrund abhoben.
Der Film und die Amidoschwarz gefärbte Membran wurden nach dem Trocknen
eingescannt und die Banden mit AIDA 2.1. densitometrisch ausgewertet. Die Proteinwerte
wurden jeweils auf die Beladungskontrolle bezogen.
4.2.4 Immunzytochemische Färbungen
4.2.4.1 Charakterisierung der Mesangiumzellen
Zellen wurden einmal mit 1xPBS gewaschen, mit TE abgelöst und auf eine Zelldichte von
20.000 Zellen/ml eingestellt. Nach 1h Blockierung wurden die Kulturobjektträger zweimal
mit 1xPBS gewaschen. 500µl Zellsuspension wurde daraufhin in jede Kammer eines 8-
Kammer Objektträgers pipettiert und für 3h bei 37°C im Brutschrank inkubiert. Danach
wurden die Zellen in Methanol bei -20°C für 10min fixiert und dreimal je 5min in 1xPBS
gewaschen. Zur Blockierung wurde 30µl 100% FKS auf die einzelnen Felder des
Objektträgers pipettiert und 30min bei 37°C in der feuchten Kammer inkubiert. Daraufhin
wurden die Primärantikörper in ausgetesteter Verdünnung (Tab. 8) auf die fixierten Zellen
gegeben und bei 4°C über Nacht im feuchten Milieu inkubiert. Am nächsten Tag wurde
der Objektträger dreimal je 5min in 1xPBS gewaschen. Die Sekundärantikörperlösung
Material und Methoden
91
wurde in entsprechender Konzentration (Tab. 8) auf die einzelnen Kammern gegeben und
bei 37°C für 2h in der feuchten Kammer inkubiert. Die Kulturobjektträger wurden
wiederholt dreimal je 5min mit 1xPBS sowie zweimal mit dH20 gewaschen und
abschließend mit Mowiol eingedeckt. Die Färbungen wurden mit Hilfe eines
Fluoreszenzmikroskopes ausgewertet.
Tab. 7: Übersicht der Primär– und Sekundärantikörper für die Charakterisierung.
Die Antikörper wurden in 1% FCS/1xPBS verdünnt.
4.2.4.2 Hämatoxylinfärbung
Zur lichtmikroskopischen Beurteilung der Morphologie wurden die Zellen auf
unbeschichtete Chamberslides ausgesät. Nach 24h Adhäsionszeit wurde das Medium
entfernt und die Zellen vorsichtig mit 1xPBS gewaschen. Die Fixierung der Zellen erfolgte
für 10min bei -20°C mit 100%igem Methanol. Es schloss sich ein Waschzyklus aus
Primärantikörper Bezugsquelle Verdünnung
Maus Anti-Human α-Glattmuskel-Aktin
DAKO, Hamburg 1:50
Kaninchen Anti-Maus α8-Integrin
Dr. Müller, Scripps Institute, La Jolla, CA, USA
1:50
Ratte Anti-Maus F4/80 Linaris GmbH, Wertheim-Bettingen 1:200
Kaninchen Anti-Maus WT-1 Santa Cruz, Heidelberg 1:50
Kaninchen Anti-Maus Zytokeratin 18
Biomol GmbH, Hamburg 1:250
Ratte Anti-Maus MECA-32 BD, Heidelberg 1:50
Kaninchen Anti-Maus -Faktor III Serotec, Wiesbaden 1: 50
Sekundärantikörper: Bezugsquelle Verdünnung
cyTM 3-Anti-Maus IgG DIANOVA, Hamburg 1:400
cyTM 2-Anti-Maus IgG DIANOVA, Hamburg 1:200
cyTM 2-Anti-Kaninchen IgG DIANOVA, Hamburg 1:200
cyTM 2-Anti-Ratte IgG DIANOVA, Hamburg 1:500
Material und Methoden
92
zweimal 5min in 1xPBS und einmal 10min in dH2O an. Für die Färbung der Zellen wurde
die Chamberslides kurz in die Hämatoxylinfärbung getaucht, unter fließendem Wasser
gespült und mit Mowiol eingedeckelt. Bei 4°C über Nacht festigt sich das Eindeck-
Medium Mowiol und erlaubt erst am folgenden Tag die mikroskopische Betrachtung.
4.2.4.3 Fluoreszenzfärbungen
Um Aussagen über die Morphologie der Zellen und die Verteilung zellulärer Proteine zu
ermöglichen, wurden immunzytochemische Färbungen durchgeführt. Dazu wurden die
Zellen auf Chamberslides bzw. auf 8-Kammer Objektträger ausgesät. Je nach
Versuchsansatz variierten die Parameter wie Zellzahl, Beschichtung, der Einsatz von
Inhibitoren und die Behandlung mit siRNA. Alle nachfolgenden Schritte erfolgten bei
Raumtemperatur.
Zuerst wurde das Medium entfernt, dreimal mit 1xPBS gewaschen und dann die Zellen mit
3,5%igem PFA 10min fixiert. Nach dem Waschen erfolgte die Permeabilisierung der
Zellen mit 0,2% Triton-X 100/1xPBS für 10min. Die Zellen wurden wiederholt wie oben
beschrieben gewaschen und anschließend in einer feuchten Kammer mit
Blockierungslösung (30min bei 37°C mit 100% FCS oder 60min bei Raumtemperatur mit
5% Pferdeserum/1xPBS) inkubiert. Nach dem Waschzyklus erfolgte die Inkubation mit
dem Primärantikörper, wahlweise 1h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4°C in der
feuchten Kammer. Der Sekundärantikörper inkubierte nach dem Waschschritt für 1h bei
Raumtemperatur in der dunklen, feuchten Kammer.
Erfolgte eine Doppelfärbung mit Phalloidin, so wurde die Phalloidinlösung nach der
Antikörperfärbung auf die Zellen aufgetragen und es folgte eine zwanzigminütige
Inkubation in der feuchten Kammer. Abschließend wurde dreimal 5min mit 1xPBS
gewaschen und der 8-Kammer Objektträger mit Mowiol eingedeckelt. Das Mowiol konnte
über Nacht bei 4°C aushärten, so dass die fluoreszenzmikroskopische Betrachtung am
Folgetag durchgeführt werden konnte.
Material und Methoden
93
Primärantikörper Bezugsquelle Verdünnung
Maus Anti-Human α-Glattmuskel-Aktin DAKO, Hamburg 1:50 in 1% FCS/1xPBS
Kaninchen Anti-Maus Vinculin Santa Cruz, Heidelberg
1:500 in 1% FCS/1xPBS
Maus Anti-Human Desmin IgG DAKO, Hamburg 1:50 in 1% FCS/1xPBS
Sekundärantikörper: Bezugsquelle Verdünnung
cyTM 2-Anti-Kaninchen IgG DIANOVA, Hamburg
1:400 in 1% FCS/1xPBS
cyTM 3-Anti-Maus IgG DIANOVA, Hamburg
1:200 in 1% FCS/1xPBS
cyTM 2-Anti-Maus IgG DIANOVA, Hamburg
1:200 in 1% FCS/1xPBS
Interkalierende Farbstoffe Bezugsquelle Verdünnung
Phalloidin Fluor 488 (grün) Molecular Probes, Leiden, NL
2,5µl Stammlösung (300U/1,5ml Methanol) auf 200µl 1xPBS
Rhodamin-Phalloidin R-415 (rot) MoBiTec, Göttingen
2,5µl Stammlösung (300U/1,5ml Methanol) auf 200µl 1xPBS
Tab. 8: Übersicht der Antikörper und Farbstoffe für Fluoreszenzfärbungen.
4.2.5 Zellbiologische Untersuchungen
Sofern erforderlich wurden Kulturschalen bzw. 8-Kammer Objektträger für den Versuch
mit Matrix-Proteinen beschichtet. Dazu wurde zunächst eine Stammlösung der folgenden
Matrixproteine entsprechend der Herstellerangaben bzw. Bezugsquelle hergestellt. Die
Fibrillinfragmente wurden uns von Prof. Dieter P. Reinhardt, McGill University, Montreal,
Kanada [131, 132] freundlicherweise zur Verfügung gestellt.
Material und Methoden
94
Matrixprotein Stammlösung Endkonzentration
Fibronektin (FN) 1mg/ml 40µg/ml in 1xPBS
Vitronektin (VN) 50µg/ml 10µg/ml in 1xPBS
Kollagen Typ I (Col I) 3,25mg/ml 30µg/ml in 1xPBS
Fibrillin-1 Fragmente: rF16 rF6H
0,8mg/ml 1,47mg/ml
15µg/ml in 1xPBS 15µg/ml in 1xPBS
Tab. 9: Übersicht der verwendeten Matrixproteine.
Angegeben sind die Konzentrationen der Stammlösungen und deren Endkonzentrationen.
4.2.5.1 Adhäsions- und Ausbreitungsassay
Zellen wurden wie bereits beschrieben abtrypsiniert, gezählt und auf die zuvor
beschichteten 8-Kammer Objektträger ausgesät. Nach 10min bis 5h Adhäsionszeit wurden
die Zellen nach einmaligem Waschen mit 1xPBS für 10min bei -20°C in 100% Methanol
fixiert, wiederholt zweimal 5min mit 1xPBS gewaschen und kurz in Hämatoxylin getaucht.
Die Zellen wurden mit Mowiol eingedeckelt und konnten nach dem Trocken über Nacht
mit dem Durchlichtmikroskop ausgewertet werden. Dazu wurden alle adhärenten Zellen
gezählt und zu der Anzahl der ausgesäten Zellen in Prozent gesetzt.
Gleichzeitig wurde die Ausbreitung der adhärenten Zellen bewertet und prozentual
berechnet. Als ausgebreitete Zellen wurden die adhärenten Zellen gezählt, die eindeutig
um ihren Nukleus Zytoplasma gebildet haben.
4.2.5.2 Migration
Wundheilungstest (Migration nach Verletzen einer Monolayerkultur („Scratchen“)
Zur Analyse der ungerichteten Migration von Mesangiumzellen wurde ein
Wundheilungstest (Scratch-Assay) durchgeführt. Hierfür wurden je ca. 250.000 Zellen/4ml
D10+ in eine 6cm Zellkulturschale ausgesät, so dass sie konfluent bewachsen war. Es
wurde dann mit Hilfe einer sterilen 1000μl Pipettenspitze in den Zellrasen eine gerade
Furche gezogen und zwei Messpunkte auf der Unterseite der Platte mit einem Stift
markiert (Tag 0). An diesen Markierungen wurde unter einem Mikroskop zu jedem
Material und Methoden
95
Messzeitpunkt (0h, 24h und 48h) fotografisch der Zustand der Furche festgehalten und
mittels MetaVue der Durchmesser der Furche bestimmt und ausgewertet.
Migration mit dem Barriere-Verfahren
Wie von Kroening S. und Goppelt-Struebe M., 2010 [130] beschrieben, kann mit Hilfe des
Barriere-Assays Matrix-abhängiges Migrationsverhalten der Zellen untersucht werden.
Dazu wurden sterile Deckgläschen mit Col I oder FN in 1xPBS beschichtet und für 2h bei
37°C inkubiert. Anschließend wurde das beschichtete Deckglas in eine 35mm Schale
überführt und eine mechanische Barriere an den Rändern der Schale fixiert (Barriere wurde
freundlicherweise von Dr. S. Kröning, Department für Nephrologie und Hypertensiologie,
Universitätsklinikum Erlangen, zur Verfügung gestellt). Diese Barriere diente dazu, an
einer definierten Stelle eine Besiedlung des Deckglasses mit Zellen zu verhindern, um
dann nach Entfernen der Barriere die Migration in den freien Spalt beobachten zu können.
Einen Tag vor dem Versuch wurden die Zellen derart ausgesät, dass sie am Versuchstag
100% konfluent vorlagen. Die Barriere wurde vorsichtig entfernt und der Spalt an
vormarkierten Stellen, flächendeckend an beiden Seiten, abfotografiert. Nach 6h, 24h und
48h wurden dieselben Stellen nochmals fotografiert und die Abnahme der freien
Spaltfläche durch migrierende Zellen mittels MetaVue ausgewertet. Nach Beenden des
Migrationsassays wurden die Zellen fixiert und die proliferierenden Zellen mit BrdU (s.
BrdU-Assay) angefärbt, um diese von den migrierenden Zellen unterscheiden zu können.
Migration in der Boydenkammer (Boyden Chamber Assay)
Eine Membran mit 8µm Poren wurde über Nacht bei 4°C in eine Gelatinelösung eingelegt
und am Versuchstag getrocknet. 28µl Chemotaxismedium wurde jeweils mit einem
Matrixprotein, 30µg/ml Col I bzw. 40µg/ml FN versetzt und in die Vertiefungen der
Abb. 36: Fotographische Darstellung der Barriere.
Die Barriere wird in eine 35mm Petrischale mit
vormarkiertem Plattenboden befestigt. (Foto wurde mit
freundlicher Genehmigung von Dr. S. Kröning, Department
für Nephrologie und Hypertensiologie, Universitätsklinikum
Erlangen, zur Verfügung gestellt).
Material und Methoden
96
unteren Kammer pipettiert. Danach wurde die Membran zügig auf die gefüllten
Vertiefungen gelegt. Zum Äquilibrieren wurde die jetzt vollständig zusammengesetzte
Boydenkammer für 1h in einer feuchten Kammer bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden in
der Zwischenzeit abtrypsinisiert, zentrifugiert, einmal mit Chemotaxismedium gewaschen
und auf 0,5 Millionen Zellen/ml eingestellt. 56µl der Zellsuspension wurden langsam in
die Vertiefung des Deckels pipettiert und in der feuchten Kammer für 5h bei 37°C im
Brutschrank inkubiert. Die Membran wurde zum Fixieren 1min in die Fixierungslösung
und zum Färben jeweils 1min in Quick Diff Lösung 1 und 2 getaucht. Nicht migrierte
Zellen wurden durch Abwischen mit einem weichen Tuch von der Oberseite der Membran
entfernt. Die blau gefärbten migrierten Zellen konnten nun auf der Membranunterseite mit
Hilfe eines Durchlichtmikroskopes gezählt werden. In jedem Ansatz, der in Tripletts
angelegt worden war, wurden drei Gesichtsfelder ausgezählt.
4.2.5.3 Apoptosemessungen
Caspase-3-Assay
Die Aktivierung der Caspase-3 durch Phosphorylierung ist ein frühes Ereignis in der
Signalkaskade nach Apoptoseinduktion und gilt somit als früher Marker in der Apoptose.
Die Messung der Caspase-3 Aktivität erfolgte mit Hilfe des Caspase-3-Assays.
6cm Petrischalen wurden mit 2ml Matrixmolekülen beschichtet (40µg/ml FN bzw. 30µg/m
Col I) und über Nacht bei 4°C oder 2h bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde zweimal
mit 1xPBS gewaschen und mit 2% BSA/1xPBS die unspezifischen Bindungsstellen für 1h
bei 37°C blockiert. In allen Versuchen wurden auch unbeschichtete Petrischalen
mitgeführt.
Eine definierte Zellzahl (350.000 WT-MMZ/Schale, 500.000 α8-/--MMZ/Schale) wurde in
4ml D10+ auf die Kulturschalen ausgesät und über Nacht adhärieren gelassen.
Am nächsten Tag wurde wie folgt stimuliert:
1. 4ml D0 (serumfreies DMEM)
2. 50µM cis-Platin im Normalmedium
3. 100µM cis-Platin im Normalmedium
Material und Methoden
97
Als Negativkontrolle dienten Zellen, die mit DMF (Lösungsmittel von cis-Platin)
behandelt worden waren. Als weitere Kontrolle wurden unbehandelte Zellen nur im
Vollmedium mitgeführt. Nach 16-24h Inkubationszeit, bei 37°C und 5% CO2, wurden die
Zellen geerntet. Die Zellen der unbeschichteten Petrischalen wurden vor dem Ernten
zweimal mit 1xPBS gewaschen und dann mit 1ml 1xPBS mittels Zellschaber geerntet. Bei
beschichteten Petrischalen wurden die Zellen 5min mit 1,5M EDTA bei 37°C abgelöst und
mit dem zuvor gesammelten Überstand 5min bei 1000rpm abzentrifugiert. Das Zellpellet
wurde einmal mit 1xPBS gewaschen und anschließend in ca. 200µl Lysepuffer auf Eis
resuspendiert. Nach dem Sonifizieren (15sek bei 40%) ruhte die Lysesuspension nochmals
10min bis 30min auf Eis, wurde danach abzentrifugiert (10min, 14.000rpm bei 4°C) und
der Überstand in neue Eppendorfcups überführt. Mittels BCA Protein Assay wurde die
Proteinkonzentration gemessen.
Auf einer 96-Well-Platte erfolgte im Triplettansatz die Bestimmung der Caspase-3
Aktivität. Für die Messung wurde pro Probe 30µg Gesamtprotein eingesetzt, mit
Lysepuffer inklusive 10mM DTT auf 140µl Endvolumen aufgefüllt und mit je 12µM
Fluoreszenzsubstrat DEVD-AMC gemischt. Die Spaltung der DEVD-Sequenz wird durch
Caspase-3 während des programmierten Zelltodes katalysiert. Dabei wird der an DEVD
gebundene Fluoreszenzfarbstoff AMC durch die Aktivität der Caspase-3 freigesetzt. Im
Fluoreszenzplattenleser TECAN Spectrafluor, Programm Magellan3, wurde der
Substratumsatz in 5min-Intervallen bei 30°C für insgesamt 2h bestimmt (Exzitation:
360nm und Emission: 465nm). Bei Sättigung mit Substrat ist der Substratumsatz
proportional zur Anzahl der aktiven Enzyme, so dass mit Hilfe der Zeitkinetik die Caspase
3-Aktivität bestimmt werden kann. Das heißt, dass die Intensität des fluoreszierenden
Lichtes korreliert direkt mit der Aktivität der Caspase.
Caspase-3-Assay mit blockierenden Antikörpern
Da α2- und α6-Integrin an der Regulation des Zellüberlebens beteiligt sein können, wurden
α8-/--MMZ vor dem Aussäen mit α2- und α6-Integrin blockierenden Antikörpern für eine
halbe Stunde vorinkubiert. Anschließend wurde der Caspase-3-Assay wie oben
beschrieben durchgeführt.
Material und Methoden
98
Blockierende Antikörper Bezugsquelle
α2-Integrin Hamster Anti-Ratte CD 49b BD, Heidelberg
α6-Integrin Anti-Ratte CD 49f VLA BD, Heidelberg
Tab. 10: Übersicht der verwendeten blockierenden Antikörper.
Hoechstfärbung
Die Hoechstfärbung ist ein Nachweis für ein spätes Apoptosestadium. Die
Chromatinkondensation erfolgt kurz vor der DNA-Fragmentierung und Bildung der
sogenannten Apoptosebläschen. Der Hoechstfarbstoff interkaliert mit dem Chromatin,
welches sich im kondensierten Zustand besonders stark anfärben lässt. Es ist damit von
unkondensiertem Chromatin nicht-apoptotischer Zellen unterscheidbar. Mittels
Fluoreszenzmikroskop lassen sich die Zellkerne mit kondensiertem Chromatin leicht
detektieren.
6cm-Petrischalen wurden mit 1ml Matrixproteinlösung inkubiert und mit 2% BSA/1xPBS
blockiert und zum Vergleich unbeschichtete Kulturschalen mitgeführt.
Die Zellen wurden abtrypsinisiert, abzentrifugiert und auf eine Zellzahl von 175.000
Zellen/ml eingestellt. In die Kulturschalen wurden jeweils 4ml Zellsuspension pipettiert
und je nach Versuchsansatz 4h-72h bei 37°C mit einem Apoptosestimulans, entweder
50µg/ml cis-Platin oder serumfreies Medium, inkubiert. Als Kontrolle wurden die Zellen
in Normalmedium ohne Apoptosestimulans ausgesät. Die Zellen wurden durch Abschaben
von den unbeschichteten oder durch Abtrypsinisieren von den beschichteten
Zellkulturschalen geerntet und abzentrifugiert. Das Pellet wurde einmal mit 1xPBS
gewaschen und mit 30µl 3,5% Paraformaldehydlösung (PFA) zur Permeabilisierung
versetzt. Jeweils zwei 15µl der fixierten Zellen wurden auf einem Objektträger verteilt und
über Nacht getrocknet. Am nächsten Versuchstag wurde der getrocknete Tropfen mit
einem Fettstift umrandet und je 100µl Hoechstfarbstoff aufgetragen. Die Inkubation fand
5min bei Dunkelheit und Raumtemperatur statt. Anschließend wurde der Objektträger
zweimal 10min mit 1xPBS und 5min mit dH20 gewaschen. Nach dem Trockenen über
Nacht wurde mit Mowiol eingedeckelt. Die Beurteilung der Kondensation erfolgte am
Fluoreszenzmikroskop mit dem UV-Filter in 40-facher Vergrößerung. Es wurden pro
Material und Methoden
99
Versuchsansatz je 500 Kerne ausgezählt und der prozentuale Anteil an positiv gefärbten
d.h. kondensierten Kernen bestimmt.
4.2.5.4 Proliferationsassay
Zur Durchführung des immunzytochemischen Assays zum Nachweis von inkorporiertem
BrdU wurden die 8-Kammer Objektträger mit Matrixproteinlösung über Nacht beschichtet
und mit 2% BSA für 1h bei Raumtemperatur blockiert. Die Zellen wurden für 72h im
Hungermedium (D0.1+) gehalten. Am Versuchstag wurden die Zellen abtrypsinisiert,
zentrifugiert und abhängig von der Zellart auf eine Zellzahl von 5000 bis 10.000 Zellen/ml
eingestellt. 500µl der Zellsuspension wurden in jede Vertiefung ausgesät. Nach 12h
Adhäsion erfolgte die Stimulation durch Zugabe von 10% FCS. In den letzten 2h der
Inkubationszeit wurde BrdU 1:1000 (0,5µl/500µl Medium/Well) hinzugegeben.
Nach 48h Inkubation bei 37°C wurde das Medium entfernt und wie folgt fixiert:
Fixierlösung: 70% EtOH in 50mM Glycin pH 2,0
a. bei vorgekühlter Fixierlösung: 20min bei –20°C
b. bei ungekühlter Fixierlösung: 30min bis 45min bei -20°C
Nach dreimal 5min Waschen wurde in jedes Well 30µl anti-BrdU-Arbeitslösung pipettiert
und für 30min bei 37°C inkubiert. Der 8-Kammer Objektträger wurde dann dreimal
gewaschen und mit 30µl anti-Maus-Ig-AP-Arbeitslösung pro Well überschichtet und
wieder für 30min bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurde der 8-Kammer
Objektträger dreimal mit 1xPBS gewaschen und in jede Vertiefung 30µl frisch hergestellte
Farbsubstratlösung gegeben und 15min bis 20min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach
einmaligem Waschen in 1xPBS wurde der 8-Kammer Objektträger kurz in Hämatoxylin
getaucht und mit klarem Wasser gespült. Danach wurde der 8-Kammer Objektträger mit
Aquatex eingedeckelt. Zur Auswertung wurden jeweils die Zellkerne von 500 Zellen am
Durchlichtmikroskop ausgezählt und daraus die positiven, dunkelblau-violetten Zellen,
prozentual ermittelt.
Material und Methoden
100
4.2.5 RNA-Methoden
4.2.5.1 Grundlagen des Real-Time-RT-PCR-Verfahrens
Die Polymerasekettenreaktion (PCR) ist ein molekularbiologisches Verfahren, um DNA-
Abschnitte zu vervielfältigen. Dazu muss zunächst die DNA bei 95°C denaturiert werden,
wobei ihre Wasserstoffbrückenbindungen aufgebrochen werden. Nach Abkühlung auf
60°C können sich nun für die Zielsequenz spezifische Primer an die zu amplifizierende
DNA anlagern und der Gegenstrang kann durch Polymerisation mit freien Nukleotiden
gebildet werden.
Wenn man mRNA quantifizieren will, muss diese zunächst mittels des Enzyms Reverse
Transkriptase (RT) in die komplementäre DNA (cDNA) umgeschrieben werden. Dies
geschieht mit Hilfe eines unspezifischen Primermix, den sogenannten Random Hexamere.
Die cDNA wird dann mittels des Real-Time-RT-PCR Verfahrens amplifiziert. Dabei kann
in Echtzeit der Verlauf des PCR-Prozesses verfolgt und der mRNA Gehalt (entspricht dem
DNA Gehalt der Probe) quantifiziert werden. Bei der Real-Time-RT-PCR wird zusätzlich
zur Amplifikation die Menge des Amplifikationsproduktes nach jedem Zyklus gemessen,
die proportional zur Emission des eingesetzten Fluoreszenzfarbstoffes ist. Wird ein neuer
Doppelstrang synthetisiert, so kommt es durch die Einlagerung von interkalierenden
Fluoreszenzfarbstoffen, wie z.B. SYBR-Green, zur messbaren Emissionszunahme. Zur
Quantifizierung wird der Zeitpunkt bestimmt, ab dem die Fluoreszenzzunahme pro Zyklus
linear verläuft (ct-Wert). Als endogene Kontrolle wurde die ribosomale Untereinheit 18S
gewählt.
Die Auswertung erfolgt durch die delta-delta-ct-Methode. Dabei wird zunächst die
Differenz (delta) aus dem ct-Wert der Ziel-mRNA und dem ct-Wert der 18S-mRNA
gebildet. Anschließend wird vom delta-ct-Wert der Kontrollwert abgezogen (delta-delta).
Dieser Wert wird in eine negative Exponentialfunktion (Expression (GenX) proportional
zu 2-ct-Wert) eingesetzt, da bei jedem PCR-Zyklus eine Verdopplung der Zielsequenz
stattfindet.
4.2.5.2 RNA-Extraktion
Die RNA-Isolation erfolgte mit dem RNeasy Mini-Kit nach Angaben des Herstellers. Die
isolierte RNA wurde in 30µl RNase freies Wasser aufgenommen und bei -20°C gelagert.
Material und Methoden
101
Die Konzentrationsbestimmung wurde bei einer Wellenlänge von 260nm photometrisch
durchgeführt. Der Reinheitsgrad wurde durch die Ratio E260/E280 bestimmt und sollte 1,8
nicht unterschreiten.
4.2.5.3 Reverse Transkription
Für die Reverse Transkription wurde zunächst ein Mastermix angesetzt. Die RNA wurde
mit RNase-freiem Wasser auf 100ng/µl verdünnt.
Reagenzien Endkonzentration Ansatz pro Probe (µl) Pipettieren
10xTaqMan RT Puffer 1x 1 zuerst
MgCl 25mM 5,5mM 2,2
dNTP-Mix je 500µM 2
Random Hexamere 2,5µM 0,5
RNase Inhibitor 0,4U/µl 0,2 dann
Multiscribe RT 50U/µl 1,2U/µl 0,25
RNase-freies H2O 2,85
RNA-probe 10pg-2µg 1
Volumen ohne RNA 9
Totalvolumen 10
Tab. 11: Mastermix für Reverse Transkriptase.
Die Umschreibung der mRNA in cDNA erfolgte durch eine PCR im Thermocycler nach
folgendem Protokoll: Annealing 25°C für 10min
Elongation 48°C für 45min
Enzyminaktivierung 95°C für 5min
Von allen mRNA wurden Reaktionen ohne Multiscribe Reverse Transkriptase (Multiscribe
RT) als negative Kontrolle mitgeführt, um Kontaminationen mit genomischer DNA
ausschließen zu können. Vor der Real-Time-PCR wurde das Reaktionsprodukt 1:1 mit
RNase-freiem Wasser verdünnt.
Material und Methoden
102
4.2.5.4 Taqman Real-Time-RT-PCR
Für die Taqman Real-Time-RT-PCR wurde zunächst für jede Ziel-mRNA ein Mastermix
(Endvolumen 8µl) aus 2x SYBR-Puffer mit bereits enthaltener Taq-Polymerase (Applied
Biosystems), Forward primer, Reverse Primer und RNase-freiem Wasser hergestellt. Alle
Proben wurden als Triplett gemessen.
In eine 96-Well-Platte wurde pro Well 8µl des Mastermixs vorgelegt und 2µl der cDNA
dazu pipettiert. Die Platte wurde mit einer Folie verschlossen und kurz bei
Raumtemperatur zentrifugiert. Nach der zehnminütigen Initialisierung und Aktivierung des
Enzyms bei 95°C folgte ein Zyklus von 3sek Denaturierung bei 95°C und Annealing
inklusive Elongation für 30sek bei 60°C, der sich 40x wiederholte. Zur Erstellung einer
Schmelzkurve erfolgte anschließend ein Zyklus mit 95°C für 15sek, 60°C für 1min und
nochmals 95°C für 15sek. Verwendet wurde hierfür das Real-Time PCR System
StepOnePlus mit der Software v2.0 von Applied Biosystems.
Reagenzien Stammlösung (µM)
Endkonzentration (nM)
Ansatz pro Probe (µl)
2x SYBR MM Puffer 2x 1x 5
Forward Primer 20 200 0,1
Reverse Primer 20 200 0,1
dH20 2,8
cDNA 2
Tab. 12: Mastermix für Real-Time-RT-PCR.
Maus Forward Primer Reverse Primer
CTGF GCCCTAGCTGCCTACCGACT CATAGTTGGGTCTGGGCCAA
Desmin GTGAAGATGGCCTTGGATGT TTGAGAGCAGAGAAGGTCTGG
Fibronektin TGTGACCAGCAACACGGTG ACAACAGGAGAGTAGGGCGC
α8-Integrin AGAATGATTACCCAGATTTGCTTGT GCTACTTTCCCTTTTCCAAATGC
MMP-2 ATGCGGAAGCCAAGATGTG GTCCAGGTCAGGTGTGTAAC
MMP-9 CAAGGATTGCTCAGAGATTCTCCG ATCTCACCTGGAGGACACAGTCTG
Material und Methoden
103
α-SMA CCCTGAAGAGCATCCGACAC GCCTTAGGGTTCAGTGGTGC
TIMP-1 GATATGTCCACAAGTCCCAGAACC CCACAGCCAGCACTATAGGTCTTT
TIMP-2 ATAAAGATGTTCAAAGGACCTGACAA GGCCGTGTAGATAAACTCGATGT
Vimentin ACGATCTCACCCTCAGGGCT GGGTCGCTGAGTCAGTGGAT
Ratten Forward Primer Reverse Primer
CTGF TGTGCACTGCCAAAGATGGT GGTACACGGACCCACCGA
Desmin GTGAAGATGGCCTTGGATGT TTGAGAGCAGAGAAGGTCTGG
EGF TGCCACTGGGTCCGAAAC ATGCACACGCCACCATTG
Fibrillin-1 TGCTCTGAAAGGACCCAATGT CGGGACAACAGTATGCGTTATAAC
Fibronektin TTGCAACCCACCGTGGAGTATGTG CTCGGTAGCCAGTGAGCTTAACAC
α8-Integrin TCCAAATCAGAAGCTCCAACAA CGCTCACGAAATTGCTGTCA
α-SMA TCCTGACCCTGAAGTATCCGATA GGTGCCAGATCTTTTCCATGTC
Vimentin GAGTCAAACGAATACCGGAGACA CCAGGGACTCATTAGTGCCTTT
Housekeeper Forward Primer Reverse Primer
18S TTGATTAAGTCCCTGCCCTTTGT CGATCCGAGGGCCTCACTA
Tab. 13: Übersicht der verwendeten Primer für Real-Time-RT-PCR.
4.2.6 siRNA Silencing
Die RNA-Interferenz, auch siRNA Silencing genannt, ist eine neue Methode für „gene
silencing“ und führt in vitro mit Hilfe der Transfektion spezifischer siRNA zur
funktionellen Inaktivierung einzelner Gene.
Bei der RNA-Interferenz macht man sich einen zelleigenen Abwehrmechanismus zu
Nutze, der darauf basiert, dass doppelsträngige RNA (dsRNA) nicht nativ in den Zellen
vorkommt, sondern nur von extern, z.B. durch einen Virenangriff, in die Zelle gelangen
kann. An diese dsRNA bindet Dicer. Dicer besteht aus ATP abhängige Ribonukleasen,
welche die RNA unter ATP-Verbrauch zerschneiden. Die RNA wird demzufolge
inaktiviert und der Virenangriff kann dadurch abgewendet werden. Handelt es sich aber bei
Material und Methoden
104
der entstandenen „small interfering RNA“ (siRNA) um Sequenzstücke, die auch in der
Zelle als mRNA vorhanden sind, läuft die Kaskade weiter. Die kurzen ds siRNAs werden
von dem „RNA induced silencing complexes“, kurz RISC, gebunden. In diesem Komplex
öffnet sich der Doppelstrang der siRNA unter Einwirkung von Helikasen. An die
einzelsträngige-RNA (ssRNA) kann sich komplementäre mRNA binden. Das wiederum
aktiviert den „RNA induced silencing complex“ und die mRNA wird gespalten. Die
mRNA Stücke sind damit dem Abbauprozess in der Zelle ausgeliefert. Es kann kein
Protein mehr gebildet werden. Da durch eine Transfektion auch spezifische siRNA in die
Zelle geschleust werden kann, kann das Zielgen funktionell inaktiviert werden, d.h. die
Transkription des Gens erfolgt ungestört, aber eine Proteinbildung findet wegen des
beschleunigten Abbaus der mRNA nicht mehr oder nur noch in vermindertem Umfang
statt. Die funktionelle Inaktivierung des Zielgens wird auch transiente Herunterregulation
oder „knockdown“ genannt.
4.2.7.6 Transiente Transfektion von RMZ
Die Versuche mit RMZ wurden mit dem Transfektionsreagenz HiPerFect (Qiagen) nach
dem fast protocol, laut Herstellerangaben, durchgeführt. Das Transfektionsreagenz besteht
aus einer Mischung aus kationischen und neutralen Lipiden und führt so über die Bildung
von Liposomen zu einer Endozytose der siRNA und Freigabe in das Zytoplasma der Zelle.
Dazu ließ man die Zellen fast 100% konfluent wachsen, stellte nach dem Abtrypsinieren
die gewünschte Zellzahl ein (z.B. für die Verwendung der Zellen 72h nach der
Transfektion: 100.000 Zellen/Well in 2,3ml D10+). Die Transfektion mit siRNA
(Endkonzentration: 5nM) wurde in der Zellsuspension durchgeführt und erst danach
wurden die Zellen auf eine 6-Well-Platte ausgesät. 24h nach der Transfektion erfolgte ein
Mediumwechsel und nach 48h eine Nachtransfektion (wie oben beschrieben, allerdings auf
die adhärenten Zellen).
Transfektion-Mastermix pro Probe: Endvolumen 100µl
12µl HiPerFect
6µl siRNA (Stocklösung: 2µM)
82µl Opti-MEM (serumreduziertes DMEM)
Der Mix wurde kurz abzentrifugiert, bei 15min Raumtemperatur inkubiert und
abschließend unter leichtem Schwenken tropfenweise zur Zellsuspension dazugegeben.
Material und Methoden
105
RNA Isolierung erfolgte mit dem RNeasy Mini Kit (Qiagen) und Umschreibung in cDNA
mittels Reverse Transcription Reagents (Applied Biosystems).
Für die folgende Real-Time-RT-PCR wird der Power SYBR Green PCR Master Mix
(Applied Biosystems), Primer von MWG Biotech AG (Endkonzentration: 200nM) und
StepOnePlus Sequence Detection System (Applied System) verwendet.
Design und Herstellung der siRNAs erfolgte mit Hilfe der Software von Qiagen (Hilden)
bzw. Invitrogen (Darmstadt).
siRNA Duplex gegen α8-Integrin Bezugsquelle Sense Strand
Ratte α8-Integrin (itga8) (21mer) Qiagen, Hilden
GACCUCCUCAGGAUGAAAUTT
Ratte α8-Integrin (itga8) oligo1 (Sequenz nach R. Zargham und G. Thibault, 2005 [99])
Invitrogen, Darmstadt
AAGGUCAGAUCGAGAUUG(dT)(dT)
siRNA Kontrollen Bezugsquelle Sense Strand
Ratte „non-silencing control“ siRNA (Negativ-Kontrolle)
Qiagen, Hilden
UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT
Maus/Ratte Ctrl_All Stars_3 „Positive cell death phenotype control“ (Positiv-Kontrolle)
Qiagen, Hilden
Eine Mischung von verschiedenen siRNAs, die Gene silencen und die Zelle damit in die Apoptose führen.
Luciferase GL2 siRNA (Negativ-Kontrolle)
Qiagen, Hilden
AACGTACGCGGAATACTTCGA (Unspezifische Target-Sequenz die nicht in eukaryontischen Zellen vorkommt.)
Tab. 14: Auflistung der Kontroll- und siRNA gegen α8-Integrin
4.2.7 Statistische Auswertung
Durch den Student`s paired t-test wurden zwei normalverteilte Gruppen mit gleicher
Varianz miteinander verglichen. Für normierte Daten wurde „Column statistics“ (one-
sample t-test)“ angewandt. Der Mann-Whitney-U-Test wurde bei nicht normaler
Verteilung zweier Gruppen eingesetzt. Die angegebenen Werte sind Mittelwerte ±
Standardabweichung. Ein p-Wert < 0,05 wurde als signifikant betrachtet. Die
Berechnungen wurden mit SPSS Software (SPSS Inc., Chicago, USA) und GraphPad
Prism 5 Software (GraphPad, San Diego, CA, USA) durchgeführt.
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Abbildungsverzeichnis
121
6 Abbildungsverzeichniss
Abb. 1: Glomerulus und Kapillarschlinge.......................................................................................... 2
Abb. 2: Querschnitt durch ein gesundes Gefäß und ein arteriosklerotisches Gefäß mit Plaque. ....... 4
Abb. 3: Schematische Darstellung des Aufbaus der Integrine. .......................................................... 8
Abb. 4: Die Familie der Integrine. ..................................................................................................... 9
Abb. 5: Schematische Darstellung von fokalen Kontakten.............................................................. 10
Abb. 6: Der Integrin-vermittelte Rho/GTPase-Weg. ....................................................................... 12
Abb. 7: Morphologischer Vergleich zwischen WT- und α8-/--MMZ............................................... 21
Abb. 8: Messung der α8-Integrin Expression in MMZ.................................................................... 22
Abb. 9: Messung der α8-Integrin Expression in si RNA transfizierten RMZ.................................. 23
Abb. 10: Morphologischer Vergleich zwischen WT- und α8-/--VSMZ. .......................................... 24
Abb. 11: Messung der α8-Integrin Expression in VSMZ. ............................................................... 24
Abb. 12: Vergleichende Fluoreszenzfärbungen der Aktinfilamente. ............................................... 26
Abb. 13: Vergleichende Immunzytochemie der Stressfasern (α-SMA)........................................... 28
Abb. 14: α-SMA Expression in mesenchymalen Zellen. ................................................................. 30
Abb. 15: Vergleichende Immunzytochemie für Vinculin. ............................................................... 32
Abb. 16: Messung mesenchymaler und epithelialer Marker............................................................ 33
Abb. 17: Beispielhafte Desmin/F-Aktin Doppelfärbung von siRNA transfizierten RMZ............... 34
Abb. 18: Adhäsions- und Ausbreitungsassays. ................................................................................ 36
Abb. 19: Migration im Wundheilungstest........................................................................................ 37
Abb. 20: Migration im Barriere-Assay. ........................................................................................... 39
Abb. 21: Migration in der Boydenkammer. ..................................................................................... 40
Abb. 22: Apoptose im Caspase-3 Assay. ......................................................................................... 42
Abb. 23: Hoechstfärbung nach cis-Platin Behandlung. ................................................................... 43
Abb. 24: Hoechst-Apoptoseassay. ................................................................................................... 44
Abb. 25: Proliferationsassay. ........................................................................................................... 45
Abb. 26: Schematische Darstellung des Fibrillin-1 Proteins und seiner Fragmente. ....................... 46
Abbildungsverzeichnis
122
Abb. 27: Adhäsions- und Ausbreitungsassay auf Fibrillinfragmenten. ........................................... 47
Abb. 28: Adhäsionsassay auf Vitronektin mit cRGD-Peptiden. ...................................................... 49
Abb. 29: Adhäsionsassay auf Fibrillin mit cRGD-Peptiden. ........................................................... 50
Abb. 30: α2- und α6-Integrin Expression in MZ.............................................................................. 51
Abb. 31: Caspase-3-Assay mit blockierenden Antiköpern. ............................................................. 52
Abb. 32: Expression von MMP und TIMP. ..................................................................................... 54
Abb. 33: CTGF Expression.............................................................................................................. 55
Abb. 34: Expression von α-SMA und CTGF nach Inhibition von ROCK....................................... 56
Abb. 35: Normierte Expression von α-SMA und CTGF nach Inhibition von ROCK. .................... 57
Abb. 36: Fotographische Darstellung der Barriere. ........................................................................... 1
Tabellenverzeichnis
123
7 Tabellenverzeichnis
Tab. 1: Integrine und glomeruläre Erkrankungen. ........................................................................... 14
Tab. 2: Integrine und vaskuläre Schäden. ........................................................................................ 15
Tab. 3: Übersicht der verwendeten Oberflächenmarker zur Charakterisierung der Zelltypen......... 19
Tab. 4: Zusammensetzung der SDS-PAGE-Gele............................................................................. 88
Tab. 5: Übersicht der Primärantikörper für Immunoblot. ................................................................ 89
Tab. 6: Übersicht der Sekundärantikörper für Immunoblot. ............................................................ 89
Tab. 7: Übersicht der Primär– und Sekundärantikörper für die Charakterisierung.......................... 91
Tab. 8: Übersicht der Antikörper und Farbstoffe für Fluoreszenzfärbungen. .................................. 93
Tab. 9: Übersicht der verwendeten Matrixproteine.......................................................................... 94
Tab. 10: Übersicht der verwendeten blockierenden Antikörper. ..................................................... 98
Tab. 11: Mastermix für Reverse Transkriptase. ............................................................................. 101
Tab. 12: Mastermix für Real-Time-RT-PCR. ................................................................................ 102
Tab. 13: Übersicht der verwendeten Primer für Real-Time-RT-PCR............................................ 103
Tab. 14: Auflistung der Kontroll- und siRNA gegen α8-Integrin.................................................. 105
Abkürzungsverzeichnis
124
8 Abkürzungsverzeichnis
8.1 Allgemeine Abkürzungen
α8-/- α8-Integrinkette dauerhaft defizient
α-SMA α-smooth muscle actin (α-Glattmuskel-Aktin)
Abb. Abbildung
Abl amidoblack (Amidoschwarz)
AK Antikörper
Akt Synonym für PKB
APS Ammoniumpersulfat
AS Aminosäure
ATP Adenintriphosphat
BCA bicinchonicin acid (Bicinchoninsäure)
bp Basenpaare
BSA bovine (Rinder) Serum Albumin
Cdc42 homologous to yeast cell division cycle gene 42
cDNA complementary-DNA (komplementäre DNA)
cis-Platin cis-platinum (II) diamine dichloride
CO2 Kohlenstoffdioxid
Col I Kollagen I
CTGF connective tissue growth factor
DEVD-AMC N-acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-7-Amino-4-methyl-coumarin
dH2O Aqua bidestelliert
DMEM Dulbecco’s Modified Eagles Medium
DMF Dimethylformamid
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA desoxyribonucleinacid (Desoxyribonukleinsäure)
DNase Desoxynuklease
dNTP’s 2`-Desoxyribonucleosid-5`-triphosphat
Abkürzungsverzeichnis
125
dsRNA double-stranded RNA (doppelsträngige RNA)
DTT Dithioreitol
ECL enhanced chemoluminescence
ECM Extrazelluläre Matrix
EDTA Etylendiamintetraazetat
EMT Epithelial-mesenchymale Transformation
EtOH Ethanol
FAK focal adhesion kinase
F-Aktin Filamentöses Aktin
FCS fetal calf serum (Fötales Kälberserum)
FN Fibronektin
g Gramm
GTP Guanosine triphosphate
h hour (Stunde)
HCL Salzsäure
HEPES 4-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-1-ethansulfonsäure
HRP horse-radish peroxidase (Meerrettich-Peroxidase)
Ig-CAM immunoglobulin cell adhesion molecules (Immunglobulin Zelladhäsionsmoleküle)
IgG Immunglobulin G
IgM Immunglobulin M
kDA Kilodalton
l Liter
M Molar
m Meter
mA Milliampere
MAPK mitogen-activated protein kinase
mDia1 mammalian Diaphanous-related formin 1
MET Mesenchymale-epitheliale Transformation
mg Milligramm
MgCl2 Magnesiumchlorid
Abkürzungsverzeichnis
126
min Minute(n)
mM millimolar (Konzentrationseinheit mMol/l)
mm Millimeter
MMP Matrixmetalloprotease
MMZ Maus-Mesangiumzellen
mRNA messenger ribonucleic acid (Boten-Ribonukleinsäure)
MZ Mesangiumzellen
NaCl Natriumchlorid
NF-κB nuclear factor-kappaB
ng Nanogramm
nm Nanometer
PI-3K phosphatidylinositde-3 kinase
PAA Polyacrylamid
PAGE Polyacrylamid Gelelektrophorese
PBS phosphate-buffered saline (phosphatgepufferte Salzlösung)
PCR polymerase-chain-reaction (Polymerase-Ketten-Reaktion)
PFA Paraformaldehyd
pg Pikogramm
PKB protein kinase B
PL Plastik
PVFD Polyvinylidenfluorid
Rac related to A and C kinases
RAD Arginin-Alanin-Aspartat Tripeptid
Ras rat sarcoma
RGD Arginin-Glycin-Aspartat Tripeptid
Rho Ras homologue
RMZ Ratten-Mesangiumzellen
RNA ribonucleinacid (Ribonukleinsäure)
Rnase Ribonuklease
ROCK Rho-associated protein kinase (Rho-assoziierte Kinase)
Abkürzungsverzeichnis
127
rpm rounds per minute (Umdrehungen pro Minute)
RT Reverse Transkriptase
SDS Natriumdodecylsulfat
sek Sekunde
siRNA small interfering RNA (kleine interferierende RNA)
ssRNA single-stranded RNA (einzelsträngige RNA)
Tab. Tabelle
Taq Thermus aquaticus DNA-Polymerase
TBS Tris buffered saline (Tris-gepufferte Salzlösung)
TBS-T TBS-Tween 20 (Polyoxyethylensorbit-Monolaurat)
TEMED N, N, N`, N`-Tretramethyl-ethylendiamin
TGF-β transforming growth factor-beta
TRIS Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
U Unit (1U=1µmol/min) Einheit für Enzymaktivität
WT Wildtyp
µ Mikro
vs. versus
8.2 Aminosäuren
Aminosäuren Dreibuchstabencode Einbuchstabencode
Alanin Ala A
Arginin Arg R
Asparagin Asn N
Asparaginsäure Asp D
Cystein Cys C
Glutamin Gln Q
Glutaminsäure Glu E
Glycin Gly G
Histidin His H
Abkürzungsverzeichnis
128
Isoleucin Ile I
Leucin Leu L
Lysin Lys K
Methionin Met M
Phenylalanin Phe F
Prolin Pro P
Serin Ser S
Threonin Thr T
Tryptophan Trp W
Tyrosin Tyr Y
Valin Val V
8.3 Nukleinsäuren
DNA- und RNA-Basen Einbuchstabencode
Adenin A
Cytosin C
Guanin G
Thymin T
Uracil U
Anhang
129
9 Anhang
A. Homologie des α8-Integrin Gens von Maus (obere Reihe) und Ratte (untere Reihe)
Query 10 GAGAGGACTGTCACTGTGGACGCTCCTAGCTCACCGACCCGGGACACCGGCCTCTGGGGA 69 ||||||||||||||||||||| | || ||||||| ||||||||||||||||||||||||| Sbjct 18 GAGAGGACTGTCACTGTGGACTCACCGAGCTCACTGACCCGGGACACCGGCCTCTGGGGA 77 Query 70 GCGTCA-GG--CCTTCTCCTCTGGGCTCCACGGCTCCCGATCCCGGGTGAACAGCG-TTC 125 | ||| || ||| ||||||| |||||||||||||||||||| |||||| ||||| || Sbjct 78 ACATCAGGGCTCCTCCTCCTCT-GGCTCCACGGCTCCCGATCCTGGGTGAGCAGCGTTTG 136 Query 126 GGGAAGGAGGGCGATGTCTGCGGGAACCCACTGTGGTCCCCCGGGGAACCGGGCACCTCC 185 ||| | |||| ||||||||||| |||||||| | |||||||||| |||| |||||||||| Sbjct 137 GGGCA-GAGGACGATGTCTGCGAGAACCCACCGGGGTCCCCCGGAGAACTGGGCACCTCC 195 Query 186 GTTCGCGCGTCTCTGTTGCGTCTCGGCCGCGCTGGGGATGCTGTGGTCCCCTGCGTGTCT 245 |||||| ||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||| | || ||| Sbjct 196 GTTCGCTTGTCTCTGTTGCGTCTCGGCCGTGCTGGGGATGCTGTGGTCCCCCGTGTCTCT 255 Query 246 GGCGTTCAACTTGGATGTGGACAAGCTCACTGTGTACAGTGGCCCCGAGGGCAGCTACTT 305 ||||||||||||||| || ||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 256 GGCGTTCAACTTGGACGTAGACAAGCTCACGGTGTACAGTGGCCCCGAGGGCAGCTACTT 315 Query 306 CGGCTACTCACTGGACTTCTACATACCTGATGCGCGCACAGCCAGTGTCTTAGTGGGGGC 365 ||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||| Sbjct 316 CGGCTACTCGCTGGACTTCTACATACCTGATGCGCGCACAGCCAGTGTCTTGGTGGGGGC 375 Query 366 ACCCAAAGCCAACACTAGCCAGCCGGATATCGTAGAAGGGGGAGCTGTCTACTACTGTCC 425 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 376 GCCCAAAGCCAACACTAGCCAGCCGGATATCGTAGAAGGGGGAGCTGTCTACTACTGTCC 435 Query 426 CTGGCCCT-CAGAGAGGTCTGCACAGTGCAAGCAGATACCGTTTGACACCACCAACAACA 484 |||| ||| ||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||| Sbjct 436 CTGG-CCTGCAGAGAGGTCTGCACAGTGCAAGCAGATACCCTTTGACACCACCAACAACA 494 Query 485 GGAAAATCAGAGTTAATGGAACCAAAGAACCTATAGAATTTAAATCAAACCAGTGGTTTG 544 |||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||| ||||||| Sbjct 495 GGAAAATCAGAGTTAATGGAACCAAAGAGCCTATAGAATTTAAATCAAACCAATGGTTTG 554 Query 545 GAGCCACAGTGAGAGCTCACAAAGGAAAAGTTGTGGCTTGTGCCCCTTTGTATCACTGGA 604 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||| Sbjct 555 GAGCCACAGTGAGAGCTCACAAAGGAAAAGTTGTGGCTTGTGCCCCTTTATATCACTGGA 614 Query 605 GAACTCTGAAACCTAATCCAGCGAAGGACCCAGTTGGCACATGCTATGTAGCAATTCAGA 664 |||||||||| ||||||||||| |||||||| |||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 615 GAACTCTGAAGCCTAATCCAGCAAAGGACCCGGTTGGCACATGCTATGTAGCAATTCAGA 674 Query 665 ATTTCAGTGCCTATGCTGAGCACTCACCTTGTCGAAACAGCAATGCTGATCCCGAAGGCC 724 | |||||||| || |||||||||||||| ||||| |||||||| | |||||| ||||||| Sbjct 675 ACTTCAGTGCTTACGCTGAGCACTCACCCTGTCGGAACAGCAACGTTGATCCTGAAGGCC 734 Query 725 AAGGTTACTGCCAGGCAGGGTTTAGCCTAGACTTCTATAAGAATGGAGACCTTATAGTGG 784 ||||||||||||| || || || || |||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 735 AAGGTTACTGCCAAGCCGGCTTCAGTCTAGACTTCTATAAGAATGGAGACCTTATAGTGG 794 Query 785 GAGGACCTGGAAGTTTTTACTGGCAAGGTCAGGTGATCACTGTCAGTATAGCAGACATCA 844 ||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||| |||||| |||||||||||| Sbjct 795 GAGGACCTGGAAGCTTTTACTGGCAAGGTCAGGTGATCACGGTCAGTGTAGCAGACATCA 854 Query 845 TTGCAAATTACTCATTCAAGGATATTCTACGAAAATTGGCCGCAGAAAAGCAGACAGACG 904 ||||||||||||||||||| || ||||| |||||| |||| ||||||||||||||||| | Sbjct 855 TTGCAAATTACTCATTCAAAGACATTCTTCGAAAACTGGCAGCAGAAAAGCAGACAGATG 914 Query 905 TGGCTCCAGCTTCCTATGATGACAGCTACCTTGGATATTCGGTCGCTGCTGGAGAATTCA 964 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| || |||||||||||||||| Sbjct 915 TGGCTCCAGCTTCCTATGATGACAGCTACCTTGGATATTCAGTTGCTGCTGGAGAATTCA 974 Query 965 CTGGGGACTCTCAGCAAGAATTGGTGGCTGGGATTCCAAGAGGAGCACAGAACTTTGGAT 1024 |||||||||||| |||||||||||| ||||| |||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 975 CTGGGGACTCTCTGCAAGAATTGGTTGCTGGAATTCCAAGAGGAGCACAGAACTTTGGAT 1034
Anhang
130
Query 1025 ATGTCTCCATCATTAACTCCACAGACATGACCTTCATTCAGAATTTTACTGGTGAGCAGA 1084 ||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1035 ATGTCTCCATCATTAACTCCACAGATATGACCTTCATTCAGAATTTTACTGGTGAGCAGA 1094 Query 1085 TGGCATCTTATTTCGGATATACTGTTGTGGTATCAGATGTTAACAATGATGGCATGGATG 1144 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1095 TGGCATCTTATTTCGGATATACTGTTGTGGTATCAGATGTTAACAATGATGGCATGGATG 1154 Query 1145 ACATATTGGTCGGGGCACCTCTCTTTATGGAGCGAGAATTTGAAAGTAACCCTAGAGAAG 1204 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1155 ACATATTGGTCGGGGCACCTCTCTTTATGGAGCGAGAATTTGAAAGTAACCCTAGAGAAG 1214 Query 1205 TGGGACAGGTCTACTTGTACCTTCAAGCAAGCGCCCTCCTCTTCCAAGACCCACAGGTCC 1264 |||| ||||||||| ||||||| |||| ||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1215 TGGGTCAGGTCTACCTGTACCTACAAGTGAGCGCCCTCCTCTTCCAAGACCCACAGGTCC 1274 Query 1265 TCACCGGCACGGAGACATTTGGGAGATTTGGTAGCTCTGTGGCCCACTTGGGGGACCTGA 1324 | || ||||| ||||| ||||||||||| ||||| ||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1275 TTACGGGCACAGAGACTTTTGGGAGATTCGGTAGTTCTGTGGCCCACTTGGGGGACCTGA 1334 Query 1325 ACCAAGATGGATACAATGACATCGCCATCGGTGTGCCCTTTGCAGGCAAGGATCAACGAG 1384 ||||||||||||||||||| || ||||||||||||||||||||||||||||||||| ||| Sbjct 1335 ACCAAGATGGATACAATGATATTGCCATCGGTGTGCCCTTTGCAGGCAAGGATCAAAGAG 1394 Query 1385 GTAAAGTCCTCATTTACAATGGAAAC-CCAAGAGGTTTACACAGCAAGCCTTCCCAAGTT 1443 ||||||||||||||||||| |||||| ||| |||| || ||||||||||||||||||||| Sbjct 1395 GTAAAGTCCTCATTTACAACGGAAACGCCA-GAGGCTTGCACAGCAAGCCTTCCCAAGTT 1453 Query 1444 CTGCAAGGAATATGGGGGTCACAGACCATCCCTTCTGGATTTGGCTTTTCTCTAAGAGGA 1503 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||| Sbjct 1454 CTGCAAGGAATATGGGGGTCACAGACCATCCCTTCTGGATTCGGCTTTTCTCTAAGAGGA 1513 Query 1504 GATGCAGACATAGACAAGAATGATTACCCAGATTTGCTTGTAGGGGCATTTGGAAAAGGG 1563 || |||||||||||||||||||||||||||||||| ||||| |||||||||||| ||||| Sbjct 1514 GACGCAGACATAGACAAGAATGATTACCCAGATTTACTTGTCGGGGCATTTGGAGAAGGG 1573 Query 1564 AAAGTAGCTGTTTACAGAGCAAGGCCAGTTGTAACCGTGGATGCCCAGCTTCTGCTGCAC 1623 ||||| || || ||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||| Sbjct 1574 AAAGTGGCCGTGTACAGAGCAAGGCCAGTTGTAACAGTGGATGCCCAGCTTCTGCTGCAC 1633 Query 1624 CCGATGATTATCAACCTTGAAAATAAAACTTGCCAGATTCCAGAATTCCCTACTCCTGTG 1683 || ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||| Sbjct 1634 CCAATGATTATCAACCTTGAAAATAAAACTTGCCAGATTCCAGAATTCCCGACTCCTGTG 1693 Query 1684 GCCTGCTTTTCTGTAAGAGTCTGTGCATCTATAGCAGGCCAGAGCATTTCAAATACAATA 1743 |||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| || Sbjct 1694 GCCTGCTTTTCTTTAAGAGTCTGTGCATCTATAGCAGGCCAGAGCATTTCAAATACAGTA 1753 Query 1744 GCCCTGCTGGCCGAGGTGCAGTTAGATTTCCTGAAGCAAAAAGGAGCCATCAAACGGACG 1803 |||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1754 GCCCTGATGGCCGAGGTGCAGTTAGATTTCCTGAAGCAAAAAGGAGCCATCAAACGGACC 1813 Query 1804 CTCTTTCTCCACAACCACCAGTCCCATTTCACCTTCCCCTTTGTGATGAAGCAGCAGAAA 1863 ||||| |||||||||||||||||||| ||| ||||||||| ||||||| |||||| ||| Sbjct 1814 CTCTTCCTCCACAACCACCAGTCCCACCTCATCTTCCCCTTCGTGATGAGGCAGCAAAAA 1873 Query 1864 TCCCTCCACTGCCAGGATTTTATGGTTTACCTTCGGGATGAAACTGAATTCCGAGATAAA 1923 ||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||| Sbjct 1874 TCCCTCCACTGCCAGGATTTTATGGTTTACCTTCGAGATGAAACTGAATTCCGAGATAAA 1933 Query 1924 TTGTCTCCAATCAACATCAGCCTGAACTACAGTTTGGATGATTCTACCTTTAAAGACAGC 1983 |||||||||||||| | |||||||||||||||||||||||||| |||||| |||| || Sbjct 1934 CTGTCTCCAATCAACGTTAGCCTGAACTACAGTTTGGATGATTCCACCTTTGAAGATGGC 1993 Query 1984 CTGGAAGTGAAGCCAATTTTGAACCACTACAGGGACAATGTAGTTACTGAGCAGGCTCAC 2043 |||||||||||||| |||||||||||||||||||| ||||| |||||||||||||||||| Sbjct 1994 CTGGAAGTGAAGCCGATTTTGAACCACTACAGGGAGAATGTCGTTACTGAGCAGGCTCAC 2053 Query 2044 ATCCTGGTGGACTGTGGAGAAGACAATCTATGCGTTCCTGACTTGAAGCTGTCAGCTAGA 2103 |||||||||||||||||||||||||| || || ||||||||||||| ||||||||||||| Sbjct 2054 ATCCTGGTGGACTGTGGAGAAGACAACCTCTGTGTTCCTGACTTGAGGCTGTCAGCTAGA 2113 Query 2104 CCAGATAAGCATCAGATAATTATTGGCGATGAAAATCACCTAATGCTCATAATAAATGCA 2163 ||||||||||| ||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||| |||||| Sbjct 2114 CCAGATAAGCAGGAGATAATTATTGGGGATGAAAATCACCTAATGCTCATAATCAATGCA 2173
Anhang
131
Query 2164 AGAAATGAGGGAGAAGGGGCCTACGAAGCCGAACTCTTTGTTATCATCCCCGAAGAAGCA 2223 || ||||| |||||||| || |||||||| |||||||| || || || |||||||||||| Sbjct 2174 AGGAATGAAGGAGAAGGAGCTTACGAAGCTGAACTCTTCGTCATGATTCCCGAAGAAGCA 2233 Query 2224 GATTATGTTGGGATTGAGCGCAACAACAAGGGACTGAGGCCCCTGAGTTGTGAGTACAAG 2283 ||||| |||||||| ||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||| Sbjct 2234 GATTACGTTGGGATCGAGCGCAACAACAAGGGACTGAGGCTCCTGAGTTGTGAGTACAAG 2293 Query 2284 ATGGAAAACGTGACCAGGATGGTGGTGTGTGACCTTGGGAACCCGATGGTGACTGGAACA 2343 ||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 2294 ATGGAAAACGTAACCAGGATGGTGGTGTGTGACCTTGGGAACCCGATGGTGACTGGAACG 2353 Query 2344 AATTTTTCTCTGGGCCTCCGATTTGCTGTTCCTCGCCTTGAGAAAACAAATATGAGCATT 2403 ||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||| ||||| ||| Sbjct 2354 AATTTTTCTCTGGGCCTCCGATTTGCTGTTCCTCGTCTTGAGAAAACAAACATGAGTATT 2413 Query 2404 AACTTCGATCTCCAAATCAGAAGCTCCAATAAGGACAATCCTGACAGCAACTTCG--AGC 2461 ||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||| |||| ||| Sbjct 2414 AACTTCGATCTCCAAATCAGAAGCTCCAACAAGGACAATCCTGACAGCAATTTCGTGAGC 2473 Query 2462 GTGTACAGATCAACATCACTGCCATTGCTCAGGTCGAAATCAGAGGAGTGTCCCACCCTC 2521 ||| | | |||||| |||||||| | |||||||| ||||||||||||||||||||||||| Sbjct 2474 GTGCA-A-ATCAACGTCACTGCCGTGGCTCAGGTGGAAATCAGAGGAGTGTCCCACCCTC 2531 Query 2522 CGCAGATTGTTCTGCCCATCCACAACTGGGAACCAGAAAAGAAGCCACACAAAGAGGAGG 2581 | || |||||||||||||||||||||||||| |||| | || |||| ||||||||||||| Sbjct 2532 CCCAAATTGTTCTGCCCATCCACAACTGGGAGCCAGCAGAGGAGCCCCACAAAGAGGAGG 2591 Query 2582 AAGTCGGTCCTTTGGTTGAGCATATTTATGAGCTGCACAATATTGGACCCAGCACCATCA 2641 |||||||||| ||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 2592 AAGTCGGTCCCCTGGTTGAACATATTTATGAGCTGCACAATATTGGACCCAGCACCATCA 2651 Query 2642 GTGACAGCATTCTTGACGTGGGCTGGCCGTTCTCTGCACGGGATGAGTTTCTCCTCTATA 2701 ||||||||||||| || ||||||||||| |||||||||||||| ||||| ||||||||| Sbjct 2652 GTGACAGCATTCTCGAAGTGGGCTGGCCATTCTCTGCACGGGAGGAGTTCCTCCTCTATG 2711 Query 2702 TTTTTCATCTTCAAACTCTGGGACCTCTACAATGTCAAACAAATCCTGAGATCAACCCAC 2761 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| | Sbjct 2712 TCTTTCATCTTCAAACTCTGGGACCTCTACAATGTCAAACAAATCCTGAGATCAACCCGC 2771 Query 2762 AGGATATAAAGCCTGCTGCCTCCCCAGAGGATACCCCTGAGCTCAGTGCCTTCTTAAGAA 2821 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||| Sbjct 2772 AGGATATAAAGCCTGCTGCCTCCCCAGAGGATACCCCTGAGCTCAGCGCCTTCTTAAGAA 2831 Query 2822 ATGCTACAATTCCCCATCTTGTCAGAAAGAGGGATGTGCCAGTGGTCCAGCTCCACAGAC 2881 ||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||| |||||||| Sbjct 2832 ATGCTACAATTCCCCATCTTGTCAGGAAGAGGGATGTGCCAGTGGTCCAGCCCCACAGAC 2891 Query 2882 AGAGCCCTGCAAGAATACTGAACTGTACCAACATTGACTGCTTGCAAATCTCTTGTGCAG 2941 ||||||| |||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||| Sbjct 2892 AGAGCCCGGCAAAAATACTGAACTGTACCAACATTGACTGCTTGCAAATCTCGTGTGCAG 2951 Query 2942 TGGGTCGCCTGGGAGGAGGCGAAAGTGCAGTCCTAAAGGTCAGATCGAGATTGTGGGCCC 3001 ||||||||||||||||||| ||||||||||| || ||||||||||||||||||||||| | Sbjct 2952 TGGGTCGCCTGGGAGGAGGAGAAAGTGCAGTTCTGAAGGTCAGATCGAGATTGTGGGCGC 3011 Query 3002 ACACGTTCCTCAAGAGAAAGAATGATCATTATGCTCTTGCATCCCTGGTGTCCTTTGAAG 3061 |||| |||||| |||||||||| || | |||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 3012 ACACATTCCTCCAGAGAAAGAACGACCCTTATGCTCTTGCATCCCTGGTGTCCTTTGAAG 3071 Query 3062 TCAAGAAGATGCCGTATAAAGAACAGCCAGCAAAGCTGCCAGCGGGGAGCACAGCGGTTA 3121 |||||||||| || |||||||| ||||||||||| |||||||| |||||||||||| ||| Sbjct 3072 TCAAGAAGATACCTTATAAAGAGCAGCCAGCAAAACTGCCAGCCGGGAGCACAGCGATTA 3131 Query 3122 AGACGTCGGTTATTTGGGCCACTCCGAATGTCTCCTTCTCAATTCCATTGTGGGTCATAA 3181 |||| |||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||| |||||||||||| Sbjct 3132 AGACATCGGTTATTTGGGCCACTCCAAATGTCTCCTTCTCAATTCCACTGTGGGTCATAA 3191 Query 3182 TACTAGCGATCCTTCTTGGTTTGCTGGTTCTGGCTATCTTAACTTTAGCTTTATGGAAGT 3241 ||||||||||||||||||| |||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||| Sbjct 3192 TACTAGCGATCCTTCTTGGCTTGCTGGTTCTGGCCATCTTAACTTTAGCTTTATGGAAGT 3251 Query 3242 GTGGATTCTTTGATAGAGCAAGACCTCCTCAGGATGAAATGACAGACAGGGAACAACTGA 3301 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 3252 GTGGATTCTTTGATAGAGCAAGACCTCCTCAGGATGAAATGACAGACAGGGAACAACTGA 3311
Anhang
132
Query 3302 CCAGTGACAAGACCCCAGAGGCGTGACTTGGAAACATGAAGACCTAAAATTCAAGCACTG 3361 |||||||||||||||| ||||| |||||||||| |||||| ||||||||||||||||||| Sbjct 3312 CCAGTGACAAGACCCCGGAGGCTTGACTTGGAACCATGAACACCTAAAATTCAAGCACTG 3371 Query 3362 GTCCTATTCAAAGAAAGAAAGGGAGGAAGGACACAAGGGCTCAATGATCATAGCCTTCCA 3421 ||||| ||||||||||||||| | ||| ||||||||| | |||||||||||||||||| Sbjct 3372 GTCCTGTTCAAAGAAAGAAAG--A--AAGAACACAAGGGTTGAATGATCATAGCCTTCCA 3427 Query 3422 TACCTGCCAATGACCCAGGGAATG-AAGAGTCCCTAATGATCACCTCATCTAAGTCATGC 3480 ||||||||||||||||||||||| ||||||||||||| | | | ||| | || Sbjct 3428 CACCTGCCAATGACCCAGGGAATGGAAGAGTCCCTAAT---C---TG-TGTAA--C--GC 3476 Query 3481 ATTGGT-GTGGAGTGCAGAGAACCCCAC-GTGAAAAGAAATGCAGCCACTAACACTACAG 3538 ||||| | ||| | ||||||||||||| | ||||||||| ||||||| |||||| || Sbjct 3477 ATTGGCAG-GGACTACAGAGAACCCCACCG-GAAAAGAAACACAGCCACCAACACTGTAG 3534 Query 3539 AAACAATCCACAGCCATGAAGATTTCCTTTGTTCTTACCGTTTCACATCTGGCTGACATT 3598 |||||||||||||||||||||||||||||| ||| ||| ||||||||||||| | ||| Sbjct 3535 GAACAATCCACAGCCATGAAGATTTCCTTTGCTCTCACCCTTTCACATCTGGCCAATATT 3594 Query 3599 CTGGAACAGCTGTAGGAGCTTAGGCAGCTGTCTAGGTCAGCCCAATATGACTTACAAAAA 3658 ||||||||||||||||| || | || ||||| || |||||||||| ||||| ||||||| Sbjct 3595 CTGGAACAGCTGTAGGAACTCAAACAACTGTCCAGATCAGCCCAATGTGACTCACAAAAA 3654 Query 3659 CA-A-TTCCTACAGAGATGAGATGAACTGAGATTGAACACTACTGTAATCCGATGGAATC 3716 || | |||||||||||| |||||| || |||| |||||||||||||||||||||| || Sbjct 3655 CACAGTTCCTACAGAGACGAGATGGACCAAGATCGAACACTACTGTAATCCGATGGCGTC 3714 Query 3717 TCAGACACCTCCCTATGGAATAGAACCCTTTCTAAGGATGCGAAGGCTCAGGGAGAAAAG 3776 || |||||| |||||||||| ||||||||||||||||||| || |||||||||||||||| Sbjct 3715 TCGGACACCCCCCTATGGAAGAGAACCCTTTCTAAGGATGTGATGGCTCAGGGAGAAAAG 3774 Query 3777 T-GATATGATGTTGGGACTATGAAAGTGCTTATGGAACTACAGAGATGATTTCA-TCATG 3834 |||| | ||||||||| ||||||||||| |||||||| ||||||||||| | | | Sbjct 3775 CAGATACAACGTTGGGACTGTGAAAGTGCTTGCAGAACTACAAAGATGATTTCACTAA-G 3833 Query 3835 GGAAG-ACCAAAAATATATTTATTTATGTTTCCTTTCTCTAGGTAGAGAATTGGGCCATT 3893 | ||| ||||||||| |||||||||||||||| |||||||||||||| ||||||||||| Sbjct 3834 G-AAGGACCAAAAATGTATTTATTTATGTTTCGTTTCTCTAGGTAGAAAATTGGGCCATC 3892 Query 3894 TAGAGGATGTGGAAATTAAGATTTGGTTAGCTAGATTTCATCA-CTACTCAGTTTACTTC 3952 |||||||| |||| | | |||||||||||||||||||||||| | ||||| ||||| | Sbjct 3893 TAGAGGATTTGGAGAGGACGATTTGGTTAGCTAGATTTCATCAGC-ACTCAACTTACTCC 3951 Query 3953 CTCTTAAGATAACTACTCTGTGCAGATAGCATATTTAATTGGGCTTCTTCAGGTGTTAGA 4012 |||||||||||||| |||||||||||||| | ||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 3952 CTCTTAAGATAACTGTTCTGTGCAGATAGCGTGTTTAATTGGGCTTCTTCAGGTGTTAGA 4011 Query 4013 TGGTGTTACACATGGTTTGGCATTAGGGCTCTGTTGTGCTTAATTTTCTGCTGCCTCGAG 4072 || ||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||| ||||||||| ||| Sbjct 4012 TGATGTTACACATGGTTTGGCATTAGGGCTCTTTTGTGCTTAATTTCCTGCTGCCTGGAG 4071 Query 4073 TGACTTTTCTTCATGTTCTCTGGAAACTCATGTCTGCATAATTCAACTTTACAAAATCTT 4132 |||| || |||||||||||| || |||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 4072 TGACATTCCTTCATGTTCTCCGGGAACTCATGTCTGCATAATTCAACTTTACAAAATCTT 4131 Query 4133 ATATTTATAGTTTC-TTTTATATGTGTAAAAAA-CTATTTCCAGTGACTTCTGTAAAGCA 4190 |||||||||||| | |||||||||||| ||||| ||||||||| |||||||| ||||||| Sbjct 4132 ATATTTATAGTT-CATTTTATATGTGTGAAAAATCTATTTCCACTGACTTCTTTAAAGCA 4190 Query 4191 TTCATTTCAAGGTACTCACTATGCTGATGATGTTGAAAAGTACTTGCACAATTTTGTAGA 4250 ||||||||||||||||||||| |||||| ||||||||| |||| ||||||||| ||||| Sbjct 4191 TTCATTTCAAGGTACTCACTACCCTGATGCTGTTGAAAACTACTAGCACAATTT-GTAGA 4249 Query 4251 GTCCATATAAAAAG-CAATTTAACTATATGGGTGAATATTATCTTAATAGCTATAGTAAG 4309 ||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||| |||||||| |||| Sbjct 4250 GTCCATATAAAAAAACAATTTAACTATATGGGTGAATATTATCTTGATAGCTATTGTAAA 4309 Query 4310 CACCAATATTTACCTTGAAATTTACACACTCATTTTCATTGTAATACCTCACATTTATAT 4369 |||||| ||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||| || | Sbjct 4310 CACCAACATTTACCTTGAAATTTACACACTTGTTTTCATTGTAATACCTCACATTCATGT 4369 Query 4370 AAAAGAGAAAACTGTGTTGAACATAAATAAGAT-GAAGATATATAAAGTTATACAAGTGT 4428 ||||||||||| |||||||| |||||||||||| ||| ||||||||||| |||||||| | Sbjct 4370 AAAAGAGAAAAGTGTGTTGAGCATAAATAAGATAGAA-ATATATAAAGTCATACAAGTAT 4428
Anhang
133
Query 4429 GAGCCAAACAGAAACTCACTCTTAAGGACATAGCAGTGCTTATTACAGCTTTATT-GTCC 4487 |||||| |||| || ||||||||||||| || || || |||||||||||||||| | || Sbjct 4429 GAGCCAGGCAGACACACACTCTTAAGGACCTAACAATGTTTATTACAGCTTTATTAG-CC 4487 Query 4488 ACTCTTTATGGTTAA-CTTTTCCTAGCAAGTAATCTTGGAGAATA-T-TTT-ATATTTAA 4543 ||||||||||||||| || | |||||||||||||||||||||||| | ||| |||||||| Sbjct 4488 ACTCTTTATGGTTAATCTGT-CCTAGCAAGTAATCTTGGAGAATAATCTTTTATATTTAA 4546 Query 4544 GCTATTTTACCATCATCTTTACCTAAACATTGCTTAGAGCTCTTGTAAATAATCCATAAT 4603 |||||||||||||||||||||| ||||| ||||||| ||| |||||||||||| |||| | Sbjct 4547 GCTATTTTACCATCATCTTTACTTAAACGTTGCTTAAAGCGCTTGTAAATAATTCATAGT 4606 Query 4604 AATTTGTAATGTTGTCATTTTGAAGTAATATTGACCAGCCAAATTAATAAGATTGTCTGC 4663 |||| |||||||| | ||||||||||| |||||| |||||||||| |||||||| |||| Sbjct 4607 AATTCGTAATGTTATGATTTTGAAGTACTATTGAACAGCCAAATTCATAAGATTACCTGC 4666 Query 4664 ACAATTTTATATCCTTTTTATAATAATGAAAAATTGCTATGGAGAAATGCTGAACAAAAT 4723 ||| |||||||||||||||||||||||||||||| |||| |||||||||||||||||||| Sbjct 4667 ACACTTTTATATCCTTTTTATAATAATGAAAAAT-GCTACGGAGAAATGCTGAACAAAAT 4725 Query 4724 GTTATGTGCAATATTTTATAGACCTATGTATCTGAGGCATGTTTACACTGGCATTAGTTT 4783 |||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 4726 GTTATGTGCAATATTTTATAGAACTATGTATCTGAGGCATGTTTACACTGGCATTAGTTT 4785 Query 4784 Ctttttttt-AATTAATATCCTGA-TCACTAAGTCTGATATAACAAGCTGACCAAAATCC 4841 ||||||||| |||||||||||||| | ||||||||||||||||||||||||||||| | Sbjct 4786 CTTTTTTTTTAATTAATATCCTGAAT-ACTAAGTCTGATATAACAAGCTGACCAAA--C- 4841 Query 4842 TAACGTTTACAAAACAG-----AAAA-CTCTGTCTCAGTTTCAACAATGACACT-TTATT 4894 ||||||||| ||| |||| || ||||||||||||| |||||||||| || || Sbjct 4842 ----GTTTACAAAGCAGTTGGGAAAATCTGTGTCTCAGTTTCACCAATGACACTCTT-TT 4896 Query 4895 TGAAAGATGACCCAAACTCACAGACAGTAAATTTTATGTGGTGCCTTAACCTGGAAAGGA 4954 ||||||| || |||||||||||||||||||| | ||||||||||||||||||||||||| Sbjct 4897 TGAAAGACGATCCAAACTCACAGACAGTAAACATGATGTGGTGCCTTAACCTGGAAAGGA 4956 Query 4955 GCCATTTGGCTTCAGTTGCTACAGTTCCTTGGAAAGCAAATGAAATGCACAGAGTCAAAC 5014 ||||||||||||||||||| | | ||||||||||||||||||| ||||| || Sbjct 4957 GCCATTTGGCTTCAGTTGC--C--T-----GGAAAGCAAATGAAATGCA--GAGTCGAAG 5005 Query 5015 AGCATTGCTGTTCATCTTGCCCTGCTTATTAGTTAAATCTGTCCTGGTAGCTGGCTT-AT 5073 | || ||||||||| |||||||||||| | |||||| |||||||| |||||| ||| || Sbjct 5006 ATCACTGCTGTTCACCTTGCCCTGCTTGTCAGTTAAC-CTGTCCTGATAGCTG-CTTTAT 5063 Query 5074 GTCTATAAGG 5083 |||||| ||| Sbjct 5064 GTCTATCAGG 5073
B. Homologie des α8-Integrin Proteins von Maus (obere Reihe) und Ratte (untere Reihe)
Aminosäuren (AS) sind in Einbuchstabencode dargestellt.
Query 1 MSAGTHCGPPGNRAPPFARLCCVSAALGMLWSPACLAFNLDVDKLTVYSGPEGSYFGYSL 60 MSA TH GPP N APPFA LCCVSA LGMLWSP LAFNLDVDKLTVYSGPEGSYFGYSL Sbjct 1 MSARTHRGPPENWAPPFACLCCVSAVLGMLWSPVSLAFNLDVDKLTVYSGPEGSYFGYSL 60 Query 61 DFYIPDARTASVLVGAPKANTSQPDIVEGGAVYYCPWPSERSAQCKQIPFDTTNNRKIRV 120 DFYIPDARTASVLVGAPKANTSQPDIVEGGAVYYCPWP+ERSAQCKQIPFDTTNNRKIRV Sbjct 61 DFYIPDARTASVLVGAPKANTSQPDIVEGGAVYYCPWPAERSAQCKQIPFDTTNNRKIRV 120 Query 121 NGTKEPIEFKSNQWFGATVRAHKGKVVACAPLYHWRTLKPNPAKDPVGTCYVAIQNFSAY 180 NGTKEPIEFKSNQWFGATVRAHKGKVVACAPLYHWRTLKPNPAKDPVGTCYVAIQNFSAY Sbjct 121 NGTKEPIEFKSNQWFGATVRAHKGKVVACAPLYHWRTLKPNPAKDPVGTCYVAIQNFSAY 180 Query 181 AEHSPCRNSNADPEGQGYCQAGFSLDFYKNGDLIVGGPGSFYWQGQVITVSIADIIANYS 240 AEHSPCRNSN DPEGQGYCQAGFSLDFYKNGDLIVGGPGSFYWQGQVITVS+ADIIANYS Sbjct 181 AEHSPCRNSNVDPEGQGYCQAGFSLDFYKNGDLIVGGPGSFYWQGQVITVSVADIIANYS 240
Anhang
134
Query 241 FKDILRKLAAEKQTDVAPASYDDSYLGYSVAAGEFTGDSQQELVAGIPRGAQNFGYVSII 300 FKDILRKLAAEKQTDVAPASYDDSYLGYSVAAGEFTGDS QELVAGIPRGAQNFGYVSII Sbjct 241 FKDILRKLAAEKQTDVAPASYDDSYLGYSVAAGEFTGDSLQELVAGIPRGAQNFGYVSII 300 Query 301 NSTDMTFIQNFTGEQMASYFGYTVVVSDVNNDGMDDILVGAPLFMEREFESNPREVGQVY 360 NSTDMTFIQNFTGEQMASYFGYTVVVSDVNNDGMDDILVGAPLFMEREFESNPREVGQVY Sbjct 301 NSTDMTFIQNFTGEQMASYFGYTVVVSDVNNDGMDDILVGAPLFMEREFESNPREVGQVY 360 Query 361 LYLQASALLFQDPQVLTGTETFGRFGSSVAHLGDLNQDGYNDIAIGVPFAGKDQRGKVLI 420 LYLQ SALLFQDPQVLTGTETFGRFGSSVAHLGDLNQDGYNDIAIGVPFAGKDQRGKVLI Sbjct 361 LYLQVSALLFQDPQVLTGTETFGRFGSSVAHLGDLNQDGYNDIAIGVPFAGKDQRGKVLI 420 Query 421 YNGNPRGLHSKPSQVLQGIWGSQTIPSGFGFSLRGDADIDKNDYPDLLVGAFGKGKVAVY 480 YNGN RGLHSKPSQVLQGIWGSQTIPSGFGFSLRGDADIDKNDYPDLLVGAFG+GKVAVY Sbjct 421 YNGNARGLHSKPSQVLQGIWGSQTIPSGFGFSLRGDADIDKNDYPDLLVGAFGEGKVAVY 480 Query 481 RARPVVTVDAQLLLHPMIINLENKTCQIPEFPTPVACFSVRVCASIAGQSISNTIALLAE 540 RARPVVTVDAQLLLHPMIINLENKTCQIPEFPTPVACFS+RVCASIAGQSISNT+AL+AE Sbjct 481 RARPVVTVDAQLLLHPMIINLENKTCQIPEFPTPVACFSLRVCASIAGQSISNTVALMAE 540 Query 541 VQLDFLKQKGAIKRTLFLHNHQSHFTFPFVMKQQKSLHCQDFMVYLRDETEFRDKLSPIN 600 VQLDFLKQKGAIKRTLFLHNHQSH FPFVM+QQKSLHCQDFMVYLRDETEFRDKLSPIN Sbjct 541 VQLDFLKQKGAIKRTLFLHNHQSHLIFPFVMRQQKSLHCQDFMVYLRDETEFRDKLSPIN 600 Query 601 ISLNYSLDDSTFKDSLEVKPILNHYRDNVVTEQAHILVDCGEDNLCVPDLKLSARPDKHQ 660 +SLNYSLDDSTF+D LEVKPILNHYR+NVVTEQAHILVDCGEDNLCVPDL+LSARPDK + Sbjct 601 VSLNYSLDDSTFEDGLEVKPILNHYRENVVTEQAHILVDCGEDNLCVPDLRLSARPDKQE 660 Query 661 IIIGDENHLMLIINARNEGEGAYEAELFVIIPEEADYVGIERNNKGLRPLSCEYKMENVT 720 IIIGDENHLMLIINARNEGEGAYEAELFV+IPEEADYVGIERNNKGLR LSCEYKMENVT Sbjct 661 IIIGDENHLMLIINARNEGEGAYEAELFVMIPEEADYVGIERNNKGLRLLSCEYKMENVT 720 Query 721 RMVVCDLGNPMVTGTNFSLGLRFAVPRLEKTNMSINFDLQIRSSNKDNPDSNFERVQINI 780 RMVVCDLGNPMVTGTNFSLGLRFAVPRLEKTNMSINFDLQIRSSNKDNPDSNF VQIN+ Sbjct 721 RMVVCDLGNPMVTGTNFSLGLRFAVPRLEKTNMSINFDLQIRSSNKDNPDSNFVSVQINV 780 Query 781 TAIAQVEIRGVSHPPQIVLPIHNWEPEKKPHKEEEVGPLVEHIYELHNIGPSTISDSILD 840 TA+AQVEIRGVSHPPQIVLPIHNWEP ++PHKEEEVGPLVEHIYELHNIGPSTISDSIL+ Sbjct 781 TAVAQVEIRGVSHPPQIVLPIHNWEPAEEPHKEEEVGPLVEHIYELHNIGPSTISDSILE 840 Query 841 VGWPFSARDEFLLYIFHLQTLGPLQCQTNPEINPQDIKPAASPEDTPELSAFLRNATIPH 900 VGWPFSAR+EFLLY+FHLQTLGPLQCQTNPEINPQDIKPAASPEDTPELSAFLRNATIPH Sbjct 841 VGWPFSAREEFLLYVFHLQTLGPLQCQTNPEINPQDIKPAASPEDTPELSAFLRNATIPH 900 Query 901 LVRKRDVPVVQLHRQSPARILNCTNIDCLQISCAVGRLGGGESAVLKVRSRLWAHTFLKR 960 LVRKRDVPVVQ HRQSPA+ILNCTNIDCLQISCAVGRLGGGESAVLKVRSRLWAHTFL+R Sbjct 901 LVRKRDVPVVQPHRQSPAKILNCTNIDCLQISCAVGRLGGGESAVLKVRSRLWAHTFLQR 960 Query 961 KNDHYALASLVSFEVKKMPYKEQPAKLPAGSTAVKTSVIWATPNVSFSIPLWVIILAILL 1020 KND YALASLVSFEVKK+PYKEQPAKLPAGSTA+KTSVIWATPNVSFSIPLWVIILAILL Sbjct 961 KNDPYALASLVSFEVKKIPYKEQPAKLPAGSTAIKTSVIWATPNVSFSIPLWVIILAILL 1020 Query 1021 GLLVLAILTLALWKCGFFDRARPPQDEMTDREQLTSDKTPEA 1062 GLLVLAILTLALWKCGFFDRARPPQDEMTDREQLTSDKTPEA Sbjct 1021 GLLVLAILTLALWKCGFFDRARPPQDEMTDREQLTSDKTPEA 1062
VIII
Publikationen
Hartner, I. Marek, N. Cordasic, C. Haas, H. Schöcklmann, G. Hülsmann-Volkert, I. Plasa, W. Rascher, K.F. Hilgers, K. Amann (2008): Glomerular regeneration is delayed in nephritic α8 integrin-deficient mice: Contribution of α8 integrin to the regulation of mesangial cell apoptosis. American Journal of Nephrology 28, 168-178
A. Hartner, N. Cordasic, C. Menendez-Castro, G. Volkert, J.M. Yabu, M. Kupraszewicz-Hutzler, W. Rascher, K.F. Hilgers (2010): Lack of α8 integrin aggravates podocyte injury in experimental diabetic nephropathy. Am J Physiol Renal Physiol 299, F1151-7
I. Marek*, G. Volkert*, A. Jahn, F. Fahlbusch, C. Zürn, Z. Özcan, M. Goppelt-Strübe, K.F. Hilgers, W. Rascher, A. Hartner (2010): Lack of alpha8 integrin leads to morphological changes in renal mesangial cells, but not in vascular smooth muscle cells. BMC Cell Biology 11, 102 (* gleichberechtigte Erstautoren)
Kongressbeiträge
Jahn, G. Hülsmann-Volkert, K.F. Hilgers, A. Hartner (2006): The alpha8 integrin chain protects renal cells against apoptosis. Poster at the XLIII Congress of the European Renal Association 2006, Glasgow and Nephrol Dial Transplant Suppl 21, V29
I. Marek, A. Jahn, G. Hülsmann-Volkert, A. Hartner (2006): The alpha8 integrin chain contributes to maintaining the mesenchymal phenotype of renal mesangial cells. Oral presentation at the 37th Meeting of the German Society of Nephrology, Essen and Zeitschrift für Nieren- und Hochdruckkrankheiten 35
A. Jahn, G. Hülsmann-Volkert, A. Hartner (2006): Contribution of the alpha8 integrin chain to renal cell survival. Poster at the 37th Meeting of the German Society of Nephrology, Essen and Zeitschrift für Nieren- und Hochdruckkrankheiten 35
A. Jahn, G. Hülsmann-Volkert, N. Cordasic, W. Rascher, K.F. Hilgers, A. Hartner (2007): Extracellular matrix molecule and integrin expression patterns are altered in vascular smooth muscle cells derived from alpha8 integrin-deficient mice. Poster at the 38th Meeting of the German Society of Nephrology, Munich and Nieren- und Hochdruckkrankheiten 36, 446
A. Hartner, N. Cordasic, A. Jahn, G. Hülsmann-Volkert, W. Rascher, K.F. Hilgers (2007): Fibrillin-1 and alpha8 integrin are coexpressed in the glomerulus and interact to confer fim adhesion of mesangial cells. Poster at the 38th Meeting of the German Society of Nephrology, Munich and Nieren- und Hochdruckkrankheiten 36, 442
IX
G. Volkert, A. Jahn, I. Marek, M. Goppelt-Strübe, K.F. Hilgers, W. Rascher, A. Hartner (2009): Lack of alpha8 integrin leads to morphological and functional changes in renal mesangial cells, but not in vascular smooth muscle cells. Poster at the 1st Annual Meeting of the German Society of Nephrology, Göttingen and Zeitschrift für Nieren- und Hochdruckkrankheiten 38, 466
A. Hartner, C. Menendez-Castro, N. Cordasic, G. Volkert, J. Dötsch, W. Rascher, K.F. Hilgers (2010): Das Fehlen von alpha8 Integrin verschlimmert den Podozytenschaden bei experimenteller Typ 1 Diabetes-assoziierter Nephropathie. Poster at the 41st Annual Meeting of the German Society of Pediatric Nephrology, Hamburg and Der Nephrologe 5, S60
A. Hartner, C. Menendez-Castro, N. Cordasic, G. Volkert, W. Rascher, K.F. Hilgers (2010): Lack of α8 integrin aggravates podocyte injury in experimental diabetic nephropathy. Poster at the XLVII ERA-EDTA Congress, Munich and Nephrol Dial Transplant Plus 3, iii 107
G. Volkert, I. Marek, A. Jahn, A. Hartner (2010): siRNA-Silencing von α8-Integrin in Mesangiumzellen. Vortrag am Kongress der Jungen Niere, Hamburg
G. Volkert, I. Marek, K.F. Hilgers, W. Rascher, A. Hartner (2010): siRNA silencing of the α8 integrin chain in mesangial cells. Poster at the 3rd International Symposium SFB 423, Bamberg
X
Danksagung
An dieser Stelle möchte ich mich bei Frau Prof. Dr. Andrea Hartner für die Überlassung
des Themas, für die wissenschaftliche Betreuung der Dissertation sowie die Übernahme
des Zweitgutachtens bedanken. Ihre fachkompetente Unterstützung und wissenschaftliche
Diskussionsbereitschaft weiß ich sehr zu schätzen.
Herrn Prof. Dr. Robert Slany danke ich für die freundliche Übernahme der Betreuung und
die Vertretung meiner Doktorarbeit seitens der Naturwissenschaftlichen Fakultät der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg.
Danken möchte ich Herrn Prof. Dr. Karl Hilgers, der mit konstruktiven Diskussionen und
wertvollen Hilfestellungen einen westlichen Beitrag zum Gelingen dieser Arbeit beitrug.
Für seine außergewöhnliche Hilfsbereitschaft möchte ich PD Dr. Christoph Daniel meinen
Dank aussprechen. Seine Tipps, vor allem bei der Etablierung der siRNA-Technik in
Primärzellen, sowie seine stete Bereitschaft für produktive Diskussionen waren mir von
großem Nutzen.
Ich weiß sehr zu schätzen, dass ich bei den Mitarbeitern des Labors stets auf gute
Arbeitsatmosphäre und spontane Hilfsbereitschaft treffen durfte. Daher gilt allen Kollegen
und Mitarbeitern ein herzliches Dankeschön für ihre Hilfen, Anleitungen, Korrekturen und
sonstigen Unterstützungen. Besonders erwähnen möchte ich an dieser Stelle Nada für ihre
Hilfe bei der Präparation der Mäuseaorten, Rainer für seine Einarbeitung in die Taqman
RT-PCR und die Unterweisung in der Generierung von Primern, Sonja für ihre wertvolle
Hilfe (und das nicht nur) im Labor und Ines für ihren freundschaftlichen Beistand bei der
Durchführung und Anfertigung meiner Doktorarbeit.
Babs, Brigitte, Susi, Tine, Andy, Hans, Tina sowie Andrea danke ich für die schöne Zeit
und die vielen netten (Mittagstisch-) Runden. Ich werde euch immer in meinem Herzen
tragen und nie vergessen, dass ihr mit mir nicht nur die Freude, sondern auch den Frust
geteilt habt. In diesem Zusammenhang möchte ich insbesondere Andy und Hans meinen
Dank aussprechen, die in besonderem Maße zu Beginn meiner Tätigkeit in der Loschge
mir zur Seite standen und mich in den Großteil der Methoden einweihten. Andy ist mir
darüber hinaus eine wichtige Freundin geworden, der ich für ihre freundschaftliche
Unterstützung auf meinem Weg danken möchte.
Darüber hinaus verdanke ich meiner Mitstreiterin Tine mehr als ich ausdrücken kann.
XI
Danke auch an Edith, Anke und im Speziellen an Cem und Andre für eure Hilfe und für
die Durchsicht des Manuskriptes. Gute Arbeit!
Nicht zuletzt möchte ich mich ganz besonders herzlich bei meiner Familie und bei meinen
Freunden für die fortwährende Unterstützung, Geduld und den stetem Glauben an mich
bedanken.
Ich danke mit Liebe und Respekt meiner Tochter Ann-Christin, die in dieser Zeit oft ohne
mich auskommen musste und dies mit viel Geduld und Verständnis gemeistert hat. Ich bin
stolz auf dich.