Cambios clínicos producidos por una pasta dental con digluconato ...
EFICÁCIA DO DIGLUCONATO DE CLOREXIDINA FRENTE A … · adriana macedo da rocha eficÁcia do...
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ADRIANA MACEDO DA ROCHA
EFICÁCIA DO DIGLUCONATO DE CLOREXIDINA FRENTE A
SUSPENSÕES DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS EM DIFERENTES
LÍQUIDOS BIOLÓGICOS
CANOAS, 2009.
ADRIANA MACEDO DA ROCHA
EFICÁCIA DO DIGLUCONATO DE CLOREXIDINA FRENTE A
SUSPENSÕES DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS EM DIFERENTES
LÍQUIDOS BIOLÓGICOS
Trabalho de conclusão apresentado ao público e a comunidade acadêmica do UNILASALLE - Centro Universitário La Salle, como exigência parcial para a obtenção do grau de Bacharel em Química, sob a orientação da Prof.º Delmar Bizani.
CANOAS, 2009.
TERMO DE APROVAÇÃO
ADRIANA MACEDO DA ROCHA
EFICÁCIA DO DIGLUCONATO DE CLOREXIDINA FRENTE A
SUSPENSÕES DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS EM DIFERENTES
LÍQUIDOS BIOLÓGICOS
Trabalho de conclusão aprovado como requisito parcial para a obtenção do grau de Bacharel em Química do Centro Universitário La Salle – UNILASALLE, pelo
avaliador:
Prof. Delmar Bizani
Unilasalle
Canoas, 19 de junho de 2009
“Procuro um lugar
Não sei se é nesse ou noutro mundo
Num mundo onde andei
A vida escondeu
No esquecimento mais profundo
Alguém que hoje sou eu”
Cidadão Quem
AGRADECIMENTOS
Gostaria de agradecer em primeiro lugar a minha família, que sempre me
incentivou e me deu forças para enfrentar todos os obstáculos encontrados durante
todos os momentos em minha vida.
Agradeço aos professores pelos ensinamentos recebidos.
Agradeço a MaxSane Indústria de Saneantes Ltda. pela confiança, e
flexibilidade em me dispensar em determinados momentos para a realização deste
trabalho.
Ao meu orientador prof. Delmar Bizani, pela disponibilidade, atenção e total
apoio durante toda a realização deste trabalho.
Aos amigos conquistados, ao longo do curso de graduação, muito valiosos que
levo para o resto de minha vida.
A todos que de alguma forma colaboraram para a realização desta importante
etapa de minha vida profissional.
RESUMO
O digluconato de clorexidina, ou somente clorexidina, como é mais conhecido é muito utilizado como anti-séptico. O objetivo deste trabalho foi testar a eficácia do digluconato de clorexidina na concentração de 2% como agente bactericida frente ao Staphylococcus aureus, isolado clínico correspondente e ainda na presença de matéria orgânica: sangue, plasma e urina. Foram realizadas análises microbiológicas em aerobiose que comprovaram que a clorexidina é um excelente agente bactericida frente aos microrganismos testados e também na presença de matéria orgânica. Palavras chave: clorexidina, eficácia, Staphylococcus, bactericida, microrganismos.
ABSTRACT
The chlorhexidine digluconate, chlorhexidine or only, as is known is more widely used as an antiseptic. The objective this work was to test the efficacy of chlorhexidine digluconate in a concentration of 2% as a bactericidal agent against the Staphylococcus aureus, corresponding clinical isolate and in the presence of organic matter: blood, bloodstone and urine. Microbiological tests were performed under aerobic showed that the chlorhexidine is an excellent bactericidal agent against the tested microorganisms and also in the presence of organic matter. Keys words: chlorhexidine, efficacy, Staphylococcus, bactericidal, microorganisms.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Molécula de Gluconato de Clorexidina ................................................ 13
Figura 2 – Staphylococcus aureus ....................................................................... 25
Figura 3 – ATCC 25923 Staphylococcus aureus e Isolado clínico ...................... 29
Figura 4 – Amostras de sangue ............................................................................ 29
Figura 5 – Amostra de urina ................................................................................. 30
Figura 6 – Esquema dos protocolos realizados .................................................... 31
Figura 7 – Placas do protocolo1 ........................................................................... 32
Figura 8 – Protocolo 1: ATCC e IC: urina ............................................................. 33
Figura 9 – Placa do protocolo 2 ............................................................................ 34
Figura 10 – Placas do protocolo 3 ........................................................................ 35
Figura 11 – Placas do protocolo 5 ........................................................................ 37
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Atividade bacteriana da clorexidina em diferentes pHs ...................... 18
Tabela 2 – MIC de clorexidina para bactérias gram-negativas ............................. 20
Tabela 3 – MIC de clorexidina para bactérias gram-positivas .............................. 21
Tabela 4 – MIC de clorexidina para fungos .......................................................... 22
Tabela 5 – Resultados do protocolo 1 .................................................................. 32
Tabela 6 – Resultados do protocolo 2 .................................................................. 34
Tabela 7 – Resultados do protocolo 3 .................................................................. 35
Tabela 8 – Resultados do protocolo 4 .................................................................. 36
Tabela 9 – Resultados do protocolo 5................................................................. 37
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................... 10
2 OBJETIVOS ...................................................................................................... 11
2.1 Objetivo específico ....................................................................................... 11
3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ........................................................................ 12
3.1 Clorexidina .................................................................................................... 12
3.1.1 Propriedades da clorexidina ........................................................................ 16
3.1.2 Mecanismo de ação da clorexidina ............................................................. 16
3.1.3 Toxicologia ................................................................................................... 17
3.1.4 Espectro e atividade .................................................................................... 18
3.1.5 Concentrações inibitórias mínimas(CIM) ..................................................... 19
3.2 Sangue ........................................................................................................... 22
3.2.1 Características fisiológicas do sangue ......................................................... 23
3.3 Plasma ........................................................................................................... 23
3.4 Urina .............................................................................................................. 24
3.4.1 Composição da urina .................................................................................. 24
3.5 ATCC-American Type Culture e collection ................................................ 25
3.5.1 Staphylococcus aureos ATCC 25923 ………………………………………… 25
3.6 Isolado clínico .............................................................................................. 26
4 Parte experimental ......................................................................................... 27
4.1 Materiais e métodos ................................................................................... 27
4.2 Microrganismos ......................................................................................... 28
4.3 Matéria orgânica ........................................................................................ 29
4.4 Teste de eficácia da clorexidina frente as matérias orgânicas e aos
Microrganismos .................................................................................................. 30
4.4.1 Protocolo 1 ................................................................................................... 31
4.4.2 Protocolo 2 ................................................................................................... 33
4.4.3 Protocolo 3 ................................................................................................... 35
4.4.4 Protocolo 4 ................................................................................................... 36
4.4.5 Protocolo 5 ................................................................................................... 36
5 CONCLUSÃO ................................................................................................... 38
REFERÊNCIAS .................................................................................................... 39
ANEXO A – Certificado do digluconato de clorexidina ......................................... 41
ANEXO B – Preparo do meio de cultura BHI ....................................................... 42
1 INTRODUÇÃO
Hoje em dia, a busca por agentes bactericidas eficazes e sobre tudo baratos é
uma constante procura na Indústria de Saneantes. É comprovada a falta de higiene
das pessoas em restaurantes, hospitais e dependências, o que reforça a utilidade de
sabonetes bactericidas nestes estabelecimentos.
Atualmente existem no mercado sabonetes do tipo álcool-gel e também
aqueles a base de triclosan. O primeiro não é muito aceito pelas mulheres
principalmente, devido a ressecação causada nas mãos pelo álcool e o triclosan é
uma matéria-prima importada e certificada com um custo bastante elevado.
Dentre os diversos agentes químicos disponíveis para uso como sanitizantes,
encontramos a clorexidina. O Digluconato de clorexidina é um excelente anti-séptico
e também agente bactericida. O presente trabalho tem como objetivo testar a
eficácia deste agente bactericida através de análise microbiológica na concentração
de 2% frente ao Staphyloccocus aureus, microrganismo encontrado freqüentemente
em frigoríficos, hospitais, cozinhas e dependências, e, além disso, testá-la também
frente a diferentes matérias orgânicas - líquidos biológicos como: sangue, plasma e
urina.
Os resultados deste trabalho servirão de base para a formulação de um
sabonete bactericida para ser utilizado institucionalmente.
2 OBJETIVOS
Este trabalho tem o objetivo de comprovar a eficácia do digluconato de
clorexidina como agente bactericida.
2.1 Objetivo específico
Testar a eficácia do digluconato de clorexidina frente ao Staphyloccocus aureus
ATCC nº 25923 e isolado clínico, tanto na ausência como na presença e em
diferentes concentrações de diferentes líquidos biológicos como: sangue, plasma e
urina.
3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
A Microbiologia1 é o estudo dos microrganismos e estes por sua vez são as
formas de vida que originalmente, só poderiam ser vistas com o auxílio do
microscópio óptico e posteriormente com microscópio eletrônico. Elas incluem:
bactérias, fungos, vírus, protozoários, algas unicelulares, viróides e prions.
Este trabalho foi realizado para testar a eficácia de uma agente bactericida:
Digluconato de clorexidina na presença de microrganismos e matérias-orgânicas
através de análises microbiológicas.(Madigan et al.,2004).
3.1 Clorexidina
O gluconato de clorexidina, comercialmente chamado de clorexidina foi
sintetizado no final dos anos 40 por cientistas que procuravam um agente para curar
a malária. Alguns anos mais tarde em 1954, decobriu-se sua verdadeira utilização:
um poderoso anti-séptico é um bactericida de amplo espectro no controle de
bactérias gram-positivos, gram-negativos, e fungos, além ser um excelente
bacteriostático, impedindo que bactérias se proliferem.
Em 1983, foi considerada como substância essencial pelo órgão máximo de
saúde internacional filiado a ONU (Organização das Nações Unidas) o WHO (World
Health Organization) e passou a ser um produto de primeira escolha.
É caracterizado por ser um detergente catiônico, da classe das biguanidas,
disponível nas formas de acetato, hidrocloreto e digluconato, sendo este último, o sal
mais comumente empregado nas formulações. 1
1 A palavra Microbiologia (introduzida em 1899) vem da junção do elemento de composição grego mikrós-, que significa pequeno e é utilizado em inúmeros vocábulos eruditos, principalmente a partir do século XIX, e biologia(grego bíos, vida+ grego logos, estudo, tratado).
13
Figura 1: Molécula de Gluconato de Clorexidina Fonte: wikipédia, 2009.
A clorexidina possui duas principais formas de atuação, proveniente de dois
tipos de sais: como digluconato, é um antimicrobiano de características
desinfetantes e sanitizantes, eficaz contra Salmonella spp., Listeria spp.,Clostridium
spp.,E.coli, Staphylococcus spp. e Pseudomonas spp.
Como Dicloridrato, age por contato na parede do intestino, recuperando e
estabilizando a integridade da flora intestinal, para melhorar a absorção de
nutrientes e proporcionar melhor desempenho produtivo.
Outras facilidades de manipular produtos contendo clorexidina, segundo
(Relatório técnico -Neobrax, 2009) são:
- Não desenvolve resistência bacteriana
- Não é absorvido pelo organismo
- Não agride a pele e as mucosas
- Baixa toxidez
- Não deixa resíduo
- Não é corrosivo
- Não requer enxágüe
- Não exala gases
- Não é volátil
- É de fácil manuseio
- Possui ação rápida e prolongada
Estas características possibilitam que a Clorexidina possa ser utilizada em
diversos segmentos de mercado como:
- Produção de aves
- Produção de suínos
14
- Produção de leite
- Alimentício
- Abatedouro e frigoríficos
- Usinas de açúcar e álcool
- Rações de animais
- Produtos veterinários
- Farmacêutico e cosmético
- Hospitalar e odontológico
- Tratamento de água
- Ar condicionado
- Limpeza
O Quadro 1 mostra os comparativos entre a Clorexidina e outros produtos
encontrados no mercado:
15
Quadro 1: Comparação entre a clorexidina e outros produtos do mercado
PRODUTO AÇÃO ESPECTRO T● C◘ COMENTÁRIOS
Álcool
Precipita proteínas
e desnatura lipídeos
Algumas bactérias
Alguns vírus envelopados
+ +
Ineficiente contra o Parvovírus e
outros não envelopados
Formol
Desagrega grupos
amino, hidroxila e
sulfidrila
Algumas Bactérias Fungos
Alguns vírus
+++ + Risco de
Carcinogenicidade e Mutagenicidade
Compostos Iodados
Reage com grupos
amino e sulfidra e
desagrega membranas
lipídicas
Algumas Bactérias Fungos
Alguns vírus Esporos Fúngicos
+ + Corrosivo em
algumas condições de uso
Cloro
Oxida enzimas e
altera a permeabilidade
da parede celular
Algumas Bactérias Poucos Fungos
Poucos vírus
+++ +++
Rapidamente neutralizado por
matérias orgânicas (urina
e fezes)
Compostos fenólicos (Amônia)
Desnatura proteínas e
altera a
permeabilidade da parede
celular
Algumas bactérias
Alguns vírus envelopados
+++ + Podem ser
Neurotóxicos
Glutaraldeído
Grupos sulfidra e
coagulação do citoplasma
Bactérias Alguns Fungos Esporos
Vírus
+++ + Toxidade
ambiental acima de 0,2 ppm/m³
Ácido peracético
Grupos sulfidra e
amônia, e atua por oxidação
Bactericida Fungicida ++ +++
É altamente inflamável e tem
odor forte
Clorexidina
Desestrutura a função
osmótica da membrana
celular dos organismos
Bactericida Fungicida Algicida Virucida
Não é tóxica
Não é corrosiva
Extremamente eficaz e segura,
pois não é absorvida pelo
organismo
T●: toxicidade; C◘: corrosividade Fonte: “Desinfection in veterinary and Farm animal pratice”- A. H. Linton – Blackwll ScientificPublication, 1988.
16
3.1.1 Propriedades da clorexidina
A Clorexidina é um composto sintético, derivado de uma biguanida que possui
um alto nível de atividade, comum em antimicrobianos de alto padrão, sem ter os
efeitos secundários que a maioria apresenta.
Devido a este alto grau de atividade, pequenas concentrações são suficientes
para inibir o processo reprodutivo ou exterminar a maioria das espécies bacterianas
que além de ser praticamente isenta de toxicidade e efeitos corrosivos proporcionam
alta segurança no ambiente de trabalho.
Suas concentrações mínimas inibitórias (MIC) situam-se bem abaixo de 4% o
que faz da Clorexidina um dos biocidas mais seguros e de melhores rendimentos.
A sua toxicidade conforme DL50 é de 1800mg/kg/dia (peso corpóreo), o que a
torne praticamente atóxica, além de não ser poluente, não exalar gases e não irritar
pele e mucosas.
Atua rapidamente, esterilizando em um tempo médio de 30s a 5 minutos,
dependendo da sua concentração e do tipo de microorganismo que se deseja
exterminar, sendo sua ação bactericida mais eficaz que a de fungicida.
Dispensa a prática de “rodízio”, pois relatos internacionais e nacionais
comprovaram que ela não permite o desenvolvimento de microorganismos de
mecanismos de resistência com aplicações intermitentes.
Devido a sua não volatilidade, permite que as soluções esterilizantes possam
ser preparadas previamente mantendo-se ativas por até 7 dias desde que abrigadas
da luz. (Relatório técnico-Neobrax, 2009).
3.1.2 Mecanismo de ação da Clorexidina
Seu mecanismo de ação está diretamente relacionado com a concentração
utilizada e ao pH da solução (entre 5,5 e 7,0).
O modo de ação da clorexidina se caracteriza por uma rápida absorção por
parte das células bacterianas, resultando numa série de modificações citológicas
que afetam sua permeabilidade e suas propriedades óticas. (Lawrence: Antimicrobial
Activity. In Vitro, of Chlorhexidine, J. Amer. Pharm.,1960).
17
A quantidade da droga absorvida é proporcional as saídas dos constituintes
celulares. As alterações que conduzem a extinção foram observadas, e levaram a
constatação de que os níveis máximos de saída dos constituintes celulares
resultaram da absorção da substância em quantidades elevadas, tanto para
Escherichia Coli, quanto para Staphylococcus aureus. (Lawrence J. Farm. Assoc.
1960).
O digluconato de Clorexidina estabelece ligação com a célula microbiana por
interação iônica. Esta ligação é favorecida pelo pH neutro ou ligeiramente alcalino e
pela disponibilidade de grupos carregados negativamente na superfície da parede
celular. A seguir ocorre lesão primária na menbrana semi permeável com vazamento
de importantes constituintes orgânicos e inorgânicos das células. Os grupos
lipofílicos do Digluconato de Clorexidina são os responsáveis pela desorientação da
membrana lipoprotéica microbiana, obstruindo sua atividade osmótica. (Relatório
técnico Neobrax, 2009).
3.1.3 Toxicologia
Estudos iniciais foram realizados por D. M. Foulkes (J. Peridont. ,1973) que
determinou a dose letal por vias oral e endovenosa, e a tolerância a administração
crônica, concluindo que a Clorexidina possui nível de toxicidade extremamente
baixo tanto para animais quanto para o homem. Pesquisas suplementares feitas por
Davies e col. (Brit.Pharmacol., 1976) confirmaram as conclusões anteriores e
determinou que para a Clorexidina o LD 50 é de 22mg/kg/dia na aplicação
endovenosa,e o LD 50 de 1800mg/kg/dia na administração oral. Estes resultados
foram obtidos a partir de experimentos levados a efeito com roedores (camundongos
e coelhos) e ruminantes (bovinos). Hubben, em 1977, constatou a ausência de
efeitos nocivos decorrentes da administração oral do Digluconato de Clorexidina.
Quanto ao potencial carcinogênico, foram feitos testes com 4 grupos de 224
ratos cada, que receberam doses de 5, 25 ou 50mg/kg de peso corporal, cada um
durante dois anos. Os piques de níveis ao término da posologia caíram pela metade
dentro de uma a duas semanas. Os níveis de Clorexidina no cérebro, pulmão,
fígado, rins, nódulos mesentéricos e outros linfáticos, bem como no sangue, foram
18
determinados em intervalos regulares durante a experimentação e nas três, seis e
nove semanas seguintes ao término da administração e nenhuma modificação
histológica foi encontrada. A concentração no fígado foi alta na fase final, mas caiu
pela metade após uma e duas semanas. Não foram constatadas incidências de
neoplasia nos grupos de controle e nos tratados. A toxidade oral aguda
extremamente baixa em animais de laboratório tem sido confirmada no homem nos
últimos 30 anos de experiência e uso irrestrito Malibach em 1977, efetuou teste de
fotolexidade ( potencial causador de dermatite alérgica ) e de fotosensibilidade,
concluindo pela inteira segurança no emprego da Clorexidina para com os humanos.
Nuno Álvares Pereira em 1985, pesquisando a toxidade aguda e crônica do
Digluconato de Clorexidina administrado por via oral em camundongos constatou:
- Incremento no ganho de peso em relação ao grupo controle;
- redução significativa no número de mortes atribuível a inibição de infecções
intercorrentes nos grupos tratados;
- ausência de efeitos teratogênicos. Case (Chemotherapy,1976) e Rushton
(1974) concluíram que a absorção percutânea é praticamente nula.
3.1.4 Espectro e atividade
A atividade bactericida é mais rápida que a fungicida e esta é fortemente
dependente do pH, sendo sua atividade máxima alcançada com pH 8, conforme
demonstra a tabela abaixo:
Tabela 1 – Atividades bactericidas da Clorexidina em diferentes pHs
pH Número de bactérias por mL após
0 min. 5min. 15 min.
5,25 4.000.000 >1.000.000 >1.000.000
6,22 4.000.000 2.300.000 50.000
7,08 4.000.000 90.000 5.000
7,97 4.000.000 17.000 900
Fonte: Davies, 1954.
19
3.1.5 Concentrações inibitórias mínimas (CIM)
Concentração inibitória mínima é a determinação da concentração mínima
necessária para que um composto seja capaz de inibir o crescimento de um dado
microrganismo. Esse valor chamado MIC ("Minimum Inhibitory Concentration") ou,
CIM (Concentração Inibitória Mínima) quantifica a atividade antimicrobiana do
composto. Consiste na diluição sucessiva de um determinado agente antibacteriano
e a posterior inoculação das diluições com uma suspensão de bactérias. Após um
certo período de incubação observa-se se houve o crescimento. A partir daí
determina-se a concentração mínima de agente antibacteriano necessária para
exterminar uma certa quantidade de bactérias. (Relatório técnico Neobrax, 2009).
A tabela 2 apresenta as concentrações inibitórias mínimas da Clorexidina
segundo NIELSEN (1977) para bactérias gram negativas;
20
Tabela 2 – MIC de clorexidina para bactérias gram-negativas
Microrganismos MIC (mcg/ml) de Clorexidina
Aeromonas aerogenes 12.5
Enterobacter cloacae 2.5 a 3.2
Escherichia coli 1.0 a 5.0
Klebsiella aerogenes 1.5 a 2.5
Klebsiella pneumoniae 6.2
Neisseria spp. 1.5 a 4.0
Salmonella Dublin 2.6
Salmonella typhi 1.6
Salmonella typhosa 2.5
Salmonella pullorum 7.0
Salmonella typhimurium 14.0
Salmonella gallinarum 1.6
Proteus marcescens 3.2 a 5.0
Proteus mirabilis 25.0 a 100.0
Proteus morgani 25.0 a 43.0
Proteus rettgeri 3.0 a 10.0
Proteus vulgaris 7.0 a 25.0
Pseudomonas aeruginosa 5.0 a 15.0
Pseudomonas fluorescens 5.0 a 15.0
Serratia marcescens (não pigmentado) 25.0
Serratia marcescens 50.0 a 75.0
Shigella flexneri 1.5
Shigella sonnei 1.6
Vibrio cholerae 7.0
Pasteurella multocida 5.0
Fonte: Nielsen, 1977.
21
Tabela 3 – MIC de clorexidina para bactérias gram-positivas
Microrganismos MIC (mcg/ml) de Clorexidina
Bacillus cereus 3.0
Bacilllus megaherim 1.0
Bacillus subtilis 1.4 a 3.0
Clostridium botulinum 3.5
Clostridium novyi 1.8
Clostridium perfringens 14.0
Clostridium tetani 7.0
Clostridium welchii 70.0
Corybacterim acnes 10.0 a 5.0
Corynebacterim diphitheriae 8.0
Corynebacterim xerosis 7.5 a 6.0
Micrococcus spp. 1.5 a 6.0
Mycobacterim balnei 5.0
Mycobacterim smegmatis 0.5
Mycobacterim tuberculosis 0.7 a 6.0
Sarcina lútea 2.0
Staphylococcus álbuns 0.5 a 2.0
Staphylococcus aureus 1.0 a 2.5
Staphylococcus epidermidis 0.25 a 6.0
Streptococcus faecalis 1.5 a 3.0
Streptococcus lactis 1.4
Streptococcus mutans 0.1
Streptococcus pneumoniae 7.0
Streptococcus pyogenes 0.6 a 5.0
Fonte: Nielsen, 1977.
22
Tabela 4 – MIC de clorexidina para Fungos
Microorganismos MIC (mcg/ml) de Clorexidina
Aspergillus Níger 200.0
Aspergillus vesicolor 75.0
Blastomuces dermatitidis 25.0
Candida albicans 6.0 – 12.5
Candida parasilosis 30.0
Cladoporium espécies 75.0
Crytococcus espécies 20.0
Debariomyces espécies 10.0
Microsporum audonini 14.0
Microsporum canis 18.5
Micrsoporum gypseum 14.0
Mucos plubeus 125.0
Penicillium notatum 200.0
Penicillium roqueforti 150.0
Rhizopus nigricans 175.0
Saccharomyces cerevisias 50.0
Saccharomyces ellipsoideus 50.0
Sporendonemina espécies 50.0
Trichoderma viride 125.0
Trichophiton abdonini 14.0
Fonte:Nielsen, 1977.
3.2 Sangue
Líquido orgânico de importância vital para o homem e para muitos animais.
Este por sua vez é um líquido biológico de alta complexidade no qual ocorrem
diversos processos bioquímicos e fisiológicos, como o transporte de oxigênio, as
reações imunológicas e a circulação dos nutrientes pelo sistema vascular.
É um tecido líquido do organismo, caracterizado pela presença de elementos
celulares próprios pela fluidez que possibilita sua circulação por todo o corpo. Sua
coloração em geral é vermelha, devido a hemoglobina, pigmento responsável pela
23
fixação do oxigênio necessário a respiração ; em alguns vertebrados , pode ser
esverdeado ou azulado, por causa de outros pigmentos. (Webciência,2009).
3.2.1 Características fisiológicas do sangue
O sangue mais complexo é o dos vertebrados, porque Possi uma infinidade de
componentes celulares, pela variedade de biomoléculas que abriga e também pela
perfeição dos mecanismos bioquímicos e fisiológicos intermediados por ele. Nos
animais com sistema circulatório diferenciado e fechado, líquido sanguíneo circula
por todo o organismo através do sistema vascular, impulsionado pelas contrações
do coração. O sangue serve como meio de fixação do oxigênio externo, graças a
presença de pigmentos oxidáveis como a hemoglobina; é veículo para transporte de
nutrientes até os tecidos do organismo e para a remoção dos produtos da excreção
celular; conduz o excesso de calor gerado nos órgãos mais profundos e ativos para
a superfície do corpo, onde é dissipado; intermedeia as reações imunológicas, que
defendem o organismo da agressão de agentes patogênicos; e abriga todos os tipos
de biomoléculas, como os hormônios , autênticos mensageiros celulares que
estimulam ou inibem a atividade de órgãos e tecidos distantes das glândulas que os
sintetizam. (Kerr,2000).
3.3 Plasma
Em essência, o plasma é uma solução aquosa com aproximadamente 91 a
92% de água, diversos íons metabólicos, nutrientes (glicose, gorduras e
aminoácidos), hormônios, etc. No organismo serve de meio de transporte aos
nutrientes, as células sanguíneas e aos produtos de excreção resultantes do
metabolismo celular; ajuda a manter a pressão sanguínea, distribui de maneira
uniforme o calor do corpo, preserva o equilíbrio básico do organismo e é vital para o
funcionamento de todos os órgãos.
As proteínas plasmáticas como as albuminas, betaglobulinas (transportadoras
de lipídios, como o colesterol, açúcares, esteróides ou íons), o fibrinogênio (que
intervém na coagulação) e as chamadas imunoglobinas (gamaglobulinas,
responsáveis pelas reações antígeno-anticorpo) contribuem de forma decisiva para
24
a manutenção do pH e da pressão osmótica do sangue. As proteínas plasmáticas
impedem a perda excessiva de líquidos capilares: a água e a maioria das
substâncias dissolvidas no plasma podem atravessar com facilidade as paredes dos
capilares, o que não ocorrem com as moléculas de proteína. Isso cria uma pressão
osmótica que assegura a manutenção, dentro de certos limites, do nível de líquido
nas vias circulatórias. Esta função reguladora é resultado, em grande parte, da
presença da albumina. (Webciência,2009).
3.4 Urina
Nos mamíferos, a urina é um fluído excretório, resultante da filtragem do
sangue nos rins. Nas aves e nos répteis é uma excreção sólida ou semi-sólida. a
urina é formada na filtração, no qual é feita nos néfrons, que obtém uma parede, um
tubo, que é chamado de túbulo no qual é revestido de vasos sanguíneos, que sugam
os nutrientes que o organismo precisa, para depois ir para ureteres, que vai para
bexiga ser armazenado, e depois passado para a uretra, sendo expelida.A urina é
um liquido excretado pelos rins através das vias urinárias, pelo qual são eliminadas
substâncias desnecessárias ao organismo.
Desempenha um papel importante na regulação do balanço de líquidos e no
equilíbrio entre ácidos e bases. Nas pessoas sadias possui coloração clara
(amarelada).
A quantidade de urina produzida diariamente é de 1 a 1,5 litro, contudo, esta
referência pode aumentar ou diminuir dependendo da quantidade de liquido
ingerido.(Todabiologia,2009).
3.4.1Composição da urina
A urina é composta aproximadamente por 95% de água e 2 % de uréia. Nos
3% restantes, podemos encontrar fosfato, sulfato, amônia, magnésio, cálcio, ácido
úrico, creatina, sódio, potássio e outros elementos.
25
3.5 ATCC - American Type Culture e Collection
Os microrganismos representam uma imensa diversidade genética e
desempenham funções únicas e cruciais na manutenção de ecossistemas, como
cadeias de alimentos e ciclos geoquímicos e ainda podem causar epidemias e
pandemias.
Hoje, as chamadas coleções de culturas desempenham um papel fundamental
em estudos e conservação dos recursos genéticos microbianos. Entre as coleções
privadas e governamentais, podemos destacar a American Type Culture Collection
(ATCC) uilizada para a realização deste trabalho, que são conhecidas
internacionalmente e trabalham com materiais certificados.
3.5.1 Staphylococcus aureus ATCC 25923
O Staphylococcus aureus, também conhecido como estafilococo dourado é
uma espécie de estafilococo coagulase-positivos. È uma das espécies patogênicas
mais comuns e a mais virulenta espécie do seu gênero. O Staphylococcus aureus é
comum em ambientes como cozinhas, banheiros, hospitais, áreas e outras
dependências. (Wickpédia,2009).
Figura 2- Staphylococcus aureus Fonte: http://www.physorg.com/newman/gfx/news/saureusbacte, 2009.
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3.6 Isolado Clínico
O isolado clínico é derivado de um processo clínico infeccioso em humanos
sem mais características identificáveis. Suas características fenotípicas e
genotípicas apresentam uma diversidade, muitas vezes adaptadas aos fatores
ambientais (Trabulsi et all, 2008).
4 Parte Experimental
A parte experimental deste trabalho iniciou no dia 30/03/2009 e terminou no dia
30/04/2009.
As análises microbiológicas necessitam de um preparo prévio do material antes
da análise propriamente dita. Todo o material utilizado, tais como ponteiras, placas
de petri, água destilada, tubos de ensaio foram esterilizados sempre antes dos dias
de execução dos ensaios. O caldo BHI (Brain Infusion Broth) foi devidamente
preparado, conforme anexo B deste trabalho.
Todas as análises foram efetuadas em aerobiose em estufa a 37ºC.
4.1 Materiais e métodos
Os materiais e equipamentos utilizados no desenvolvimento do trabalho estão
descritos abaixo:
§ Tubos de ensaio com tampa rosca
§ Erlenmeyers
§ Hastes para tubos
§ Placas de petri
§ Tubos eppendorfs
§ Pipetadores automáticos com ajuste monocanal marca Kacil : 10/100µL e
200/1000µL
§ Ponteiras
§ Bico de bunsen
§ Estufa bacteriológica marca De Leo
§ Capela de exaustão fixa
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§ Cabine de fluxo laminar vertical CFLV-09 Veco
§ Auto clave vertical marca: Bio Eng Mod A30 – 30 litros
§ Centrífuga clínica Macro 3660 RPM
§ Espátula de Drigalsky
§ Digluconato de Clorexidina 20% marca: Alpha Química conforme certificado
de análise em anexo A
§ Caldo BHI (Brain Infusion Broth) marca: Himedia Laboratories PV.T Limited
lote: WA 187 validade: 02/2011
§ Ágar BHI marca: Himedia Laboratories PV.T Limited lote: WA 187 validade:
02/2011
§ Amostras de sangue
§ Amostras de urina
§ ATCC 25923 Staphylococcus aureus
§ IC
§ Câmera Digital- Digitron 6s marca Tron
4.2 Microrganismos
Foram utilizados como microrganismos teste Staphylococcus aureus ATCC
25923 e Isolado clínico correspondente. Os pré inóculos citados foram
desenvolvidos em meio líquido, em estufa bacteriológica a 37ºC por 24 horas para
facilitar o manuseio durante os experimentos.
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Figura 3 – ATCC 25923 Staphylococcus aureus e Isolado clínico Fonte: Autoria própria, 2009.
4.3 Matéria orgânica
Para a realização deste trabalho, foram utilizados líquidos biológicos coletados
de animais de laboratório em condições padrão, nos dias dos experimentos. As
amostras de sangue foram centrifugadas por 10 minutos para que pudéssemos
separar o plasma que também foi utilizado nos testes.
Figura 4 – Amostras de sangue Fonte: autoria própria, 2009.
30
Figura 5 – Amostra de urina Fonte: autoria própria, 2009.
4.4 Teste de eficácia da Clorexidina frente às matérias orgânicas e aos
microrganismos
Como o as concentrações mínimas inibitórias (MIC) da Clorexidina ficam
abaixo de 4%, este trabalho fixou a concentração de uso de clorexidina em 2% e
variamos as concentrações de matéria orgânica e de microrganismos. Esta
concentração é coerente com as soluções de clorexidina encontradas no mercado
que são de 20%, bastando fazer diluições para utilizar as concentrações desejadas.
Segundo o The Nactional Commitee for Clinical Laboratory Standards para
determinações em Agar o MIC recomendado para os pré inóculos é de 10 -4. Então
iniciamos os trabalhos nestas concentrações.
Os protocolos analisados compreenderam: o prévio preparo das placas de petri
com o Agar BHI e o preparo das amostras.
As amostras foram preparadas, adicionando as matérias orgânicas, os
microrganismos (ATCC e IC) e por último a Clorexidina em tubos de ensaio com
tampa rosca e incubados em estufa de cultivo bacteriológica a 37ºC por 10minutos.
Em seguida foram efetuadas diluições das concentrações de 10-1 a 10 -6.
31
De cada diluição, transferimos 0,1mL para as placas de petri contendo o Agar
BHI e espalhamos por toda a superfície da placa com o auxílio da alça de Drigalsky,
incubando as placas em estufa bacteriológica a 37ºC por 24horas.
A leitura dos resultados foi realizada através de observação das placas quanto
a presença ou ausência de crescimento microbiano.
Figura 6 – Esquema dos protocolos realizados Fonte: Microbiologia de Brock, p.136, 2004.
4.4.1 Protocolo 1
No primeiro protocolo foi testada a eficácia da clorexidina, frente aos dois
microrganismos: ATCC e Isolado Clínico, com os três tipos de matéria orgânica:
sangue, plasma e urina, na concentração 10-2 e realizado em duplicata.
A tabela 5 mostra os resultados encontrados no protocolo 1;
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Tabela 5 – Resultados do protocolo 1
Placas
Agente bactericida – clorexidina 2%
Matéria
orgânica Microrganismos Resultados
1
Plasma
ATCC NC
2 ATCC NC
1 Isolado Clínico NC
2 Isolado Clínico NC
1
Sangue
ATCC NC
2 ATCC NC
1 Isolado Clínico NC
2 Isolado Clínico NC
1
Urina
ATCC NC
2 ATCC NC
1 Isolado Clínico NC
2 Isolado Clínico NC
NC: Não houve crescimento bacteriano Fonte: autoria própria, 2009.
Figura 7 – Placas do protocolo 1 Fonte: autoria própria, 2009.
33
Figura 8 – Protocolo 1: ATCC e IC da Urina Fonte: autoria própria, 2009.
4.4.2 Protocolo 2
No segundo protocolo foram adicionados os dois tipos de microrganismos e os
três tipos de matéria orgânica na concentração 10-2 e não foi adicionado o agente
bactericida - controle negativo do trabalho.
A tabela 6 mostra os resultados encontrados no protocolo 2:
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Tabela 6 – Resultados do protocolo 2
Placas Matéria
orgânica Microrganismos Resultados
1
Plasma
ATCC Ufc inc.
2 ATCC Ufc inc. 1 Isolado Clínico Ufc inc. 2 Isolado Clínico Ufc inc. 1
Sangue
ATCC Ufc inc. 2 ATCC Ufc inc. 1 Isolado Clínico Ufc inc. 2 Isolado Clínico Ufc inc. 1
Urina
ATCC Ufc inc. 2 ATCC Ufc inc. 1 Isolado Clínico Ufc inc. 2 Isolado Clínico Ufc inc.
Ufc inc.: unidades formadoras de colônias incontáveis Fonte: autoria própria, 2009.
Figura 9 – Placa do protocolo 2; ufc – unidades formadoras de colônias incontáveis. Fonte: autoria própria, 2009.
35
4.4.3 Protocolo 3
No terceiro protocolo foram adicionados somente os microrganismos e o
agente bactericida, a fim de verificar algum interferente proveniente nas matérias
orgânicas.
Tabela 7 – Resultados do protocolo 3
Placas Microrganismos
Agente
bactericida Resultado
1 ATCC
Clorexidina
2%
NC
2 NC
1 Isolado clínico
NC
2 NC
NC: não houve crescimento bacteriano. Fonte: autoria própria, 2009.
Figura 10 – Placas do protocolo 3: não houve crescimento bacteriano. Fonte: autoria própria, 2009.
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4.4.4 Protocolo 4
No protocolo 4 foi aumentado em 5% a concentração inicial de matéria
orgânica e de ATCC, permanecendo a concentração de clorexidina em 2% . Foram
feitas diluições de 10-1 a 10-6. Realizamos as análises em duplicatas em placas com
as diluições de 10 -3 a 10 -6.
Tabela 8 – Resultados do protocolo 4
Placas
Agente bactericida – clorexidina 2%
Matéria orgânica Microrganismo Diluições
10-3 10-4 10-5 10-6
1 Plasma
ATCC
NC NC NC NC
2 NC NC NC NC
1 Sangue
NC NC NC NC
2 NC NC NC NC
1 Urina
NC NC NC NC
2 NC NC NC NC NC: Não houve crescimento bacteriano Fonte: autoria própria,2009.
4.4.5 Protocolo 5
No protocolo 5 foi aumentado em 10% a concentração inicial de matéria
orgânica e de ATCC, permanecendo a concentração de clorexidina em 2% . Foram
feitas diluições de 10-1 a 10-6. Realizamos as análises em duplicatas em placas com
as diluições de 10 -3 a 10 -6.
A tabela 9 mostra os resultados do protocolo 5:
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Tabela 9 – Resultados do protocolo 5
Placas
Agente bactericida – clorexidina 2%
Matéria orgânica Microrganismo Diluições
10-3 10-4 10-5 10-6
1 Plasma
ATCC
NC NC NC NC
2 NC NC NC NC
1 Sangue
Ufc inc. NC NC NC
2 NC NC NC NC
1 Urina
NC NC NC NC
2 NC NC NC NC NC: não houve crescimento bacteriano; Ufc. Inc. unidades formadoras de colônias incontáveis. Fonte: autoria própria, 2009.
Figura 11 – Placas do protocolo 5 Fonte: autoria própria, 2009.
5 CONCLUSÃO
As análises microbiológicas nos fornecem uma ampla noção da verdadeira
eficácia dos agentes bactericidas. Todos nós estamos rodeados de microrganismos
e convivemos com eles diariamente, nas nossas casas, nos restaurantes, na
universidade, enfim em todos os lugares eles estão presentes e muitas vezes são
causadores de doenças.
Este trabalho comprovou e forneceu dados para que o digluconato de
clorexidina na concentração de 2% possui propriedades microbianas satisfatórias,
capazes de inibir o Staphylococcus aureus, na presença de interferentes como
líquidos biológicos.
No último protocolo, ocorreu o crescimento microbiano, apenas nas placas
contendo, sangue, devido as suas características diferenciadas das outras matérias
orgânicas testadas, pois o sangue é o responsável pelo transporte de nutrientes,
oxigênio, neurotransmissores, hormônios e imunoglobulinas, além de substâncias
tóxicas para serem eliminadas, enquanto o plasma é composto de 92% de água e
7% proteínas e a urina 95% de água, 2% uréia e outros elementos.
É possível concluir, por meio de suas características desinfetantes e nas
condições testadas neste trabalho, que o digluconato de clorexidina, além de mais
acessível em questões financeiras e na sua aplicabilidade, pode ser uma opção de
escolha como principio ativo de compostos bactericidas existentes atualmente no
mercado.
REFERÊNCIAS
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40
URINA saiba mais sobre ela. 2009. Disponível em <http://www.todabiologia.com/dicionario/urina.htm> Acesso em 26 mar.2009. UTILIZAÇÃO do digluconato de clorexidina em maças.2009. Disponível em < http://www.neobrax.com.br > Acesso em 15 mar.2009. ZANATTA, Fabrício Batistin; RÖSING, Cassiano Kuchenbecker. Clorexidina: mecanismo de ação e evidências atuais de sua eficácia no contexto do biofilme supragengival.Scientific-p.35-43, 2007. Wickpedia,2009.Disponível<htemp://pt.wickpedia.org/wiki/gluconato_de_clorexidina> Acesso em 10 jan.2009. Wickpedia, 2009.Disponível<htemp://pt.wickpedia.org/wiki/Staphylococcus_aureus> Acesso em 16 mar. 2009.
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ANEXO A – Certificado do digluconato de clorexidina 20%
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ANEXO B – Preparo do meio de cultura : Caldo BHI (Brain heart infusion broth):
infusão de cérebro e coração
Dados:
Fabricante: Himedia Laboratories P.V.T limited
Origem: Índia
Nº. do registro no MS/ANVISA: 10200510078
Lote: WA 187
Validade: 02/2011
Preparação:
Pesar 52g/L de (Agar-cérebro-coração) e 37g/L de caldo de cérebro e coração,
dissolver em água destilada e esterilizar em autoclave a 121ºC por 15 minutos.
pH: 7,4 +/- 0,2