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Efeitos do esteróide anabolizante sobre o músculo de ratos que realizaram
treinamento aeróbico.
Gilson Sampaio Pinheiro Filho Aluno concluinte do CEDF/UEPA
[email protected] Katia Simone Kietzer
Professora orientadora do CCBS/UEPA [email protected]
Resumo O objetivo do estudo foi analisar os efeitos do EAA sobre a morfologia do músculo gastrocnêmio de ratos machos. Os animais foram distribuídos em grupos: Grupo Treinado Anabolizado (GTA), Grupo Sedentário Anabolizado (GSA), Grupo Treinado (GT) e Grupo Sedentário (GS). Os animais dos grupos GTA e GT foram submetidos a exercício de corrida em roda voluntária onde os numero de voltas era registrado no fim do treinamento, depois de 12 semanas podemos verificar que o grupo GTA percorreu maior distancia (542,1m) em relação ao grupo GT (417m). Após o término do treinamento diário, os animais dos grupos GTA e GSA receberam uma injeção contendo 5mg/kg de Decanoato de Nandrolona. Após as 12 semanas do treinamento associado à administração de EAA, os ratos foram sacrificados e tiveram imediatamente seu músculo gastrocnêmio removido com objetivo de investigar possíveis alterações na estrutura muscular. Para análise morfológica, lâminas histológicas do músculo foram montadas e analisadas com o auxílio de um fotomicroscopio acoplado a um sistema de analisador de imagem onde mensuramos o diâmetro transverso das fibras para diagnosticar possíveis diferenças de espessura e quantificar o número de mionúcleos. Verificou-se que os animais do grupo GTA apresentaram aumento do diâmetro da fibra muscular (2666,58±483,05) quando comparados ao GS (2010,75± 328,17). Ao analisarmos a proliferação de núcleos na fibra muscular verificou-se que os animais do grupo GTA (328,3±40,0) apresentaram aumento quando comparados ao GS (274,8±31,7). Através dos nossos resultados, podemos concluir que o uso de EAA associados ou não ao exercício físico provoca alterações morfológicas no músculo de ratos jovens. Palavras chave: Anabolizante. Exercício Voluntário. Morfologia. Músculo.
INTRODUÇÂO
Os hormônios esteroides são derivados sintéticos dos hormônios sexuais
masculinos, todos derivados do colesterol, que apresenta diversas funções
relacionadas à maturação sexual e às características sexuais secundárias inerentes
a cada gênero que promovem e mantém características sexuais à masculinidade e
status anabólicos dos tecidos somáticos (FERRARI, 2011).
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Os esteroides anabólicos androgênicos (EAA) têm sido uma das substâncias
ergogênicas mais utilizadas como forma de doping. São utilizados por atletas para
melhorar o desempenho esportivo tendo em vista seus efeitos sobre o aumento da
síntese proteica, o incremento das reservas energéticas e a redução no tempo de
recuperação após treinamento físico (CARMO, 2011).
O uso dessas substâncias tem vários objetivos dentre eles, ganhar ou perder
peso corpóreo, estimular a hipertrofia e a força muscular e diminuir o percentual de
gordura subcutânea (CARMO, 2011). Esses fatores que fizeram os EAA também
serem utilizados por não atletas com finalidade estética, pelo desejo de melhorar a
aparência (DIAS; NETO; GAMA, 2011).
O abuso do consumo de EAA, dentro e fora do cenário esportivo, constitui-se
em grande preocupação social, governamental e das mais importantes agências e
órgãos sanitários e esportivos, como a Organização Mundial de Saúde (OMS) e o
Comitê Olímpico Internacional (COI) (LIMA; CARDOSO 2011).
Homens e mulheres têm investido cada vez mais tempo, energia e recursos
financeiros no consumo de bens e serviços destinados à construção e manutenção
de um corpo atlético (AGUIAR; BRITO; PINHO, 2011). Alguns estudos têm
evidenciado que, contraditoriamente, em paralelo ao culto ao corpo tem aumentado
a insatisfação das pessoas com seus corpos, assim como o consumo de EAA, as
chamadas “drogas da imagem corporal” (IRIART et al., 2009).
Já está evidente na literatura cientifica os efeitos dos EAA associados ao
exercício anaeróbico sobre o sistema músculo esquelético, como mostra Carmo et al
(2011) que em seu estudo observou processos hipertróficos na musculatura de ratos
submetidos ao exercício resistido, porém os estudos que associam essa droga com
exercícios aeróbicos ainda são escassos na literatura cientifica.
Assim, buscando incrementar o conhecimento acerca do uso do EAA no
exercício aeróbico, o presente estudo teve como objetivo analisar o desempenho
durante o exercício e a morfologia de músculo estriado esquelético de ratos
submetidos a um protocolo de exercício voluntário de longo prazo e tratados com
EAA decanoato de nandrolona (Deca Durabolin- Organon).
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1 TESTOSTERONA: MATÉRIA PRIMA DOS EAA
A testosterona é o hormônio esteroide mais importante secretado pelas
células intersticiais do testículo (MCARDLE, 2008,). Derivada do hormônio sexual
masculino, a testosterona é a principal substância anabólica, a qual é produzida em
nosso organismo com a capacidade de controlar o desenvolvimento normal e o
funcionamento das características masculinas, além de regular a manutenção das
características anabólicas das células e tecidos (OLIVEIRA, 2012).
O hormônio masculino tem várias funções no organismo, mas foi o seu efeito
anabólico sobre a massa muscular, que tornou esse hormônio a matéria prima da
maioria dos esteroides anabolizantes (MCARDLE, 2008,). Gentil (2005, p.46) “relata
que a testosterona atua na célula estimulando a produção de RNAm1, que leva ao
aumento da síntese proteica”.
Existe também o efeito anticatabólico relacionado ao hormônio masculino. A
testosterona se acopla a receptores celulares específicos, mas também compete
pelos receptores para hormônios catabólicos, diminuindo assim o catabolismo
muscular (GENTIL, 2005,).
2 A UTILIZAÇÃO DO EAA NO ESPORTE
Visando seus efeitos sobre a síntese proteica, o incremento das reservas
energéticas e a melhora da eficiência do processo de recuperação dos indivíduos
após o treinamento passaram a ser utilizados por atletas para melhorar o
desempenho esportivo (CARMO, 2011).
Os EAA despertaram a atenção dos pesquisadores nas últimas décadas,
devido o seu envolvimento com esportes de alto nível. O uso dessas substancia por
atletas é considerado doping. Segundo o Comitê Olímpico Brasileiro (2007) o
doping é definido como o uso de qualquer substância endógena ou exógena em
1 O termo RNA mensageiro (RNAm) designa uma molécula de ácido ribonucleico
transcrita a partir de uma cadeia de DNA, que transporta a mensagem para a síntese de
proteínas.
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quantidades ou vias anormais com a intenção de aumentar o desempenho do atleta
em uma competição.
Os EAA são utilizados por atletas como recurso ergogênico que é qualquer
fator ou fenômeno que aprimora o desempenho, não apenas atlético, mas também
emocional e psíquico para a realização do trabalho físico (POWERS, HOWLEY,
2000 apud CARMO, 2011).
3 A UTILIZAÇÃO DO EAA FORA DO ÂMBITO ESPORTIVO
Atualmente, devido à nova tendência da sociedade em cultivar a beleza e a
estética corporal, o consumo de EAA com finalidade estética, vem sendo motivos de
consumo de anabolizantes sem finalidade terapêutica (OLIVEIRA, 2012).
Tais ideais de estética e de corpo belo, que outrora tinham foco no público
feminino, atingem homens e adolescentes, que em busca de uma aparência
musculosa, jovem e saudável, se tornam dependentes de esteroides, anabolizantes,
dietas e exercícios físicos em excesso (RODRIGUES, 2002 apud DIAS, NETO,
GAMA, 2011).
A busca por um "corpo perfeito" em um curto espaço de tempo leva os
usuários a procurarem métodos que produzam resultados rápidos, sem se
preocuparem com as consequências possíveis efeitos colaterais (IRIART et al.,
2009).
O uso abusivo de EAA causa efeitos deletérios para o organismo, causando
consequências adversas, de ordem metabólica, endócrina, cardiovascular, hepática,
neural, comportamental e psiquiátrica muitos desses se tornando irreversíveis
(REDONDO, 2007).
4 HIPERTROFIA MUSCULAR
Uma dessas adaptações estruturais é a hipertrofia muscular, que é
conceituada por Gentil (2005) como o aumento volumétrico de um músculo. Em
função deste aumento volumétrico das fibras ocorre o aumento significativo da força
e potência muscular.
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Certas estruturas estão diretamente ligadas aos processos de hipertrofia
muscular, dentre elas estão os núcleos musculares. Sabe-se que a fibra muscular é
multinucleada, assim as proteínas dessas fibras estão sob o controle de diferentes
núcleos, esse fato tem sido chamado de domínio nuclear (FLECK; KRAEMER,
2009).
A quantidade de proteína muscular não poderá ser aumentada, ao menos
que o número de núcleos seja aumentado através da divisão mitótica das células
satélites ativadas (FLECK; KRAEMER, 2009).
Outros fatores como o estresse mecânico produzido pelo exercício físico
também estimula as proteínas sinalizadoras a ativarem os genes que ativam a
translação do RNAm a estimular a síntese proteica a nível celular, tendo como
consequência a hipertrofia do músculo estimulado (MCARDLE et al, 2008).
5 EXERCÍCIOS FÍSICO
Exercício é toda e qualquer atividade que envolve geração de força e potência
pelos músculos. O exercício pode ser quantificado mecanicamente através da força,
torque, trabalho, potência e velocidade de progressão (FLECK; KRAEMER, 2006).
Podemos classificar o exercício através do tempo de duração e do substrato
energético utilizado em sua realização.
O exercício aeróbico compreende as atividades onde o principal substrato
energético é o oxigênio. Geralmente em esforços de duração superior a 2 min, a
produção de energia aeróbia na célula muscular é assegurada pela oxidação
mitocondrial da glicose e dos lipídios na formação de ATP, tendo como subproduto
gás carbônico e água (MCARDLE et al, 2008). Os esportes inseridos dentro desse
grupo são geralmente atividades de baixa intensidade e longa duração, como as
maratonas, ciclismo de estrada, corridas de dez mil metros, cinco mil metros e etc.
(MCARDLE et al, 2008).
Os exercícios anaeróbicos estão inseridos dentro de dois sistemas de
transferência de energia o anaeróbico aláctico, esta relacionado com atividades de
intensidade máxima com uma duração inferior a 30s, utilizando as fontes
energéticas imediatas, como a adenosinatrifosfato e a fosfocreatina (FLECK;
KRAEMER, 2006).
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No sistema anaeróbico láctico estão inseridos esforços de alta intensidade
que duram de 30s a 1 min , essas atividades utilizam o glicogênio como fonte
energética, este processo degrada o glicogênio a ácido láctico, formando
paralelamente duas moléculas de ATP (FLECK; KRAEMER, 2009).
Podemos então relatar que nos esportes com predominância de geração de
energia em déficit de oxigênio como por exemplo as provas de 100 e 200 metros
rasos, as provas rápidas de natação como os 50, 100 e 200 metros, enfim provas
atléticas que tenham duração abaixo de 1 minuto (FLECK; KRAEMER, 2006).
6 MATERIAIS E MÉTODOS
Foram utilizados 24 ratos (Rattus novergicus) da linhagem Wistar, machos,
jovens, entre 90 e 120 dias, com peso variando entre 250 e 300 gramas, originados
do Biotério de Reprodução do Laboratório de Cirurgia Experimental da Universidade
do Estado do Pará. Todos os animais da pesquisa em questão foram cuidados de
acordo com as normas do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) e
legislação nacional em vigor no uso de animais em aulas e pesquisas (Lei federal
11.794 de 08 de outubro de 2008).
Esses animais foram mantidos em ambiente com fatores controlados como
umidade, ruído, temperatura a 22º C, obedecendo a um foto-período de 12 horas
escuro e 12 horas claro, recebendo água e ração ad libitum, durante todo o
experimento. Para que o protocolo de treinamento fosse realizado no período do dia,
os grupos experimentais foram submetidos a um ciclo invertido dia/noite, onde esses
animais que naturalmente seriam mais ativos durante a noite, realizariam a atividade
física durante o dia, facilitando o manuseio dos mesmos e a coleta de dados.
Os animais foram alojados em gaiolas contendo no máximo quatro animais e
previamente adaptados a um Gabinete para Biotério Desmontável (EB 273/ Insight)
instalado no Biotério do Laboratório de Morfofisiologia Aplicada a Saúde do Centro
de Ciências Biológicas na Universidade Estadual do Pará, por um período de 15 dias
antes do início do experimento.
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6.1 Grupos Experimentais
Os 24 ratos foram divididos em quatro grupos experimentais: o grupo treinado
anabolizado (GTA),o grupo sedentário anabolizado (GSA), o grupo treinado (GT) e o
grupo sedentário ou controle (GS).
Os animais dos grupos GT e GTA foram submetidos ao protocolo de
treinando de corrida em rodas voluntarias (Insight, Brasil), os grupos GTA e GSA
foram submetidos a doses intramusculares de Decanoato de Nandrolona (Deca
Durabolin- Organon), e o grupo GS não foi submetido a treinamento nem
anabolização.
6.2 Protocolo de exercício físico de corrida
Os animais foram submetidos a um protocolo de exercícios de corrida em
roda voluntaria (Insight, Brasil). A roda de corrida que o animal tinha acesso não era
motorizada e era movida pela atividade de corrida do animal. Essa roda possui um
dispositivo de contagem, conhecido como “conta giros”, que registrava o número de
voltas percorridas pelo animal durante o período de treinamento. Como o
treinamento tinha o caráter voluntario esses números obtidos por esses dispositivos
de contagem era o parâmetro para analisar o desempenho dos animais. Os
indivíduos dos grupos GTA e GT foram colocados em caixas com as rodas de
corrida voluntaria contendo água e comida em abundancia, durante seis horas, com
início às sete horas da manhã e término às treze horas, três vezes por semana
durante doze semanas.
Grupos experimentais Volume de treinamento Dias de treino
GTA 6h/dia SEG/QUA/SEX
GT 6h/dia SEG/QUA/SEX
GSA 0h/dia Sem treinamento
GS 0h/dia Sem treinamento
TABELA 1 – relação grupos experimentais e volume de treinamento
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6.3 Análise do desempenho atlético
Os animais dos grupos GT e GTA eram submetidos a treinamento de corrida
em roda voluntaria três dias por semana, durante seis horas por dia, no fim do
período diário de treinamento os animais eram retirados da gaiola de exercícios e
devolvidos ao biotério onde eram condicionados no período em que não estivesse
se exercitando, o numero de voltas era registrado através de um dispositivo conta
giros acoplado a roda.
Com o fim das 12 semanas de treinamento, foi feito a media de voltas para
cada grupo, depois esse valor foi multiplicado pelo o diâmetro da roda de exercícios
e obtivemos a distancia percorrida em metros quadrados.
6.4 Administração de Decanoato de Nandrolona
Após o período de seis horas de treinamento, os animais dos grupos GTA e
GSA receberam uma injeção intramuscular no músculo quadríceps da coxa
contendo 5 mg/kg de Decanoato de Nandrolona (DN; Deca Durabolin-
Organon).Para administração do EAA ou do solvente, os animais foram imobilizados
por um pesquisador enquanto outro segurava gentilmente a pata, fazia a assepsia e
aplicava a injeção no músculo quadríceps dos animais, utilizando uma seringa de
insulina. A dose de 5mg/kg tem sido relatada como equivalente as doses geralmente
utilizadas por atletas, 600mg/semana ou aproximadamente 8mg/kg/semana, em
academias (NORTON, 2000). Os animais dos grupos T e S receberam injeção
intramuscular de óleo mineral, veículo utilizado para solubilizar o EAA, nas mesmas
proporções e no mesmo período que os animais dos outros grupos. A administração
do veículo óleo mineral e o EAA foram iniciadas na primeira semana de treinamento,
totalizando 12 semanas.
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6.5 Análise Morfológica
Para a Análise morfológica, foram confeccionadas lâminas histológicas do
músculo gastrocnemio. Os músculos que foram retirados dos animais foram
conservados em formol, para posterior montagem das lâminas. As amostras foram
desidratadas, em seguida, as peças passaram por processo de diafanização para
retirada de gordura. Na etapa de impregnação, as peças foram mantidas em
recipientes com parafina. Esse procedimento foi realizado automaticamente pelo
equipamento Histotécnico Leika. Em seguida, as peças passaram por processo de
inclusão em parafina utilizando a Central de Inclusão Leika.
Em um Micrótomo Leika, foram obtidos cortes transversais do músculo
gastrocnêmio. Os cortes foram colocados em banho-maria para que se abram as
ranhuras da parafina e da secção, e para que ele forme uma aderência, na lâmina
histológica. As lâminas permaneceram em estufa para a adesão da secção do
músculo e derretimento da parafina.
Para a coloração das lâminas, foi utilizada a técnica hematoxilina-eosina (HE),
Por meio desta coloração podemos diferenciar partes basófilas (pela hematoxilina)
e acidófilas, ou eosinófilas (pela eosina), Desta forma, esta coloração nos permitiu
analisar formas e tamanhos do músculo gastrocnêmico. Para a montagem das
lâminas com sobreposição das lamínulas foi utilizado Bálsamo do Canadá.
As lâminas foram analisadas em microscópio óptico Zeiss scoopA1, acoplado
a uma filmadora Nikkon de alta definição, onde se obteve fotos dos cortes
histológicos. As análises morfométricas foram realizadas num analisador de imagem
Axion Vision (Zeiss, Alemanha).
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FIGURA 2- Foto da fibra muscular do grastrocnêmio em processo de mensuração pelo analisador de imagem Axion Vision. 40x FONTE: dados da pesquisa.
As imagens foram obtidas dos cortes transversais do músculo gastrocnemio e
através da câmara, foram projetadas em um monitor (Sony, Japão). Os diâmetros
transversos das fibras musculares foram delimitados com ajuda do mouse e o
sistema computacional registrava automaticamente área do diâmetro transverso em
μ² das fibras musculares.
Também foi analisado o número de núcleos presentes nas fibras partindo da
contagem dos mesmos nas fotos obtidas para a mensuração do diâmetro das fibras.
Fizemos a quantificação dos núcleos presentes em duzentas fibras por grupo
experimental.
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7 RESULTADOS E DISCUSSÕES
Ao analisarmos o desempenho atlético dos animais submetidos
ao protocolo de treinamento podemos observar que o GTA teve um
rendimento superior ao GT.
GRÁFICO 1 - efeito dos esteroides anabolizanes sobre a desempenho.
Análise de variância com Teste ANOVA e Subteste de Tukey, nível de
significância p<0,01.
No estudo de Kurling et al. (2005) apud Martins et al (2005), verificou-se
que o decanoato de nandrolona (DN) em ratos sadios nas doses de 5 e 20 mg kg-1
durante duas semanas gera um aumento significativo, nos eritrócitos totais e
hemoglobina.
O aumento na potencialidade farmacocinética da hemoglobina resulta na
melhora da competência aeróbia e da performance desportiva. Por este motivo, o
DN é um medicamento muito utilizado por atletas de longa distância (CRUZ, et al.
2006)
Mas o estudo de Cunha et al (2004) mostrou que o tratamento com doses
suprafisiológicas de DN 5 mg/kg, 2x por semana, não promoveu aumento das
reservas de glicogênio, nos músculos esqueléticos e no tecido hepático, além
daquele obtido através da prática de exercício, fato que entra em contradição com
os resultados encontrados no presente estudo
Quando comparamos o diâmetro da fibra muscular, podemos verificar que os
animais do GTA (2754,5±307,5) apresentaram aumento no diâmetro transverso
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quando comparado com o GS (2010,75±307,5). Os demais grupos GSA
(2397,4±307,5) e GT (2290,03±307,5) não obtiveram resultados diferentes quando
comparado com o grupo controle.
GRÁFICO 2- O efeito do treinamento físico e do EAA sobre a hipertrofia do músculo. Análise de variância com Teste ANOVA e Subteste de Tukey, nível de significância p<0,05 GS grupo sedentário, GT grupo treinado, GSA grupo sedentário anabolizado GTA grupo controle.
No estudo de Carmo et al (2011) que submeteu ratos a exercícios de natação,
treinamento de força e doses de decanoato de nandrolona, eles observaram que
após o período de treinamento houve resultados hipertróficos relacionado somente
com o treinamento anaeróbico. Os grupos praticantes de natação não obtiveram
resultados relevantes referentes a hipertrofia muscular.
No estudo de Cunha et al. (2006) que utilizou o mesmo esteroide
anabolizante e um protocolo de exercícios aeróbicos semelhantes ao utilizando por
Carmo et al (2011) também não obteve resultados significativos relacionados ao
crescimento do diâmetro da fibra.
Também observamos no (GRAFICO 2) que o grupo GSA (2010,75±307,5)
não apresentou diferença no diâmetro da fibra se comparados ao grupo GS
(2010,75±307,5). Este resultado entra em divergência com os resultados
encontrados na literatura. Sabe-se que os EAA são utilizados no tratamento de
sarcopênia diminuindo a perda de proteína muscular em portadores do HIV (CUNHA
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et al. 2011). Como mostra Strawford et al., (1999) apud Silveira (2007) que
estudaram Indivíduos portadores de HIV que apresentavam perda de peso. Durante
12 semanas realizaram um tratamento com altas doses de DN, e foi observado que
esses indivíduos aumentaram cerca de 0,9kg a 1,2kg/semana de massa magra,
mesmo na ausência de treinamento.
Em relação a proliferação nuclear, verificamos que o grupo GTA (346,5 ±30,2)
apresentou maior número de núcleos quando comparados ao GS (274,8±30,2),
evento que não ocorreu com os outros grupos experimentais GT (295,8 ±30,2) e
GSA (300,5 ±30,2). (gráfico 2).
GRÁFICO 2- O efeito do treinamento físico e do EAA sobre a proliferação nuclear do músculo. Análise de variância com Teste ANOVA e Subteste de Tukey, nível de significância p<0,05.GS grupo sedentário, GT grupo treinado, GSA grupo sedentário anabolizado GTA grupo controle
Os resultados observados no presente estudo entram em divergência com os
achados de Joubert et al (1989) apud Carmo et al (2011) que diz que os EAA tem
sido utilizado devido ter importante papel no processo hipertrófico, atuando na
proliferação e diferenciação de células satélites e dos mionúcleos, o que acaba
refletindo em uma maior concentração proteica nesses músculos mesmo na
ausência de treinamento
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CONCLUSÃO
Após a análise dos resultados obtidos na presente pesquisa
podemos concluir que o DN associado ou não ao exercícios físico gerou
adaptações morfológicas no músculo dos grupos experimentais, tanto
relacionado a hipertrofia muscular quanto a proliferação nuclear nas fibras
musculares.
Em relação ao desempenho atlético dos animais, podemos observar
que os animais anabolizados percorreram maior distância em relação ao
grupo não anabolizado provado que o esteroide anabolizante melhora o
rendimento em atividades aeróbicas.
Os resultados da associação dos EAA com exercício aeróbico ainda
são escassos na literatura cientifica, por isso é necessário que outros
estudos sejam realizados na área para esclarecer possíveis duvidas ainda
existentes sobre o tema no meio cientifico, e também ajudar a entender as
ações dessa droga no organismo, a atuação o sistema músculo esquelético
e possíveis efeitos colaterais.
Abstract
The objective of the study was to analyze the effects of AAS on morphological changes in the gastrocnemius muscle of 24 Wistar male rats, trained and sedentary youth. The animals were divided into four groups: Group Trained steroids (GTA), Group Sedentary steroids (GSA), Trained Group (WG) and Sedentary Group (GS). The animals in groups GTA and GT underwent running exercise in voluntary wheel for 12 weeks. Upon completion of training, the animals in groups GSA and GTA received an intramuscular injection containing Nandrolone decanoate 5mg/kg. After 12 weeks of training associated with AAS administration, the mice were sacrificed and immediately had his gastrocnemius muscle dissected and removed for morphological analysis in order to investigate possible changes in muscle structure. For morphological analysis, muscle histology slides were stained with HE and analyzed with the aid of a light microscope coupled to an image analyzer system that allowed measuring the transverse diameter of the muscle fibers to detect possible differences in thickness and quantify the number of these myonuclei muscle fibers. It was found that the animals in the GTA showed an increase in muscle fiber diameter (2666.58 ± 483.05) compared to GS (2010.75 ± 328.17). By analyzing the proliferation of nuclei in the muscle fiber was found that the animals in the GTA
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(328.3 ± 40.0) showed an increase when compared to GS (274.8 ± 31.7). Through our results, we conclude that the use of AAS associated or not to exercise causes morphological changes in the muscle of young rats. Keywords: Anabolics, Training, Effects, Histology.
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