中国组织工程研究与临床康复 第 13 卷 第 21 期 2009–05–21 出版 Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research May 21, 2009 Vol.13, No.21

P.O. Box 1200, Shenyang 110004 cn.zglckf.com 4080

1Clinical Medical College of Fuzhou General Hospital, Fujian Medical University, Fuzhou 350025, Fujian Province, China; 2Second Department of Orthopaedics, Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Command, Fuzhou 350025, Fujian Province, China Lin Zeng-ping★, Studying for master’s degree, Physician, Clinical Medical College of Fuzhou General Hospital, Fujian Medical University, Fuzhou 350025, Fujian Province, China lzp2320305012@ sina.com Correspondence to: Wang Wan-ming, Clinical Medical College of Fuzhou General Hospital, Fujian Medical University, Fuzhou 350025, Fujian Province, China; Second Department of Orthopaedics, Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Command, Fuzhou 350025, Fujian Province, China Supported by: the General Program of Technological Research of Medical Science of Nanjing Military Command. No.06MA137* Received: 2009-02-01 Accepted: 2009-04-05

力学刺激对人骨髓间充质干细胞/聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物 生物学性状的影响*★

林增平1，王万明1,2，陈学明2，周 忠2，吕 琦2，林 旺1

Effects of various mechanical stresses on biological characteristics of human bone marrow stem cells/Poly (DL-lactide-co-glycolide)

Lin Zeng-ping1, Wang Wan-ming1,2, Chen Xue-ming2, Zhou Zhong2, Lü Qi2, Lin Wang1

Abstract BACKGROUND: Studies demonstrated that mechanical stress stimulation plays an important role in various cellular activities and the development of human organs, which affect human bone marrow stem cells (hBMSCs) differentiating into chondrocytes. OBJECTIVE: To explore the Influence of various mechanical stresses on biological characteristics of human bone marrow stem cells/Poly (DL-lactide-co-glycolide) (PLGA). DESIGN, TIME AND SETTING: The in vitro cytology experiment was performed at the Department of Laboratory and Department of Pathology, General Hospital of Nanjing Military Command from May to December 2008. MATERIALS: The hBMSCs were provided by Second Department of Orthopaedics, General Hospital of Nanjing Military Command, and PLGA was purchased from Daigang Biological Company. METHODS: Totally 15 mL bone marrow was drawn from human ilium and BMSC was separated and cultured with the density gradient centrifugation. The third passage of BMSC was prepared for cell suspension with 2×1010/L and transferred onto the PLGA, followed by addition of chondrocyte induction medium after 5 days. BMSCs-PLGA was divided into four groups: 3 of which were cultured in centrifuge tube with centrifugal force of 100 g, 200 g and 300 g, twice per day, 30 minutes a time at 12 hours intervals for 4 weeks. In the static group, BMSCs-PLGA was routine cultured in 6-well plate. MAIN OUTCOME MEASURES: Adherence of BMSCs on PLGA, the expression of type Ⅱ collagen, as well as contents of proteoglycan. RESULTS: BMSCs grew well and secreted matrix on the PLGA. At 4 weeks after centrifuge culture, the volume of composites was no shrink in each experimental group, which was largest in 200 g stress group with excellent elasticity. The volume in the group was shrinking with poor elasticity. Hematoxyin-eosin staining showed that cartilage lacuna-like structure could be found in 200 g stress group with a lot of secreted matrix. Immunohistochemical staining of collagen type Ⅱ showed that the 200 g group stained deeply yellow, on the contrary, the static, 100 g stress, and 300 g stress group were stained lightly yellow or negative. Compared to static group, content of proteoglycan in experimental group was notably increased (P < 0.05), which were obvious decreased in 100 g and 300 g stress groups than that of 200 g stress group (P < 0.05), but there was no significant difference between 100 g stress group and 300 g stress group. CONCLUSION: The composition of BMSCs/PLGA exhibits better adhesion performance. Adequate mechanical stress can accelerate BMSCs differentiating into chondrocytes under the premise of exist of chondrocyte induction medium; the optimum stimulus is 300 g centrifugal force. Lin ZP, Wang WM, Chen XM, Zhou Z, Lü Q, Lin W.Effects of various mechanical stresses on biological characteristics of hu-man bone marrow stem cells/Poly (DL-lactide-co-glycolide).Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2009;13(21): 4080-4084. [http://www.crter.cn http://en.zglckf.com]

摘要 背景：研究表明离心力等力学刺激对细胞的功能活动及人体组织器官的正常发育具有重要影响，而且力学刺激也影响骨髓间

充质干细胞的分化。 目的：观察施加不同程度离心力对人骨髓间充质干细胞/聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物生物学性状的影响。 设计、时间及地点：细胞-组织工程学体外实验，于 2008-05/12 在解放军南京军区福州总医院实验科及病理科完成。 材料：骨髓来源于因骨不连行自体髂骨移植的患者，由解放军南京军区福州总医院骨二科提供。聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物

为济南岱罡生物公司产品。 方法：自人体髂骨抽取骨髓 15 mL，密度梯度离心法体外分离培养骨髓间充质干细胞，传至第 3 代制成 2×1010 L-1

细胞悬液，

均匀接种到聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物上，5 d 后加入软骨细胞诱导液。设立 4 组：3 个受力组于离心管内培养，分别施加 100 g，200 g，300 g 离心力，2 次/d，30 min/次，间隔 12 h，受力 4 周；静止组于 6 孔板内常规培养。 主要观察指标：骨髓间充质干细胞与聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物的黏附情况，复合物Ⅱ型胶原的表达及蛋白聚糖含量。 结果：人骨髓间充质干细胞与聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物黏附性良好，能在聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物上生长并分泌基质。离

心培养 4 周后，各受力组形成的复合物体积无收缩，且 200 g 受力组体积 大，弹性较好；静止组复合物体积收缩，弹性也

较各受力组差。200 g 受力组苏木精-伊红染色后出现大量的软骨陷窝样结构，偶见同源细胞群，Ⅱ型胶原免疫组化染色后可

见较多呈黄色的软骨细胞特异性基质Ⅱ型胶原；余 3 组形成的陷窝样结构及Ⅱ型胶原均较少。与静止组比较，体外培养 4 周

各受力组复合物分泌的蛋白聚糖含量均明显升高(P < 0.05)；与 200 g 受力组比较，100 g，300 g 受力组复合物分泌的蛋白

聚糖含量均明显降低(P < 0.05)；100 g，300 g 受力组间比较无明显差异。 结论：人骨髓间充质干细胞与聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物具有良好的黏附性能。在软骨细胞诱导液存在的前提下，施加适当

的力学刺激更有利于骨髓间充质干细胞向软骨细胞转化，200 g 离心力是较佳的力学刺激条件。 关键词：人骨髓间充质干细胞；聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物；支架；软骨细胞；力学刺激

基础实验

ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH 4081

1 福建医科大学福总临床医学院，福建 省 福 州 市 350025；2解放军南京军区福州总医院骨二科，福建省 福 州 市 350025 林增平★，男，1980 年生，福建省福州市人，汉族，福建医科大学在读硕士，医师，主要从事心外科学方面的研究。 lzp2320305012 @sina.com 通讯作者：王万明，福建医科大学福总临床医学院，福 建 省 福 州 市 350025；解放军南京军区福州总医院骨二科，福建省 福 州 市 350025 南京军区医药卫生 科 研 课 题(06MA137)* 中图分类号:R318 文献标识码:B 文章编号:1673-8225 (2009)21-04080-05 收稿日期：2009-02-01 修回日期：2009-04-05 (20081213005/ZS•Z)

doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2009.21.018

林增平，王万明，陈学明，周忠，吕琦，林旺.力学刺激对人骨髓间充质干细胞/聚乳酸-聚羟基乙酸共

聚物生物学性状的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2009，13(21):4080-4084. [http://www.crter.org http://cn.zglckf.com]

0 引言

软骨组织工程的三大要素为种子细胞、支

架材料、生长因子[1]。骨髓间充质干细胞具有

来源充足、取材容易、易于培养、能够自我更

新增殖、多向分化的潜能[2-3]，自体移植无明显

免疫排斥反应，因此可作为组织工程理想的种

子细胞[4]。 人工合成的聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物除

具有良好的组织相容性和细胞相容性外，还具

有来源广、降解速度可控性、易塑性等优点，

而且其高孔隙率和适合的孔径为细胞培养提供

良好的三维空间，避免了二维培养中细胞接触

抑制想象，使细胞能够保持旺盛的增殖态势[1]。 人体组织器官除了受周围基质的影响外，

还受到各种生物力学作用，如离心力。研究表

明这些力学刺激对细胞的功能活动及组织的

正常发育与成熟具有重要影响，而且力学刺激

也将影响骨髓间充质干细胞的分化[5]。

1 材料和方法

设计：细胞-组织工程学体外实验。 时间及地点：于2008-05/12在解放军南京

军区福州总医院实验科及病理科完成。 材料：骨髓来源于因骨不连行自体髂骨移

植的患者，排除代谢性骨病、结核、血液系统

性疾病，肝肾功能正常，由解放军南京军区福

州总医院骨二科提供。

实验方法：

人骨髓间充质干细胞的分离与培养[6-9]：将取得

的15 mL骨髓用DMEM/F12稀释1倍，稀释液缓

慢注入预先加有2倍体积的人淋巴细胞分离液

的离心管内，使两者之间有明显的分界线， 2 000 r/min密度梯度离心10 min，吸取呈云雾

状的中间层的单核细胞，用DMEM/F12洗涤2次，1 500 r/min离心10 min。沉淀用含体积分

数为10%的胎牛血清、维生素C 0.05 g/L、青霉

素10万U/L、链霉素0.1 g/L的DMEM/F12培养

液重悬后，计数，调整细胞密度为1×108 L-1

备用，取6 mL置入50 mL的培养瓶中，将细胞

置于37 ℃、体积分数为5%的CO2、95%湿度

条件下培养，每3 d换液一次，逐渐将悬浮的细

胞去除。待细胞生长达90%左右融合时，用 2.5 g/L胰蛋白酶+ 0.2 g/L EDTA消化，1∶3传代，收集第3代细胞用于接种聚乳酸-聚羟基 乙酸共聚物。然后进行骨髓间充质干细胞的鉴

定与生长曲线分析[10-12]。 骨髓间充质干细胞/聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物

复合物的形成[13-15]：将第3代骨髓间充质干细胞

制成2×1010 L-1细胞悬液，均匀接种到聚乳酸-

聚羟基乙酸共聚物上。5 d后改用软骨细胞诱导

液(含体积分数为5%的胎牛血清、6.25 μg/L转化生长因子β1、50 μg/L胰岛素样生长因子

Ⅰ、40 μg/L地塞米松、0.05 g/L维生素C、青

霉素10万U/L、链霉素0.1 g/L的DMEM/F12)中，

同时施加相应的力学刺激，每周换液2次。 力学刺激

[16-18]：设立4组，3个受力组于离

心管内培养，分别施加100 g，200 g，300 g离心力，2次/d，30 min/次，间隔12 h，受力4周；静止组于6孔板内常规培养。

光镜及电镜观察：倒置相差显微镜下连续观

察细胞生长情况，扫描电镜观察细胞在支架上

的黏附及细胞外基质的分泌情况。 大体观察：大体观察各组复合物的外观，常

规苏木精-伊红染色观察组织结构，甲苯胺蓝染

色观察细胞外基质中蛋白聚糖的分泌情况。 免疫组化检测

[19-21]：应用鼠抗人Ⅱ型胶原单

克隆抗体行标本的免疫组织化学染色，SABC法，DAB显色，棕黄色为阳性。人皮肤为阴性

试剂与仪器 来源

DMEM/F12、胎牛血清、 2.5 g/L 胰酶-0.2 g/L EDTA

地塞米松、维生素 C 人淋巴细胞分离液 聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物 转化生长因子β1、 胰岛素样生长因子 I Ⅱ型胶原免疫组化试剂盒 FICT 标记鼠抗人 CD44、 CD45 单克隆抗体

MTT 甲苯胺蓝、DMSO

美国 GIBCO 公司 美国 Sigma 津脉基因测绘技术有限公司

济南岱罡生物 美国 Peprotech Boster 晶美生物 华美生物工程公司 上海生工

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对照，PBS代替一抗为空白对照。 蛋白聚糖含量检测

[22]：应用阿尔辛蓝检测体外培养4周的复合物中蛋白聚糖含量。492 nm波长处酶标仪测定

吸光度值，硫酸软骨素绘制标准曲线，通过吸光度值与

标准曲线对照计算样品蛋白聚糖含量，6例/组。 统计学分析：由第一作者采用SPSS 15.0软件进行

统计处理，行多样本均数间的多重比较(SNK-q检验)， P < 0.05为差异有显著性意义。

2 结果

2.1 细胞形态观察与生长情况

原代培养：

24 h后即可见细胞贴壁，随后贴壁细胞逐渐增多。 原代细胞呈集落样生长，但形态不均一，主要包括圆形、多边形，

短小梭形。 3 d后首次换液，去除大量悬浮细胞，可见贴壁细胞以短小梭形

为主，见图1a。 培养6 d时细胞形态逐渐趋向一致，以中等梭形为主，细胞增加

明显，进入对数增长期。 第9天时细胞增长减慢，第11天细胞已达90%左右融合，见图1b。

传代后：

细胞增殖明显加快，6 h绝大部分细胞贴壁。 细胞形态较均一，呈中等梭形，排列有方向性，旋涡样、同心圆

样分布。 生长也较原代明显加快，第3天细胞增加明显，进入对数生长期；

第6天细胞增加减慢，已达95%以上融合，见图1c。 第8代后细胞生长速度减慢，形态不规则，变得宽大扁平，排列

失去方向性，胞内黑色颗粒增多，折光性能差，开始出现老化。

2.2 骨髓间充质干细胞表型鉴定结果 单参数流式细

胞仪检测第3代细胞CD44阳性率为88.6%，CD45阳性

率为0.73%。

2.3 骨髓间充质干细胞生长曲线分析 第1，3，5代细

胞生长过程无明显差别。第1，2天细胞生长缓慢，且第

2天吸光度值较前略有减少，为潜伏期；第3天开始细胞

增加明显，进入指数生长期；第6天细胞生长有所减慢；

第7天已无明显细胞生长，进入停滞期。 2.4 骨髓间充质干细胞与聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物的

黏附 光镜观察：

接种2 d后，聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物上可见梭形的细胞，孔

隙中更为明显。 细胞的折光性好，随培养时间延长细胞数量也增加。 未接种的聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物未见有骨髓间充质干细胞

生长。

电镜观察：

细胞沿聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物走向生长，聚乳酸-聚羟基乙

酸共聚物的表面及孔隙中均可见梭形细胞，见图2a。 成软骨诱导7 d后，可见细胞分泌较多的细胞外基质，将细胞包

裹其中，并填满支架的孔隙，见图2b。 未接种的聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物呈多孔隙的网状结构，孔隙

间彼此相通，见图3。

Figure 1 Morphological observation of bone marrow mes-enchymal stem cells (×100)

图 1 骨髓间充质干细胞形态观察(×100)

c: At 6 days after culture of 3 passage cells

a: Bone marrow mesenchymal stem cells with spindle-shape could be found on PLGA

a: At 3 days after primary culture b: At 11 days after primary culture

Figure 2 Adherence of bone marrow mesenchymal stem cells on PLGA were observed under scanning electron microscope

图 2 骨髓间充质干细胞与聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物的黏附扫描电镜观察

b: Extracellular matrix was secretedat 7 days after cartilage induction

Figure 3 Observation of scanning electron microscope in nonvaccinated PLGA

图 3 未接种的聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物扫描电镜观察

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大体观察：

离心培养4周后，各组复合物均形成软骨样组织。 100 g，200 g，300 g受力组复合物体积无收缩，表面光滑明亮，

有细腻光泽，呈灰白色，弹性较好；静止组复合物体积收缩，弹

性也较各受力组差。 苏木精-伊红染色可见200 g受力组有较明显的软骨陷窝样结构，

而且数量较多，呈散在及片状分布，陷窝样结构内含有3~5个细胞，

并可见细胞核及核仁，同时可见同源细胞群。细胞周围有蓝染的

胞外基质沉积，见图4。 100 g受力组、300 g受力组和静止组形成的陷窝样结构少，细胞

数量少，形成的胞外基质也少，其中静止组 少。

2.5 Ⅱ型胶原免疫组织化学结果 200 g受力组可见较

多呈黄色的软骨细胞特异性基质Ⅱ型胶原，见图5；而 100 g，300 g受力组及静止组呈黄色的Ⅱ型胶原形成较少。

200 g受力组胞甲苯胺蓝染色外基质有较明显的紫

红色异染，细胞核呈绿色，见图6；而100 g，300 g受力组淡染，静止组无染色。

2.6 蛋白聚糖含量检测 阿尔辛蓝检测结果显示，与

静止组比较，体外培养4周100 g，200 g，300 g受力组

复合物分泌的蛋白聚糖含量均明显升高(P < 0.05)；与

200 g受力组比较，100 g，300 g受力组复合物分泌的

蛋白聚糖含量均明显降低(P < 0.05)；100 g，300 g受力组间比较无明显差异，见表1。 3 讨论

研究显示种属间的差异在骨髓间充质干细胞培养

中不容忽视，对人骨髓间充质干细胞研究是组织工程进

入临床所必须的[23-24]，实验抽取成人骨髓更适合于临床

应用。 实验结果表明，骨髓间充质干细胞能黏附在聚乳

酸-聚羟基乙酸共聚物上，而且生长良好，经软骨细胞

诱导液诱导后能分泌软骨细胞特异性基质Ⅱ型胶原和

蛋白聚糖。基质包裹细胞并填满支架孔隙，细胞/聚乳 酸-聚羟基乙酸共聚物复合物经4周的体外诱导培养后，

支架部分已发生降解，取而代之得是软骨细胞基质，故

外观上支架材料体积变大而非缩小，形成光滑明亮、细

腻光泽、弹性良好的组织工程软骨。至于骨髓间充质干

细胞的数量与聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物大小的比例应

为多少，才能达到正常组织软骨的生物性能和物理性

能，还需进一步研究。 转化生长因子β1是一种多功能的细胞因子，对多

种细胞的生长和分化起重要作用，有研究表明经转化生

长因子β1诱导后人骨髓间充质干细胞所分泌的细胞外

基质无论在数量还是在特质上与软骨细胞所分泌的基

质具有很大的相似性[25]。另据文献报道，在含有胎牛血

清的培养液中，加入5.0~10.0μg/L转化生长因子β1能更好使人骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化，胞浆有更

多的Ⅱ型胶原和蛋白聚糖表达 [26]。有研究发现，在 10μg/L转化生长因子β1中含有体积分数为5%的胎牛血

清更有利于骨髓间充质干细胞向软骨细胞表型分化[27]。胰

岛素样生长因子Ⅰ是一种促有丝分裂的多肽生长因子，

能够提高多种细胞存活率，并刺激细胞增殖。有文献报

道，胰岛素样生长因子Ⅰ能够促进软骨细胞增殖，并维

Figure 4 The arrow shows chondrocyte in 200 g stress group (Hematoxylin-eosin staining,×100)

图 4 箭头示 200 g 受力组软骨细胞(苏木精-伊红染色，×100)

Figure 5 Immunohistochemical staining of collagen type Ⅱ of 200 g stress group (×50)

图 5 200 g 受力组Ⅱ型胶原免疫组化染色(×50)

Figure 6 The arrow shows homologous chondrocyte mass in 200 g stress group (Toluidine blue staining, ×200)

图6 箭头示200 g受力组软骨同源细胞群(甲苯胺蓝染色，×200)

表 1 各组每克工程软骨中蛋白聚糖含量的比较 Table 1 Comparison of proteoglycan of per gram tis-

sue-engineering cartilage in each group (mg/g)

Sample Static group 100 g stress group

200 g stress group

300 g stressgroup

1 0.240 0.506 1.056 0.500 2 0.240 0.509 0.934 0.495 3 0.120 0.503 0.945 0.492 4 0.240 0.512 0.940 0.487 5 0.120 0.501 0.951 0.495 6 0.240 0.506 0.945 0.489

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持软骨细胞表型[28]。实验在含体积分数为5%的胎牛血

清前提下，将6.25μg/L转化生长因子β1与50μg/L胰岛素样生长因子I联合应用，结果表明两者联合应用能够

使骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化，并分泌软骨细胞

特异性基质。 同时，考虑到体内软骨在人体行使运动功能时经常

受到各种应力作用，体外构建时模拟体内的生物力学环

境对软骨组织的形成具有重要作用。Angele等[29]单纯应

用力学刺激即可诱导部分骨髓间充质干细胞向软骨细

胞分化。Mouw等[30]研究表明，动态的力学刺激能促使

骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化和上调软骨相关基

因的表达。刘天一等[18]研究力学刺激对骨髓间充质干细

胞体外软骨形成的结果表明：体外诱导构建过程中施加

合适的外力可与生长因子产生某种作用或联系， 终促

进骨髓间充质干细胞的体外软骨形成。但对于体外骨髓

间充质干细胞向软骨细胞分化时应施加多大的外力，才

能使骨髓间充质干细胞能够更好的向软骨细胞分化，从

而为软骨损伤的治疗开辟新路，同时也为体外软骨构建

用生物反应器的研制提供相应的技术参数，是目前研究

的热点之一。实验在相同软骨诱导液的前提下，分别施

加不同的力学刺激，发现受力组在生成软骨细胞特异性

基质蛋白聚糖和Ⅱ型胶原均明显多于静止组，且具有统

计学意义。在实验条件下，施加200 g的外力是 佳的

诱导力学大小。而100 g偏小，不能充分使骨髓间充质

干细胞向软骨细胞分化，300 g过大致使细胞损伤，因

为体内组织中细胞是被包埋于基质，力直接作用到细胞

外基质上，由于软骨的特异性组织结构特点而将力进行

分解传递。而在体外构建组织中，基质成分相对少，力

无法分解，故过大将直接造成细胞损伤。至于体外的受

力大小是否与体内相同以及力学的作用机制还需要进

一步分析。

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