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목재부후균의 생육조건과 효소

- 제 3 장 -

1. 영 양 ◦ 에너지원, 균체성분, 4대 영양분

가. 탄소화합물(탄소원)

◊ Glucose(포도당, dextrose), Mannose, Xylose, 전분 등

◊ 인공배지: glucose 첨가

◦ 영양, 수분, 산소, 온도, pH, 광선

Mannan(β-D-mannose)

Xylan(β-D-xylose)

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제1절 목재 부후균의 생육조건

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Cellulose와 Starch의 화학구조

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나. 질소화합물(질소원)

◊ 무기질산염, 암모늄염, 유기요소 등

◊ 인공배지: 펩톤 첨가

다. 무기염류(미량원소)

◊ 목재 세포 내 함유물질, 세포벽 중에 존재

◊ P, Mg, K, S 등: 세포 내 삼투압 조절, pH의 안정화

◊ Ca, Co, Cu, Fe, Mn, Mo, Zn 등: 효소의 활성화, 조효소 성분

◊ 인공배지: K2HPO4, MgSO4 · 7H2O 첨가

라. 생육인자(미량물질)

◊ 비타민류, 아미노산 등

◊ 인공배지: 맥아추출물 첨가

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■ 자연계에서 목재부후균의 영양 섭취

○ 목재로부터 영양분 섭취하며 생활

○ 4대 영양분 중에서

♦ 탄소원, 무기염류, 생육인자: 목재로부터 섭취 가능

♦ 질소원: 균체증식(단백질 합성)을 위해 상당량이 필요

- 균사 생장에 필요한 배양기 중의 질소 함유량: 0.5~2.0%

- 목재 내 질소 함유량: 0.1~0.4%(목재 전건중량 대비) - 부족

○ 부족한 질소원 조달 방법 – 추정

① 질소고정 세균의 도움

- 근거: 목재 초기부후에 질소고정세균 관여

② 토양 중의 질소원 이용

- 근거: 토양 접지부로부터 목재 내부로 질소화합물 이동

③ 균사의 자기소화

- 근거 1: 부후말기 목재에서 균사 관찰이 불가능

- 근거 2: 균사 생육 과정 중에 어느 조건에서 강한 단백질 분해효소(protease) 분비

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부후 초기 부후 말기

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2. 수 분

◦ 세포 내 원형질의 최다 구성성분

◦ 물질대사의 매체 역할

◦ 목재부후균의 생장: 목재 내 수분과 밀접한 관계 有

【참 고】목재 중의 수분 존재 상태

① 결합수(흡착수)

◊ 세포벽 구성성분과 물리화학적으로 결합(수소결합, 반데르바알스 힘)하고

있는 수분

◊ 섬유포화점(FSP) 이하에서의 수분

② 자유수

◊ 세포내강이나 공극에 액체 상태로 존재하는 수분

◊ 섬유포화점 이상에서의 수분

◊ 목재부후균이 이용할 수 있는 수분

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가. 목재 함수율과 부후

① 기건재: 함수율 약 15% 전후

◊ 부후 발생 불가능

② 포수재: 함수율 약 150%(고비중재) ~ 200%(저비중재)

◊ 부후 발생 불가능

③ 다습재: 포수 함수율에 가까운 함수율을 갖는 목재

◊ 부후 발생 불가능, 연부후 발생

나. 수분 조건과 부후

① 공중 습도

◊ 최적: 95~99%(최저 85%)

② 목재 함수율

◊ 최적: 30~60%

◊ 불량: 25% 미만, 100% 이상

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3. 산 소

① 단당류의 산화에 필요(당류 → 화학에너지)

② 목재부후균: 호기성균

◊ 기체 상태의 산소를 이용

◊ 수중 또는 지중 깊은 곳의 목재: 부후 발생 곤란

◊ 산소 조건과 수분 조건은 밀접한 관계 有

③ 산소 요구성: 부후균 > 연부후균

④ 산소요구도 측면에서 목재 공극율

◊ 담자균류 생장: 공극율 20% 이상

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4. 온 도

가. 미생물의 생육적온에 의한 분류

① 저온균: 18℃ 이하

② 중온균: 25~40℃

③ 고온균: 45℃ 이상

나. 목재부후균: 대부분 중온균-세분화

① 好저온균: 24℃ 이하 ◊ Serpular lacrymans

② 好중온균: 24~32℃

◊ Fomitopsis palustris, Trametes versicolor

③ 好고온균: 32℃ 이상

◊ Gloephyllum saepiarium, Pycnoporus coccineus

다. 목재부후균의 온도에 대한 저항성

◊ 야외발생균(토목용재, TRV) > 실내발생균(건축용재, SEL)

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5. pH

가. 균류 생장의 최적 pH

◊ 부후균, 연부후균: 산성 측(pH 4~6)

◊ 세균, 방선균: 약 알칼리 측(pH 6.5~7.5)

나. 부후 시험: 배양액 pH 5.5~6.0으로 조정

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6. 광 선

가. 균사 생장에는 불필요, 자실체 형성에 필요

나. 자외선(파장 100~400nm): 균 생장에 유해 → 살균에 이용

◊ 일광소독

◊ 파장 240~280nm: 살균력 有

◊ 파장 260~265nm: 살균력 强(253.7nm)

◊ 殺菌機構(추정): 세포 내 핵산(DNA)에 변화 발생 → 신진대사 장해

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다. 자외선 照射에 의한 變異株 생산

◊ 백색부후균에 자외선(260~265nm) 조사 → Cellulase 缺損 변이주 출현

◊ Cellulase 결손 변이주: 생물적 pulping(Bio-pulping)에 사용

Modified wood structures due to bio-pulping

Overview of the 50-ton outdoor bio-pulping chip pile (4 meters high, 9 meters wide, 21 meters long)

< 효소의 분류 >

1) 세포 외 효소(균체 외 효소): 균체 외로 분비되어 촉매작용

◊ 고분자물질의 저분자화(解重合)에 관여하는 효소

◊ Cellulose, Hemicellulose, Lignin 분해계 효소

◊ 필요에 따라 생산하는 효소(誘導酵素)

2) 세포 내 효소(균체 내 효소): 균체 내에서 촉매작용

◊ 호흡, 발효에 관계하는 효소(호흡, 발효계 효소)

◊ 항상 균체 내에 존재하고 있는 효소(構成酵素)

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제2절 목재 부후균의 효소

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효소의 기능

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1. 셀룰로오스 분해 효소

◊ Cellulose의 β-1·4-D-glucoside 결합을 加水分解하는 효소

- Cellulose: glucose로 구성된 monopolysaccharide(단순다당류)

◊ Cellulose(다당류) → Glucose(단당류): 관여 효소

① Cellobiohydrolase ② endo-glucanase ③ Cellobiase

가. Cellobiohydrolase(CBH) : exo-1,4-β-D-glucanase

① 셀룰로오스의 결정영역(micell, crystalline region)을 가수분해

② 대표적인 생산균류: 갈색부후균은 분비하지 않음

◊ 곰팡이류: Trichoderma, Aspergillus, Penicillium, Fusarium

◊ 백색부후균: Phanerochaete chrysosporium(유색고약버섯),

Schizophyllum commune(치마버섯)

③ CBH의 종류: CBHⅠ, CBHⅡ

◊ 화학구조와 분해특성이 각각 다름

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1) Cellobiohydrolase I

① Cellulose 환원성 말단기로부터 glucose oligomer를 절단

◊ glucose oligomer: cellotriose(G3) ~ cellohexose(G6)

◊ glucose oligomer 중에서 cellotetrose(G4)를 가장 많이 절단

② 셀룰로오스를 불규칙하게 절단

2) Cellobiohydrolase II

① Cellulose 비환원성 말단기로부터 cellobiose (G2) 또는

cellotriose(G3)를 절단

② G3에서 glucose를 절단하기도 함

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Cellulose 분자구조 (비환원성 말단기, 환원성 말단기)

Cellulose 가수분해 효소

Crystalline cellulose Amorphous cellulose

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나. Endo-glucanase(EG)

① 별칭: endo-1,4-β-D-glucanase, glucanohydrolase

② 셀룰로오스의 비결정영역(non-crystalline region)을 가수분해

③ Glucose oligomer 생성 → cellobiose 생성

다. Cellobiase

① 별칭: β-D-glucosidase

② Cellobiose → Glucose

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갈색부후균의 셀룰로오스 분해 메카니즘

■ 갈색부후균의 셀룰로오스 분해효소

○ EG와 cellobiase만 분비

○ 셀룰로오스 결정영역을 분해하는 CBH는 분비하지 않음

→ 그럼에도 세포벽을 극심하게 분해

■ 갈색부후균은 셀룰로오스를 어떻게 분해할까?

○ 저분자 대사물질의 세포벽 내로의 확산에 의해 분해

○ 과산화수소의 Fenton 반응 가설 제시(Koenigs, 1974)

○ Fenton’s reaction: 강력한 산화반응

○ 과정: 갈색부후균 과산화수소 분비→목재 중의 전이금속(Fe)과

Fenton 반응 → 수산화 자유 radical(HO •) 생성 → HO • 에의해

셀룰로오스 절단

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■ 갈색부후균의 셀룰로오스 분해

○ 효소적 가수분해와 산화 반응계가 중요한 역할

○ 저분자 대사물질이 관여하는 것은 확실

○ 기작은 불확실

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2. 헤미셀룰로오스 분해 효소

◊ Hemicellulose: heteropolysaccharide

◊ 구성 다당류의 종류:

① Glucuronoxylan: 활엽수 HC의 주체(활: 25~35%, 침: 5~15%)

② Glucomannan: 침엽수 HC의 주체(침: 10~20%, 활: 2~5%)

③ Arabinoglucuronoxylan(침: 10~15%, 활: 0.1~2.0%)

가. Xylanase

◊ 별칭: 1,4-β-D-xylanohydrolase

◊ Xylan의 주쇄(β-1·4-D-xyloside 결합)를 加水分解

1) endo-xylanase

◊ xylan → 무작위로 xylose oligomer 생성

◦ xylose oligomer: 주로 xylotriose 또는 xylotetrose

2) exo-xylanase

◊ xylose oligomer를 xylose로 가수분해

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Fig. Schematic representation of the action of the xylanolytic enzyme system. 1 – endoxylanases; 2 – α-L-arabionofuranosidases; 3 – glucuronidases; 4 – feruloyl and coumaroyl esterases; 5 – acetyl xylan esterases; 6 – β-xylosidases. Source: Chavez etal., 2006

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나. Mannase

◊ Mannan의 주쇄(β-1·4-D-mannoside 결합)를 가수분해

1) endo-mannase

◊ glucomannan으로부터 무작위로 oligomer 생성

◦ (mannose + mannose) oligomer

◦ (mannose + glucose) oligomer

2) β –D-mannosidase

◊ (mannose + mannose) oligomer → mannose

3) β –D-mannosidase, β –D-glucosidase

◊ (mannose + glucose) oligomer → mannose, glucose

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(acetyl기)

β-D-mannose β-D-glucose

Glucomannan

다. 기 타

◊ 측쇄를 가수분해하는 효소

- acetyl esterase, glucuronidase, arabinosidase 등

◊ Hemicelluse의 가수분해에는 cellulose에 비하여 많은 종류의

효소가 관여

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3. 리그닌 분해 효소

◊ 리그닌의 화학구조: 매우 복잡

◦ 구성단위: phenylpropane

◦ phenylpropane의 종류

① p-hydroxyphenylpropane

② syringylpropane

③ guaiacylpropane

◊ 식물 리그닌의 구조 단위

◦ 식물의 진화와 함께 리그닌 구조단위도 복잡

◦ 벼과 식물: ①+②+③

◦ 활엽수: 주로 ② - 분해가 용이

◦ 침엽수: 주로 ③ - 분해가 곤란

p-coumaryl alcohol (p-hydroxyphenyl propane)

coniferyl alcohol (guaiacyl propane)

sinapyl alcohol (syringyl propane)

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가. 효소에 의한 리그닌의 분해과정

◊ phenylpropane 단위의 분해

① 탈메톡실화(demethoxylation)

② α자리 탄소의 산화(carbonyl화, C=O)

③ 측쇄구조의 절단

④ β-O-4(β-arylether결합)결합의 절단

⑤ 방향환의 개환

나. 리그닌 분해에 관여하는 효소

◊ 지금까지 알려진 효소

① 리그닌 과산화수소효소

(lignin peroxidase, Lip, lignase)

② 망간의존형 과산화수소효소

(Mn-dependant peroxidase, MnP)

③ Laccase

①

②

③ ④

⑤

침엽수 리그닌(guaiacylpropane) 분해모식도

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다. 리그닌 분해 미생물

◊ 대부분 백색부후균

◦ 백색부후균의 40%: Lip와 MnP를 생산

◦ 백색부후균의 60%: MnP와 Laccase를 생산

◦ Pycnoporus cinnabarinus: Laccase만 생산

◊ 방선균: Nocardia, Streptomyces

◊ 세균: Pseudomonas, Xanthomonas

1) 리그닌 과산화수소효소(LiP)

◊ Phanerochaete chrysosporium(유색고약버섯)에서 발견된 효소

◊ 효소 활성에 과산화수소(H2O2)를 필요로 하는 산화환원효소

◊ 리그닌 구조의 분해

◦ β-O-4(β-arylether결합), Cα-Cβ 간의 결합 분해

◊ LiP 생산 균주

◦ 유색고약버섯, 구름버섯, Phlebia radiata, Trametes hirsuta

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2) 망간의존형 과산화수소효소(MnP)

◊ 과산화수소(H2O2)와 2가의 망간(Mn++)을 필요로 하는 산화효소

◊ Mn++를 Mn+++로 산화시키면서 페놀구조를 산화

◊ 산화력: 활엽수 리그닌 > 침엽수 리그닌

◊ MnP 생산 균주

◦ 유색고약버섯, 표고버섯, Phlebia radiata, Ceriporiopsis

3) Laccase

◊ laccase의 리그닌 분해에 관한 보고

◦ 1928년 Bavendamm(독일)

◦ Bavendamm반응: 목재부후균의 부후형 식별 수단

◊ 리그닌 구조의 산화 분해

◦ Cα 의 산화, 탈메톡실화, phenyl기의 개열, Cα-Cβ 의 절단

◊ 유백색의 생옻액(주성분: urushiol)에도 존재

◦ 옻칠의 건조에 불가결한 효소(옻칠의 산화 중합 효소)

urushiol

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Bavendamm’s reaction

○ 목재부후균의 부후형(갈색, 백색) 식별 수단

○ 방 법

◊ 탄닌산 또는 몰식 자산(gallic acid) 함유 배지 → 未知의 담자균

접종 → 수 일간 배양 → 균사체 주위에 갈색 띠 형성 유무 확인

◊ 갈색 띠 형성: 백색부후균(갈색부후균: 음성)

Lignin의 분해와 옻칠의 건조

○ Lignin의 분해: laccase에 의한 산화 분해 - in vivo(생체 내)

○ 옻칠의 건조: laccase에 의한 산화 중합 – in vitro(시험관 내)

○ 리그닌 분해 실험

◊ in vivo(생체 내) 상에서는 재중합이 발생되지 않음

◊ in vitro(시험관 내) 상에서는 분해된 리그닌의 재중합 발생

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Fig. Characteristics of the Bavendamm’s reaction caused by the oxidation of gallic acid and the formation of quinones on a Fusarium sp. strain D3-FB culture