首都圏北部４大学発新技術説明会

迅速かつ簡便にウイルス、微生物類を検出する指示薬の開発

埼玉大学大学院理工学研究科准教授 幡野 健

E-mail: khatano@fms.saitama-u.ac.jpTel & Fax: 048-858-3535

感染における糖鎖の役割

VirusToxin Bacterium

Glycolipid

Glycoprotein

O157の産生するベロ毒素の糖鎖認識

Side view Bottom view

Grobotriaosyl Ceramide (Gb3: Galα1-4Galβ1-4Glcβ-Cer)

Vero toxin (Stx1 and Stx2)

OOH

HOO

HO

OH

OHO O

OH

OH

OHO

OH

OHO

N

OH

HO

これまでの研究成果：糖鎖クラスター効果1)

SiMe

MeSi Si R

R

RR

R

R

Si R

R

R

Si

Si

Si Si

Si RR

RR

RR

RR

RR

RR

Fan(0)3 Dumbbell(1)6 Ball(1)12

OHO

AcHN

OH

OCOOH

HOOH

OHO O

OH

OOHOH

OHO SR :

O SOOH

OHO

OH OH

OHO

OH

OHO O

NHAc

OH

OOHOH

HOOH

OR :

シアリルラクトース

ラクトネオテトラオース

OOH

HO O

OH

HO

OO

OHO

OH OH

OHO

OHHO

SR :

グロボ三糖

OH

ベロ毒素（O157）Tetrahedron Lett., 1999, 40, 7839-7842. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 2002, 99, 7669-7674.

インフルエンザBioorg. Med. Chem. Lett., 2008, 18, 4405-4408.

デングウイルスCarbohydr. Res. 2006, 341, 467-473.

1) Y. C. Lee, FASEB J. 1992, 6, 3193–3200.

感染検査に求められる特性

・ 検査が簡単に行える・ 結果が迅速に得られる・ 精度が高い・ 高額機器を用いない・ 安価な方法・ 検査対象が多い

これらの特性を兼ね備えた理想的な検査方法は可能か！？

検出試薬のための分子設計

• 病原体の存在確認糖鎖担持カルボシランデンドリマー群の病原体への特異的認識能・接着能を用いる（従来技術の利用）。

• ビジュアル化発光部位の導入で可能になる？ただ発光するのみ ⇒ 蛍光標識発光が変化する ⇒ 検出薬

（色調、強度の変化色調、強度の変化）↓

この研究の鍵！

シロールのAIE効果

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100Water fraction (vol %))

Em

issio

n In

tens

ity %

Solv.: Water/Acetone mixture；Concentration: 10-6 M; Ex: 360 nm

Si

Ph Ph

PhPh

Ph S

Aggregate-induced Emission2)

2) B. Z. Tang et al., Chem. Commun., 2001, 1740.

糖鎖クラスター効果とAIE効果の融合

SiSi Si R

R

RR

R

R

Ph4

Si

Ph

Ph PhMe Me

Ph 病原体を特異的に認識する蛍光分子

2,3,4,5-TetraphenylsilolesAIE効果

SiMe

MeSi Si R

R

RR

R

R

＋

検査試薬と成り得るのか？

Dumbbell(1)6糖鎖クラスター効果

hybridhybrid

シロールデンドリマーへの糖鎖導入

OAc

OO

OAcO

OAc OAc

OAcO

OAcAcO

SAc+

NaOMe

MeOH / DMF

Ac2O

Py

1) NaOMe / MeOH

2) NaOH aq

OHO

HO OHO

OHO

OH

OHO

OH

SLac:

Si Si Si

Ph

Ph

Ph

Ph BrBr3 3

Si Si Si

Ph

Ph

Ph

Ph LacLac3 3

y. 47% (2steps) y. 83%

3) K. Hatano et al., Tetrahedron Lett., 2007, 48, 4365.

シロールデンドリマーの水中でのPL

照射前 365 nm照射

● Silole-Dumbbell(1)6-Lac 1mM aq.

ΦFL = 92%

レクチン結合活性 -測定法-

SiloleDumbbell(1)6-Lac

OH

OO

OH

HOOH

OOHO

OH

OHLac= S

Si

Ph Ph

SiSi PhPh

Lac

Lac

Lac

Lac

Lac

Lac

PL spectrum measurement ofSilole-Dendrimers

Measured at 5 ℃

Dendrimer solution： 3 mlConc. 0.6 μM in HEPES buffer (pH = 7.4)

PNA solutionConc. 20.0 μM in HEPES buffer (pH = 7.4)

peanut agglutinin (PNA): a Lac binding lectin

PL強度変化によるPNA検出4)

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

400 450 500 550 600Wavelength (nm)

Inte

nsity

(a.u

.)

0 μL10 μL20 μL30 μL40 μL50 μL

Figure PL spectra of Silole-Dumbbell(1)6-Lac in the presence of different amounts of PNA (from 0 to 50 μL). Concentration: 0.6 μM in HEPES buffer (5 μM, pH = 7.4). Excitation: 360 nm.

4) K. Hatano et al., Tetrahedron Lett., 2009, 50, 5816; 幡野ほか、ウイルス, 微生物類の検出方法, 特願 2008-283976

発光強度変化と発光強度差4)

-1

-0.9

-0.8

-0.7

-0.6

-0.5

-0.4

-0.3

-0.2

-0.1

00 0.1 0.2 0.3 0.4

[PNA] (μM)

(I－

I 0)/

I 0

Figure Plots of relative fluorescence intensity [(I－I0)/I0] of solution of Silole-Dumbbell(1)6-Lac at 474 nm vs concentration of PNA.

(A) (B)

Figure Pictures of photoluminescence of the HEPES buffer solution of Silole-Dumbbell(1)6-Lac in the (A) absence and (B) presence of PNA. Excitation: 360 nm.

95%が消光

4) K. Hatano et al., Tetrahedron Lett., 2009, 50, 5816; 幡野ほか、ウイルス, 微生物類の検出方法, 特願 2008-283976

レクチン特異性と希釈効果

0

100

200

300

400

500

600

700

800

400 450 500 550 600

Wavelength (nm)

Inte

nsity

(a. u

.)

0 μL

20 μL

40 μL

60 μL

80 μL

(A)

0

100

200

300

400

500

600

700

800

400 450 500 550 600Wavelength (nm)

Inte

nsity

(a. u

.)

0 μL20 μL

40 μL

60 μL

80 μL

(B)

Figure PL spectra of Silole-Dumbbell(1)6-Lac. (A): Presence of different amounts of WGA (from 0 to 80 μL). Concentration: 0.6 μM in HEPES buffer (5 μM, pH = 7.4). Excitation: 360 nm. (B): Addition of different amounts of blank solution (from 0 to 80 μL). Excitation: 360 nm.

WGA滴下 Blank滴下

2%だけ消光

Stx1 B（ベロ毒素）の検出試験

Figure PL spectra of Silole-Dumbbell(1)6-Gb3. Presence of different amounts of Stx1 B (from 0 to 60 μL). Silole-Dumbbell(1)6-Gb3 Conc.: 0.7 μM, Stx1 Conc.: 1.2 μM, PBS Buffer: 10 μM, Excitation: 360 nm.

Stx1 B：同志社大学 西川喜代孝教授より提供

検出検査所要時間

Figure WGA溶液の滴下時間の変化によるSiloleDumbbell(1)6-Lc3の蛍光強度の変化SiloleDumbbell(1)6-Lc3 Conc.: 0.7 μΜ, WGA Conc.: 7.0 μM, HEPES buffer, Temp.: 5℃Ex = 360 nm, Em = 474 nm

異なる発光色のシロール誘導体

Tamao et al., Chem. Eur. J., 2000, 6(9), 1683.

青色発光

緑色発光

赤色発光

Si

Ph

R R

Ph

Si

Ph

R R

Ph

OMeMeO

Si

Ph

R R

Ph

S SS S

緑色発光デンドリマーによるWGA検出

0

200

400

600

800

1000

400 450 500 550 600 650

Wavelength (nm)

Intensity (a.u.) WGA0μl

WGA10μl

WGA20μl

WGA30μl

WGA40μl

WGA50μl

Figure PL spectra of AnisiylSilole-Dumbbell(1)6-Lc3. Presence of different amounts of WGA (from 0 to 50 μL). Dendrimer Conc.: 0.7 μM, WGA Conc.: 10 μM; Buffer: HEPES (5 μM, pH = 7.4); Ex: 378 nm

Si Si Si

Ph

R2

Ph

R2 YY

Y

Y

Y

Y

OMeR2 =

Y = WGAと接着する糖鎖

2

494 nm

シロール混合系へのWGAの添加

0

200

400

600

400 500 600

Wavelength (nm)

Intensity (a.u.)

WGA0μl

WGA10μl

WGA20μl

WGA30μl

WGA40μl

WGA50μl

Si Si Si

Ph

R1

Ph

R1 XX

X

X

X

X1

R1 =

X = PNAと接着する糖鎖

Figure PL spectra of Silole-Dumbbell(1)6-Lac/AnisiylSilole-Dumbbell(1)6-Lc3. Presence of different amounts of WGA (from 0 to 50 μL). Dendrimer Conc.: 0.35 μM; WGA Conc.: 10 μM; Buffer: PBS (pH = 7.4, 10 μM)

Si Si Si

Ph

R2

Ph

R2 YY

Y

Y

Y

Y

OMeR2 =

Y = WGAと接着する糖鎖

2

486 nm

476 nm

WGA滴下による発光の色調変化5)

0 μl 10 μl 20 μl 30 μl 40 μl 50 μl

WGA滴下量

UVランプ (365 nm)照射時の発光写真

5) 幡野ほか、発光の色調変化による複数微生物の同時検出方法、特願2010-45452.

発光色変化による複数微生物の同時検出の原理

Si Si Si

Ph

R3

Ph

R3 ZZ

Z

Z

Z

Z

S SR3 =

Z = ウイルス(C)と接着する糖鎖

3

（赤色発光）

Si Si Si

Ph

R1

Ph

R1 XX

X

X

X

X1

R1 =

X = ウイルス(A)と接着する糖鎖

（青色発光）

Si Si Si

Ph

R2

Ph

R2 YY

Y

Y

Y

Y

OMeR2 =

Y = ウイルス(B)と接着する糖鎖

2

（緑色発光）

5) 幡野ほか、発光の色調変化による複数微生物の同時検出方法、特願2010-45452.

この検出薬の特徴

○ 利点

・ 単純な方法で短時間で検査結果が分かる

・ 特殊機器が不要（ハンディＵＶランプのみ）

・ 糖鎖の置換より別のウイルス・毒素に対応可

・ 治療薬、予防薬に比べ少量でよい（>1７0回／１㎎）

・ 毒性、水に対する溶解度を気にしなくて良い

○ 可能な検査対象（糖鎖との関連あるもの）

・ インフルエンザ、コロナウイルス、エイズウイルス、

ヘルペスウイルス、ニューカッスル病ウイルス・・・

・ コレラ菌、淋菌、ボツリヌス菌、マイコプラズマ肺炎菌、

ネズミチフス菌、ブドウ状球菌、肺炎双球菌、ヘリコバク

ター・ピロリ菌、腸炎ビブリオ・・・

従来検査方法と本方法の比較

検査方法必要機器（価格）

検査の簡便さ

検査所要時間

検出対象 検査費用 検出感度

PCR法×

PCR装置（300万円程）

×熟練が必要

△数時間

◎多数

×数千円

◎102~103個/mL

イムノクロマト法

◎不要

◎誰でも可

○30分

×制限あり

×数千円

○105~107個/mL

培養法

×培養装置（500万円程）

×熟練が必要

×数日以上

◎多数

◎数百円

◎103個/mL

本方法

〇紫外線ランプ

（1万円程）

◎誰でも可

◎5分

〇50以上

◎数百円（予想）

?~1013個/mL（改善可）

知的財産権およびお問い合わせ先

発明の名称 ：ウイルス,微生物類の検出方法

出願番号 ：特願2008-283976 出願人：国立大学法人埼玉大学

発明者：幡野 健, 松岡浩司, 照沼大陽

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発明の名称 ：発光の色調変化による複数微生物の同時検出方法

出願番号 ：特願2010-45452出願人：国立大学法人埼玉大学

発明者：幡野 健, 森 祥太, 佐伯 整, 松岡浩司, 照沼大陽

【お問い合わせ先】埼玉大学 総合研究機構地域オープンイノベーションセンター 知的財産・技術移転推進部門

048－858－9106、 FAX 048－858－9120ｅメール coic-chizai@ml.saitama-u.ac.jp