問題1(生物学) - 名古屋大学問題1(生物学) 以下のA、Bの文章を読んで問いに答えよ(問題は2ページある)。 A. 細胞内で起こる代謝の化学反応は酵素により触媒されている。酵素は基質と特異的
酵素の安定性を高める 植物由来因子 - JST酵素の安定性を高める...
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酵素の安定性を高める植物由来因子
福井大学 大学院 工学研究科
生物応用化学専攻 准教授 寺田 聡
繊維工業研究センター 助教 佐久間 紹子
産学官連携本部 研究員 柳原 佳奈
2010年 8月 4日 新技術説明会 (科学技術振興機構)
背景
生体で起こる化学反応に対して触媒として機能する分子
特定の分子にしか触媒作用をもたないタンパク質
酵素
食品分野、化学工業分野、医薬分野、研究分野など多岐にわたる分野に応用
産業分野
240億円
食品加工
洗剤
飼料
燃料エタノール
繊維/皮革
医薬・
研究分野
160億円
医薬原体
研究・その他
診断薬
400億円
産業酵素の応用技術と最新動向(2009年 シーエムシー出版)
≪食品・日用品加工業≫
ビール製造に利用(βアミラーゼ)
→ 大麦を麦芽糖に分解する
味の素製造に利用(グルタミナーゼ)
→ さとうきびの糖蜜をグルタミン酸に分解する
洗剤に添加(プロテアーゼおよびリパーゼ)
→ タンパク質および油汚れを分解する
≪医療・製薬業≫
臨床検査に利用
→ 体内の代謝酵素の存在量の測定により疾病を診断する
バイオセンサーの実用化
→ 酵素の基質特異性と反応性を利用して化学物質を検出する
(例)市販の血糖値測定器(グルコースセンサー)
酵素の利用分野
酵素活性 : 酵素を構成するタンパク質の 立体構造 が深く関与
熱、凍結融解、乾燥、pH変化、
塩濃度、溶媒、他の酵素による作用で
不可逆的に変化
いかに安定な状態に保つか
・溶液状態
・至適温度外 で活性を維持
・長期間
従来の酵素安定化剤 ウシ血清アルブミン (BSA)
公知の感染性病原体の検査・検出しか不可能 = 院内感染の恐れ
品質の良いBSAの大量で安定的な入手が困難 = コスト高
院内感染、コスト高酵素製品
利点
• 溶解性が高い
• 高塩濃度の条件下でも析出しない
• 比較的広いpH域で使用できる
欠点
• 原料(牛血清)由来のプロテアーゼが含まれる
• 血液中の黄色の色素であるビリルビンが混入し、着色や酸化還元反応の阻害が生じる
• ロットによって品質にばらつきがある
• ウシ海面脳症(BSE)や口蹄疫などの人畜共通感染症の懸念がある
酵素液の凍結乾燥過程における、劣化防止に使用
ショ糖(スクロース)、トレハロース
ラッキョウ フルクタン
冷水にも可溶
120℃でも安定
廃棄物の再利用
冷水にも可溶
120℃でも安定
廃棄物の再利用
酵素安定化剤 ラッキョウ フルクタン
ラッキョウフルクタン
フルクタンの特徴・ 分子量 : 6 ~100 kDa・ n : m = 3 : 1・ 高い水溶性水100 mlに40 g以上溶解
・ 沸騰水中でも安定m
CH2OH
HOH2C
CH2OH
H2C O
CH2
HO
HO
OO
HO
HO
O
O
HOHO
OH
OO
OH
HO
HOH2C
CH2
n
b-2,6 bond
b-2,1 bond
期待される効果
医療・研究用酵素の市場は約160 億円
これら酵素の50%にBSAが使用されていると仮定した場合、
その半数に代替できれば、40億円の市場
医療・研究用酵素の市場は約160 億円
これら酵素の50%にBSAが使用されていると仮定した場合、
その半数に代替できれば、40億円の市場
現行品である
BSAの代替
市場の拡大
人畜共通感染症の懸念の払しょく
品質の安定化
供給の安定化
コスト削減
近年需要が拡大している、バイオエタノールや
洗剤といった産業用酵素にも利用できる可能性
近年需要が拡大している、バイオエタノールや
洗剤といった産業用酵素にも利用できる可能性
産業用酵素分野への展開
これまでに得られた研究成果の紹介
フルクタンの酵素安定化能の評価
高温加熱後の残存活性
溶液状態、高温(至適温度+10℃以上)で
静置した後の酵素の活性を測定
DNAポリメラーゼ(PCR反応に用いる酵素)
ペルオキシダーゼ(ELISAの呈色反応に用いる酵素)
目的
実験1
DNAポリメラーゼ
PCR反応に用いる酵素
PCR法とはPCR(polymerase chain reaction)とは、ポリメラーゼ
連鎖反応の略称である。DNAを増幅するための手法であ
る。次のような長所を持つことから、遺伝子型の判定や
ウイルス感染の有無を評価するといった、臨床での診断
に広く利用されている。
・ ヒトのゲノム(30億塩基対)のような非常に長大な
DNA分子の中から、自分の望んだ特定のDNA断片(数百か
ら数千塩基対)だけを選択的に増幅させることができる。
しかも極めて微量なDNA溶液で目的を達成できる。
・増幅に要する時間が2時間程度と短い。
・プロセスが単純で、全自動の卓上用装置で増幅できる。
フルクタンのDNAポリメラーゼに対する安定化能
加熱時間条件 : 85℃、30min
フルクタン濃度 : 0、0.05、0.10、0.20、0.50% (in DEPC処理水)
cDNA : HepG2から抽出したもの
検出遺伝子 : ハウスキーピング遺伝子のACTB(β-actin)
プライマープローブ : TaqMan®Gene Expression Assays
ACTB gene (Applied Biosystems)
リアルタイムPCR装置 : Light Cycler®480 (Roche)
step1
• 各濃度のフルクタン水溶液を調製
• DNAポリメラーゼ(5units/μL)と混合
step2
• 酵素‐フルクタン
水溶液を85℃で
30分加熱
step3
• PCR反応液を調製
• リアルタイムPCR
フルクタンのDNAポリメラーゼに対する安定化能
サイクル数
Intensity
0.2%フルクタンで加熱未処理と同等の活性を維持
フルクタンのDNAポリメラーゼに対する安定化能
フルクタン含有でも Ct値に影響なし
加熱処理(85℃、30分)加熱未処理
フルクタン濃度
0% 0.05% 0.1% 0.2% 0.5% 0%
最大 Intensity(39サイクル)
11.8 27.1 31.5 32.8 30.3 33.0
残存活性(%)(加熱/未処理)
35.7 82.2 95.6 99.4 91.7 -
平均Ct値 20.21 20.83 20.92 20.95 20.63 21.12
標準偏差 0.11 0.02 0.02 0.02 0.02 0.04
実験2
ペルオキシダーゼ
ELISAの呈色反応に用いる酵素
ELISAELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) は、試
料中に含まれる抗体あるいは抗原の濃度を検出・定量する際に用いられる方法である。生体試料中には、種々雑多なタンパク質が存在するた
め、特定のタンパク質を検出・定量するには、特に他のタンパク質と比べて微量にしか存在しない場合が多く、特異性の高さ(夾雑物からどれだけ正確に区別できるか)と定量性の良さ(微量であっても検出できる、あるいは低濃度における再現性の良さ)が求めらる。ELISAは特異性の高い抗原抗体反応を利用し、酵素反応に基づく発色・発光をシグナルに用いることで上記の条件をクリアしている。感染の有無やアレルギーなど、医療分野で診断として
広く利用されている。
加熱時間条件 : 60℃、10min
フルクタン濃度 : 0、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、 1、2%
(in リン酸緩衝液)
コントロールサンプル: BSA、イヌリン、レバン、トレハロース、フルクトース
(0.2、2%)
基質 : o-フェニレンジアミン+30%過酸化水素
反応緩衝液: リン酸クエン酸緩衝液
step1
• 各濃度のフルクタン溶液を調製
• ペルオキシダーゼ(0.8μg/mL)と混合
step2
• 酵素‐フルクタン溶液を 60℃で10分加熱
step3
• 基質と混合
• プレートリーダーで
カイネティック測定
フルクタン濃度(%)
0 0.01 0.02 0.05 0.1 0.50.2 1 2
残存相対活性(%)
(加熱/非加熱)
残存活性(%)(加熱/未処理)
70.9 85.3 93.7 88.9 96.8 102.2 93.1 93.3 99.9
フルクタン含有で、加熱後も活性を維持
残存相対活性(%)
(加熱/非加熱)
BSA、トレハロースよりも高い活性維持効果
2% 0.2% 2% 0.2% 2% 0.2% 2% 0.2% 2% 0.2% 2%
フルクタン イヌリン レバン トレハロース フルクトース BSA PBS
残存活性(%)
(加熱/未処理)
95.2 89.1 49.0 46.0 81.2 82.2 60.4 85.1 17.3 32.8 89.9 85.9
今後の展開
1.多様な酵素に対する保護効果を実証
これまでに系統的な分類の違う2種類の酵素について
保護効果を確認、より多様な酵素に対して実証
2.長期保存に対する保護効果を検証
酵素保護剤として最も期待されている、長期間にわたる
保護効果を実証
3.分画し、保護剤として最も有効な分子構造を探索
将来的に一層の展開をはかるべく、分画を検討
本技術に関する知的財産権
• 発明名称 :酵素安定化剤
• 出願番号 :特願2010‐029438
• 出願人 :福井大学、福井県
• 発明者 :寺田 聡、 佐久間紹子、
柳原佳奈、竹下悟史、
小林恭一、大浦 剛
産学連携の経歴
絹タンパク質セリシンに関して• 2002年‐2010年
セーレン社と共同研究実施• 2007年‐2009年
JST育成事業に採択• 2009年
セリシンGIT培地(日本製薬)の市販
ラッキョウ多糖フルクタンに関して• 2009年‐2011年
農水省 新しい農業政策事業に採択
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生物応用化学専攻
准教授 寺田 聡
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