2ABS 分子生物学08

1

135

遺伝子研究のための基礎DNAの性質

2ABS 遺伝生化学08

136

DNAの性質

+エタノールC2H5OH

DNAが水に溶ける水和の状態

水和殻

疎水性高まる↓

水和殻壊れる↓

DNAが水に溶けていられない

↓DNAが凝集

↓沈殿

水 水

反発

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--------

塩の効果--------

--------

（ー）電荷 （＋）イオン塩で中和

エタ沈

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近づける

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137

DNAの性質

138

ベクター（vector)

組換えDNA実験のために改良した plasmid, phage 等様々な遺伝子や DNA 断片の運び屋

•複製開始点をもつ

•選択マーカーをもつ

•薬剤耐性遺伝子

•アンピシリン ampicillin (原核生物用）

•テトラサイクリン tetracycline （原核生物用）

•クロラムフェニコール chloramphenicol （原核生物用）

•オーレオバシジン aureobasidin （原核・真核生物用）

•ハイグロマイシン hygromycin （原核・真核生物用）

など

•栄養要求性遺伝子

•LEU2, HIS2, URA3, ADE2 (酵母) など

•様々な制限酵素の切断部位をまとめた部位Multi-cloning site, Multiple cloning site, polycloning site

139

プラスミド (Plasmid)

host（宿主）

ゲノム DNAE. coli 4639 kb

plasmid2〜10 kb

ゲノム DNA (genomic DNA) 以外の環状DNADNA 複製は、genomic DNAと同調していないDNA 複製開始点 (ori) を持つコピー数: 1〜2 (single copy), 100〜1000 (multi copy)接合型遺伝子や薬剤耐性遺伝子をもつ

140

プラスミドベクター

multiple cloning siteマルチクローニングサイト

lacZ geneβ-galactosidase

複製開始点

Ampicillin resistant gene（アンピシリン耐性遺伝子）

(β-lactamase)

multiple cloning site

2ABS 分子生物学08

2

141

Plasmid の構造

CCCcovalently closed circular dsDNA

OCopen circular dsDNA

linear dsDNA

ssDNA��(nick)

dsDNA���

負の超らせんをもつ閉環状二本鎖 DNA

開環状二本鎖 DNA

直鎖状二本鎖 DNA 142

plasmidの形状と別名

form I DNA (CCC)

負の超らせんをもつ閉環状二本鎖 DNA

negatively supercoiled dsDNA

form II DNA (OC)

nicked circular

open circularform III DNA

(Linear)

form IV DNA

超らせんを持たない閉環状二本鎖DNA

143

環状DNAのトポロジーLinking number(超らせんの程度を表す指標）

右巻き超らせん

負（ー）の超らせん

negative supercoil

左巻き超らせん

正（+）の超らせん

positive supercoil

Linking number: LkTwisting number: Tw

(二重らせんの数）

Writhing number: Wr

（超らせんの数）

Lk = Tw + Wr

Twisting number: Tw

二重らせんは約10 bpで1回転

2700 bp plasmidなら

Tw = 270

-1

Writhing number: Wr

-2

-3

+1

+2

+3

1回

144

超らせんとLinking number

plasmid 2700 bp負の超らせん 50回

Tw = 270Wr = -50

Lk = 220

Topoisomerase

plasmid 2700 bp負の超らせん 0回

Tw = 270Wr = 0

Lk = 270

DNA複製or転写

Tw = 220Wr = 0

Lk = 220

2700 bp二重らせん減少負の超らせん 0回

plasmid 2700 bp正の超らせん 20回

Tw = 200Wr = +20

Lk = 220

さらに進行

145

TopoisomeraseトポイソメラーゼはLkを変える

Type ITopoisomerase

右巻き超らせん

負（-）の超らせん

negative supercoil

左巻き超らせん

正（+）の超らせん

positive supercoil

Gyrase（ATP必要）Type IITopoisomerase

Type ITopoisomerase（真核生物由来のみ）

Reverse Gyrase（ATP必要）Type IITopoisomerase

トポイソメラーゼは切断再結合によりLkを変化させる。

DNAが切断されない限りLkは変化しない

form IV DNA

超らせんを持たない閉環状二本鎖DNA

146

エチジウムブロマイド (EtBr) は超らせん構造を変えるがLkは変えない

EtBr

EtBr EtBr

EtBrは塩基と塩基の間にIntercalation して12°巻き戻し (untwisting)

30分子のEtBrで1回転 untwisting

negative positiverelax

Tw = 270Wr = -50Lk = 220

Tw = 220Wr = 0Lk = 220

Tw = 190Wr = +30Lk = 220

2ABS 分子生物学08

3

147

超らせんDNAはエチジウムブロマイド (EtBr) の濃度により電気泳動の移動度が変化する

ccc(form I)

oc(form II)

EtBr 多無無 少

well