学 位 論 文 2011 年

― 196 ―

論 文 内 容 の 要 旨

氏 名

学 位 記 番 号

学位記授与の日付

学 位 論 文 題 目

学 位論文

岩　澤　俊一郎

千大院医薬博甲第医 680 号

2011 年 3 月 25 日

Upregulation of thioredoxin reductase 1 in human oral squamous cell carcinoma

（ヒト口腔扁平上皮癌におけるThioredoxin reductase 1の高発現）

【目的】外科的治療の進歩により、口腔扁平上皮癌の治療成績向上が得られている。しかし、切除不能例も多く存在し、抗がん薬に低感受性であることから、その予後は未だ不良である。腫瘍増大に関与し、治療標的となり得る新たな分子を見出すことを目的として、分子生物学的検討を行った。

【方法】口腔扁平上皮癌症例の腫瘍組織および対照の正常口腔粘膜について、DNA マイクロアレイ解析およびnetwork 解析を行い、腫瘍増殖に関与する高発現遺伝子の選び出しを行った。また、定量的RT-PCRによりmRNA の発現を細胞株，切除検体について検討した。さらに、切除組織の免疫組織化学的評価と、臨床指標との関連性について比較検討を行うこととした。

【結果】DNA マイクロアレイ解析では、131遺伝子の高発現が示され、network 解析によって腫瘍関連遺伝子によるnetwork が見出された。この中で、Thioredoxin reductase(TrxR1) に着目し、細胞株および切除検体におけるmRNA の有意な高発現を確認した。50例の切除組織での免疫組織化学染色による検討では、所属リンパ節転移，臨床病期との有意な相関関係が示され、TrxR1の腫瘍進展への関与が示唆された。

【結論】TrxR1は、様々な酸化ストレスによって生じるapotosis の回避に関与しており、多くの癌腫における高発現と腫瘍増殖との関連が示され、治療標的分子としての臨床研究が行われている。本研究は、口腔扁平上皮癌におけるTrxR1の項発現と腫瘍進展との相関が初めて示されたものであり、新たな治療標的分子となる可能性が示唆された。

― 197 ―

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氏 名

学 位 記 番 号

学位記授与の日付

学 位 論 文 題 目

学 位論文

論 文 内 容 の 要 旨

【背景、目的】悪性胸膜中皮腫は、極めて難治のがんであり新規治療法が求められている。癌原遺伝子c-myc は胸膜中皮腫を含めた種々のがん腫で発現増大している。一方、c-myc 遺伝子の発現抑制は細胞にapoptosis を誘導することからc-myc 転写抑制因子FIR (FUSE-binding protein- interacting repressor) を用いた悪性胸膜中皮腫の新規治療が期待できる。そこで本邦に特許を持つ非伝播型（F 因子を欠損させた）FIR センダイウイルス（以下SeV/ ΔF/FIR）を用いた悪性中皮腫に対する遺伝子治療の可能性を、シスプラチンや他の抗がん剤との併用療法を含めて検討した。

【方法】3種類のヒト悪性中皮腫細胞株（211H, H2452, H226）を用いてSeV/ ΔF/FIR の細胞傷害活性（MTS 法による）と、感染後の蛋白発現をwestern blotting 法で評価した。また胸腔内担がんマウスにSeV/ ΔF/FIR およびシスプラチンを投与し、抗腫瘍効果（相乗・相加効果）も検討し、副作用の評価のために、マウスの末梢血を用いて生化学的な検討を行なった。

【結果】SeV/ ΔF/FIR は検討した悪性胸膜細胞株全てにおいて細胞傷害性を示した。細胞株の検討でSeV/ ΔF/FIR の感染後にFIR の発現とc-Myc の抑制を認め、caspase-3, -9の活性化によるapoptosis が生じていることを確認した。さらにSeV/ ΔF/FIR は、シスプラチンとの併用療法においてはin vitro, in vivoともに有意な抗腫瘍効果を認め、isobologram において統計学的に相乗効果を示した。

【考察】悪性胸膜中皮腫（211H）において、SeV/ ΔF/FIR はc-Myc 抑制を介したapoptosis が一因となり細胞死の誘導がもたらされると考えられた。

【結論】SeV/ ΔF/FIR とシスプラチンとの併用は動物モデルにおいては相乗効果を示し、有効な治療方法のない悪性胸膜中皮腫に対する新規の治療法として期待できる。

北　村　淳　史

千大院医薬博甲第医薬 54 号

2012 年 3 月 27 日

Synergistic effects of non-transmissible Sendai virus vector encoding the c-myc suppressor FUSE-binding protein-interacting repressor plus cisplatin in treatment of malignant pleural mesothelioma

（c-myc 転写抑制因子 FUSE-binding protein-interacting repressor 非伝播型センダイウイルスとシスプラチン併用療法はマウス悪性胸膜中皮腫モデルに対し相乗効果を示す）

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Synergistic effect of non-transmissible Sendai virusvector encoding the c-myc suppressor FUSE-bindingprotein-interacting repressor plus cisplatin in thetreatment of malignant pleural mesotheliomaAtsushi Kitamura,1,2 Kazuyuki Matsushita,2,12 Yuichi Takiguchi,3 Hideaki Shimada,4 Yuji Tada,1 Makako Yamanaka,1

Kenzo Hiroshima,5 Masatoshi Tagawa,6 Takeshi Tomonaga,7 Hisahiro Matsubara,8 Makoto Inoue,9

Mamoru Hasegawa,9 Yasunori Sato,10 David Levens,11 Koichiro Tatsumi1 and Fumio Nomura2

Departments of 1Respirology, 2Molecular Diagnosis, 3Chemotherapy, Graduate School of Medicine, Chiba University, Chiba; 4Department of Surgery, Schoolof Medicine, Toho University, Tokyo; 5Department of Pathology, Tokyo Women’s Medical University, Yachiyo Medical Center, Yachiyo; 6Division ofPathology and Cell Therapy, Chiba Cancer Center, Chiba; 7Proteome Research Center, Proteome Research Project, National Institute of BiomedicalInnovation, Ibaraki; 8Department of Frontier Surgery, Graduate School of Medicine, Chiba University, Chiba; 9DNAVEC Corporations, Tsukuba; 10ClinicalResearch Center, Chiba University Hospital, Chiba, Japan; 11Laboratory of Pathology, National Cancer Institute, Bethesda, Maryland, USA

(Received February 8, 2011 ⁄ Revised March 6, 2011 ⁄ Accepted March 13, 2011 ⁄ Accepted manuscript online March 25, 2011 ⁄ Article first published online May 9, 2011)

Human malignant pleural mesothelioma (HMPM) is highly resis-tant to conventional therapy, and therefore novel therapies arerequired. We previously reported that overexpression of the FUSE-binding protein-interacting repressor (FIR), a c-myc transcriptionalrepressor, induces apoptosis via c-Myc suppression, and is thus asuitable cancer therapy. In the current preclinical trial, a fusiongene deleted non-transmissible Sendai virus vector encoding FIR(SeV ⁄DF ⁄ FIR) was prepared and its cytotoxic activity against anorthotopic xenograft model of HMPM, in combination withcisplatin, was assessed. SeV ⁄DF ⁄ FIR and a fusion gene deletednon-transmissible Sendai virus vector encoding green fluorescentprotein (SeV ⁄DF ⁄GFP) were prepared. The transduction efficiencyof these agents in terms of dose-dependent cytotoxicity and ⁄orapoptosis induction was then assessed in a few HMPM cells. Com-bination therapy with SeV ⁄DF ⁄ FIR plus cisplatin was evaluatedin vitro and in a mouse model. SeV ⁄DF ⁄ FIR significantly reducedcell viability in three HMPM cell lines but was less effective in non-tumor immortalized mesothelial cells. SeV ⁄DF ⁄ FIR cytotoxicity waspartly due to apoptosis induction via c-Myc suppression. In addi-tion, SeV ⁄DF ⁄ FIR showed synergistic antitumor effects in combina-tion with cisplatin, as was revealed by isobologram analysis inMSTO-211H. Moreover, combination therapy with SeV ⁄DF ⁄ FIR pluscisplatin demonstrated significant tumor reduction and improve-ment in survival rate in an animal model. Combination therapywith SeV ⁄DF ⁄ FIR plus cisplatin has therapeutic potential againstHMPM. SeV ⁄DF ⁄ FIR plus cisplatin will be an attractive modalityagainst HMPM in the future. (Cancer Sci 2011; 102: 1366–1373)

H uman malignant pleural mesothelioma (HMPM), whichcommonly originates from mesothelial cells lining the

pleural cavity, is an aggressive tumor that is difficult to treat.(1)

The number of HMPM patients is predicted to increase becauseof the long latency of the disease and historical exposure toasbestos.(2) To date, standard therapies against HMPM are sur-gery, chemotherapy and ⁄or radiation, but all are unsatisfactory(median survival, 6–12 months).(3) Gene therapy has been con-sidered for HMPM treatment because of easy accessibility to theintrapleural cavity.(4,5) For example, intrapleural delivery of rep-lication-deficient adenoviral vectors expressing the suicide geneherpes simplex thymidine kinase followed by the administrationof ganciclovir was reported as an antiviral therapy.(6)

Safe and highly efficient transduction of viral vectors isrequired for the success of gene therapies. The Sendai virus(SeV) is a candidate vector for this purpose; it is a member of

the Paramyxoviridae family with a non-segmented negative-strand RNA genome, and it infects targets via sialic acid resi-dues through glycoproteins or asialoglycoproteins, which arepresent on the cell surface of most mammalian cells.(7,8) Fusionprotein is necessary for SeV transmission and SeV is relativelysafe because it replicates only in the cytoplasm and is not incor-porated into the host cell’s genomic DNA.(9)

Elevated c-Myc expression has been detected in a broad rangeof human cancers, indicating its key role in tumor develop-ment.(10) Human malignant pleural mesothelioma also showselevated c-Myc expression.(11) Previous reports have indicatedthat the FUSE-binding protein-interacting repressor (FIR)strongly represses c-myc transcription by inhibiting TFIIH (P89)DNA helicase activity(12) and induces apoptosis;(13) thus, theFIR expression vector is a potential candidate for cancer genetherapy.(14) In the current preclinical study, a fusion genedeleted non-transmissible Sendai virus vector encoding FIR(SeV ⁄DF ⁄FIR) was prepared and its efficacy against HMPMwas determined. Specifically, the cytotoxic activity of SeV ⁄DF ⁄FIR against HMPM in vitro and in vivo was explored; wealso determined its therapeutic feasibility with and withoutcisplatin.

Materials and Methods

Cell lines and culture conditions. Three HMPM cell lines,MSTO-211H (211H), H2452 and H226, and a non-tumorigenicmesothelial cell line, Met5A, were purchased from AmericanType Culture Collection (Manassas, VA, USA). Cells weregrown in RPMI 1640, supplemented with 10% fetal bovineserum (FBS), 1% (v ⁄v) penicillin and streptomycin (100 U ⁄mL;Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), and grown in a humidifiedatmosphere containing 5% CO2 at 37�C.

Preparation of non-transmissible recombinant Sendai virusvectors. A fusion gene deleted non-transmissible Sendai virusvector encoding green fluorescent protein (SeV ⁄DF ⁄GFP) wasprepared as previously described.(15) SeV ⁄DF ⁄FIR was preparedaccording to the same procedure. In brief, human FIR cDNAwas amplified with a pair of NotI site-tagged primers containingSeV-specific transcriptional regulatory signal sequences (end

12To whom correspondence should be addressed.E-mail: kmatsu@faculty.chiba-u.jp

Cancer Sci | July 2011 | vol. 102 | no. 7 | 1366–1373 doi: 10.1111/j.1349-7006.2011.01931.xªª 2011 Japanese Cancer Association

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論 文 内 容 の 要 旨

氏 名

学 位 記 番 号

学位記授与の日付

学 位 論 文 題 目

学 位論文

【目的】慢性血栓塞栓性肺高血圧症（chronic thromboembolic pulmonary hypertension ; CTEPH）は、主症状が息切れや動悸など非特異的であり診断が遅れがちである。また診断に胸部造影 CT、肺換気・血流シンチグラフィー、右心カテーテル、肺動脈造影などを要し、侵襲やコストが大きい。本研究では、血清のプロテオミクス解析を行うことで、診断マーカーにつながるペプチドを検索することにした。

【方法】CTEPH 患者血清 34 例および年齢・性別を一致させた健常者血清 34 例を、無作為に discovery set 9例および validation set 25 例に分けた。Validation set には、更に 20 例の他疾患患者血清を加えた。Matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) を用いて discovery set の peptide profile を解析し、患者・健常者血清間で差を認めたピークに関し validation set を用いて再現性を確認した。診断候補となりうるピークを選択し MALDI-TOF/TOF MS を用いて同定後、同定されたペプチドの安定同位体を作成し絶対定量を行った。更に定量を行ったペプチドの血清中濃度と様々な患者背景との相関を検討した。

【結果】Training set で差を認めた14ピークのうち、validation set でも再現性が確認されたのは4ピークであった。4ピークのROC 解析を行い、最もAUCの高かったm/z 2989を同定したところ、fibrinogen Aα鎖の断片であった。Fibrinogen Aα鎖断片の安定同位体を用いて行った絶対定量では、健常群および他疾患患者群と比較し、CTEPH 群において有意に高値を示した。血清中fibrinogen Aα鎖断片の濃度と患者背景との比較では、患者血中のPIC と正の相関の傾向(p=0.073)、およびTAT と負の相関(p=0.031) を認めた。

【結論】CTEPH 患者血清において fibrinogen Aα鎖断片の上昇を認めた。これはCTEPHの診断において、有望な biomarker となりうる。

矢　野　利　章

千大院医薬博甲第医 694 号

2011 年 3 月 25 日

Serum fibrinogen Aα fragment increases in chronic thromboembolic pulmonary hypertension

（慢性血栓塞栓性肺高血圧症患者血清においてfibriongen Aα鎖断片が上昇している）

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論 文 内 容 の 要 旨

氏 名

学 位 記 番 号

学位記授与の日付

学 位 論 文 題 目

学 位論文

【目的】肺動脈性肺高血圧症は肺動脈圧の上昇と右心不全を特徴とする難治性の疾患である。いくつかの肺高血圧実験モデルにおいて Rho/Rho キナーゼシグナルの増強と Rho キナーゼ阻害薬の効果が示されているが、骨形成因子 2 型受容体（BMPRII）変異による肺高血圧に対する効果は示されていないため検討する。

【方法】テトラサイクリン遺伝子発現制御システムを用いて、平滑筋特異的に変異型 BMPRII を発現するトランスジェニックマウスを準備した。変異は細胞質側末端領域のナンセンス置換（R899X）を用いた。右心カテーテル、組織学的検査により肺高血圧の評価を行い、また Rho/Rho キナーゼシグナルの変化および Rho キナーゼ阻害薬（ファスジル）の効果を検討した。

【結果】野生型マウスと比べて、トランスジェニックマウスでは右心室圧上昇、右心室肥大、細小肺動脈筋性化、肺血流障害を認めた。またウエスタンブロット法にて Rho キナーゼ活性の亢進を認めたが、BMPRII の下流シグナルである Smad 経路には変化が認められなかった。Rho キナーゼ阻害薬は右心室圧、右心室肥大、細小肺動脈筋性化、肺血流障害を改善させ、Rho キナーゼ活性を低下させたが、Smad 経路には変化が認められなかった。

【考察】BMPRII 細胞質側末端領域の変異による肺高血圧実験モデルにおいて、Rho/Rho キナーゼシグナルの活性化が認められた。Smad 経路には変化が認められなかったため、Rho/Rho キナーゼシグナル活性化の機序として Smad 非依存経路による活性化が考えられた。また Rho キナーゼ阻害薬は BMPRII 遺伝子変異による肺高血圧に対しても有効であると考えられた。

安　田　直　史

千大院医薬博甲第医 677 号

2011 年 3 月 25 日

Rho-kinase inhibition alleviates pulmonary hypertension in transgenic mice expressing a dominant-negative BMPRII gene

（Rho キナーゼ阻害薬は優性阻害型 BMPRII 発現マウスの肺高血圧を改善する）

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Rho-kinase inhibition alleviates pulmonary hypertension in transgenic miceexpressing a dominant-negative type II bone morphogenetic protein receptorgene

Tadashi Yasuda,1 Yuji Tada,1 Nobuhiro Tanabe,1 Koichiro Tatsumi,1 and James West2

1Department of Respirology, Graduate School of Medicine, Chiba University, Chiba, Japan; and 2Division of Allergy,Pulmonary, and Critical Care Medicine, Vanderbilt University Nashville, Tennessee

Submitted 23 November 2010; accepted in final form 15 August 2011

Yasuda T, Tada Y, Tanabe N, Tatsumi K, West J. Rho-kinaseinhibition alleviates pulmonary hypertension in transgenic mice express-ing a dominant-negative type II bone morphogenetic protein receptorgene. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 301: L667–L674, 2011. Firstpublished August 19, 2011; doi:10.1152/ajplung.00423.2010.—Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a life-threatening diseasecharacterized by a sustained elevation in the pulmonary artery pres-sure and subsequent right heart failure. The activation of Rho/Rho-kinase activity and the beneficial effect of Rho-kinase inhibition havebeen demonstrated in several experimental models of pulmonaryhypertension. However, it remains unclear whether Rho-kinase inhib-itors can also be used against pulmonary hypertension associated withmutations in the type II bone morphogenetic protein receptor (BMPRII)gene. Transgenic mice expressing a dominant-negative BMPRII gene(with an arginine to termination mutation at amino acid 899) insmooth muscle by a tetracycline-gene switch system (SM22-tet-BMPR2R899X mice) were examined. They developed an elevated rightventricular systolic pressure (RVSP), right ventricular (RV) hypertro-phy, muscularization of small pulmonary arteries, and an associateddisturbed blood flow in their lungs. The Rho/Rho-kinase activity andSmad activity were determined by a Western blot analysis by detect-ing GTP-RhoA and the phosphorylation of myosin phosphatase targetsubunit 1, Smad1, and Smad2. In the lungs of SM22-tet-BMPR2R899X

mice, the Rho/Rho-kinase activity was elevated significantly, whereasthe Smad activity was almost unchanged. Fasudil, a Rho-kinaseinhibitor, significantly decreased RVSP, alleviated RV hypertrophyand muscularization of small pulmonary arteries, and improved bloodflow in SM22-tet-BMPR2R899X mice, although it did not alter Smadsignaling. Our study demonstrates that Rho/Rho-kinase signaling isactivated via a Smad-independent pathway in an animal model ofpulmonary hypertension with a BMPRII mutation in the cytoplasmictail domain. Rho-kinase inhibition is therefore a possible therapeuticapproach for the treatment of PAH associated with genetic mutation.

pulmonary circulation; Rho-kinase inhibitor; bone morphogeneticprotein signaling

PULMONARY ARTERIAL HYPERTENSION (PAH) is clinically charac-terized by a sustained elevation in the mean pulmonary arterypressure and subsequent right heart failure leading to signifi-cant morbidity and mortality. The histological features of PAHreveal a proliferation of endothelial and smooth muscle cellswith vascular remodeling. PAH is usually fatal within threeyears if untreated. Whereas new therapeutic approaches haveprolonged patient survival, the prognosis remains far fromsatisfactory.

At least 6% of all PAH cases are familial (FPAH) (26), andthe causative gene for FPAH was identified as BMPR2, whichencodes a type II bone morphogenetic protein receptor belong-ing to the transforming growth factor-� (TGF-�) superfamily,which plays a critical role in cell differentiation and cell growth(5, 9). Because only 10–20% of subjects with a BMPR2mutation develop PAH, it is believed that other genes, geneticpolymorphisms, or environmental factors are involved in thedevelopment of pulmonary hypertension (PH).

We previously reported that transgenic mice expressing adominant-negative type II bone morphogenetic protein recep-tor (BMPRII) in smooth muscle show the phenotype of severePH and right ventricular hypertrophy in the absence of otherstimuli (31). We also demonstrated pulmonary vascularchanges resembling the plexiform lesion and dysregulationof gene expression in mice expressing a dominant-negativeBMPRII with a stop mutation in the cytoplasmic tail domain(BMPR2R899X) (32).

Rho-kinase is one of the downstream effectors of the smallG protein Rho, which regulates gene transcription, cell differ-entiation, proliferation, migration, and smooth muscle contrac-tion (11, 14, 18, 24). It is also known that Rho/Rho-kinasesignaling is a major regulator of vascular tone (25); this is truein the pulmonary circulation as well (30). Rho-kinase inhibi-tion has shown beneficial effects in treatment of hypoxia-induced or monocrotaline-induced PH (1, 2, 6, 21). We wantedto determine whether the administration of the Rho-kinaseinhibitor fasudil may also be effective against PH in cases witha mutation in the BMPRII gene.

MATERIALS AND METHODS

All procedures in the present study were approved by the ChibaUniversity Institutional Animal Care and Use Committee.

Transgenic mice. The expression of a dominant-negative BMPRIIgene was controlled by a tetracycline-gene switch system because ofthe necessity of bone morphogenetic protein (BMP) signaling in theearly development of embryos. TetO7-BMPR2R899X transgenic micewere generated as previously described (32). R899X is an arginine totermination mutation at amino acid 899 in the BMPRII tail domainfound in family US33 (9), thus leaving the Smad pathway intact. Toinduce the expression of BMPR2R899X in smooth muscle, we crossedTetO7-BMPR2R899X mice to SM22-reverse tetracycline transcrip-tional activator (rtTA) transgenic mice with smooth muscle-specificexpression of the rtTA. Both transgenic mice were on the FVB/Nbackground. Double-transgenic mice, SM22-tet-BMPR2R899X mice,were generated and used for all experiments.

Experimental design. Double-transgenic mice were divided intotwo groups. One group was fed doxycycline in their chow (1 g/kg)from 3 wk after birth. The other group was fed doxycycline in theirchow from 3 wk and were treated with fasudil (Asahi Kasei Pharma,

Address for reprint requests and other correspondence: Y. Tada, Dept. ofRespirology (B2), Graduate School of Medicine, Chiba Univ., 1-8-1 Inohana,Chuo-ku, Chiba 260-8670, Japan (e-mail: ytada25@yahoo.co.jp).

Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 301: L667–L674, 2011.First published August 19, 2011; doi:10.1152/ajplung.00423.2010.

1040-0605/11 Copyright © 2011 the American Physiological Societyhttp://www.ajplung.org L667

on January 2, 2012ajplung.physiology.org

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― 204 ―

論 文 内 容 の 要 旨

氏 名

学 位 記 番 号

学位記授与の日付

学 位 論 文 題 目

学 位論文

【目的】特発性肺線維症（IPF）は慢性進行性疾患で、有効な治療法に乏しい予後不良の疾患である。ブレオマイシン (BLM) は IPF の動物実験モデルとして最も利用されている薬物である。一方、CD69 分子は C タイプレクチンファミリーに属する膜分子でリンパ球の早期活性化マーカーとして広く用いられているが、近年、様々な実験モデルにおいて炎症性疾患との関わりが指摘されている。本研究では IPF における CD69 分子の役割を検証する目的で、CD69 ノックアウト（KO）マウスへの BLM投与をおこなった。

【方法】8 週から 10 週齢の雄の野生型マウス及び CD69KO マウスに BLM3mg/kg を PBS にて溶解し気管内投与した。コントロール群には PBS のみを投与した。7 日後に殺処分後、気管支肺胞洗浄液を採取し、さらに肺を凍結保存し RT-PCR に使用した。また 14 日後に肺を採取し病理組織評価、コラーゲン定量に使用した。観察期間中、連日体重を測定した。

【結果】CD69KO マウスは、野生型マウスと比較して有意に体重減少が抑制された。BLM 投与 7 日後の気管支肺胞洗浄液中の白血球数と炎症性サイトカイン（IL-6,MCP-1,TIMP-1,sTNF-R）はKO マウスで有意に低かった。14 日後の肺の線維化とコラーゲン含有量、さらに TGF- β mRNA 量も軽減された。BLM 投与した野生型マウス肺の CD69 免疫染色をおこなったところ多くの肺胞内マクロファージに CD69 発現を認めた。

【考察】CD69KO マウスでは BLM による肺の急性炎症、線維化が軽減された。今後、肺線維症の新規治療法の開発において、CD69 分子が新たなターゲットになる可能性が示された。

山　内　圭　太

千大院医薬博甲第医 765 号

2011 年 9 月 28 日

Attenuation of lung inflammation and fibrosis in CD69–deficient mice after intratracheal bleomycin　( ブレオマイシン肺線維症モデルマウスにおける CD69 分子の役割 )

― 205 ―

RESEARCH Open Access

Attenuation of lung inflammation and fibrosis inCD69-deficient mice after intratracheal bleomycinKeita Yamauchi1, Yoshitoshi Kasuya2, Fuminobu Kuroda1, Kensuke Tanaka1,2, Junichi Tsuyusaki1, Shunsuke Ishizaki1,Hirofumi Matsunaga2,3, Chiaki Iwamura4, Toshinori Nakayama4 and Koichiro Tatsumi1*

Abstract

Background: Cluster of differentiation 69 (CD69), an early activation marker antigen on T and B cells, is alsoexpressed on activated macrophages and neutrophils, suggesting that CD69 may play a role in inflammatorydiseases. To determine the effect of CD69 deficiency on bleomycin(BLM)-induced lung injury, we evaluated theinflammatory response following intratracheal BLM administration and the subsequent fibrotic changes in wild type(WT) and CD69-deficient (CD69-/-) mice.

Methods: The mice received a single dose of 3 mg/kg body weight of BLM and were sacrificed at 7 or 14 dayspost-instillation (dpi). Lung inflammation in the acute phase (7 dpi) was investigated by differential cell counts andcytokine array analyses of bronchoalveolar lavage fluid. In addition, lung fibrotic changes were evaluated at 14 dpiby histopathology and collagen assays. We also used reverse transcription polymerase chain reaction to measurethe mRNA expression level of transforming growth factor b1 (TGF-b1) in the lungs of BLM-treated mice.

Results: CD69-/- mice exhibited less lung damage than WT mice, as shown by reductions in the following indices:(1) loss of body weight, (2) wet/dry ratio of lung, (3) cytokine levels in BALF, (4) histological evidence of lung injury,(5) lung collagen deposition, and (6) TGF-b1 mRNA expression in the lung.

Conclusion: The present study clearly demonstrates that CD69 plays an important role in the progression of lunginjury induced by BLM.

Keywords: cluster of differentiation 69, lung inflammation, pulmonary fibrosis, bleomycin

BackgroundIdiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a chronic interstitialpneumonia of unknown causes and has poor prognosis[1,2]. Patients with IPF could be treated with steroids orimmunosuppressants to ameliorate the inflammation thatoccurs early in the course of the disease, but these drugsdo not improve their survival [3]. Hence, the discovery ofa target that could be useful in the therapeutic interven-tion of IPF is desirable.Bleomycins (BLMs) are a family of glycopeptide anti-

biotics [4] with potent anti-tumor activity against a widerange of lymphomas, head and neck cancers, and germ-cell tumors [5]. However, the therapeutic efficacy of BLMis limited by the development of pulmonary fibrosis in

patients using it [6,7]. BLM-induced pulmonary fibrosisin mice is the most common experimental model ofhuman IPF. In this model, intratracheal administration ofBLM induces acute alveolitis and interstitial inflamma-tion, which are characterized by the recruitment of leu-kocytes within 1 week [8] and pulmonary edema.Subsequently, during the second week, fibrotic responses,such as fibroblast proliferation and synthesis of extracel-lular matrix, occur [9]. Various types of cells, includingmacrophages and neutrophils have been the immunecells primarily implicated as playing potential roles in thedevelopment of pulmonary fibrosis [10].Cluster of differentiation 69 (CD69) is a C-type lectin

expressed as a disulfide-linked homodimeric membraneprotein [11]. The CD69 gene is located within the naturalkiller (NK) gene complex on mouse chromosome 6 andhuman chromosome 12 [12,13]. CD69 was initiallydetected on the surface of activated lymphocytes and is

* Correspondence: tatsumi@faculty.chiba-u.jp1Department of Respirology, Graduate School of Medicine, Chiba University,Chiba, JapanFull list of author information is available at the end of the article

Yamauchi et al. Respiratory Research 2011, 12:131http://respiratory-research.com/content/12/1/131

© 2011 Yamauchi et al; licensee BioMed Central Ltd. This is an Open Access article distributed under the terms of the CreativeCommons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0), which permits unrestricted use, distribution, andreproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

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論 文 内 容 の 要 旨

氏 名

学 位 記 番 号

学位記授与の日付

学 位 論 文 題 目

学 位論文

【目的】CD69 分子はリンパ球の早期活性化マーカーとして知られている。最近 CD69 欠損（KO）マウスが喘息や関節炎に対し抵抗性を示す事が報告された。喫煙は慢性閉塞性肺疾患 (COPD) 発症における最大のリスク要因である。しかし、喫煙による炎症のメカニズムはいまだ不明な点も多い。今回 CD69 分子の喫煙曝露における役割を検討した。

【方法】自動喫煙曝露システム（INH06-CIGR01,M.I.P.S 社）を用い、たばこ (PEACE) を 1 本 / 分の速度で燃焼させ、その煙を室内気で 20 倍に希釈する。C57BL6/J(WT) マウス（8 週齢・雄）及び CD69KO マウス（8 ～ 10週齢・雄）に 5 分×4 回 ( 休憩 15 分 )/日の喫煙曝露を 5 日間施行し、最終曝露 4 時間後に対照群と共に肺・気管支肺胞洗浄液 (BALF) を回収した。喫煙に伴う CD69 の発現をウエスタンブロット法・免疫染色で検討した。また肺の病理組織所見、MPO 活性の評価を行い、BALF 中の細胞分画の評価とウエスタン ブロットアレイにてサイトカイン濃度を測定して喫煙曝露に伴う変化を WT・KO マウス群で比較検討した。

【結果】喫煙曝露に伴い肺胞腔内のマクロファージに CD69 の発現が認められた。また喫煙に伴う肺の炎症性細胞浸潤と BALF 中の総細胞数・好中球数・マクロファージの増加は KO マウス群において有意に抑制され、喫煙により誘導された KC・MCP-1・GM-CSF・sTNF-R1 & -R2 および MPO の発現も KO マウス群において有意に抑制されていた。

【考察】CD69KO マウスでは喫煙曝露による肺の炎症が抑制された。マクロファージ上の CD69 分子が喫煙による肺の炎症に関与し、CD69 分子は COPD の治療において新しい標的分子になる可能性が示唆された。

露　﨑　淳　一

千大院医薬博甲第医 764 号

2011 年 9 月 28 日

Cigarette smoke-induced pulmonary inflammation isattenuated in CD69-deficient mice(CD69 欠損マウスにおいて喫煙曝露による肺の炎症が抑制される )

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論 文 内 容 の 要 旨

氏 名

学 位 記 番 号

学位記授与の日付

学 位 論 文 題 目

学 位論文

永　吉　　　 優

千大院医薬博甲第医 560 号

2010 年 3 月 25 日

Inhalation of Stachybotrys chartarum evokes pulmonary arterial re-modeling in mice, attenuated by ROCK inhibitor

（Stachybotrys chartarum の吸入によりマウスの肺動脈リモデリングが惹起され、ROCK 阻害薬の投与により減弱する）

【目的】Stachybotys chartarum （以下Sc）は居住環境中に生息する黒色真菌である。乳児の特発性肺ヘモジデローシスとの関連が示唆されているが、呼吸器への病原性については未だ不明である。本菌の反復吸入により惹起される肺血管病変の病理学的特徴と、関与する因子につき検討した。

【方法】6週齢雄ddY マウスを用いて、4-12週間（計6-18回）のSc 胞子反復気管内投与を施行した。肺病理組織像につき経時的な観察を行った。気管支肺胞洗浄液（BALF）中の細胞数、白血球分画計測およびELISAを用いた炎症性メディエーターの定量を行った。また、肺高血圧症の治療に有望視されているRho-kinase（ROCK）阻害剤fasudil の長期経口投与を同時に施行し、肺病理組織像の比較検討を行った。

【結果】Sc 胞子反復気管内投与マウス群において、neointima を伴う著明な肺動脈壁肥厚像を認めた。肺動脈周囲に好酸球、好中球を含む炎症性細胞の集蔟を認めたが血管炎はなく、肺実質の炎症は軽微で、気道 リモデリングを認めなかった。BALF 中の好酸球数増加、Th2サイトカイン IL-4、IL-5の有意な増加を 認めたが、Th1サイトカインであるIFN -γの増加は認めなかった。Fasudil 長期経口投与群においては、Sc 胞子投与による肺動脈リモデリングの抑制効果が認められた。4週間のSc 胞子投与終了後8週間経過したマウス群においては、肺動脈リモデリングを認めず、血管病変の可逆性が示唆された。Sc は経時的に排除され、感染の成立は認められなかった。

【結論】Sc 胞子反復吸入によりマウスの肺動脈リモデリングが惹起された。Th2サイトカインを介する慢性炎症の関与が示唆された。多くの肺高血圧動物モデルにおいて関与が示唆されるRhoA/ROCK 経路が、 本モデルの血管病変にも関与する可能性が示唆された。

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