S V E U Č I L I Š T E U Z A G R E B UDR.SC.-01 Prijava teme doktorskog rada

Obrazac je napravljen pomoću sustava OBAD

Dr.Sc.-01 PRIJAVA TEME DOKTORSKOG RADA

OPĆI PODACI I KONTAKT DOKTORANDA/DOKTORANDICE

Titula, ime i prezime

doktoranda/doktorandice:

Mirna Biluš, mag. biol. mol.

Nositelj studija: Sveučilište u Zagrebu, Prirodoslovno-matematički fakultet

Naziv studija: Kemija

Matični broj

doktoranda/doktorandice:

IV-4041-13

Odobravanje teme za

stjecanje doktorata znanosti:

(molimo zacrniti polje):

u okviru doktorskog

studija

na temelju

znanstvenih

dostignuća

dvojni doktorat

(cotutelle)

Ime i prezime majke i/ili oca: Ružica, Miro

Datum i mjesto rođenja: 15.05.1989., Zagreb, Hrvatska

Adresa: Bednjanska 10, Zagreb, Hrvatska

Telefon/mobitel: 0913465700

E-mail: mirna.bilus@gmail.com

ŽIVOTOPIS DOKTORANDA/DOKTORANDICE

Obrazovanje

(kronološki od novijeg k starijem

datumu):

1. Sveučilište u Zagrebu, Prirodoslovno-matematički fakultet, Diplomski studij molekularne

biologije, Diplomski, Hrvatska (2012./2013.)

2. Sveučilište u Zagrebu, Prirodoslovno-matematički fakultet, Preddiplomski studij

molekularne biologije, Preddiplomski, Hrvatska (2010./2011.)

Radno iskustvo

(kronološki od novijeg k starijem

datumu):

2013 - danas: asistent, Zavodu za biokemiju, Kemijski odsjek, PMF

Popis radova i aktivnih

sudjelovanja na znanstvenim

skupovima:

1. Cvetešić, Nevena; Biluš, Mirna; Gruić-Sovulj, Ita.

Interplay between isoleucyl-tRNA synthetase and tRNAIle for optimized amino acid recognition

in translation // 10th International Symposium on Aminoacyl-tRNA Synthetases.

2015. 21-21 (predavanje,sažetak,znanstveni).

2. Šoštarić, Nikolina; Cvetešić, Nevena; Dulić, Morana; Biluš, Mirna; Gruić-Sovulj, Ita.

Significance of the pre-transfer editing pathway in eukaryotic isoleucyl-tRNA synthetase // Book

of abstracts, XXIV CROATIAN MEETING OF CHEMISTS AND CHEMICAL ENGINEERS /

Ukić, Šime ; Bolanča, Tomislav (ur.).

Zagreb, 2015. 175-176 (poster,sažetak,znanstveni).

3. Cvetešić, Nevena; Biluš, Mirna; Palencia, Andres; Dulić, Morana; Cusack, Stephen; Gruić-

Sovulj, Ita.

Class I aaRS quality control mechanisms preserve canonical translation in Escherichia coli //

25th tRNA Conference 2014 Abstract Book / Drainas, Denis ; Stathopoulos Constantinos (ur.).

2014. 63-63 (pozvano predavanje,sažetak,znanstveni).

4. Biluš, Mirna; Gruić-Sovulj, Ita.

IleRS eliminates norvaline from Escherichia coli proteome via pre- and post-transfer editing

pathways // Biomolecular complexes and assemblies / Hozić, Amela ; Vuletić, Tomislav (ur.).

Zagreb, 2014. 56-56 (poster,sažetak,znanstveni).

5. Cvetešić, Nevena; Biluš, Mirna; Gruić-Sovulj, Ita.

The tRNA A76 Hydroxyl Groups Control Partitioning of the tRNA-dependent Pre- and Post-

transfer Editing Pathways in Class I tRNA Synthetase. // The Journal of biological chemistry.

1 / 8

S V E U Č I L I Š T E U Z A G R E B UDR.SC.-01 Prijava teme doktorskog rada

Obrazac je napravljen pomoću sustava OBAD

290 (2015) , 22; 1398-1391 (članak, znanstveni).

6. // The application of transient kinetic methods to biological macromolecules

Canterbury, Ujedinjeno Kraljevstvo, 2015 (Znanstveni skupovi i radionice, Bez priopćenja)

7. Biluš, Mirna; Gruić-Sovulj, Ita

IleRS eliminates norvaline from Escherichia coli proteome via pre- and post-transfer editing

pathways // 12th Greta Pifat Mrzljak International School of Biophysics: Biomolecular

complexes and assemblies

Primošten, Hrvatska, 2014 (Znanstveni skupovi i radionice, Poster)

NASLOV PREDLOŽENE TEME

Hrvatski: Mehanizam diskriminacije prirodnih proteinogenih i neproteinogenih nepripadnih aminokiselina kod

aminoacil-tRNA-sintetaza razreda Ia

Engleski: Mechanism of discrimination of natural proteinogenic and non-proteinogenic amino acids in class Ia

aminoacyl-tRNA synthetases

Naslov na jeziku na kojem će

se pisati rad (ako nije na

hrvatskom ili engleskom):

Područje/polje/grana: Prirodne znanosti / Kemija / Biokemija i medicinska kemija

PREDLOŽENI ILI POTENCIJALNI MENTOR(I)

(navesti drugog mentora ako se radi o interdisciplinarnom istraživanju ili ako postoji neki drugi razlog za višestruko mentorstvo)

Titula, ime i prezime: Ustanova, država: E-Pošta:

Prvi mentor: doc. dr. sc. Ita Gruić

Sovulj

Sveučilište u Zagrebu,

Prirodoslovno-

matematički fakultet,

Hrvatska

gruic@chem.pmf.hr

KOMPETENCIJE MENTORA - popis do pet objavljenih relevantnih radova u posljednjih pet godina

Prvi mentor: 1. Cvetesic N., Palencia A., Halasz I., Cusack S, Gruic-Sovulj I. (2014), The physiological target for

LeuRS translational quality control is norvaline, EMBO J, 33,1639-1653.

2. Cvetesic N., Bilus M., Gruic-Sovulj I. (2015), The tRNA A76 Hydroxyl Groups Control Partitioning

of the tRNA-dependent Pre- and Post-transfer Editing Pathways in Class I tRNA Synthetase,

J Biol Chem 290,13981-13991.

3. Dulic M., Cvetesic N., Perona J.J., Gruic-Sovulj I. (2014), Determinants for tRNA-dependent

pretransfer editing in the synthetic site of isoleucyl-tRNA synthetase, Biochemistry 53, 6189-6198.

4. Perona J.J., Gruic-Sovulj I. (2014), Synthetic and Editing Mechanisms of Aminoacyl-tRNA

Synthetases, Topics in current chemistry 344, 1-42.

5. Cvetesic N., Perona J.J., Gruic-Sovulj I. (2012), Kinetic partitioning between synthetic and editing

pathways in class I aminoacyl-tRNA synthetases occurs at both pre-transfer and post-transfer

hydrolytic steps, J Biol Chem 287, 25381-25394.

2 / 8

S V E U Č I L I Š T E U Z A G R E B UDR.SC.-01 Prijava teme doktorskog rada

Obrazac je napravljen pomoću sustava OBAD

OBRAZLOŽENJE TEME

Sažetak na hrvatskom jeziku:

(maksimalno 1000 znakova s

praznim mjestima)

Aminoacil-tRNA-sintetaze (AARS) kataliziraju vezanje aminokiselina na 3'-kraj tRNA. Reakcija

aminoacilacije odvija se u dva koraka, pri čemu se aminokiselina prvotno aktivira uz pomoć ATP-a

kako bi nastao aminoacil-adenilat, a u drugom koraku se prenosi na tRNA. Uslijed sličnosti pojedinih

aminokiselina, neke AARS mogu misaminoacilirati pripadnu tRNA pogrešnom aminokiselinom, te su s

ciljem smanjenja učestalosti misaminoacilacije razvile mehanizme popravaka vlastitih pogrešaka.

Pokazano je da se popravak može odvijati prije ili nakon prijenosa aminokiseline na tRNA. U ovoj

disertaciji istraživat će se mehanizmi popravka pogreške enzima IleRS i ValRS iz bakterije Escherichia

coli u prisutnosti nepripadnog proteinogenog valina, odnosno treonina te neproteinogenog norvalina.

Pokusi toksičnosti in vivo rasvjetlit će učinak zamjene izoleucina proteinogenom ili neproteinogenom

prirodnom aminokiselinom te pružiti uvid u moguće razloge isključivanja norvalina iz genetskog koda.

Sažetak na engleskom jeziku:

(maksimalno 1000 znakova s

praznim mjestima)

Aminoacyl-tRNA synthetases (AARSs) catalyse binding of amino acids to tRNA's 3'-end.

Aminoacylation reaction occurs in two steps: firstly, amino acid is activated using ATP to form

aminoacyl-adenylate, and in the second step, amino acid is transferred to tRNA. As some amino acids

are similar, AARSs may inadvertently misaminoacylate cognate tRNAs with noncognate amino acids.

These AARSs have developed proofreading to reduce the frequency of misaminoacylation.

Proofreading may occur prior or after amino acid transfer to tRNA. In this dissertation, proofreading by

Escherichia coli IleRS and ValRS will be examined in detail in the presence of noncognate

proteinogenic valine and threonine, respectively, and in the presence of noncognate nonproteinogenic

norvaline. In vivo toxicity assays will elucidate the effect of isoleucine substitution with proteinogenic or

nonproteinogenic natural amino acid and provide insight into reasons of norvaline exclusion from the

genetic code.

Uvod i pregled dosadašnjih istraživanja (preporučeno 7000 znakova s praznim mjestima)

Aminoacil-tRNA-sintetaze (AARS) su enzimi koji kataliziraju povezivanje pripadnih aminokiselina na 3'-kraj molekula tRNA. Reakcija

aminoacilacije se sastoji od dva koraka: aktivacije aminokiseline pri čemu se troši jedna molekula ATP-a i nastaje aminoacil-adenilat, i

prijenosa aktivirane aminokiseline na 3'-kraj pripadne molekule tRNA. Aminoacil-tRNA-sintetaze se prema strukturnim i funkcionalnim

karakteristikama dijele na razred I i II. Tijekom čitavog procesa biosinteze proteina mogu se dogoditi pogreške zbog čega nastali

sintetizirani protein ne mora u potpunosti odgovarati teorijskom proteinu kojeg kodira odgovarajući gen. Prepoznavanje pripadne tRNA

uglavnom ne predstavlja problem za većinu AARS. Kako su molekule tRNA usporedive veličine kao i AARS, veća je i dodirna površina

AARS:tRNA binarnog kompleksa, te mnogobrojne intermolekulske interakcije omogućavaju lakše prepoznavanje pripadne tRNA i AARS.

Međutim, uslijed sličnosti bočnih ogranaka pojedinih aminokiselina, neke AARS mogu aktivirati i prenijeti na tRNA nepripadne

aminokiseline, pri čemu kao konačni produkt nastaje misaminoacilirana tRNA. Pojedine AARS su razvile složene mehanizme popravka

vlastitih pogrešaka u prepoznavanju pripadne aminokiseline kako bi smanjile učestalost pogrešne misaminoacilacije i smanjile razinu

pogreške u biosintezi proteina na razinu koja je prihvatljiva stanici (1 na 1000-10000) (Ling i sur. 2009). Popravak pogreške koji postoji

kod ovih enzima se može podijeliti na popravak pogreške prije prijenosa aktivirane nepripadne aminokiseline i popravak pogreške nakon

prijenosa aktivirane aminokiseline. Popravak pogreške prije prijenosa se može odvijati u odustnosti tRNA (tRNA-neovisan popravak

pogreške prije prijenosa aminokiseline), ali može biti i potpomognut prisustvom tRNA (tRNA-ovisan popravak pogreške prije prijenosa

aminokiseline). Ovaj mehanizam popravka lokaliziran je unutar sintetskog aktivnog mjesta AARS, a odvija se hidrolizom nepripadnog

aminoacil-adenilata pri čemu se oslobađaju aminokiselina i AMP. Popravak pogreške nakon prijenosa aminokiseline odvija se u zasebnoj

30 Ǻ udaljenoj domeni CP1 (eng. connective peptide). Ovom popravku prethodi translokacija misaminoaciliranog 3'-kraja tRNA iz

sintetskog aktivnog mjesta u hidrolitičko mjesto domene CP1. Nakon hidrolize esterske veze misaminoacilirane tRNA, dolazi do

otpuštanja tRNA i slobodne aminokiseline u otopinu (Perona i Gruic-Sovulj 2014).

Norvalin je prirodna nekanonska aminokiselina koja je strukturno slična leucinu, izoleucinu i valinu, a nastaje kao nusprodukt biosinteze

leucina uslijed nespecifičnosti biosintetskih enzima (Umbarger 1978.). Pokazano je da se norvalin u uvjetima uzgoja E. coli sa

smanjenom količinom kisika (mikroaerobni uvjeti) može u citoplazmi nakupiti do milimolarne koncentracije (Soini i sur. 2008.). Norvalin je

neproteinogena aminokiselina, što znači da njegova ugradnja u proteine nije određena genetskim kodom. Međutim, pokazano je da u

3 / 8

S V E U Č I L I Š T E U Z A G R E B UDR.SC.-01 Prijava teme doktorskog rada

Obrazac je napravljen pomoću sustava OBAD

pojedinim uvjetima može doći do ugradnje norvalina u proteom bakterija, i to umjesto leucina (Apostol i sur. 1997, Cvetesic i sur.

neobjavljeni rezultati). Do sada je mehanizam kojim se stanica štiti od zamjene leucina norvalinom detaljno okarakteriziran kod E. coli.

Istraživanja in vitro i in vivo su pokazala da je upravo norvalin, a ne izoleucin kao kanonska proteinogena aminokiselina, najveća prijetnja

točnom dekodiranju leucinskih kodona, te da leucil-tRNA-sintetaza (LeuRS) učinkovito uklanja norvalin kroz popravak pogreške nakon

prijenosa aminokiseline, odnosno hidrolizom norvalilirane tRNA

Leu

(Cvetesic i sur. 2014.). Također je pokazano da su prijašnja

istraživanja prema kojima LeuRS loše diskriminira izoleucin pogrešna zbog korištenja nedovoljno čistog izoleucina koji je sadržavao

tragove pripadnog leucina (Cvetesic i sur. 2014.).

Izoleucil-tRNA-sintetaza (IleRS) je enzim koji katalizira povezivanje izoleucina i pripadne tRNA

Ile

. Poznato je da IleRS može aktivirati

nepripadni valin, obzirom da je strukturno sličan izoleucinu, odnosno manji za metilensku (-CH

2

) skupinu. Izmjereni kinetički parametri

pokazali su da IleRS iz E. coli aktivira valin svega 100 puta slabije nego pripadni izoleucin (Dulic i sur. 2010.). Pokazano je i da IleRS ne

diskriminira pripadni izoleucin i nepripadni valin u koraku prijenosa aminokiseline s aminoacil-adenilata na tRNA jer je koeficijent brzine

prijenosa jednak u prisustvu obje aminokiseline. Obzirom na slabu diskriminaciju u sintetskoj reakciji, E. coli IleRS koristi mehanizme

popravka pogreške kako bi sprječio nakupljanje valil-tRNA

Ile

. E. coli IleRS pritom koristi tRNA-ovisan popravak pogreške prije prijenosa

aminokiseline (do 30 % ukupne hidrolitičke aktivnosti), što čini ovaj enzim za sada jedinstvenim u razredu Ia. Međutim, dominantni i

neophodni oblik popravka je popravak pogreške nakon prijenosa aminokiseline (Dulic i sur. 2010., Dulic i sur. 2014.). Fiziološka važnost

popravka pogreške prije prijenosa aminokiseline još nije razjašnjena.

Valil-tRNA-sintetaza (ValRS) katalizira nastajanje valil-tRNA

Val

. Iz literature je poznato da ValRS uz valin može aktivirati i strukturno slični

treonin. Aktivacija nepripadnog treonina je svega 270 puta lošija, a treonin se zatim s nastalog treonil-adenilata prenosi na tRNA

Val

jednakim koeficijentom brzine prijenosa kao i valin (Dulic i sur. 2010.). Pokazano je da ValRS s ciljem minimizacije greške koristi

popravak pogreške nakon prijenosa aminokiseline.

Do sada nije poznato u kojoj mjeri norvalin predstavlja prijetnju točnosti dekodiranja izoleucinskih ili valinskih kodona, odnosno da li je

norvalin dobar supstrat enzima IleRS i ValRS. Starija istraživanja sugeriraju da IleRS i ValRS mogu aktivirati norvalin i prenijeti ga na

pripadnu tRNA (Bacher i sur. 2005., Loftfield i sur. 1966., Tardif i sur. 2001.), međutim mehanizam diskriminacije nije detaljno istražen.

Nadalje, usporedba toksičnosti kanonske i nekanonske mistranslacije nije nikada napravljena.

Cilj i hipoteze istraživanja (preporučeno 700 znakova s praznim mjestima)

Cilj istraživanja je okarakterizirati i usporediti mehanizme popravka pogreške IleRS i ValRS iz bakterije E. coli u prisutnosti nepripadnih

proteinogenih aminokiselina i neproteinogene aminokiseline norvalin. Također, ustvrdit će se toksičnost norvalina soju E. coli s ugašenim

popravkom pogreške IleRS i usporediti s toksičnošću koju izaziva ugradnja proteinogenog valina umjesto izoleucina u proteine. Ovakav

sustav i istraživanje pružit će vrijedan uvid u razloge isključivanja norvalina iz genetskog koda. Nadalje, obzirom da je nedavno pokazano

da su rezultati istraživanja diskriminacije izoleucina s LeuRS iz E. coli pogrešni zbog korištenja nedovoljno čistog izoleucina te da

norvalin predstavlja glavu prijetnju točnosti dekodiranja leucinskih kodona u bakteriji E. coli, preispitat će se diskriminacija norvalina i

izoleucina kod LeuRS iz Homo sapiens.

Materijal, ispitanici, metodologija i plan istraživanja (preporučeno 6500 znakova s praznim mjestima)

Materijal

U istraživanju će se koristiti ValRS i IleRS iz E. coli te LeuRS iz H. sapiens. Navedeni proteini će se proizvesti u bakteriji E. coli

prekomjernom ekspresijom s ekspresijskih vektora. Svi proteini će se eksprimirati s heksahistidinskim privjeskom na N-kraju proteina.

Pomoću heksahistidinskog privjeska proteini će se pročistiti afinitetnom kromatografijom na Ni-NTA smoli, a po potrebi koristit će se i

druge kromatografske metode poput gel-filtracije ili ionske izmjene. Osim divljih tipova enzima pripremit će se i mutirane varijante

proteina, metodom mutageneze in situ.

Molekule tRNA

Ile

i tRNA

Val

iz E. coli, i tRNA

Leu

iz H. sapiens će se proizvesti prekomjernom ekspresijom u bakteriji E. coli, a po potrebi

metodom transkripcije in vitro. Iz ukupne stanične tRNA prekomjerno eksprimirani izoakceptor pročistit će se metodom kromatografije

obrnutih faza. U mjerenjima reakcije aminoacilacije koristit će se radioaktivno obilježena tRNA. Obilježavanje 3'-kraja radioaktivnim

nukleotidom [α-

32

P]-ATP, provest će se metodom izmjene posljednjeg nukleotida (Wolfson i Uhlenbeck 2002.).

4 / 8

S V E U Č I L I Š T E U Z A G R E B UDR.SC.-01 Prijava teme doktorskog rada

Obrazac je napravljen pomoću sustava OBAD

Izmjena ATP/PP

i

Da bi se pobliže istražio mehanizam reakcije aminoaciliranja, zasebno će se istražiti korak aktivacije aminokiseline, te prijenosa

aminokiseline na tRNA. Prvi korak aminoacilacijske reakcije pratit će se kinetičkim testom ATP/PP

i

. U ovom eksperimentu u reakcijsku

smjesu se dodaje radioaktivno obilježeni pirofosfat (PP

i

) a reakcija se prati putem povratne reakcije u kojoj nastaje radioaktivno obilježeni

ATP. Kako je povratna reakcija pirofosforolize izuzetno brza i ograničena sporijom naprednom reakcijom nastajanja aminoacil-adenilata

(prvi korak aktivacije aminokiseline), ovakav kinetički test omogućava mjerenje aktivacije. Metoda se izvodi na način da se u određenim

vremenskim točkama reakcija zaustavlja, a produkti svake vremenske točke zasebno se nanose na pločicu za tankoslojnu kromatografiju

(TLC) gdje se produkti reakcije razdvajaju. TLC pločica se izlaže zaslonu s uskladištenim fosforom, koji se zatim snima na uređaju

Typhoon PhosphoImager, a podaci se denzitometrijski obrade. S ciljem određivanja kinetičkih parametara, dobiveni rezultati će se

utočnjavati na Michaelis-Menteninu jednadžbu u računalnom programu za utočnjavanje GraphPad Prism.

Aminoaciliranje

Kako bi se odredila ukupna brzina aminoaciliranja u ustaljenom stanju, koristit će se kinetički test u prisustvu

14

C-radioaktivno obilježene

aminokiseline. Reakcijska smjesa sadrži sve potrebne sastojke za aminoaciliranje in vitro : odgovarajući enzim AARS, tRNA, ATP,

reakcijski pufer i radioaktivno obilježenu aminokiselinu. Reakcija se u određenim vremenskim točkama zaustavlja nanošenjem alikvota

reakcijske smjese na diskić filter-papira, koji se uranja u 10% TCA te se uzrokuje taloženje makromolekula. Diskići se još 2 puta ispiru u

5% TCA, čime se uklanja slobodna radioaktivno obilježena aminokiselina, a na diskiću ostaje aminoacilirana tRNA. Diskići se posuše,

stave u staklene bočice sa scintilacijskom otopinom i u scintilacijskom brojaču se izmjeri radioaktivnost. Kako bi se mogla kvantificirati

nastala aminoacilirana tRNA, konstruira se i baždarni pravac ovisnosti ukupne količine aminokiseline o izmjerenim udarcima u minuti

(eng. counts per minute, cpm), a iz nagiba pravca odredi se specifična radioaktivnost aminokiseline.

Aminoaciliranje će se također raditi pomoću radioaktivno obilježene tRNA. Reakcija se također zaustavlja u određenim vremenskim

točkama. Nakon završetka reakcije, alikvotu reakcijske smjese dodaje se nukleaza P1 kako bi se omogućilo cijepanje terminalnog

adenozina na koji je vezana aminokiselina (Wolfson i Uhlenbeck 2002.). Smjesa se nakon inkubacije nanosi na TLC pločicu, gdje u

kromatografskom razdvajajnju aminoacilirani i neaminoacilirani terminalni adenozini imaju različitu pokretljivost, te je moguće kvantificirati

udio aminoacilirane tRNA.

Test utroška ATP-a i paralelno praćenje utroška ATP-a i nastajanja aminoacilirane tRNA

Prilikom aktivacije aminokiseline dolazi do utroška jedne molekule ATP-a, što rezultira stehiometrijom od jednog ATP-a po molekuli

aminoacilirane tRNA. ATP će se također utrošiti prilikom aktivacije pogrešne aminokiseline koja se zatim popravkom pogreške prije ili

nakon prijenosa aminokiseline regenerira u slobodnom obliku. Kako se pritom ne akumulira aminoacilirana tRNA, povećani omjer

utrošenog ATP-a i nastale aminoacilirane tRNA služi kao dijagnostički test popravka pogreške. Test utroška ATP-a se izvodi na način da

se u reakcijsku smjesu dodaje radioaktivno obilježeni [α-

32

P]-ATP, zatim se reakcija aminoaciliranja zaustavlja u određenim vremenskim

točkama, produkti se nanose na TLC pločicu, dolazi do kromatografskog razdvajanja [α-

32

P]-ATP-a i [α-

32

P]-AMP-a i produkti se

kvantificiraju kako je ranije opisano (Gruic-Sovulj i sur. 2005).

Paralelnim praćenjem utroška ATP-a, odnosno praćenjem nastanka [α-

32

P]-AMP usporedno s praćenjem aminoaciliranja pomoću

radioaktivno obilježene tRNA, moguće je dobiti uvid u utrošak ATP-a kao posljedice aktivnog popravka pogreške. Ukoliko se isti test

izvodi s enzimom koji ima ugašen popravak pogreške nakon prijenosa aminokiseline, povećani utrošak ATP-a u odnosu na nastanak

aminoacilirane tRNA uzima se kao dijagnostički test aktivnog tRNA-ovisnog popravka pogreške prije prijenosa aminokiseline te

omogućava njegovo mjerenje.

Prijenos aminokiseline na tRNA

Kinetika drugog koraka aminoaciliranja, prijenosa aktivirane aminokiseline s aminoacil-adenilata na tRNA, pratit će se u uvjetima jednog

obrtaja enzima. Predinkubirana smjesa aminokiseline, ATP-a, enzima i reakcijskog pufera pomiješat će se s radioaktivno obilježenom

5 / 8

S V E U Č I L I Š T E U Z A G R E B UDR.SC.-01 Prijava teme doktorskog rada

Obrazac je napravljen pomoću sustava OBAD

tRNA i zatim zaustaviti u željenim vremenskim točkama. Na taj način je u predinkubiranoj smjesi već došlo do aktivacije aminokiseline

pomoću ATP-a, a reakcija koja se mjeri je samo prijenos aminokiseline. Kako bi se omogućio samo jedan obrtaj enzima, enzim je u

suvišku u odnosu na tRNA (omjer otprilike 10:1). Kao i kod aminoaciliranja s [

32

P]-tRNA, nakon zaustavljanja, reakcijska smjesa će se

inkubirati s nukleazom P1, doći će do cijepanja terminalnog adenozina tRNA koji na sebe ima ili nema vezanu aminokiselinu. Produkti će

se od supstrata razdvojiti na TLC pločici i kvantificirati kako je ranije opisano. Prilikom određivanja koeficijenta brzine prijenosa

aminokiseline na tRNA koristit će se instrument s brzim gašenjem protoka (engl. Rapid Chemical Quench), pomoću kojeg je moguće

pratiti reakciju na milisekundnoj skali.

Deacilacija aminoacilirane tRNA

Da bi se istražio popravak pogreške nakon prijenosa, to jest enzimska deacilacija misaminoacilirane tRNA, preparativno će se pripremiti

tRNA na koju je na 3'-kraj vezana pogrešna aminokiselina. Koristit će se radioaktivno obilježene molekule tRNA, a kako bi se omogućila

misaminoacilacija, koristit će se varijante enzima koje imaju mutaciju u mjestu za popravak pogreške nakon prijenosa. Reakcijska smjesa

koja sadrži misaciliranu tRNA pomiješati će se s enzimom u suvišku kako bi se osigurao jedan obrtaj enzima, i reakcija će se zaustaviti u

različitim vremenskim točkama. Detekcija produkata i kvantifikacija će se izvesti isto kao kod prijenosa aminokiseline na tRNA. Za

deacilaciju će se također koristiti instrument s brzim gašenjem protoka (engl. Rapid Chemical Quench).

Istraživanje toksičnosti aminokiselina in vivo

Toksičnost nepripadnih aminokiselina sojevima E. coli testirat će se metodom određivanja konstante IC50 (eng. inhibitory concetration

50). U ovoj metodi u hranjivi medij u kojem raste E. coli se dodaju različite koncentracije norvalina ili druge aminokiseline. Vijabilnost

stanica se mjeri spektrofotometrijski određivanjem optičke gustoće stanica na valnoj duljini 600 nm. OD

600

se mjeri kroz vrijeme, a

parametri dobiveni iz krivulja rasta se nelinearnom regresijom utočnjavaju na odgovarajuće jednadžbe kako bi se odredila brzina diobe

stanice. Iz ovisnosti brzine diobe stanica o koncentraciji dodane nepripadne aminokiseline, određuje se vrijednost IC50 koja odgovara

koncentraciji aminokiseline koja uzrokuje pad brzine diobe na 50 % od maksimalne vrijednosti. Nadalje, testirat će se toksičnost

aminokiselina pri bakterijskom temperaturnom stresu testovima sposobnosti stvaranja bakterijskih kolonija na krutim hranjivim

podlogama (eng. colony forming units, CFU).

Očekivani znanstveni doprinos predloženog istraživanja (preporučeno 500 znakova s praznim mjestima)

Norvalin je prirodna neproteinogena aminokiselina koja se u stanicama E. coli u određenim uvjetima može akumulirati u milimolarnim

koncentracijama. Obzirom da norvalin strukturno nalikuje izoleucinu, leucinu i valinu, mehanizmi sprječavanja misacilacije tRNA

Ile

,

tRNA

Leu

ili tRNA

Val

norvalinom predstavljaju vrlo važne mehanizme očuvanja točnosti dekodiranja pripadnih kodona te očuvanja strukture

i funkcije proteina. Ovo istraživanje će pokazati na koji način IleRS iz E. coli eliminira pogrešku prepoznavanja norvalina, zatim koliko je

norvalin dobar nepripadni supstrat u odnosu na valin, te je li za stanicu štetnija zamjena izoleucina proteinogenim valinom ili

neproteinogenim norvalinom. Rezultati ovakvog istraživanja imaju primjenu u području sintetske biologije koje se bavi proizvodnjom

proteina s ugrađenim neprirodnim aminokiselinama jer istražuju stanične mehanizme koje je potrebno zaobići prilikom proizvodnje

nestandardnih proteina s novim željenim svojstvima. Nadalje, utvrdit će se predstavlja li norvalin glavnu prijetnju točnosti dekodiranja

leucinskih kodona kod čovjeka, kao što je pokazano za E. coli, ili je popravak pogreške kod humanog sustava optimiran za sprječavanje

ugradnje izoleucina umjesto leucina, obzirom da se kod eukariota (izuzev kvasca) ne sintetizira norvalin.

Popis citirane literature (maksimalno 30 referenci)

Apostol I, Levine J, Lippincott J, Leach J, Hess E, Glascock CB, Weickert MJ, Blackmore R (1997) Incorporation of norvaline at leucine

positions in recombinant human hemoglobin expressed in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 272: 28980-28988.

Bacher JM, de Crécy-Lagard V, Schimmel PR (2005) Inhibited cell growth and protein functional changes from an editing-defective tRNA

synthetase. Proc Natl Acad Sci USA 102:697-1701.

Bergmann FH, Berg P, Dieckmann M (1961) The Enzymic Synthesis of Amino Acyl Derivatives of Ribonucleic Acid. J. Biol. Chem.

236:1735-1740.

6 / 8

S V E U Č I L I Š T E U Z A G R E B UDR.SC.-01 Prijava teme doktorskog rada

Obrazac je napravljen pomoću sustava OBAD

Cvetesic N, Palencia A, Halasz I, Cusack S, Gruic-Sovulj I (2014) The physiological target for LeuRS translational quality control is

norvaline. EMBO J 33(15): 1639–1653.

Dulic, M, Cvetesic, N, Perona, JJ, and Gruic-Sovulj, I (2010) Partitioning of tRNA-dependent editing between pre- and post-transfer

pathways in class I aminoacyl-tRNA synthetases. J. Biol. Chem. 285: 23799-23809.

Dulic M, Perona JJ, Gruic-Sovulj I (2014) Determinants for tRNA-Dependent Pretransfer Editing in the Synthetic Site of Isoleucyl-tRNA

Synthetase. Biochemistry 53 (39): 6189–6198

First EA (2005): Catalysis of the tRNA aminoacylation reaction. In Ibba M, Francklyn CS, Cusack S. (eds.): The aminoacyl-tRNA

synthetases. Landes Bioscience/Eurekah.com, Georgetown, Texas, 328-347.

Fukai S, Nureki O, Sekine S, Shimada A, Tao J, Vassylyev DG, Yokoyama S (2000) Structural Basis for Double-Sieve Discrimination of

L-Valine from L-Isoleucine and L-Threonine by the Complex of tRNA

Val

and Valyl-tRNA Synthetase. Cell 103: 793–803.

Gruic-Sovulj I, Uter N, Bullock T, Perona JJ (2005) tRNA-dependent aminoacyl-adenylate hydrolysis by a nonediting class I aminoacyl-

tRNA synthetase. J Biol Chem 280: 23978-23986.

Ibba M, Söll D (2000) Aminoacyl-tRNA synthesis. Annu Rev Biochem 69: 617-650.

Ling J, Reynolds N, Ibba M (2009) Aminoacyl-tRNA synthesis and translational quality control. Annu Rev Microbiol 63: 61–78.

Loftfield RB, Eigner EA (1966) The specificity of enzymic reactions aminoacyl-soluble RNA ligases. Biochim Biophys Acta 130:426-448.

Perona JJ, Gruic-Sovulj I (2014): Synthetic and Editing Mechanisms of Aminoacyl-tRNA Synthetases. Top Curr Chem 344:1-41.

Soini J, Falschlehner C, Liedert C, Bernhardt J, Vuoristo J, Neubauer P (2008) Norvaline is accumulated after a down-shift of oxygen in

Escherichia coli W3110. Microbial Cell Factories 7:30.

Tardif KD, Liu M, Vitseva O, Hou YM, Horowitz J (2001) Misacylation and Editing by Escherichia coli Valyl-tRNA Synthetase: Evidence

for Two tRNA Binding Sites. Biochemistry 40:8118-8125.

Umbarger HE (1978) Amino Acid Biosynthesis and its Regulation. Annu Rev Biochem 47:532-606.

Wolfson AD, Uhlenbeck OC (2002) Modulation of tRNAAla identity by inorganic pyrophosphatase. Proc Natl Acad Sci USA 99:

5965-5970.

Procjena ukupnih troškova predloženog istraživanja (u kunama)

60000-80000

Predloženi izvori financiranja istraživanja

Nacionalno

financiranje

Naziv projekta

Voditelj projekta

Potpis

Međunarodno

financiranje

Naziv projekta The origin of amino acid specificity in editing class I aminoacyl-tRNA

synthetases and cellular requirements for proofreading

Voditelj projekta Ita Gruić-Sovulj

Potpis

Ostale vrste

projekata

Naziv projekta

7 / 8