Dr. Özge KAHRAMAN ILIKKAN 4. Hafta · sağlayacak proteolitik enzim sistemleri bulunmadığından...

Dr. Özge KAHRAMAN ILIKKAN 4. Hafta

4. Hafta

NEDEN BOYAMA?

Bakteriler genel olarak renksiz ve şeffaf görünür. Mikroskopta boyanmadan

direkt lam üzerinde incelendiğinde, bakterilerin ayırt edilmeleri güçtür. Bu

nedenle, bakteriler boyanarak bakteri hücresi ve bölümleri görünür hâle

getirilir.

Boyama yapılarak mikroorganizmaların morfolojisinin incelenmesi amaçlanır.

Boyamada bakteri hücresi ve bakterinin bölümleri; hücre duvarı, kapsülü,

sporu, flajel ve ya bakterinin bulunduğu ortam zemin boyanabilir ve

incelenebilir.

Çeşitli boyalara karşı davranışları (gram pozitif, gram negatif, aside dirençli

bakteri) belirlenebilir

4. Hafta

BOYA ÇEŞİTLERİ

Boyalar, boya molekülünün elektrik yüküne göre, 1.Asit İyonize oldukları zaman, molekülün porsiyonu negatif elektrikle yüklenir. Asit boyalar arasında, asit fuksin, safranin, eosin, v.s bulunmaktadır. 2.Bazik İyonize oldukları zaman, molekülün boya kısmı pozitif elektrikle yüklenir. Bazik boyalardan, metilen mavisi, kristal vioele, bazik fuchsin çok kullanılır. 3.Nötr Asit ve baz boyaların uygun oranda karışımlarından elde edilir (Giemsa, Wright, Leishman vs).

Boyanma, kimyasal bir olaydır. Boyalar genellikle tuz yapısındadırlar.

4. Hafta

BOYA AŞAMALARI

1. Preparatın Hazırlanması

2. Preparatın Kurutulması

3. Preparatın Tespiti (Fiksasyon)

4. Preparatın Boyanması

4. Hafta

Preparat Nasıl Hazırlanır Boyasız preperat Temiz lam üzerine bir damla su damlatılır.

Damlanın üzerine yeteri kadar örnek konur.

Homojen bir şekilde ezilir.

Üzerine 45 derecelik açıyla hava kalmayacak şekilde lamel kapatılarak incelenir.

Sıvı örnek ise bir damla konur, lamel kapatılır ve incelenir

4. Hafta

Preparat Nasıl Hazırlanır Boyalı preparat

Temiz lam üzerine bir damla su damlatılır.

Damlanın üzerine öze ile yeteri kadar örnek konur

Homojen bir şekilde yayılır.

Havada kurutulur

Isıyla fikse edilir ve boyama işleme geçilir.

BOYAMA YÖNTEMLERİ

1- Basit boyama

2-Negatif boyama (Kapsül boyama)

3- Ayırt edici boyama

3a) Gram Boyama

3b) Ziehl Neelsen (Acid Fast) boyama

4-Spor boyama

4. Hafta

1-Basit Boyama • Preparattaki mikroorganizmanın sadece morfolojisi hakkında bilgi edinmek için bir tek

boya solusyonu kullanılarak yapılan boyama yöntemidir. Preparata boya bir kez

uygulanır ve 1 dk kadar tutulur. Bakteri, kullanılan boyanın rengine göre boyanır.

• Örneğin; Karbol Fuksin, Kristal Viyole ve Metilen mavisi

2-Negatif boyama (Kapsül boyama) • Mikroorganizmaların değil ortamın boyandığı bir yöntemdir

• Genellikle kapsül görüntüleme için kullanılır

• Zemin boyamada en sık çini mürekkebi

4. Hafta

3- Ayırt edici boyama 3a) Gram Boyama

4. Hafta

Isı ile Fiksasyon

2-3 dak Kristal viole ile boyama

1-2 dakika Gram İyodür ile boyama (KV-I)

5-10 sn Alkol muamelesi ile boyanın akması

30 sn Safranin ile boyama

4. Hafta

Isı fiksasyonunda fazla ısıya maruz bırakmak ve aşırı su kaybı gram-pozitif hc. lerin renk kaybına neden olur.

Kültürün yaşı; 18– 24 saatlik kültürler kullanılır.

Kültür yoğunluğu boyamayı etkiler

Tekniğin doğru uygulanması

Karışık kültür

4. Hafta

Gram Negatif Bakteriler Gram Pozitif Bakteriler

Escherichia coli Staphyloccoccus aureus

Salmonella typhi/paratyphi Bacillus cereus

Pseudomonas aeroginosa Strepcoccus thermophilus

Shigella dysenteriae Clostridium perfringens

Listeria monocytogenes

Bazı Gram negatif ve Gram pozitif bakteriler

4. Hafta

3- Ayırt edici boyama 3b) Asit-Fast Boyama Mycobakteriler lipidden zengin balmumsu hücre duvarları nedeniyle asit-alkole dirençlidirler. Bu nedenle, gram boyama gibi normal boyama yöntemleri ile çok zor boyanırlar. EZN boyamada Karbol Fuksin gibi fenollü boyalar lipid tabakayı geçebildiklerinden ilk boya olarak kullanılırlar.

Karbol fuksin ile boyarken örnek ısıtılırsa lipit tabaka ( mumsu tabaka ) gevşer ve boyanın içeri nüfuz etmesi, hücre duvarına ulaşması sağlanır.

Asit alkol karışımı ile örnek yıkanınca normal hücrelerin hepsi boyayı bırakır ancak Aside dirençli bakteriler boyayı bırakmazlar

4. Hafta

3- Ayırt edici boyama 3b) Asit-Fast Boyama

Ehrlich-Ziehl - Neelsen (EZN) Mikobakterileri boyama yöntemi a) Preparat hazırlanır, kurutulur ve tespit edilir. b) Lam üzerine ve bütün lâmı kaplayacak tarzda karbol fuksin solusyonu konur. c) Preparat alttan 4-5 dakika ve aralıklı olarak hafifçe ısıtılır. Preparatın yanmamasına ve kabarcıkların çıkmamasına dikkat edilir (preparat üzerinden hafif buharlar çıkabilir). d)Boya dökülür ve preparat asit-alkolde (% 95 alkol + % 5 HCI asit) yıkanır. e) Su ile yıkanır. f) Preparat üzerine metilen mavisi solusyonu konur ve 20-25 saniye boyanır. g) Boya dökülür ve su ile yıkanır. h) Kurutulur ve immersiyonla muayene edilir. Mikobakteriler veya asidorezistans mikroorganizmalar pembe kırmızı renkte ve

diğer mikroorganizmalar ise mavi renkte görülürler.

4. Hafta

4-Spor boyama 1. İncelenecek bakteri kültürü ile preparat hazırlanır ( yayma, kurutma, tespit)

2. Preparat uygun bir beher yada teneke kutu kullanılarak hazırlanan kaynar su

banyosu düzeneği üzerine yerleştirilir

3. Preparatın üzeri % 5’lik malaşit yeşili boya çözeltisi ile kaplanır ve bunun

üstüne daha önceden, lamdan daha küçük olacak şekilde kesilerek hazırlanmış

olan bir kurutma kağıdı yerleştirilir. Kurutma kağıdı boya çözeltisini çekerek ıslanır,

4. Kurutma kağıdı üzerine malaşit yeşili boya çözeltisi damlatılır ve kağıdın sürekli

olarak ıslak kalmasını sağlayacak şekilde hareket edilir. Bu amaçla, kurutma

kağıdının ıslaklığı azaldıkça, üstüne malaşit yeşili boya çözeltisi damlatılır ve bu

şekilde preparat 5-6 dk boyanır

5. Süre sonunda kurutma kağıdı bir pensle kaldırılarak atılır, preparat yıkanır

6. Karşıt boya olarak bazik fuksin yada safranin (%0.5) ile 20-30 sn boyanır,

7. Preparat yıkanır ve havada kurutulur,

8. Vejetatif hücre kırmızı, endospor ise yeşil olarak görülür

4. Hafta

4-Spor boyama Malaşit Yeşili

Bacillus ve Clostridium cinslerine ait türler endospor oluşturma yeteneğine sahiptirler. Bu endosporlar bakterinin vejetatif formuna oranla yüksek ısı ve dezenfektanlar gibi fiziksel ve kimyasal yöntemlere karşı daha dirençlidir. Bu direnci sağlayan sporun dışındaki koruyucu tabaka, ancak boyama sırasında preparatın alttan ısıtılması ile gevşetilir ve sporun boyayı alması sağlanır.

4. Hafta

MİKROBİYOLOJİDE BESİYERLERİ

5. Hafta

Besi yerleri;

Mikroorganizmaları bulundukları ortam dışında ve laboratuvarlarda üretmek için

formüle edilmiş, mikroorganizmaların gereksinimini olan besin ögelerini içeren, pH’ı

uygun, besleyici, yapay ortamlardır

5. Hafta


Besi yerleri çok farklı amaçlarla kullanılabilir. Bunlar

1. Mikroorganizmaların; üretilmesi, geliştirilmesi ve canlılıklarının korunması,

2. Duyarlılık ve sterilite testleri, saf kültürlerinin elde edilmesi(izolasyonu),

tanımlanmaları (identifikasyon), sayımları

3. Yapılarının ve biyokimyasal özelliklerinin incelenmesi, biyolojik ve

metabolik ürünlerinin elde edilmesi,

4. Gıda, su ve çevre kontrolleri, antibiyotik ve vitamin analizleri

5. Hafta

Besi yerleri bileşiminde bulunması

gereken maddeler:

Su,

Karbohidratlar

Proteinler, peptonlar, amino asitler vb. organik bileşikler, KNO3,

(NH4)PO4 vb. inorganik tuzlar gibi azot kaynağı maddeler,

Vitaminler(özellikle B grubu)

Na, K, Cl, P, Ca, Fe, Mg, S vb. makro elementlerle, Zn, Mg, Br, Mo, Co,

Cu, B vb mikro elementler yani minerallerdir.

5. Hafta

Besi Yerlerinin Bileşimine Giren Temel Maddeler

Agar

Bazı deniz yosunlarından elde edilen uzun zincirli polisakkarittir.

Toz veya lifler halinde üretilir.

Sıvı ortamları katılaştırmak için %2-3 oranında kullanılırken,

yarı-katı ortamlar için %0.3-0.5 oranında sıvı besiyerine ilave

edilir.

Agar, 90-98 0C’de erir ve 40-42 0C’de katılaşır.

5. Hafta


Pepton Süt proteini (kazein), kan proteini (fibrin), sığır eti, karaciğer veya soya proteininin tripsin, pepsin veya papain gibi proteolitik enzimlerle hidrolize edilmesinden üretilir. Pek çok mikroorganizmada proteinleri hidrolize ederek N kaynağı olarak kullanmalarını sağlayacak proteolitik enzim sistemleri bulunmadığından besi yerine pepton katılır. Maya Ekstraktı (Yeast Extract) Ekmek mayası (Saccharomyces cerevisiae), bira mayası gibi mayaların enzim veya asitle hidrolizinden elde edilir. Et Ekstraktı (Beef Extract) Bakteriler için genel besi yeri olarak kullanılır. Yağsız, tendonları ayrılmış sığır etinden (kıymasından) elde edilir. Tuz (NaCl) Besi yerlerinde iyon konsantrasyonunu ayarlamak ve izotonik (eş basınçlı) ortam yaratmak için kullanılır.

5. Hafta


Jelâtin Sinir, kemik, tendon vb. hayvansal dokulardan elde edilen protein yapısında bir maddedir. Agar gibi katılaştırıcı özelliği vardır fakat daha çok mikroorganizmaların proteolitik aktivitelerini ortaya çıkarmak için kullanılır. Karbohidratlar Fermente olabilen karbohidratlar, mikroorganizmalar için enerji ve C kaynağıdır. En çok kullanılan karbohidratlar glukoz, laktoz ve sakkarozdur.

5. Hafta


Kan Sıvı veya katı bazı besi yerlerini zenginleştirmek için ya da mikroorganizmaların hemoliz (alyuvarların parçalanması) özelliklerinin saptanması testlerinde kullanılır. Tampon Maddeler (Buffer) Mikroorganizmaların gelişimine etki eden en önemli faktörlerden biri pH’dır. Besi yerinde üreyen mikroorganizmaların metabolik artıkları ortamın pH’ını değiştirebilir. Besi yeri pH’ını kontrol altında tutmak için tampon maddeler katılır. İnorganik maddeler Özellikle hazır olarak satılan sentetik besi yerlerine mikroorganizmaların ihtiyacına göre mineraller eklenebilir. Fakat genellikle besi yerlerine katılan pepton, bulyon, maya ekstraktı, et ekstraktı mikroorganizmaların mineral ihtiyacını yeteri kadar karşılamaktadır.

5. Hafta

Besiyerleri 3 kategoride incelenir

Fiziksel özelliğine göre Kimyasal Özelliğine Göre Fonksiyonel ya da Kullanım Amacına Göre

1. Sıvı 1. Sentetik 1. Genel amaçlı

2. Katı 2. Sentetik Olmayan 2.Zenginleştirilmiş

3. Yarı Katı 3. Seçici

4. Ayırt Edici

5. Seçici ve ayırt edici

6. İdentifikasyon Besiyerleri

7. Canlandırma Besiyerleri

8. Anaerob Besiyerleri

5. Hafta

Fiziksel Özelliklerine Göre Besiyerleri 1. Sıvı (Broth) Kullanım esnasında sıvı olan besiyerleri. 2. Katı(Agar) Mikroorganizmaların büyütülmesi, stoklanması, saf kültür eldesi, koloni özelliğinin belirlenmesi gibi amaçlarla kullanılır. Yatık ya da dik hazırlanabilir 3. Yarı Katı Mikroorganizmaların hareket özelliğinin gözlenmesi amacıyla kullanılır.

Katı Sıvı (Broth)

Yarı Katı

Yatık

5. Hafta

Kimyasal Özelliğine Göre

1. Sentetik: İçeriği kimyasal olarak tanımlanmış besiyerleri 2. Sentetik olmayan besiyeri: En az bir tane kimyasal formülle gösterilmeyen madde içeren besiyeri - Kan, serum, et ekstresi, süt, pepton (kısmen sindirilmiş protein) vb.

5. Hafta

Fonksiyonel ya da Kullanım Amacına Göre 1. Genel Besiyeri:

Herhangi bir inhibitör madde içermeyen, besin maddelerince yeterli veya zengin,

herhangi bir mikroorganizma grubunun gelişmesini özel olarak desteklemeyen, bazı zor

gelişenlerin de dahil olduğu çok sayıda mikroorganizmanın gelişmesini sağlayan

besiyerleridir

Genel besiyerleri aşağıdaki amaçlar için kullanılır:

· Toplam mezofil ve ya psikrofil aerob bakteri sayımı

· Bozulma veya hastalık etmeninin ön izolasyonu

· Günlük kullanımdaki bakterilerin aktifleştirilmesi, korunması

· Genel besi yerleri inkübasyon koşullarının değiştirilmesi ve kontrolü

5. Hafta

Fonksiyonel ya da Kullanım Amacına Göre

1. Genel Besiyeri:

Plate Count Agar,

Nutrient Agar ve ya Nutrient Broth,

Tryptic Soy Agar ve ya Tryptic Soy Broth

Yeast Extract Agar en sık kullanılan genel besiyerleri içinde yer alırlar.

5. Hafta

2. Zenginleştirilmiş Besiyeri

Geliştirilmek istenen mikroorganizmanın istediği besin maddeleri ile zenginleştirilen besiyerleridir. Kan, serum, hemeoglobin veya vitamin, amino asit gibi özel büyüme faktörleri ile mikroorganizmaların büyümesini destekleyen maddeleri içerirler Örn; Neisseria bakterisi kan agarın ısıtılması ile hazırlanan çikolata agarda büyür


5. Hafta

Streptococcus pyogenes Streptococcus viridans S. Pneumoniae S. thermophilus


5. Hafta

3. Seçici Besiyeri

Formülasyonu yalnızca belli bir mikroorganizma veya mikroorganizma grubunun tipik

gelişimini sağlayacak şekilde hazırlanmış besi yerleridir.

Selektif besi yerlerinin bileşimine diğer istenmeyen mikroorganizmaların enzim veya metabolizma sistemlerini olumsuz etkileyen, gelişmelerini engelleyen; Boyalar, Antibiyotikler, Kimyasal maddeler, Safra tuzları gibi inhibitör maddeler pH ayarlamalarıyla istenen mikroorganizmaların gelişmeleri sağlanır.


5. Hafta

Örn; Mannitol Salt Agar – % 7,5 NaCl içerir Staphylococcus bakterilerinin iyi büyümesini sağlar.


5. Hafta

4. Ayırt Edici Besiyeri

Belli bir mikroorganizmanın kendi türüne özgü tipik koloniler oluşturduğu katı besi yerleridir. Ortama bazı boya ve kimyasal maddeler katılarak mikroorganizmaların üreme şekli ayrı bir özellik kazanır. Bu ortamlarda bütün bakteriler büyüyebilir ama farklı görünürler. Örneğin; SS Agar (Salmonella Shigella Agar) Salmonella kolonilerini tanımada, EMB Agar ise E. coli’nin ayrımında kullanılır.


5. Hafta

4. Ayırt Edici Besiyeri


Eosin, pH indikatörüdür Metilen mavisi , gram + leri engeller

5. Hafta


5. Hafta

5. Seçici ve ayırt edici

Bazı besi yerleri hem selektif (seçime yönelik) hem ayırt edici (farklara dönük)

olabilir.

Örneğin Mac Conkey besi yerlerinde

Kristal viole vardır ve gram pozitifleri engeller

Laktoz ve pH indikatörü olarak da neutral red vardır. Koliform bakterileri laktozu

fermente ederek kırmızı renkli koloniler, laktozu fermente edemeyen Salmonella

türleri ise renksiz koloniler oluşturur.


4. Hafta

5. Hafta

6. İdentifikasyon besiyeri

Bir besiyerinde birden çok mikrobiyolojik tanımlama testi aynı anda beraberce

yapılabilir.

Bunun en tipik örneği Salmonella analizinde yaygın olarak Triple Sugar Iron Agardır.

Yatık agar olarak tüplerde hazırlanan bu besiyerinde tek ekim ile glikoz, laktoz ve

sakkarozdan asit oluşturma, glikozdan gaz oluşturma ve H2S oluşturma testleri

yapılmaktadır. Bu gibi identifikasyon amaçlı ve birden çok test uygulananlar

"kombine besiyeri" olarak adlandırılır.


5. Hafta

Triple Sugar Iron Agar


5. Hafta

7. Canlandırma- Ön zenginleştirme besiyeri

Bir ortamda zarar görmüş, üreme yeteneği azalmış, canlılık oranı düşük olan

mikroorganizmaların canlanmasını, gelişmesini ve adaptasyonunu sağlayan sıvı

besiyerleridir.

Bu besiyerlerine en tipik örnek, gıdalarda Salmonella aranmasına yönelik

çalışmaların ilk aşaması olan ön zenginleştirmede kullanılan "Tamponlanmış

Peptonlu Su" besiyeridir.


5. Hafta

7. Anaerob Besiyeri


Ortamdaki oksijeni gideren redükleyici maddeler (sodyum tiyoglikolat gibi) eklenmiş

ve böylece anaerob bakterilerin daha kolay üremesini sağlayan besiyerleridir.

Redükleyici maddeler, besiyerlerinde çözünmüş olarak bulunan oksijen ile kimyasal

reaksiyona girerek mikroorganizmalar tarafından kullanılmasını engeller.

Dr. Özge KAHRAMAN ILIKKAN 4. Hafta · sağlayacak proteolitik enzim sistemleri bulunmadığından...

Documents

Transcript of Dr. Özge KAHRAMAN ILIKKAN 4. Hafta · sağlayacak proteolitik enzim sistemleri bulunmadığından...