http://http://www.irb.hr/hr/str/zmm/LABS/LabOSwww.irb.hr/hr/str/zmm/LABS/LabOS//

Neven Žarković, dr. sc., znanstveni savjetnikMarija Poljak-Blaži, dr. sc., znanstveni savjetnikSuzana Borović Šunjić, dr. sc., znanstveni suradnik

Ana Čipak, dipl. inž., znanstveni novakMorana Jaganjac, dipl. inž., znanstveni novakFilip Rabuzin, dipl. inž., znanstveni novak

Nevenka Hiršl, kemijski tehničarTea Vuković, med. lab. inž., viši tehničar

NevenNeven ŽarkovićŽarković,, dr. sc., dr. sc., znanstveniznanstveni savjetniksavjetnikMarijaMarija PoljakPoljak--BlažiBlaži, , dr. sc., dr. sc., znanstveniznanstveni savjetniksavjetnikSuzanaSuzana BorovićBorović ŠunjićŠunjić, , dr. sc., dr. sc., znanstveniznanstveni suradniksuradnik

Ana Ana ČipakČipak, , dipldipl. in. inžž., ., znanstveniznanstveni novaknovakMoranaMorana JaganjacJaganjac, , dipldipl. in. inžž., ., znanstveniznanstveni novaknovakFilipFilip RabuzinRabuzin, d, diplipl. in. inžž., ., znanstveniznanstveni novaknovak

NevenkaNevenka HiršlHiršl, , kemijskikemijski tehničartehničarTea Vuković, med. lab. inž., viši tehničarTea Vuković, med. lab. inž., viši tehničar

Suradne ustanove:Suradne ustanove:

Institut Ruđer Bošković, ZagrebKBC Dubrava, ZagrebKBC Rebro, Zagreb Medicinski fakultet, ZagrebTraumatološka klinika, ZagrebKemijsko tehnološki fakultet, SplitFarmaceutsko-biokemijski fakultet, ZagrebAgronomski fakultet, Zagreb

Nagoya University Graduate School of Bioagricultural Sciences, Nagoya, JapanINRA, Toulouse, FrancuskaInstitute of Molecular Biology, Biochemistry and Microbiology, Graz, AustrijaUniversity Clinic for Surgery, Karl-Franzens-Universität Graz, AustrijaInstitut für Genetik und Allgemeine Biologie, Salzburg, Austrija

Institut Institut RuRuđđerer BoškovićBošković, Zagreb, ZagrebKBC KBC DubravaDubrava, Zagreb, ZagrebKBC KBC RebroRebro, Zagreb , Zagreb MedicinskiMedicinski fakultetfakultet, Zagreb, ZagrebTraumatološkaTraumatološka klinikaklinika, Zagreb, ZagrebKemijskoKemijsko tehnološkitehnološki fakultetfakultet, Split, SplitFarmaceutskoFarmaceutsko--biokemijski fakultet, Zagrebbiokemijski fakultet, ZagrebAgronomski fakultet, ZagrebAgronomski fakultet, Zagreb

Nagoya University Graduate School of Nagoya University Graduate School of BioagriculturalBioagricultural Sciences, Nagoya, JSciences, Nagoya, JapanapanINRAINRA,, Toulouse, Toulouse, FrancuskaFrancuskaInstitute of Molecular Biology, Biochemistry and Microbiology, GInstitute of Molecular Biology, Biochemistry and Microbiology, Graz, raz, AustrijaAustrijaUniversity Clinic for SurgeryUniversity Clinic for Surgery, Karl, Karl--FranzensFranzens--UniversitätUniversität Graz, Graz, AustrijaAustrijaInstitut für Genetik und Allgemeine BiologieInstitut für Genetik und Allgemeine Biologie,, Salzburg, Salzburg, AustrijaAustrija

Znanstvena produkcija laboratorija 2000Znanstvena produkcija laboratorija 2000--20062006

Knjige, poglavlja u knjigama, udžbenici i skripte: 6Znanstveni radovi u CC časopisima: 35Radovi u ostalim časopisima: 17Pozvana predavanja na skupovima: 18Disertacije i magistarski radovi: 7Diplomski radovi: 3

KnjigeKnjige, poglavlja u knjigama, udžbenici i skripte: 6, poglavlja u knjigama, udžbenici i skripte: 6ZnanstveniZnanstveni radoviradovi u CC u CC časopisimačasopisima: 35: 35RadoviRadovi u u ostalimostalim časopisimačasopisima: 17: 17PozvanaPozvana predavanjapredavanja nana skupovimaskupovima: 18: 18DisertacijeDisertacije i i magistarskimagistarski radoviradovi: 7: 7DiplomskiDiplomski radoviradovi: 3: 3

OOpremapremaBiokemijskiBiokemijski diodioHPLC HPLC sustavsustavii, , luminometarluminometar, , flourimetarflourimetar, , sustavsustavii zaza elektroforezuelektroforezu, , iimmunoblottingmmunoblotting, in situ PCR, , in situ PCR, spektrofotometar i spektrofotometar i čitaččitačii pločicapločica (plate readers) (plate readers) In vitroIn vitro diodiostandardnstandardnaa opremopremaa zaza istovremeniistovremeni radrad 55--66 osobaosoba ((komorekomore zaza sterilnisterilni radrad, , COCO22 inkubatorinkubatorii, , invertninvertnii mikroskopmikroskopii, , brojačbrojačii stanicastanica [cell counter], [cell counter], pogonpogon zazaradrad s s kvascemkvascem, , itditd.) .) ImunohistokemijskiImunohistokemijski diodionamjenjen namjenjen imunodetekcijimunodetekcijii citokinacitokina, , proteinskihproteinskih konjugatakonjugata produkata lipidne produkata lipidne peroksidacije (peroksidacije (HNE i HNE i sličnihsličnih biljegabiljega oksidacijskogoksidacijskog stresastresa)) -- suradnjasuradnja s s kolegamakolegama iziz inozemstvainozemstva i i MedicinskogMedicinskog fakultetafakulteta u u ZagrebuZagrebuRadioaktivnaRadioaktivna jedinicajedinicazajedničkazajednička zaza radrad s s ostalimostalim skupinamaskupinama;; uglavnomuglavnom se se koristikoristi zaza testovetestoveugradnjeugradnje 33HH--TdR TdR In vivoIn vivo diodiopokusipokusi se se provodeprovode u u PogonuPogonu laboratorijskihlaboratorijskih životinjaživotinja ZavodaZavoda zaza molekularnumolekularnumedicinumedicinu i uključuju rad na miševima i štakorimai uključuju rad na miševima i štakorima

ROSO2•-

HO•H2O2 NO•

antioksidansi

ROS

antioksidansiO2•-

HO•H2O2 NO•

Nastaju:Nastaju:endogeno (u metaboličkim procesima)endogeno (u metaboličkim procesima)egzogeno (zračenje, sunčanje)

vježbanjeegzogeno (zračenje, sunčanje)

normalni metabolizam

visoki pO2

smog(O3, NO2) kemikalije i lijekovi

repefuzijski stres

Reaktivne kisikove vrste (spojevi)Reaktivne kisikove vrste (spojevi)(O(O22¯, H¯, H22OO22, OH•), OH•)

starenjeupala

aditivikonzervansi u hrani

IshemijaIshemijaOO22

OO22Oštećenje staniceOštećenje stanice

ROS ili SLOBODNI RADIKALI?ROS ili SLOBODNI RADIKALI?

atomi/ioni/molekuleatomi/ioni/molekule s s jednimjednim iliili viševiše nesparenihnesparenih elektronaelektronanestabilninestabilni, , reaktivnireaktivniniskaniska koncentracijakoncentracija (10(10--55 -- 1010--99 mol)mol)kratakkratak poluživotpoluživot (10(10--6 6 -- 1010--99 s)s)

TRAJANJETRAJANJE((poluživotpoluživot))

11OO22 singletni oblik kisikasingletni oblik kisika 1010--66 ss

OO22--•• superoksidni anionsuperoksidni anion

HOHO•• hidroksilni radikalhidroksilni radikal

1010--66 ssRORO•• alkoksi radikalalkoksi radikal

ROOROO•• peroksi radikalperoksi radikal

HH22OO22 vodikov peroksidvodikov peroksid

7 s7 s

minuteminuteROOHROOH organski hidroperoksidorganski hidroperoksid

NONO•• dušikov oksiddušikov oksid

ONOOONOO••-- peroksinitritperoksinitrit

ROSROS

6 6 -- 60 s60 s

1010--66 ss

1010--99 ss

1010--33 ss

minuteminuteHOClHOCl hipoklorna kiselinahipoklorna kiselina minuteminute

Slobodni radikali oštećuju biološke molekule:Slobodni radikali oštećuju biološke molekule:proteine, lipide, DNA i ugljikohidrateproteine, lipide, DNA i ugljikohidrate

R1 R2

R1 R2

R1 R2

R1 R2

R1 R2

R1 R2 R1 R2

R. radikal npr. HO.

RH

višestruko nezasićena masna kiselina ( LH )

konjugacija diena lipidni (alkilni) radikal ( L. )

O2

.

.

OO. LH

L.

Mn+

M(n+1)+ + .OH

M(n+1)+

Mn+ + H+

OO.O.

OOH

lipidni peroksid ( LOOH )

lipidni peroksil radikal ( LOO. )

O OO

H

OHmalondialdehid 4-hidroksi-2-nonenal

lipidni alkoksil radikal ( LO. ) lipidni peroksil radikal (LOO. )

reaktivni aldehidi

Lančana reakcija lipidne peroksidacijeLančana reakcija lipidne peroksidacije

ROS

Koža

Probavni sustav

Mozak

Koštani sustavSrce

Pluća

Bubrezi

Krvne žileOko

Multiorganska oštećenja

Istraživanje ROS i oksidacijskog stresa

I fazaVrhunac: 50. godine 20 st.ROS nastaju kao štetni sporedni produkti različitih oksido-redukcijskih reakcija,

odgovorni za oštećenje stanica, nastanak tumora i degenerativnih bolesti

II fazaPočetak: 60.-70. godina 20 st. Istraživanje oštećenja koja ROS uzrokuju na DNA, proteinima, lipidimaOtkrivanje uloge antioksidacijskih enzima

III fazaPočetak: 90. godine 20 st. – početak 21. st.Otkrivaju se poželjni biološki učinci ROS koji ukazuju na njihovu važnu fiziološku

ulogu u: ~ proliferaciji stanica~ diferencijaciji stanica ili funkcionalnom sazrijevanju~ programiranoj staničnoj smrti

SSažetak naših istraživanjaažetak naših istraživanja

Izučavanje fiziologije i patologije oksidacijskog stresaMolekularne značajke regulacije rasta stanica s osvrtom na lipidnu peroksidaciju (4-hidroksinonenal) Eksperimentalna dijagnostika i terapija zloćudnih bolesti temeljenihna oksidacijskom stresuBioterapija zloćudnih bolesti

IzučavanjeIzučavanje fiziologijefiziologije i i patologijepatologije oksidacijskogoksidacijskog stresastresaMolekularneMolekularne značajkeznačajke regulacijeregulacije rastarasta stanica s osvrtom na lipidnu stanica s osvrtom na lipidnu peroksidaciju peroksidaciju ((44--hidroksinonenalhidroksinonenal) ) EksperimentalnaEksperimentalna dijagnostikadijagnostika i i terapijaterapija zloćudnihzloćudnih bolestibolesti temeljenihtemeljenihnana oksidacijskomoksidacijskom stresustresuBioterapijaBioterapija zloćudnih bolestizloćudnih bolesti

OdreOdređđivanjeivanje oksidacijskogoksidacijskog i i antioksidacijskogantioksidacijskogstatusastatusa u uzorcima plazme, tkiva i stanicau uzorcima plazme, tkiva i stanica

odreodređđivanjeivanje produkataprodukata lipidnelipidne peroksidacijeperoksidacije MDA i HNE MDA i HNE pomoćupomoćuHPLC HPLC metodemetodeodreodređđivanjeivanje peroksidaperoksida iziz plazmeplazmeodreodređđivanjeivanje ukupnogukupnog antioksidativnogantioksidativnog kapacitetakapaciteta plazmeplazmeodreodređđivanjeivanje hidroksilnoghidroksilnog radikalaradikala pomoćupomoću HPLC HPLC metodemetodeodreodređđivanjeivanje autoimunihautoimunih protutijelaprotutijela nana oksidiranioksidirani LDL u LDL u plazmiplazmiodreodređđivanjeivanje aktivnostiaktivnosti peroksidazeperoksidaze u u plazmiplazmikemiluminescencijakemiluminescencija ((oksidacijskioksidacijski prasakprasak leukocitaleukocita) ) imunohistokemijaimunohistokemija uzorakauzoraka tkivatkiva i i stanicastanica in vitro in vitro nana produkteprodukte lipidnelipidneperoksidacijeperoksidacije (HNE, MDA, (HNE, MDA, akroleinakrolein) ) odreodređđivanjeivanje glutationaglutationa, , glutationglutation SS--transferaztransferaze i katalazee i katalazeprimjenaprimjena kvascakvasca kaokao modelamodela zaza oksidacijskioksidacijski stresstres

OOstale metodestale metode

OdreOdređđivanje proliferacije stanica testovima ivanje proliferacije stanica testovima ugradnjeugradnje 33HH--TdR TdR i MTTi MTTOdreOdređđivanjeivanje programirane stanične smrti stanica (programirane stanične smrti stanica (apoptozeapoptoze))Pratimo parametre diferencijacije stanicaPratimo parametre diferencijacije stanicaImunokemijskImunokemijskim metodama i PCRom odreim metodama i PCRom određđujemo čimbenike rasta i ujemo čimbenike rasta i citokine u uzorcima stanica i tkivacitokine u uzorcima stanica i tkiva

In vivo modeliIn vivo modeli

ŠŠtakori i miševitakori i miševiToksikološkeToksikološke studijestudije in vivo in vivo ProtutumorskiProtutumorski učinciučinci potencijalnihpotencijalnih ljekovitihljekovitih tvaritvariIIshemijskoshemijsko--reperfuzijskareperfuzijska ozljedaozljeda kaokao model model oksidacijskogoksidacijskog stresastresa in in vivovivoModel parcijalne hepatektomije za izučavanje regeneracije jetre Model parcijalne hepatektomije za izučavanje regeneracije jetre

In vitro modeliIn vitro modeli

Primarne stanične kulturePrimarne stanične kulture–– osteoblastiosteoblasti–– hepatocitihepatociti–– limfociti, neutrofili i makrofazilimfociti, neutrofili i makrofazi–– karcinom kolonakarcinom kolona

Normalne stanične linijeNormalne stanične linije–– fibroblastifibroblasti–– makrofazimakrofazi

Tumorske stanične linijeTumorske stanične linije–– karcinomikarcinomi–– fibrosarkomifibrosarkomi–– osteosarkomiosteosarkomi–– leukemijeleukemije

Kulture transgenog kvascaKulture transgenog kvasca

Osteoblasti Osteoblasti

Hepatociti Hepatociti

Indukcija apoptozeIndukcija apoptoze

IH na HNEIH na HNE

Indukcija HIndukcija H22OO22

PCRPCR

HPLCHPLC

Kabinet za sterilni radKabinet za sterilni rad

Hvala na pažnji!