Dr. Martin Oberringer Abt. für Unfall-, Hand- und...
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Lehrerfortbildung Nanobiotechnologie
Fluoreszenzmikroskopie und Probenpräparation
Dr. Martin Oberringer Abt. für Unfall-, Hand- und Wiederherstellungschirurgie Homburg
Fachrichtung Experimentalphysik Saarbrücken
03.04.03
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Lehrerfortbildung Nanobiotechnologie
Fluoreszenzmikroskopie und Probenpräparation- ImmunfluoreszenzBegriffserklärungenFärbeprinzip
- Verwendete AntikörperSpezifität
- Färbeprotokoll
- AuswertungMikroskopierenDokumentierenBildnachbearbeitung
- Begriffserklärungen
- Apparative VorraussetzungenAufbau
- Auflicht-Fluoreszenz-AnregungFilteraufbauFiltertypenFluorochrome/ Filtersätze
- Beispiele biologischer Anwendungen
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FluoreszenzmikroskopieBegriffserklärungen
Lumineszenz: Unter Lumineszenz versteht man den Prozeß, bei dem durch unterschiedliche Vorgänge elektromagnetische Strahlung im Bereich des sichtbaren Lichts emittiert wird.
Fluoreszenz: Die Lumineszenz endet unmittelbar nach Beendigung derAnregung.
Phosphoreszenz: Da die Lichtemission die Zeit der Einwirkung der Lichterregung überdauert, kommt es zum Nachleuchten. (Zwischenstufe der Elektronen beim Übergang vom angeregten in den Grundzustand).
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FluoreszenzmikroskopieBegriffserklärungen
Photolumineszenz: Durch die Anregung im UV-, IR- oder sichtbaren Bereich wird eine Lichtemission ausgelöst.
Chemolumineszenz: Energie der Reaktion wird als Lichtemission frei.
Biolumineszenz: (besondere Art der Chemolumineszenz) Emission nach enzymatische Reaktionen aus Flora und Fauna.
-andere: Tribolumineszenz, Kathodenlumineszenz, Radiolumineszenz
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FluoreszenzmikroskopieApparative Vorraussetzungen/ Auflicht-Fluoreszenz-Anregung
Strahlengang
4
2c
2b
12a1 Hg-Dampfhochdrucklampe
2 Filterwürfel2a Anregungsfilter2b Teilerspiegel
(dichroischer Spiegel)2c Emissionsfilter3 Fluoreszierende Probe4 Betrachter/ Kamera
2
3
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FluoreszenzmikroskopieAuflicht-Fluoreszenz-Anregung
Filtertypen
LongpassDAPI (359nm/ 461nm)
BandpassFluoresceinisothiocyanat (488nm/ 525nm) (FITC)
Quelle: http://www.zeiss.de
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FluoreszenzmikroskopieAuflicht-Fluoreszenz-Anregung
Fluorochrome/ Filtersätze
BandpassCy3 (552nm/ 570nm)
Triple BandpassFITC, Cy3, DAPI
Quelle: http://www.zeiss.de
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FluoreszenzmikroskopieBeispiele biologischer Anwendungen
Chromosom
DNA-Helix
Ziel-DNA
Denaturierung
Chromosomen-Sonde
Sonden-DNA
DenaturierungFluoreszenz in situ-Hybridi-sierung (FISH) mit Zentromersonden, Cy3 und FITC markiert, Kern-Gegenfärbung mit DAPI
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FluoreszenzmikroskopieBeispiele biologischer Anwendungen
ImmunfluoreszenzfärbungvWF-Cy3
Immunfluoreszenzfärbung Mib-Ki67-Cy3 (+ FISH)
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ProbenpräparationImmunfluoreszenz
Begriffserklärungen/ Färbeprinzip
Indirekte FärbungDirekte Färbung
Markierter (Zweit-)AntikörperMarkierter Antikörper
Antigen Unmarkierter Antikörper
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Probenpräparation Verwendete Antikörper
1. Ki67- Im Zellkern- Proliferationsassoziiertes Antigen- In den Zellzyklusphasen späte G1 – Mitose- Erlaubt die Identifkation von ruhenden und proliferierendenZellen in Gewebeschnitten oder Zellkulturen
G0
G1
2. Von Willebrand Faktor (Faktor VIII related antigen)- Multimeres Glycoprotein- Bindet andere Glycoproteine, Kollagen und Heparin- Schutz von Faktor VIII vor unspezifischem Abbau- Vermittelt die Adhäsion von Thrombozyten- Gespeichert in Weibel-Pallade-Körperchen- Erlaubt die Charakterisierung vom Endothelzellen
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Probenpräparation Verwendete Zellen
Immunfluoreszenz--färbung
Gewebestücke
Kollagenase-Verdau
Kultivierung inQuadriperm-Schalen
Zell-Fixierung
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ProbenpräparationFärbeprotokoll Ki67
::::::::::::Trocknen
HDMEC
Primär-AK: Ki67 (Maus)
Sekundär-AK:Ziege-anti-Maus-Cy3
FISH undKern-Gegenfärbung
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ProbenpräparationFärbeprotokoll vWF
Primär-AK: vWF (Kaninchen)
Sekundär-AK:Ziege-anti-Kaninchen-Cy3
Trocknen
HDMEC
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ProbenAuswertung
Mikroskopieren-Einführung
-Erklärung der Komponenten
-Präparate: Ki67-Cy3 mit FISH und KerngegenfärbungvWF-Cy3 mit Kerngegenfärbung
-Auszählen der positiven Zellen und Ermittlung des prozentualen Anteils
-Auszählen der FISH-Signale
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ProbenAuswertung
Dokumentieren
-Protokoll der Auswertung:Auszählen der positiven Zellen und Ermittlung des prozentualen AnteilsAuszählen der FISH-Signale
Negative
Positive
PolyploideDiploideKi67
-Bildaufnahme
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ProbenAuswertung
Bildnachbearbeitung
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Organisation/ Gruppeneinteilung