Dosage des acides aminés plasmatiques Etapes ...Dosage des acides aminés plasmatiques Etapes...
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Dosage des acides aminés plasmatiques
Etapes préanalytiques
Etude multicentrique
Angers : Gilles Simard
Caen : Marie-Hélène Read
Clermont-Ferrand : Régine Quinard
Lille : Gilbert Briand
Lyon : Cécile Acquaviva, Cécile Pagan, Alice Merllié
Paris Necker : Sylvia Sanquer
Paris Robert Debré : Apolline Imbard, Jean-François Benoist
Reims : Roselyne Garnotel
Rouen : Marion Colnot, Frédéric Ziegler et Soumeya Bekri
Dosage des acides aminés plasmatiques
Etapes préanalytiques
Objectif : définir les modalités de prélèvements et de conservation des échantillons pour
le dosage des acides aminés plasmatiques
Trois études
• Influence de la nature du tube de prélèvement et de la température de centrifugation
(4°C ou 16°C)
• Conservation du sang total à température ambiante versus dans la glace
• Conservation du plasma à température ambiante versus dans la glace
Nature du tube de prélèvement et température de centrifugation
Comparaison
- Tubes héparinés classiques centrifugés à 4°C ou 16°C
- Tubes héparinés avec gel séparateur (polymère acrylique BD) centrifugés à 4°C ou 16°C
- Tubes EDTA
Etude réalisée dans 4 labo / 2 prélèvements témoins par labo
- Clermont-Ferrand et Caen : technique échange d’ions
- Angers et Lyon : technique MSMS
Méthode d’analyse des résultats
– Condition de référence = tube hépariné classique centrifugé à 4 °C = valeur de 100%
– Variations exprimées en pourcentage par rapport à cette condition de référence (prise en
compte de la moyenne des % des 2 témoins)
– Interprétation tient compte de la répétabilité des dosages d’acides aminés estimée à 10%
60
70
80
90
100
110
120
130
Heparine 4°C Heparine 16°C Heparine gel 4°C EDTA 4°C
ALAARG
ASN
ASP
CITCYS
GLN
GLUGLY
HIS
ILELEU
LYS
MET
ORNPHE
PRO
SERTAU
THR
TYR
Résultats Caen
Orn, Glu
Tau
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
140
150
HEP 4° HEP 16° HEP GEL 16° HEP GEL 4° EDTA 4°
ALA
ARG
ASN
ASP
CIT
CYS
GLN
GLU
GLY
HIS
ILE
LEU
LYS
MET
ORN
PHE
PRO
#REF!
SER
TAU
Asp
Résultats Clermont Ferrand
Tau, Glu
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
HEP 4°C HEP 16°C HEP GEL 16°C HEP GEL 4°C EDTA 4°C
Ala
Arg
Asn
Asp
Cit
Cystine
Gln
Glu
Gly
His
IsoLeu
Leu
Lys
Mét
Orn
Phé
Pro
Sér
Tau
Thréo
Trp
Tyr
Val
Tau
Asn
Asp
Tyr
Cys
Résultats Angers
Résultats Lyon
0102030405060708090
100110120130140150160170180190200210220230240250
Heparine 4°C Heparine 16°C Heparine gel 16°C Heparine gel 4°C EDTA 16°C
ALA
ARG
ASN
ASP
CIT
CYS
GLN
GLU
GLY
HIS
ILE spé
LEU spé
LYS
MET
ORN
PHE
PRO
SER
THR
TRP
TYR
VAL
* Attention valeurs basses
Glu* Asp*
Gly
Cys
Conclusions
- Technique d’échange d’ions, pas de variations communes entre les 2 labo : pas
d’influence du type de tube ni de la température de centrifugation
- Technique MSMS : tendance à une inhibition avec l’EDTA : à éviter
� Recommandations générales
- prélèvement sur tube hépariné avec ou sans gel,
- centrifugation 4°C de préférence mais 16°C possible
- éviter EDTA
Conservation du sang total prélevé sur héparine
- à température ambiante
- à +4°C
pendant 0, 30 mn, 1h, 2h, 3h, 4h, 5h, 6h (sauf Lille, max = 3h30 ; + de temps
intermédiaires)
Puis congélation du plasma jusqu’à analyse (+ test de déprotéinisation immédiate à
Lille).
3 labo : Reims, Lille, Paris Necker (+ test sang EDTA)
Dosages de 2 témoins/labo
Analyse des données
- Calcul des variations en %, en prenant le T0 comme référence 100%
- Prise en compte des variations < ou > à 10% (moyenne des % des 2 témoins)
Sang total conservé à T ambiante : résultats Reims
0102030405060708090
100110120130140150160170180190200210220230240250260270280290300310320330340350360370380
T 0 T 30min T 60min T 2h T 3h T 4h T 5h T 6h
Thr
Ser
Asn
Glu
Gln
Gly
Ala
Cit
Val
Met
Cys2
Ile
Leu
Tyr
Phe
Trp
Orn
Lys
1Met
His
3Met
Arg
Pro
Orn
Glu
Arg
Cys
0102030405060708090
100110120130140150160170180190200210
T0 T30 T1H T2H T3H30
Ala
Arg
Asn
Asp
Cit
Cys
Gln
Glu
Gly
His
Ile
Leu
Lys
Met
Orn
Phe
Pro
Ser
Tau
Thr
Trp
Tyr
Orn
Glu
Arg
Cys
0102030405060708090
100110120130140150160170180190200210
T0 T30 T1H T2H T3H30
AlaArg
AsnAspCitCysGlnGluGlyHisIle
LeuLysMetOrnPheProSerTauThrTrp
TyrVal
Orn
Glu
ArgAsp
Sang total conservé à T ambiante : résultats Lille
Congélation du plasma
Congélation après déprotéinisation
Sang total conservé à T ambiante : résultats NeckerAttention cystine et acide aspartique non quantifiés
30405060708090
100110120130140150160170180190200210220230240
T0 T30 T1H T2H T4H
ASP
ASN
SER
SAR
GLN
GLY
GLU
THR
ALA
CIT
PRO
VAL
MET
TYR
ILE
LEU
PHE
HIS
ORN
TRP
LYS
ARG
Orn
GluAsn
Arg
Cit
héparine
EDTA
30405060708090
100110120130140150160170180190200210220230240250260
T0 T30 T1H T2H T4H
ASN
SER
SAR
GLN
GLY
GLU
THR
ALA
CIT
PRO
VAL
MET
Orn
Glu
Arg
60
70
80
90
100
110
120
130
140
150
160
170
180
190
200
210
220
230
240
250
260
270
280
290
300
310
320
T 0 T 30min T 60min T 2h T 3h T 4h T 5h T 6h
Asp
Thr
Ser
Asn
Glu
Gln
Gly
Ala
Cit
Val
Met
Cys2
Ile
Leu
Tyr
Phe
Trp
Orn
Lys
His
Arg
Pro
Asp (mais valeurs très
faibles)
Orn
Glu
Arg
Sang total conservé à 4 °C : résultats Reims
Sang total conservé à 4 °C : résultats Necker
Attention cystine et acide aspartique non quantifiés
70
80
90
100
110
120
130
140
T0 T30 T1H T2H T4H
ASP
ASN
SER
SAR
GLN
GLY
GLU
THR
ALA
CIT
PRO
VAL
MET
TYR
ILE
LEU
PHE
Glu Orn
Tyr
Héparine
Conclusions
- Sang total conservé à température ambiante
- Dès 1h de conservation du sang total, augmentation de l’ornithine avec diminution
concomitante de l’arginine
- puis ↑ acide glutamique (interpréter la somme Gln+Glu) et ↓ cystine
- Sang total conservé à 4°C
- Amplitude de variation moins importante
- Mais augmentation de l’ornithine avec diminution de l’arginine (>3h)
- Augmentation de l’acide glutamique (interpréter la somme Gln+Glu)
- à température ambiante
- à +4°C
pendant 0, 30 mn, 1h, 2h, 3h, 4h, 5h, 6h
Puis congélation du plasma jusqu’à analyse
2 labo : Paris RDB, Rouen
Dosages de 2 témoins/labo
Analyse des données
- Calcul des variations en %, en prenant le T0 comme référence 100%
- Prise en compte des variations < ou > à 10% (moyenne des % des 2 témoins)
Conservation du plasma hépariné
70
80
90
100
110
120
130
140
150
160
170
T0 T30 T1H T2H T3H T4H T5H T6H
PRO
ASP
THR
SER
ASN
GLU
GLN
GLY
ALA
CIT
VAL
CYS
MET
ILE
LEU
TYR
PHE
ORN
LYS
HIS
ARG
Résultats Rouen
70
80
90
100
110
120
130
140
150
160
170
T0 T30 T60 T2h T3H T4H T5H T6H
Tau
Asp
Thr
Ser
Asn
Glu
Gln
Gly
Ala
Cit
Val
Cys
Met
Ileu
Leu
Tyr
Phe
Orn
His
Lys
Résultats RDB
Plasma conservé à T ambiante
Glu
Glu
Cys
Cys
Plasma conservé à 4°C
80
90
100
110
120
130
T0 T30 T1H T2H T3H T4H T5H T6H
PROTAUASPTHRSERASNGLUGLNGLYALACITVALCYSMETILELEUTYRPHE
RouenGlu
80
90
100
110
120
130
T0 T30 T60 T2H T3H T4H T5H T6H
Tau
Asp
Thr
Ser
Asn
Glu
Gln
Gly
Ala
Cit
Val
Cys
Met
RDB
Conclusions
- Plasma température ambiante
- > 2H ↑ acide glutamique : interpréter la somme Gln+Glu
- > 3H ↓ cystine
- Autres AA : pas variation jusqu’à 6H
- Plasma 4°C
- > 3H : augmentation de l’acide glutamique : interpréter la somme Gln+Glu
- Autres AA : pas variation jusqu’à 6H
Résultats identiques à ceux présentés par Lyon à la réunion Biologie & Qualité
en 2013
1. Anticoagulant
– héparine (avec ou sans gel séparateur)
– éviter EDTA
2. Centrifugation
– recommandée à 4°C mais 16°C acceptable
– dans l’heure qui suit le prélèvement, sinon mettre le sang à 4°C (max = 3H)
– Au delà
• ↓ arginine et ↑ ornithine
• ↓ cystine
• ↑ acide glutamique : interpréter le bloc Gln+Glu
3. Conservation du plasma
– 1H à T ambiante , ensuite
• ↑ acide glutamique (>2H) : interpréter le bloc Gln+Glu
• ↓ cystine (>3H)
• Autres AA : pas de variation significative jusqu’à 6H
– 3H à 4°C, au-delà ↑ acide glutamique (autres AA pas de variation significative jusqu’à 6H)
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