Ana Škaričić, Ksenija FumićOdjel za dijagnostiku nasljednih metaboličkih bolesti i

novorođenački probir

KBC Zagreb

DOMETI I OGRANIČENJA TANKOSLOJNE

KROMATOGRAFIJE U LABORATORIJSKOJ

DIJAGNOSTICI METABOLIČKIH BOLESTI

Garrord AE.

Inborn errors of

metabolism.

Oxford University Press.

Oxford, 1909.

ALKAPTONURIJA

ALBINIZAM

PENTOZURIJA

CISTINURIJA

> 680

NASLJEDNE METABOLIČKE BOLESTI

RIJETKE BOLESTI

6.000 - 8.000

Vrlo rijetke, neliječive, uglavnom sa smrtnim

ishodom

Ugrožavaju život bolesnika, ali se ipak mogu u

određenoj mjeri i liječiti...

Mutacije gena za fenilalaninhidroksilazu

FENILALANIN

TIROZIN

Smanjena aktivnost

fenilalaninhidroksilaze

Povišena koncentracija

Fenilalanina-serum

Izlučivanje fenilpiruvične kiseline

-urin

Mentalna retardacija,

neurološki ispadi

PATOGENEZA - PRIMJER FENILKETONURIJE

KLINIČKASUMNJA

NACIONALNIPROGRAMSKRININGA

SPECIJALISTIČKAOBRADA

LABORATORIJ ZA

NOVOROĐENAČKI

PROBIR

LABORATORIJ ZA

SELEKTIVNI PROBIR

ORGANIZACIJA LABORATORIJSKE DIJAGNOSTIKE

NASLJEDNIH METABOLIČKIH BOLESTI

Racionalan pristup dijagnostici:

• osnovni testovi

(jednostavne metode probira)

• specifične dijagnostičke

pretrage (GAG, VLCFA, AK...)

• testovi potvrde

(aktivnost enzima i/ili

analiza gena)

Odjel za dijagnostiku nasljednih metaboličkih bolesti i

novorođenački probir

(SELEKTIVNI PROBIR)

Kromatografiju je izumio ruski botaničar Tswett (Cvet) početkom 20. st.

(grč. Chroma = boja)

E. Stahl - začetnik tankoslojne kromatografije (TLC), 1950

KROMATOGRAFIJA

Kromatografski sustav

analizirani uzorak nepokretna (stacionarna) faza pokretna (mobilna) faza

u kromatografskoj komori

TANKOSLOJNA KROMATOGRAFIJA

Rf (related to front) = faktor zaostajanja odnos udaljenosti koju prijeđe uzorak i udaljenosti koju

prijeđe pokretna faza

fronta otapala

TLC ploča

komponenta

B

startna

linija

komponenta

A

10 X 10 cm20 X 20 cm

TANKOSLOJNA (PLOŠNA) KROMATOGRAFIJA

STACIONARNA FAZA

celulozne ili silikagel ploče s

kemijski modificiranim tankim

slojem nepokretne faze

High Performance Thin Layer Chromatography, HPTLC

Automatizirano nanošenje uzoraka

CAMAG Linomat 5 uzorci se u formi

spreja uz pomoć dušika i komprimiranog

zraka nanose na TLC ploču

1 cm

NANOŠENJE UZORKA

prije kromatografiranja se

mogu zasititi parama

otapala: filtar papir natopljen

mobilnom fazom prisloni se

na stijenku komore

komore s ravnim dnom

komore s podijeljenim dnom(istovremeno razvijanje dviju ploča)

MOBILNA FAZA

KROMATOGRAFSKE KOMORE

CAMAG smartALERT Solvent Front Monitor

- za sigurno praćenje tijeka kromatografije- svjetlosni i

zvučni alarm

OTAPALO /SMJESA OTAPALA

KROMATOGRAFSKE KOMORE

MOBILNA FAZA

JEDNOSTRUKO RAZVIJANJE započinje čim otapalo nošeno kapilarnim silama počne putovati

na nekoj udaljenosti sile postaju preslabe da održe brzinu

pokretne faze

kada se otapalo približi gornjem rubu ploče, ona se izvadi iz

komore i osuši u struji zraka

JEDNODIMENZIJSKO VIŠESTRUKO

RAZVIJANJE kromatogram se razvija do određene udaljenosti, izvadi iz

komore, osuši i ponovo vrati u komoru

→ ponovi se postupak razdvajanja

može se mijenjati sastav mobilne faze (otapala)

omogućuje bolju razlučivost složenih smjesa

CAMAG automatska komora

za razvijanje (Automatic Developing Chamber, ADC2)

jednostavna, sigurna i

reproducibilna

potpuno automatizirano

razvijanje kromatograma

RAZVIJANJE KROMATOGRAMA

PRSKALICE

KOMORA ZA PRSKANJE

uranjanje ploče

u reagens

DETEKCIJA KROMATOGRAFSKI

RAZDVOJENIH SASTOJAKA

fino raspršena otopina reagensa

reagira s analitom

prskati treba cijelu površinu JEDNOLIČNO!!!

DERIVATIZIRAJUĆI REAGENSI

CAMAG TLC Visualizer 2 slikovni prikaz TLC/HPTLC kromatograma s

digitalnom CCD kamerom

CAMAG TLC Scanner 4

denzitometrijska evaluacija TLC/HPTLC

kromatograma

IDENTIFIKACIJA KROMATOGRAFSKI RAZDVOJENIH SASTOJAKA

CAMAG TLC-MS Interface 2 elucija TLC/HPTLC zona s online transferom

u spektrometar masa (MS)

IZ ANAMNEZE

-drugo dijete zdravih roditelja

-ima starijeg zdravog brata i dvije zdrave sestre

-dva majčina brata umrla pod nejasnim okolnostima

u ranoj dojenačkoj dobi

-trudnoća i porođaj uredni

-u dobi od 2 mjeseca u razdoblju od nekoliko dana

povraćanje iz nejasnog razloga

-u dobi od 2 godine ponovno epizoda povraćanja,

tada praćena i gubitkom svijesti

-oporavio se nakon trodnevne infuzije

-u dobi od 7 godina nakon povraćanja jednom do

dva puta dnevno u trajanju od 4 dana postao klonuo,

a uskoro i somnolentan

-zbog sumnje na intrakranijalni tumor upućen u KBC

-po primitku amonijak 123 mol/L

-CT mozga uredan

POSLANI UZORCI SERUMA I URINA (uzeti u vrijeme krize) u

Klinički zavod za laboratorijsku dijagnostiku, KBC Zagreb

Ilija, 8 godina

Ala

Glu

OTC

ILIJA

AMINOKISELINE

TANKOSLOJNA KROMATOGRAFIJA - kvalitativna metoda

PROBIR!!!

Minutes

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130

mV

olts

150

200

250

300

350

400

450

500

3,6

33

Ph

osp

ho

seri

n

1

6,3

00

Tau

rin

2

7,8

00

Ph

op

heth

an

ola

min

3

10

,59

9

Ure

a

4

21

,63

2

5

23

,83

2

Asp

ara

gin

acid

6

(H

yd

rox

yp

roli

n)

29

,19

8

Th

reo

nin

e

7

31

,39

8

SE

RIN

8

36

,09

8

Asp

ara

gin

9

38

,53

1

Glu

tam

icacid

1

0

40

,76

4

Glu

tam

in

1

1

42

,83

1

1

2

(S

arc

osi

n)

45

,93

0

Am

inad

ipic

Acid

1

3

48

,36

4

Pro

lin

1

4

49

,89

7

Gly

cin

1

5

51

,63

0

Ala

nin

1

6

(C

itru

llin

e)

55

,13

0

a-A

min

ob

utr

ic A

cid

1

75

8,4

63

Vali

n

1

86

2,6

63

Cy

stin

e

1

9

63

,99

6

All

ois

ole

ucin

2

0

66

,86

2

Meth

ion

in

2

1

(D

L/C

yst

ath

ion

ine)

(D

L/C

yst

ath

ion

ine)

72

,99

5

Iso

leu

cin

e

2

27

6,1

62

Leu

cin

e

2

3

78

,56

2

Arg

inin

osu

ccin

ic a

cid

2

4

81

,02

8

Ty

rosi

ne

2

5

82

,36

1

b-A

lan

ine

2

6

85

,12

8

Ph

en

yla

lan

in

2

7

(a

a-I

sob

uty

ric A

cid

)

90

,82

8

Ho

mo

cy

stin

e

2

8

(g

-Am

ino

bu

tyri

c A

cid

)

94

,66

1

Eth

an

ola

min

2

9

97

,32

7

Am

mo

nia

k

3

0

(H

yd

rox

yly

sin

)

10

4,4

93

Orn

ith

ine

3

1

10

7,8

60

Ly

sin

3

2

10

9,6

26

1-M

ety

lhis

idin

3

3

11

1,5

93

His

tid

in

3

4

(T

ryp

top

han

)

(3

-meti

lhis

tid

in)

(a

nse

rin

)

(k

arn

ozin

)

12

5,8

59

Arg

inin

e

3

5

570nm

Blaskovic Nikola

20092004002.dat

Retention Time

Name

Pk #

Glutamin = 2464 µm (ref.raspon:370 – 958 µM)

Citrulin = 0 µM (ref.raspon:9-35 µM)

Arginin = 44 µM (ref.raspon:6 – 130 µM)

Alanin = 2670 µM (ref.raspon:131 – 460 µM)

Uz orotsku kiselinu u urinu nalaz upućuje na

MANJAK ORNITIN TRANSKARBAMOILAZE

Fenilketonurija* Tirozinemija tipa I i II*

Neketotična hiperglicinemija* Leucinoza

Poremećaj sinteze serina* Homocistinurija

Cistinurija* Argininemija*

Citrulinemija* Manjak ornitin transkarbamoilaze

Lizinurička intolerancija

proteina*

Hipofosfatazija*

Argininosukcinična acidurija* Hiperornitinemija*

Hartnupova bolest* Hiperamonijemija Hiperornitinemija Homocitrulinurija

sindrom*

Manjak prolidaze* Manjak sulfit oksidaze

Poremećaji koje se mogu otkriti primarno mjerenjem aminokiselina*

NASLJEDNI METABOLIČKI POREMEĆAJI KOJI SE MOGU

DIJAGNOSTICIRATI MJERENJEM AMINOKISELINA

18 min

Pser

PEtN

Tau

Asn

Ser

Hyp

Gly

EtN

Gln

Asp

Cit

Thr

Sar

bAla

Ala

His

1MHis

3MHis

Glu

Asa

Hcit

Ans

Car

Aad

GABA

bAib

Abu

Arg

Hyp

Pro

Orn

Cth

Cys

Allolle

Lys

Met

Val

Nva

Hcy

Tyr

Lle

Leu

Nle

Phe

Trp

AMINOKISELINE

hepatomegalija, žutica, E.coli, zaostajanje u razvoju...

prekid unosa mlijeka - prehrana isključivo intravenski – GLC i AK

-Reduktivne tvari:

-TLC-šećera-Galaktoza u krvi:

-Galaktoza u mokraći:

-Organske kiseline u urinu: Značajno povišene 4-OH-fenilmliječna, 4-OH-fenilpropionska kiselina.

SUKCINILACETON NIJE PRISUTAN. Takav nalaz upućuje na oštećenje jetre nepoznate etiologije, a isključuje

tirozinemiju tipa I.

Neonatalna hemokromatoza –

Nedostatak alfa-1-antitripsina –

Poremećaji glikozilacije proteina -

Jetrena bolest nepoznate

etiologije ?!?

Tuga N.

laktoza

galaktoza

fruktoza

ksiloza

glukoza, galaktoza, fruktoza, laktoza,

manoza, ksiloza, homogentizinska kiselina,

sijalinska kiselina

LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA

REDUKTIVNE TVARI U MOKRAĆI TLC – MONO-DISAHARIDA

Tuga N – dobila mliječni obrok

1 sat iza toga izvađena EDTA-krv i uzet uzorak urina

PORUKA :

1. Kada u laboratoriju zaprimimo uzorak krvi i/ili mokraće, za

mjerenje galaktoze, uvijek odmah liječnika i pitati za

vrijeme uzimanja uzorka !!!

2. Ako se mjeri aktivnost galaktoza-1-fosfat uridil transferaze

(ERITROCITI), uvijek odmah pitati kada je dijete primilo

transfuziju krvi!

Galaktoza u krvi : 1980 mol/L

(referentni raspon nakon mliječnog obroka < 350 mol/L)

Galaktoza u mokraći : 8,9 mmol/L

(referentni raspon nakon mliječnog obroka < 3,33 mmol/L)

GALAKTOZEMIJA – PREDANALITIČKA FAZA

SFINGOLIPIDI

GLIKOGEN

OLIGOSAHARIDI

KOLESTEROL

GLIKOZAMINOGLIKANI

AMINOKISELINE

PEPTIDI

PROTEINI

MUTACIJE

LIZOSOMSKI ENZIMI

AKTIVACIJSKI PROTEINI

KLINIČKA SLIKA

LIZOSOMSKE BOLESTI NAKUPLJANJA

Dermatan sulfat

Heparan sulfat

Hondroitin sulfat

Središnji živčani sustav

Periferni živčani sustav

Poteškoće s vidom

Poteškoće sa sluhom

Teškoće s dišnim putovima

Kardiovaskularni problemi

Nutritivni i abdominalni problemi

Promjene na lokomotornom sustavu

11 tipova MUKOPOLISAHARIDOZA

MUKOPOLISAHARIDOZE - PATOFIZIOLOGIJA

Hondroitin

sulfat

Dermatan

sulfat

MPS tipa I, II, VI MPS tipa IV

Keratan

sulfat

5

4

3

2

1

1 2 3 4 5

RAZDVAJANJE GLIKOZAMINOGLIKANA- MUKOPOLISAHARIDA

iz 24-satnog urina izolirati glikozaminoglikane

GM1-GANGLIOZIDOZA GM2-SANDHOFF

M.POMPE -FUKOZIDOZA

-MANOZIDOZA -MANOZIDOZA

MPS IVB SIJALIDOZA

URIN

porcija

OLIGOSAHARIDI

Zbog nedovoljne aktivnosti enzima

kisele α-glukozidaze (kisele

maltaze) glikogen se nakuplja u

lizosomima svih stanica, a osobito

u skeletnom i srčanom mišiću

1: 30 000

Glikogenoza tipa II - Pompeova bolest

Manjak kisele α-glukozidaze

simptomi se javljaju u prvim mjesecima života

poteškoće hranjenja, zaostajanje u somatskom i psihomotornom razvoju, progresivna mišićna slabost, izrazita hipotonija, hipertrofična kardiomiopatija

hepatomegalija i makroglosija

gotovo svi umiru unutar prve godine života zbog zatajenja srca i respiratorne insuficijencije

INFANTILNI OBLIK POMPEOVE BOLESTI

prvi simptomi u ranom djetinjstvu

tijek bolesti je teži što se simptomi

ranije jave

simetrična slabost proksimalne

skupine mišića

hipertrofija listova

apneje u spavanju

osteoporoza, kontrakture zglobova

nakon 10-ak godina od pojave simptoma

– invalidska kolica i respirator

smrt do kraja 2. desetljeća života zbog

respiratornog zatajenja

JUVENILNI OBLIK POMPEOVE BOLESTI

www.eur.nl/FGG/CH/pompe/mutations.html

KLINIČKA SUMNJA

OSNOVNI LABORATORIJSKI NALAZI

CK, aminotransferaze

KONAČNA DIJAGNOZA

-glukozidaza - limfociti

- FIBROBLASTI- bioptat kože

u sterilnom hranilištu

ANALIZA MUTACIJA

U

R

I

N

POMPEOVA BOLEST-DIJAGNOZA

TANKOSLOJNA KROMATOGRAFIJA U

LABORATORIJSKOJ DIJAGNOSTICI NASLJEDNIH

METABOLIČKIH BOLESTI

vrlo korisna metoda razdvajanja

ekonomski isplativa

ne zahtjeva posebnu opremu

ALI...

traži iskustvo analitičara

ima svoje domete i ograničenja