35

DNA Mikroarray/DNA Mikrodizilimi: Hematolojide Kullan›m Alanlar›

Tayfun ÖZÇEL‹K

Bilkent Üniversitesi, Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü

DNA mikrodizilimleri DNA molekülünün ince-lenmesi için gelifltirilen en yeni tekniklerden biriolarak son y›llarda t›p ve hematoloji araflt›rmala-r›nda önemli bir yer edinmifltir. Gen ifade profille-rinin incelendi¤i "cDNA mikrodizilimi"nin en önem-li özelli¤i tek bir deney ile binlerce farkl› genin ifa-de profillerinin bir arada incelenmesini mümkünk›lmas›d›r. Bu tekni¤in özünde bir cam lam veyanaylon zar üzerine k›sa ve RNA sentezinde kullan›-lan yüzlerce/binlerce DNA hedef dizilimlerinin(3’ expressed sequence tags) yerlefltirilmesi ve ince-lenecek cDNA’n›n floresan/radyoaktif iflaretleme-nin ard›ndan yerlefltirilmifl DNA ile bir araya getiri-lerek iflleme al›nmas› bulunmaktad›r. Konuflmam-da cDNA mikrodizilimlerinin teknik özellikleri üze-rinde durmay›, dizilim üretimi, hedef DNA iflaretle-mesi, görüntü analizi, veri eldesi ve biyoinformatikyöntemleri ile sonuçlar›n de¤erlendirilmesi ve he-matolojide kullan›m alanlar› konular›nda bilgi ver-meyi istiyorum.

DNA mikrodizilimi teknolojisinin geliflmesi ‹n-san Genom Projesi ile yak›n bir paralellik göster-mifltir. Asl›nda, genom projeleri genifl çapl› genomaraflt›rmalar›n›n baflar› ile yürütülebilmesinde vegenlerin ifllevlerinin, çeflitli düzenleme mekanizma-lar›n›n tan›mlanmas›nda h›zland›r›c› olmufl, bu-nun da ötesinde yeni bir çal›flma alan› olan "ifllev-sel genomik" disiplininin do¤mas›na öncülük et-mifltir (1). Farkl› gen ifadelerinin kapsaml› incele-mesi ifllevsel genomik için bir dönüm noktas› ol-mufltur. Buna ba¤l› olarak, farkl› gen ifadelerininaraflt›r›lmas› için çeflitli teknikler gelifltirilmifltir (2,3, 4, 5, 6, 7, 8). Bir zar veya cam yüzeye cDNA’la-

r›n bir düzen içinde yerlefltirilerek incelendi¤i ilkbaflar›l› çal›flma bir bitki türü olan Arabidopsis’in45 farkl› geninin ifadesinin toplu olarak incelendi-¤ini çal›flma olmufltur (7). Daha sonra, binlerce ge-ni içeren yüksek yo¤unluklu mikrodizilimlerin ge-lifltirilmesi h›zl› bir flekilde gerçekleflmifltir. Günü-müzde, dünyada birçok laboratuvar cDNA mikro-dizilim sistemini kurmufl ve bu tekni¤in binlercegenin mRNA profillerini incelemekte çok faydal› ol-du¤unu göstermifltir. ‹nternet kullan›m› ile bu bil-gilere ulafl›labilir (Tablo 1).

Tablo 1. ‹nternet’te mikrodizilim kaynaklar›

Web sitesi ‹çeri¤i

www.gene-chips.com Mikrodizilim teknolojisinin temel kurallar›n›, kullan›m alanlar›n› ve teknik özelliklerini anlatan çok kapsaml› bir kaynak.

http://linkage.rockefeller.edu/wli/microarray Mikrodizilim veri analizi ile ilgili makale ve internet sitelerine ba¤lant› veren bir kaynak.

http://cmgm.stanford.edu/pbrown cDNA mikrodizilim teknolojisini bulanPat Brown’un laboratuvar›n›n ve Stanford Üniversitesi mikrodizilin grubunun sayfas›.

DNA Mikroarray/DNA Mikrodizilimi: Hematolojide Kullan›m Alanlar›ÖZÇEL‹K T.

XXX. Ulusal Hematoloji KongresiMezuniyet Sonras› E¤itim Kursu

36

cDNA mikrodizilimlerinin yayg›n kullan›m›ndaakademi-endüstri iflbirli¤i önemli bir yer tutmakta-d›r. Her yeni teknolojide oldu¤u gibi ilgili donan›msistemlerinin, analitik yaz›l›m programlar›n›n, bi-yolojik kaynaklar›n, istatistiksel ve biyokimyasalmetodlar›n gelifltirilmesine ve standartlaflt›r›lmas›-na gerek duyulmufltur. Pek çok araflt›rma labora-tuvar›nda ciddi zorluklarla karfl›lafl›lm›fl olsa da,gerekli malzemelerin güvenli bir flekilde kullan›l-mas› ile çeflitli dokular aras›ndaki gen ifade profil-lerindeki de¤ifliklikler saptanm›flt›r. Model sistem-lerde bilinen de¤iflikliklerin gözlenmesi ve yeni bu-lunan de¤iflikliklerin do¤rulanmas› ile bu sisteminperformans› de¤erlendirilmektedir. Bu çaban›nesas amac›, bütün insan genlerinin mRNA ifadele-rinin ayn› anda incelenmesi ve ç›kan sonuçlar›nbiyokimyasal ve hücresel biyoloji ile k›yaslanmas›-n› sa¤lamakt›r.

Birkaç farkl› mikrodizilim sistemi bulunmaklaberaber hepsinin ortak bir temeli vard›r. Mikrodi-zilimler üç ana gruba ayr›l›r: Zar üzerine sentezle-nen cDNA mikrodizilimleri (9), cam üzerine sentez-lenen cDNA mikrodizilimleri (10,11), ve oligonükle-otid mikrodizilimleri/DNA çipleri (12). cDNA mik-rodizilimi deneyleri birkaç bölüme ayr›l›r (fiekil 1).‹lk olarak özgün ve farkl› DNA hibridizasyon hedef-lerini içeren (ki bu hedeflerin her biri tek bir geni

temsil eder), yüksek yo¤unluktaki noktalama iflle-mi bir mikrodizilim halinde cam bir destek üzerineyap›l›r. Binlerce DNA noktas›n› içeren birçok dizi-lim sentezlenerek sonraki deneylerde kullan›labi-lir. Ard›ndan, her deney için floresan iflaretli cDNAiflaretleyicileri haz›rlan›r. Bu aflama iki ayr› hücretoplumunun mRNA eldesi ile bafllar. Daha sonra,her bir mRNA’n›n farkl› floresan boyalar kullan›la-rak ayr› ayr› ters yaz›l›m› gerçeklefltirilir. ‹ki farkl›iflaretleyici birlefltirilerek ayn› anda cDNA hedefle-ri ile bir araya getirilir. Daha sonra, bir lazer tara-y›c›s› kullan›larak ortaya ç›kan floresan ›fl›malartespit edilir. E¤er iki örnekten birinde herhangi birgenin mRNA düzeyi yüksekse, daha fazla cDNA sözkonusu gen ile etkileflime girer ve o örne¤in iflaret-lenmesinde kullan›lan floresan boya üstün geldi¤iiçin daha fazla ›fl›ma sinyali al›n›r. Belirli bir nok-tada iki iflaretli örne¤in floresan yo¤unluklar›n›noran› taray›c› ile belirlenir (fiekil 2). Ortaya ç›kansonuç bir veri taban›na aktar›larak incelenir. Buaflamada biyoinformatik yaklafl›mlar büyük önemtafl›maktad›r. Elde edilen verilerin incelemesi vebirçok farkl› deneyin karfl›laflt›r›lmas› için biyoin-formatik yaz›l›mlar›n kullan›m› mutlaka gereklidir.

Mikrodizilim teknolojisi, moleküler biyolojininhala yeni ama son derece güçlü bir araflt›rma ala-

fiekil 1. Mikrodizilim teknolojisi ile gen ifade profilinin incelenmesi aflamalar›n›n flematik gösterimi.

RNA eldesi Klonlanm›fl ve

dizi analiziyap›lm›flcDNA kitapl›¤›

Hücreler, dokular,mikroorganizmalar Nümleik

asitleriniflaretlenmesi

Dizilimlehibridizasyon

“Klon”lar›n sentezlenmesi vedüzenli bir dizilimolarak haz›rlanmas›

Digital görüntüleme ilehibridizasyon sinyal

yo¤unluklar›n›nincelenmesi

RNAeldesi

XXX. Ulusal Hematoloji KongresiMezuniyet Sonras› E¤itim Kursu

37

ÖZÇEL‹K T.DNA Mikroarray/DNA Mikrodizilimi: Hematolojide Kullan›m Alanlar›

n›d›r. Hematolojide multipl miyelom, monoklonalgammopati, kronik ve akut lösemiler, lenfomalargibi farkl› malign hastal›klar›n moleküler s›n›fla-mas›nda kullan›lmaya bafllam›flt›r. Gen ifade pro-fillerinin araflt›r›lmas›n›n yan›nda DNA mikrodizi-limleri mütasyon taramas›, genotipleme, genlerinve klonlar›n haritalanmas› ve kromozom mikrode-lesyonlar›n›n incelenmesinde kullan›lmaktad›r.Önümüzdeki y›llarda gen ifade profili incelemesi-nin hematolojik hastal›klar›n tan›s›, hastal›k altgruplar›n›n belirlenmesi, tedavi seçeneklerinin de-¤erlendirilmesi gibi alanlarda yayg›n olarak kulla-n›lmas› beklenmektedir.

KAYNAKLAR

1. Collins F.S., Patrinos A., Jordan E., Chakravarti A.,Gesteland R., Walter L. New goals for the U.S. Hu-man Genome Project: 1998-2003. Science. 1998;282: 682-689.

2. Adams M.D., Kelley J.M., Gocayne J.D., Dubnick M.,Polymeropoulos M.H., Xiao H., Merril C.R., Wu A.,Olde B., Moreno R.F., et al. Complementary DNA se-

quencing: expressed sequence tags and human ge-nome project. Science. 1991; 252: 1651-1656.

3. DeRisi J., Penland J., Brown P.O., Bittner M.L., Melt-zer P.S., Ray M., Chen Y., Su Y.A., Trent J.M. Use ofcDNA microarray to analyze gene expression pat-terns in human cancer. Nat. Genet. 1996;14: 457-460.

4. Hubank M., Schatz D.G. Identifying differences inmRNA expression by representational differenceanalysis of cDNA. Nucleic Acids Research. 1994; 22:5640-5648.

5. Liang P., Pardee A.B. Differential display of eukaryo-tic mRNA by means of the polymerase chain reacti-on. Science. 1992; 257: 967-971.

6. Lockhart D.J., Dong H., Byrne M.C., Follettie M.T.,Gallo M.V., Chee M.S., Mittmann M., Wang C., Koba-yashi M., Horton H., Brown E.L. Expression monito-ring by hybridization to high-density oligonucleotidearrays. Nature Biotechnology. 1996; 14: 1675-1680.

7. Schena M., Shalon D., Davis R.W., Brown P.O. Qu-antitative monitoring of gene expression patternswith a cDNA microarray. Science. 1995; 270: 467-470.

8. Velculescu V.E., Zhang L., Vogelstein B., Kinzler

fiekil 2. GenePix 4000 taray›c›s›ndan (Axon) elde edilen cDNA mikrodizilim görüntüsü. K›rm›z› noktalar ilgili gene ait test cDNA sinyalinin referans cDNA sinyalinden yüksek, yeflil noktalar düflük, sar› noktalar ise eflit oldu¤unu göstermektedir.

DNA Mikroarray/DNA Mikrodizilimi: Hematolojide Kullan›m Alanlar›ÖZÇEL‹K T.

XXX. Ulusal Hematoloji KongresiMezuniyet Sonras› E¤itim Kursu

38

K.W. Serial analysis of gene expression. Science.1995; 270: 484-487.

9. Cox J.M. Applications of naylon membrane arrays togene expression analysis. J. Immunol. Methods.2001; 250: 3-13

10. Hegde P., Qi R., Abernathy K. et al. A concise guideto cDNA microarray analysis. Biotechniques. 2000;29: 548-556.

11. van Hal N.L., Vorst O., van Houwelingen A.M. et al.The application of DNA microarrays in gene expres-sion analysis. J.Bi›technol. 2000; 78: 271-280.

12. Lipshutz R.J., Fodor S.P., Gengevas T.R. et al. High-density synthetic oligonucleotide arrays. Nat Genet.1999; 21: 20-24.