Diurnal Regulation of the G Protein G11α and Guanine Nucleotide-regulated Phospholipase C Activity...

4
LETTER TO THE EDITORS Diurnal Regulation of the G Protein G 11 a and Guanine Nucleotide-regulated Phospholipase C Activity in Rat Retina Mammalian photoreceptors have been shown to express the molecular components of a G protein- regulated phosphatidylinositol signaling pathway, including the phospholipase C isozyme PLC-b4, the G protein G 11 a that could regulate its activity (Peng et al., 1997) and several calcium-dependent protein kinase C isoforms (Osborne et al., 1992). Protein kinase C phosphorylation of many visual signal transduction components have been shown including rhodopsin (Newton and Williams, 1993), transducin (Zick et al., 1986), arrestin (Weyand and Kuhn, 1990), cGMP- phosphodiesterase subunits (Udovichenko et al., 1994), and guanylyl cyclase (Wolbring and Schnet- kamp, 1995). Despite all this information the role of the G 11 a protein and its target phospholipase C-b4 protein in vertebrate photoreceptors have remained illusive. Studies in a number of vertebrate species have given con¯icting results when light activation of inositolpho- spholipid metabolism was tested and recent studies of PLC-b4 null mice have failed to show any abnormalities in phototransduction (Jiang et al., 1996). Furthermore, introduction of protein kinase C inhibitors or activators into ROS isolated from frogs failed to in¯uence phototransduction (Jindrova and Detwiler, 1998). Together, these studies do not suggest a role for the phosopholipase C system in phototransduction. The present study in the mammalian retina was undertaken to try and identify the temporal pattern of G 11 a expression and phospholipase C activation. In our study, adult male Wistar rats were housed under 12 hr light/12 hr dark conditions for 1 week before being used in experiments. All animals were treated in accordance with the ARVO Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research, and with institutional approval. To quantitate the content of speci®c G protein subunits eyes were removed from groups of six rats at 3 hr time intervals from the time of light onset (7:00 hr) for 24 hr. At each time point, the eyes were divided into two groups of six each for protein and RNA extractions. Eyes were harvested, enucleated and retinas isolated within 5 min of killing. Total protein was extracted by incubating two retinas in 600 ml of extraction buffer (10 mM Tris±HCl pH 7 . 5, 10 mM NaCl, 1 . 5mM MgCl 2 , 0 . 5% (w/v) deoxycholate, 1 % (v/v) Tween 20, 100 mM (4-92- aminoethyl benzenesulfonyl¯uoride, HCl)). Tissues were vortexed vigorously and incubated on ice for 60 min followed by centrifugation at 15 339 g for 20 min at 48C. G proteins in tissue extracts were quantitated by immunoblotting by methods previously described (Mitchell and Bansal, 1997) using poly- clonal antiserum selective for G 11 a protein (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, U.S.A.) or antiserum that selectively recognized G t a raised in rabbits against puri®ed bovine G t . The amount of G 11 a in each retina was determined by comparison of samples to a set of recombinant G 11 a protein standards run on the same gel. Similarly, G t a protein levels were determined by comparison of retinal extracts to a series of standards of puri®ed bovine G t a. It has previously been established that G 11 a and G t a are only expressed in photoreceptor cells in the rat retina (Peng et al., 1997). Quantitative assessment of these G protein subunit levels in the photoreceptors of adult animals at 3 hr intervals revealed considerable variation of the amount of both G 11 a and G t a with time throughout the 12 hr light/12 hr dark cycle. As shown in Fig. 1(A), the levels of G 11 a ranged between a low of 1 . 78 + 0 . 74 pmol per retina at 10:00 hr, 3 hr after onset of light, and 8 . 03 + 3 . 27 pmol per retina at 22:00 hr, 3 hr after onset of dark. The variation in G 11 a protein levels was signi®cant (ANOVA analysis P 5 0 . 0001). The pattern of variation of G t a was quite different from that seen for G 11 a.G t a levels increased over the ®rst 6±9 hr of light to a peak of 540 + 65 pmol per retina at 16:00 hr. This level was maintained until the onset of dark and then followed by a decline in the total amount of G t a to 224 + 46 pmol per retina over the next 3 hr, and these lower levels were maintained with some variability throughout the hours of dark. The variation in G t a levels was also signi®cant (ANOVA, P 5 0 . 0001) and is in agreement with previous studies showing increased G t a immunoreac- tivity in rat photoreceptor inner segments during the daytime (Brann and Cohen, 1987). Since the change in G t a protein levels were reported to follow a rise in G t a mRNA at the end of the dark period (Brann and Cohen, 1987), we examined the amount of mRNA encoding the G 11 a protein in the same groups of animals as those used to examine the protein levels. The amount of mRNA encoding G 11 a was assessed by semi-quantitative RT±PCR by methods previously described (Wang and Mark, 1990). The primers used for G 11 a mRNA were sense 5 0 -ACGTGACCGCATCGCCACAGTAG-3 0 and antisense Exp. Eye Res. (2002) 75, 371±374 doi:10.1006/exer.2002.2006, available online at http://www.idealibrary.com on 0014-4835/02/$35.00/0 # 2002 Elsevier Science Ltd.

Transcript of Diurnal Regulation of the G Protein G11α and Guanine Nucleotide-regulated Phospholipase C Activity...

������ �� ��� ������

������� �������� � �� � ������ �������� ��� ��������������������� ������������ � �������� �� ��� �����

��������� ���� ���� ���� ���� ���� ������� �� ��� ���� ������ � � � �������������� ��������������� ��������� ��������� ������ �� ����������� � ������ ������� ��� ����� � � �� ��� ������� �� � ���� !����� ��"� ##$% ��� ������� �� ������������ �����&����� � ������ !'����� � ��"� ##(%" ����� &������ ����������� � ���� ������ ������ ������ �� ������ ���� ���� ���� �� ������ �������!)��� ��� *�������� ##+%� ������ �� !,� & � ��"� #-.%� ������� !*����� ��� /���� ##0%� ������������������ ������� !1��� ���& � ��"� ##�%� ��� �������� � ���� !*������ ��� 2 ����&���� ##3%" 4����� ��� ��� �������� �� ��� � ��� � ����� ��� �� ���� ����������� ���� ������� �������� ���� ���� ���� �������� ��������"2����� �� � ������ � �������� ��� ��� ���� ����� �5� ��� ������ ���� ���� � ����� � ���������������� �������� ��� ���� ��� �� �� ������ ������������� � ���� ������ ������������������� �������� �� !6���� � ��"� ##.%" 7�������������� �� � ����� &����� � �������� � � ������� 8'2 ������ ��� ���� ������ ��5��� ��������� �� !6������ ��� 4������� ##-%"9������ ���� ������ � � ������ � ��� �� ������������� � ����� �� �������� ��"9�� ������ ���� �� �� ��������� ����� ���

������&�� �� ��� ������� �� ������ ����� �� � ��������� ��� ����������� � � �����" :��� ����� ���� ���� *���� ��� ���� ����� ����� ( �� ����; ( �� ���& ������ �� ���& ���������� ���� �� ����������" <�� ������� ���� ����� ��� ���� � ��� �� <8=' 2����� �� �� 1�� �<������ �� '������� ��� =���� 8����� �� ��� ������������ �������" 9 >������ �� ��� ���� �? � ����� ������� ���� ���� ������ �������� � ��� ��� � + �� ��� �������� ��� �� ���� ���� ��� !$@00 ��% �� (� ��" < �� � ��� ������ ���� ���� ������� �� � ����� � ��� �� � ������� ��� 8)< ���� ���" A��� ���� ������������ ����� ��� ������ ������ ����� 3 ��� � &������"9�� ����� ��� ���� �� �� �� ������ � �������� .00 �� � ���� �� ������ ! 0 �� 9���BC�� �C$"3� 0 �� )���� "3 �� ����(� 0"3D !�;�%���� ����� D !�;�% 9���� (0� 00 �� !��#(��������� ��������������5������ C��%%" 9���������� ������ �������� ��� �� ����� � � � ��.0 ��� ������ �� ���������� � 3 ++# � ��

(0 ��� � ���" � ������ �� ����� ���� � ����>������� �� ���������� ������� ������������ ����� !�� ���� ��� E������ ##$% ����� ���� ���� �������� ���� ��� �� � � ����� !2��� ����E�� ������ 2��� ����� �<� 1"2"<"% � ���������� ���� ����� �� ������ �� ������ �� ������ ����������?�� ����� �" 9�� ���� � � � �� �� � �������� ��������� �� ������� � ������� � �� ��� ������ � � ����� �������� ��� � �� �������" 2��������� �� ����� ������ ���� ��������� �� ������� � ������ ���� � � ������ � ��������� ����?�� ����� ��" : ��� ��������� �������������� �� � � ��� �� ��� ��� ��������� ������ ��� ���� �� �� �� ����� !���� � ��"� ##$%" F�������� ��������� � ���� � ����������� ������ �� �� ���� ���� � ���� ������� �+ �� �������� �������� ���������� ������� � ������ � �� � � ��� �� ��� ��� �������� ( �� ����; ( �� ���& � ��" <� ���� ��7��" !<%� �� ������ � � � ������ ������ � �� � "$-� 0"$� ��� ��� ����� � 0@00 ��� + �� ������� � ����� ��� -"0+� +"($ ��� ��� ����� �((@00 ��� + �� ���� ��� � ���&" 9�� ������� ��� � ����� ������ ��� �����? �� !<)'=< ��������� � 0"000 %"9�� ����� � ������� � �� ��� >��� ��������

��� �� ���� �� � �" �� ������ �� ������ ��� ��?�� .B# �� � ���� � ���& � 3�0� .3 ��� �������� � .@00 ��" 9��� ����� ��� ��������� ������ ��� � ���& ��� ��� ������ �� � �� ���� �� ���� ���� � �� ((�� �. ��� ��� ����� ����� ��� + ��� ��� ���� ���� ������ ���� ������������ ��� ���������� ������ �� ���� � ���&"9�� ������� �� �� ������ ��� ��� �����? ��!<)'=<� � � 0"000 % ��� �� �� �������� ���������� ������ ������ �� ������ �� �������� ����� �� �� ���� ��� ����� ������� ������ �������� !E���� ��� ����� #-$%"2�� � �� ����� �� �� ����� ������ ���� ������

���� � ���� �� �� �8)< � �� ��� � �� ���&����� !E���� ��� ����� #-$%� �� �������� ������ � �8)< �� ���� �� � � ����� ���� ���� ����� � ������� �� ��� ���� ��������� ����� ������" 9�� ���� � �8)< �� ����� � ��� �������� �� �����>�������� 89B��8 ������� ��������� ��� ����� !*��� ��� ���&� ##0%" 9�� ������� ���� �� � � �8)< ���� �����3��<��9�<����<9����<�<�9<��+� ��� ��������

���� ��� ��� !(00(% ��� +$ B+$���@ 0" 00.;����"(00("(00.� ��������� ����� � ��@;;���"�����������" � �

00 ���-+3;0(;G+3"00;0 � (00( A������� 2 ��� � ��"

3���<9����99�9�<99�9�9�<�9�+� ���������� ��>��� �� �-$B3 0 ��� $( B$�� � ���� � � 4)< !2������� ��� 2���� ##0%" -2 �8)<������� ��� �� �� ���� � 8)< �� �� � ��� ���� ��������� ��� ����� !9� ����&� � ��"� #-+%" ��8��� �������� ��� �� ������ ��������� � �� � #3���� +00 �� � . �� �� +0 �� � $(�� �� .0 �� � ��� (- � ��� � #3�� �� +0 �� � . �� �� +0 �� � $(�� ��.0 �� ��� � ?��� ������� � �� � #3�� �� +0 �� �. �� �� +0 �� � $(�� �� +00 �� " ��8 ���� � ����������� � (D ������ ����� ������ ��� =���� �����!<������� ������ �� E�� �� '�&������ ')� 1"2"<"%��� � ����� ��� � �����:����� !��� ����4����� �� ')� 1"2"<"%" :����� ������ ���� ������������� � ����� � ������� � ������� ��� � ��������� �� �� ��8 ��� ��� �������� �� ����������� � ��� �� � ��8 ���� � ��� �� ������8)< �������" <� ���� �� 7��" !E%� �� ���� ��8)< �� ���� � � ������ �� � ������� ������ �� ���� �� �� ������ �� ������� ������� ���� ���� ���&� ��� �� ������� �8)< ����� ���� ����# �� � ���&" 9�� ���� � �8)< �� ���� � ��� ����� ��� �� �� �� ���� � �� ���& � �� ����������� �� ������ �� ( �� � ����!7��" !E%%" 2�� � �� ������ �� � � ����� ����8)< ������ ��� � ���� � ����� ������ ����� ���� �� �� � ��� ����B���� ��������������� ��� ������ �� ������ �� �8)< �� ����� � ������� ������ �� ��� � ��&��� ���� ��� �� ��� ������� �� ������ �� ����� ���������� �� �� �����"*� ��� �������� �� �� ������ �� � � �����

������� �� �� ������ � ������� ����� ������������ � � ���� �� �� �����" 7� ���� ���������� ���� 8'2 ���� �������� �� ��������� ��� �����!� 4����� ##+% ��� ����� � 0 ������ �&����� ������� � ����� + �� �� �� ���� � ��� ����� � ������ ���� ����� � + �� �� �� ���& � ������� � � ������ ���� � ���� ������" �:�(��������� �� ������ ���� ��� ���������� ����������� �� ��� ����� ��������� !�� ���� � ��"� ##3%" <� ���� �� 7��" !�%� �9��2�������������������� � � ���� ��� �� ������ ("3���� ��8'2 �������� ��� ������� ������ �� ���& ���� ������ 8'2 �������� ��� ������� �� �� ����"2�� � �� ������ � � � ����� ��� �8)< ������

��� �� ����;���& � ��� �� ������ ������� �� ��� � �� ��� �� ����� � ������� �� �����" 9 �� ����� � �������� � � �� ����� � ������� ������� �� �� ���� ���& �� + ���� ��������� � ,9 (������� � ����& ��������� �� ( �� ����; ( �� ���& � �� � �� ��� �������" 8��������� � ���� �������� � �� � ��� � �� ����!,9 3� + �� ���� ������ ��������� � ���&% ��� ��!,9+� + �� ���� ������ ��������� � ����% ���� �� � ���������" <� ���� �� 7��" (!<%� �� �� ������� � � ������ ��� ��������� �� ���� ������� �� ������� � � � ���� ����� �� �� ?�� ($ �� �� ����� ��� ��� ������� ������� ���� ���&"

7:�" " F������� � � �� �� ����� ������� � ��8)< ������ ��� � �������������� ����������� �� ���� �� �� ������ � �������� ���� ������ � ( ������; ( �� ���& � ��" !<% 8����� �&�� ��� ������� &������ ���� ��� ���� ������ �� (� �� ����;���& � ���!,90 � $@00 ��%" 9�� ���� � � � ����� ��� ������� ��� �������� �� >�������� ����������" 9�������� ���� ��� �� ������ 2"A" �� ���� ����������������� � �� � ��� ��� �������� �� ���� �����������������" !E% 9�� ���� � �8)< �� ���� � � ����������� ��89B��8 �� ��� ������ �&�� ���������� &����� ����� ��� ���� ������ �� (� �� ����;���& � ��" =��������� ��� �� ������ 2"A" �� ���� ���������� ������� ��� � ��� ���" !�% ����������� � � ���� �� 8'2 ����������� ������� ��� ���� !,9 3% ��� �� !,9+% ��������������� � � � �����" ����������� � � ���� �� 8'2�������� ��� �������� �� �� ���� �� � H+CI�:�+ ���H+CI���������������� ��3����������� �� �� ������ � � 0 �� ���� ��(� !�����% � 0 ������� ��(� ��� 0 ���9��2 !�9��2%" 9�� ������ ���� ��� �� ������ 2"A" ����� ������� ����������" � :��� ��� ������ �����? ������ ������ ��� ��� � ,9+ ����� 2����J� ��� !� � 0"03%

�� ������ �� ��� ������

*��� ������� ���� ��������� �� ���� ���� ��� ������ �� � � ������ ��� �� ����� �� ?��($ �� ��� ������ � � � �������� �� � ��� ������������ ������ + ���� ������� �������� !7��" (!E%%" 9���� ��� ������ �� �� �� ������������ �� ����� � ��������� � �� � � ������� �� ����� ��� ������� �� ������ ��>������

��������� ������ � ���� ��� ���& ������� ������� � ��������" <����������� �� ������ � � ���� ���� � ���& ��� ���� ������ �� ����� �� � � ������� �� �� ����� ��� �� ��� � ��� ��� �� ��������� ��� � ��� ���� �� � ���" 9�� ��� ���������� �� �������� �� ���� � �������� � ���& � �� ������ � ��" 9�� ������ � ������� ������ ��� ������� ���� ��� �� � ������� �� ������� ��������� �� �������&���� �� � ���� �� ��� ���� �� ������� ������ ����� � �� ���� ������ !7��" (!�%%" 9�� ������� �� ������ � ����� �� ������� �� ������������� �� ���� ���� �� � ���� !7��" (!�%%"9�� �������� � �� ��� �������� �� �� ����� ������� �� � ��� ��������� �� �� ����� � � ���������� �� �������� ��� ���� ����":� � ������ �� ��������� �� ���� ������ �

� � ���� �� �� ���& ����� � � ����;���& ����� � ��������� �� � ������� ������� ��� � ������� ���� �� ����� �� � �������������� ����������� �� ����" 9������ ���� ������ ������ � ��� ���� � �������������� ����������� � ����� ������������ �� ���& ��� � ���� ����"

�������� ���

9��� ��& ��� ������� �� � ���� ��� �� 8� 8����� �7�������7������ E��������� ��� �� ���������� ���7��� 7� 2��� 4������ � ������ E�������� <���� � !8"�" ��� 2"/%

�� �� ��������� ����������� ��� ��������������� ������ ���� ���������� ����� ����� ������� ��� ���� ������

K<������ ��������� � @ 6��� �� ����� 4������� ������� ���� 1�������� � 9��� /���J� ������ ��� ��� 8��+�(� 9��� '���� �32 <-� ������" A�����@ L���"�� ����M���" �

������

E����� �" 8" ��� ����� �" =" ! #-$%" 4������ ��������� ������� �� �8)< ��� ����� ��� � ������ �� ����� � �� �����" �� ���� ���� 3-3B$"

E���� �"� =�� =���� 9" ��� 7����� 4" E" ! #--%" '������������ ��� �-�&4� ����� �� ����� ��� �� ����������@ ����������� ��������� � �8)<� ��������� ��� ����;���& � ���� � �8)<�" ���� ������ ��� +.#B#0"

6����� C"� �������&�� <"� 4��� 8"� =����� )"� ����� A"�E����� 4"� 2���� �" :" ��� *�� 4" ! ##.%" ������������ � �� �� ������� �� �������� �� ������������� �� �� �" ����� ��� ����� �� � ������ ��� �3#-B.0 "

6������� C" ��� 4������� �" E" ! ##-%" ����� &����� � ���:�+ �� ���������� � ��� ������ ��� �� ����������@ ������� ��� ���� ���" ��� ��� ��� ���(-3B#0"

� 4����� 6" C" ! ##+%" ��������� �� ��� ������ ����������� ����������� �������� ��� ���������� ���

7:�" (" A��� � ���� ���& � ���� ���� ������� ������� � �� ������ � � � � �� ������ �� �� ������� ���� � ���� ��� �� ����� ���������" !<% ����� �������� ���� &�� �� ���� ���&���� �� �� ���� ��������� � ���� ������� � ���& ��������� �� ��� ����;���& � ��" !E% ����� � ������� ���� &�� �� ���� ���� �� �� ���� ��� ������ � ����" !�% ������ ������� ���� &�� �� ���� ���& � ���� ���� �� �����" 9�� ������ ���� ��� ������ 2"A" �� ��� ������� ��� � ��� ���" �:��� ��� ������ �����? ���� ����������� ��� � ��� ������� ����� 2����J� ���!� � 0"03%

������� ���������� �� ��� � ������� �� ��� ������ �

����� � ������" :�@ ����������� ����" !C���������" <"� A�"% ��" (+B+0" < ����� �����@ 2�� 4���� �<�1"2"<"

�� ����� 6" ��� E������ <" ! ##$%" 4��������� �� ��������>� ��������� ��� �������������� ������������ � � ���� �� 1�8� 0.�0 ����" ��� �� ��� ������� A3(-BA3+3"

�� ����� 6"� ��������� 6" ��� )����� 6" /" ! ##3%"����? ���� ���� �������� ��� ������ ���� � ����>��� � � � � ������� ����� ����������� � ����>��� ���� ����" �� � ��� ����� ���� -3�B#"

)���� <" �" ��� *�������� 4" 2" ! ##+%" 8������ �� ����L� �� ��� ������� � ����� &����� � �� �� ���������� � ���� ��� ���������" �� � ��� ��������� - - B#."

'������ )" )"� E����� )" �"� ������ )" 6" ��� C����� 7"! ##(%" 9�� ���� � � ���� ������� � �����&����� � !�� � ��� �% �� ������ � �������� ��� ���" ��� ���� ���� . B."

����� N"�*"� 8���� 2" �"� C� N"�/"� 2 ���� 9"� ������� �" 6"��� N��� /"�*" ! ##$%" :����? ��� � ������ �� ������������ ��������� ������ �� ������ �� ����������" ����� ��� ����� �� � ������ ��� ##3B(000"

2�������� �" ��� 2���� �" :" ! ##0%" � �������������@ � ����� ���� � ����� ������� �� �������� ��������� ��� �����������" ����� ��� ����� �� ������� ��� # +B$"

9� ����&�� 8" �"� E���� <" �" ��� 7�&�� �" ! #-+%" 9�� ����� �� ����� ��>��� � � �� �� -2 �������8)< ���� ��� ������� ��� �� ����� ��� ������� ��� �����" ����� � �� � ��� ��� �-$#B#0"

1��� ���&� :" �"� ����� &� 6"� �������� /" ��� 9�&���4" 6" ! ##�%" 7�� ���� ���� � ����������� � ������ ��� �������������� �������� ������ ������� &����� �" �� � ��� ����� ���� #-30B."

*���� <" �" ��� ���&� 4" 7" ! ##0%" :�@ ��� �������"!:����� �" <"� �������� 4" C"� 2�����&�� 6" 6" ��� *����9" 6"� A��"% ��" $0B3" < ����� �����@ )�� N�&� )N�1"2"<"

*������ :" ��� /���� C" ! ##0%" 2����� ��� � ���������� ����� �����" A>��� ��� ���� ������� ����� ��� ������� �� ������ ����� �� � ������������� �� �����������" ���� �� � ������ �����3#B.$"

*������� �" ��� 2 ���&���� �" �" �" ! ##3%" < ������� �/� � �� �� ������������ �������� � ���� ������� ������ �� ��� ������� �������� ��� ���� �� �����" � ����� �� ��� �.-#B#3"

,� &� N"� 2����A��������� 8"� ������ �"� ����� ��&� �" ���2������� <" �" ! #-.%" ������� ����������� � ��� ������ � ������ �� �� �� ������� �� ��� &�������� ����� &����� �" ����� ��� ����� �� � ������ ���#(#�B$"

� � ����� !" #���$�� !%%�� � ����� �� ������� �� %& ����� !%%!%

�� ������ �� ��� ������