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UFOP - CETEC - UEMG
REDEMATREDE TEMÁTICA EM ENGENHARIA DE M ATERIAIS
UFOP – CETEC – UEMG
Dissertação de Mestrado
"Avaliação e Caracterização de Membranas de Celulose
Microcristalina Regenerada para uma Potencial Aplicação
em Cicatrização de Feridas Crônicas”
Autor: Elke Margareth Fernandes Lemos
Orientador: Prof. Dr. Cláudio Gouvêa dos Santos
Co-orientador: Prof. Dr. Herman Sander Mansur
Março de 2008
UFOP - CETEC - UEMG
REDEMATREDE TEMÁTICA EM ENGENHARIA DE M ATERIAIS
UFOP – CETEC – UEMG
Elke Margareth Fernandes Lemos
Avaliação e Caracterização de Membranas de Celulose
Microcristalina Regenerada para uma Potencial Aplicação
em Cicatrização de Feridas Crônicas
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Ciência e Engenharia de
Materiais da REDEMAT, como requisito parcial para
a obtenção do título de Mestre em Ciência e
Engenharia de Materiais.
Área de concentração: Biomateriais
Orientador: Prof. Dr. Cláudio Gouvêa dos Santos
Co-orientador: Prof. Dr. Herman Sander Mansur
Ouro Preto, Março de 2008
iii
DEDICATÓRIA
A Deus e ao cosmos, pelo fato do universo sempre ter conspirado a meu favor, me
dando fé e perseverança. “Eu e o Universo somos um.”
A minha “Yoga” e a minha meditação constante, por ter me oferecido equilíbrio e
sabedoria nas escolhas ao longo da vida. “Olhe para o seu coração e siga sua natureza“
(Buda).
Aos meus pais por terem me dado a vida e a oportunidade de estar aqui e evoluir mais
uma vez, nesta passagem pela existência humana.
Ao meu sobrinho Igor Gustavo de nove aninhos, que agüentou meu mau-humor e
ausência quando ele mais queria soltar pipa.
Ao meu querido gato “chuchu” por todo carinho e compreensão nos momentos de
desespero e ansiedade, que sempre, sempre ficou deitado ao lado do computador
olhando pra mim com seu meigo e doce semblante e que está comigo desde o início
desta jornada.
A Chico Xavier por ter me ensinado TUDO sobre Amor e Compaixão:
“A caridade é um exercício espiritual. Quem pratica o bem, põe em
movimento as forças da alma. “
“Tudo tem seu apogeu e seu declínio... É natural que seja assim;
todavia, quando tudo parece convergir para o que supomos o nada,
eis que a vida ressurge, triunfante e bela!... Novas folhas, novas
flores, na indefinida bênção do recomeço!...”
iv
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador e professor Cláudio Gouvêa dos Santos, que aceitou este desafio
de entrar comigo na área de Biomateriais, agradeço por toda a sua dedicação, força e fé
nos desígnios da vida. Nunca vi uma pessoa tão animada quanto ele!
Agradeço ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
(CNPq), à Fundação de amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) e à
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo apoio
financeiro a este projeto, que sem esses recursos seria impossível atravessar mais esta
etapa.
Ao meu co-orientador Professor Herman Sander Mansur, por me aceitar na UFMG
com otimismo e grande entusiasmo e por sua constante disponibilidade em me atender
mesmo quando estava atarefado, agradeço sua eficiente postura profissional.
Ao meu professor Sidney, por ter me ensinado com exclusividade sobre ciência dos
biomateriais e por ter acreditado no meu trabalho.
Ao meu professor Antônio Vassalo, pela sua dedicação e interesse na minha
pesquisa, estando sempre disponível em me ensinar, quantas vezes fosse necessária.
Aos meus colegas de laboratório, Agda, Alexandra, Ezequiel, Fagner, Hermes,
Magda, Keila (Portugal), Viviane Bispo e todos aqueles que me ajudaram de alguma
forma no desenvolvimento desta pesquisa.
Aos funcionários dos laboratórios de Materiais Cerâmicos (FTIR), de Microscopia
Eletrônica (MEV/EDS) e ao laboratório de Raios-X (DRX) da UFMG e da UFOP.
A professora Edel Stancioli do Laboratório de Biologia de Microrganismos – ICB –
UFMG pela realização dos ensaios Biológicos.
A minha amiga Cíntia Ramaldes, por ter me incentivado e me apoiado muito para
fazer meu mestrado, sempre me direcionando na caminhada da vida.
E finalmente, a todos os meus amigos que torcem por mim Astemius, Carol, Dani,
Erlei, Fernando, Luís, Milton, Nivânia, Valéria e Viviane.
v
SUMÁRIO
DEDICATÓRIA ................................................................................................................iii
AGRADECIMENTOS...................................................................................................... iv
LISTA DE FIGURAS.......................................................................................................vii
LISTA DE TABELAS ...................................................................................................... ix
LISTA DE NOTAÇÕES E SÍMBOLOS............................................................................. x
RESUMO........................................................................................................................ xi
ABSTRACT ....................................................................................................................xii
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................1 1.1 Justificativa...........................................................................................................4 1.2 Biofilmes...............................................................................................................5 1.2.2 Uma Matriz Subcutânea Biodegradável ............................................................5 2. OBJETIVOS ................................................................................................................6 2.1 Objetivo Geral .....................................................................................................6 2.2 Objetivos Específicos ..........................................................................................6 3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ........................................................................................7 3.1Estrutura e fisiologia da pele .................................................................................7 3.2 Úlceras de Pressão – UP .....................................................................................9 3.3 Processos de cicatrização e fatores bioquímicos ..............................................12 3.4 Os Biomateriais e a Engenharia de tecidos .......................................................15
3.4.1 Características dos Suportes de Crescimento de Tecidos.........................17 3.5 A Celulose..........................................................................................................20
3.5.1 Estrutura da Celulose ...............................................................................22 3.5.2 A Celulose Microcristalina – MCC..............................................................23
3.5.3 Processos de obtenção de uma celulose microcristalina...........................25 3.5.4 A membrana de Celulose Microcristalina Regenerada ..............................26
3.6 Caracterização da Celulose Microcristalina ......................................................27 3.6.1 Difração de Raios-X – DRX .......................................................................27 3.6.2 Microscopia Eletrônica de Varredura – MEV .............................................30 3.6.3 Espectroscopia no Infravermelho – FTIR...................................................32 3.7 Ensaios da Celulose Microcristalina ..................................................................33 3.7.1 Ensaio de Biocompatibilidade (ensaio colorimétrico de MTT)....................33 3.7.2 Ensaios em SBF ........................................................................................35 3.8 Modificação na superfície dos Biopolímeros .....................................................36 4. METODOLOGIA........................................................................................................36 4.1 Materiais e Reagentes .......................................................................................36 4.2 Procedimentos Experimentais............................................................................37 4.2.1 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) ..............................................38 4.2.2 Espectroscopia de Infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) ....38 4.2.3 Difratometria de Raios-X (DRX).................................................................39 4.3 Ensaios Biológicos ............................................................................................39 4.3.1 Teste de Biocompatibilidade......................................................................40
Preparo das amostras ..............................................................................40 Ensaio de contato - Citotoxicidade...........................................................40 Ensaio de MTT.........................................................................................41
vi
4.3.2 Ensaios de Biodegradação In vitro (PBS e SBF) .......................................42 Ensaios de Imersão .................................................................................42 Volume da Solução ..................................................................................42 Preparo da solução de PBS .....................................................................43 Preparo de amostras de MCCR (MEMBRA-CEL) para imersão em PBS 43 Imersão das amostras em Tampão Fosfato de Sódio (PBS) ...................43 Preparo da solução de SBF .....................................................................44 Imersão das amostras em Fluido Simulador do Corpo (SBF) ..................45 Índice de Degradação da MCCR no PBS ................................................46 Massa Intumescida ..................................................................................46
4.4 Modificação Química da celulose MCCR ..........................................................47 4.4.1 Ensaios de degradação In vitro (PBS e SBF) ............................................48 5. RESULTADOS E DISCUSSÕES ..............................................................................49
5.1 Espectroscopia na Região do Infravermelho .....................................................49 5.2 Difratometria de Raios-X ...................................................................................50 5.3 Ensaios Biológicos ............................................................................................53
5.3.1 Ensaio de MTT da celulose Solucel® ........................................................53 5.3.2 Ensaio de MTT da celulose MCCR ou MEMBRA-CEL™ ..........................56 5.3.3 Índice de degradação da MCCR ou MEMBRA-CEL™ ..............................60
5.4 Modificação Química da Celulose .....................................................................64 6. CONCLUSÃO............................................................................................................65 7. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS.........................................................66 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..........................................................................67
vii
LISTA DE FIGURAS
Figura 3.1: Camadas da pele (corte de pele da planta do pé)........................................ 7
Figura 3.2: Estrutura esquemática da pele ......................................................................8
Figura 3.3: Locais mais comuns que ocorrem úlceras de pressão..................................9
Figura 3.4: O grau de profundidade ou estágios das lesões: 1, 2, 3 e 4 da esquerda para
a direita .........................................................................................................................11
Figura 3.5: Fase proliferativa: (A) Migração de células epiteliais (B) Produção de
fibroblastos e fibras colágenas, (C) Angiogênese .........................................................14
Figura 3.6: Suportes para crescimento de tecidos ósseos ............................................18
Figura 3.7: Estrutura da celulose...................................................................................22
Figura 3.8: Diferentes microestruturas da celulose (A e B) ...........................................23
Figura 3.9: Celulose Microcristalina em pó prensada da marca Solucel®.....................24
Figura 3.10: Fluxograma do processo de manufatura da celulose Microcristalina Avicel®
......................................................................................................................................24
Figura 3.11: Reação envolvida no processo viscose.....................................................25
Figura 3.12: Difração de raios – X de pó de celulose de baixo índice de cristalinidade 27
Figura 3.13: Difração de raios – X de pó de celulose com alto índice de cristalinidade 27
Figura 3.14: Difração de raios – X de pó de celulose com um índice semicristalino .....28
Figura 3.15: Delimitação da área cristalina da área amorfa através da linha de base ..28
Figura 3.16: Micrografias de uma celulose de baixa cristalinidade (LCC) com um aspecto
liso (a), e de uma celulose Algiflor com vales e picos irregulares (b). ...........................30
Figura 3.17: Micrografias da celulose AMC com aspecto mais uniforme (a) e da celulose
Cladophora com muitos filamentos em sua morfologia (b)............................................30
Figura 3.18: Micrografia da celulose Microcristalina-MCC com um aspecto liso, plano 30
Figura 3.19: Viabilidade celular medida por MTT ..........................................................33
Figura 4.1: MEMBRA-CEL™ (Membrana e tubo para diálise). .....................................35
Figura 4.2: Fluxograma das ferramentas de caracterização para a MCCR...................37
Figura 4.3: Fluxograma dos novos tipos de MCCR .......................................................47 Figura 5.1: Espectros IR da membrana - MCCR ...........................................................49
Figura 5.2: Difratograma da MCCR identificando principais picos.................................51
Figura 5.3: Difratograma da MCCR, destacando as regiões: cristalina e amorfa ..........52
Figura 5.4: Estatística do ensaio de MTT da celulose Solucel®....................................53
viii
Figura 5.5: Histograma da viabilidade de células Vero com a Solucel®........................54
Figura 5.6: Microscopia por luz transmitida: (a) Imagens do crescimento das células
VERO (b) células sobre a hidroxiapatita em forma de agregados de pó, após os ensaios
MTT ...............................................................................................................................54
Figura 5.7: Células no controle positivo (Triton X-100 0,1%).........................................55
Figura 5.8: Imagens da Solucel, mostrando as células viáveis (a) cristais de
metilformazan e (b) aspecto fusiforme ..........................................................................55
Figura 5.9: Fotomicrografias de MEV da Solucel com cultura celular em ampliações
de 150, 1000, 3000 e 4000x ..........................................................................................56
Figura 5.10: Histograma da viabilidade de células Vero com a MEMBRA-CEL®..........57
Figura 5.11: Estatística do ensaio de MTT da celulose MEMBRA-CEL™.....................57
Figura 5.12: Microscopia ótica do controle celular (a) e da hidroxiapatita (b)................58
Figura 5.13: Microscopia ótica da MEMBRA-CEL™ com células viáveis......................59
Figura 5.14: Fotomicrografia por MEV da MCCR com cultura celular em
várias ampliações: 3000 e 4000x ..................................................................................59
Figura 5.15: Índice de degradação das amostras de MCCR no PBS e SBF.................60
Figura 5.16: Grau de Intumescimento das amostras de MCCR no PBS e SBF ............61
Figura 5.17: Índice de degradação das amostras de MCCR no PBS e SBF.................62
Figura 5.18: Grau de Intumescimento das amostras de MCCR no PBS e SBF ............63
ix
LISTA DE TABELAS Tabela 1.1: Dados estatísticos sobre UP.........................................................................4
Tabela 3.1: Fatores importantes na seleção de materiais para aplicação biomédica....16
Tabela 3.2: Bandas vibracionais de grupos típicos da celulose ....................................32
Tabela 3.3: Concentração de íons no plasma sanguíneo humano (SBF) ....................34
Tabela 4.1: Reagentes para a solução de PBS.............................................................42
Tabela 4.2: Reagentes para preparo de 1 litro de SBF .................................................44
Tabela 5.1: Principais bandas no espectro de infravermelho da MCCR .......................49
Tabela 5.2: Resultados dos percentuais das regiões amorfa e cristalina......................52
x
LISTA DE NOTAÇÕES OU SÍMBOLOS
ATR Reflexão Total Atenuada
DRX Difração de Raios-X
ECM Matriz Extracelular
EDS Espectrômetria de Energia Dispersiva
EtO Óxido de Etileno
FDA Food and Drug Administration (Agência norte-americana que regula produtos alimentícios e farmacêuticos)
FTIR Espectroscopia de Infravermelho por Transformada de Fourier
GA Glutaraldeído
IV Infravermelho
MCCR Membrana de Celulose Microcristalina Regenerada
MEV Microscopia Eletrônica de Varredura
MI Massa intumescida
MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide
PBS Tampão de Fosfato de Sódio
RGD Arginina-Glicina-Aspartato
SBF Simulador de Fluido do Corpo
SEM Scanning Electron Microscopy
SFB Soro Bovino Fetal
SUS Sistema Único de Saúde
UP Úlcera de Pressão
xi
RESUMO
Este trabalho é parte de um estudo que pretende usar a celulose microcristalina
(MCCR) no processo de cicatrização de feridas crônica. Para avaliar sua
microestrutura, a MCCR foi caracterizada através de FTIR, DRX e MEV. A
caracterização biológica foi também realizada para verificar seu grau de citoxicidade e
além desses foram ainda avaliados o índice de degradação e o de intumescimento da
celulose imersa em tampão fosfato de sódio (PBS) e em simulador de fluido corpóreo
(SBF). Os resultados mostraram um significante percentual de degradação da MCCR
assim como uma importante tolerância no contato celular. A biocompatibilidade da
MCCR foi estabelecida através de testes de citotoxicidade e confirmada através de
análises do MEV. E foi verificado o comportamento da MCCR através de uma
modificação química, a qual não apresentou mudanças significativas na degradação e
manteve o mesmo comportamento de intumescimento em relação à MCCR original.
xii
ABSTRACT
This work is part of a study aiming at the use of regenerate microcrystalline
cellulose (MCCR) in the process of cicatrization of chronic wounds. In order to evaluate
its microstructure, MCCR was characterized by FTIR, DRX and SEM. Biological
characterization was also carried out with a view to verify its degree of citoxicity and
the index of degradation of cellulose in sodium phosphate buffer (SPB) and simulated
body fluid (SBF). The results show a significant percent of MCCR degradation as well
as an important tolerance towards cell contact. The biocompatibility of RMCC was
established by the citotoxicity tests and confirmed by SEM analysis. And was seeing
the performance of MCCR through of a chemistry change, which showing not alteration
amount in degradation and to keep the performance same of swelling compare with
MCCR strange.
1
1. Introdução
As úlceras por pressão (UP), ou úlceras da pele são lesões cutâneas
geradas em conseqüência de uma ausência de irrigação sanguínea e de uma
irritação do tecido que reveste uma saliência óssea, sobretudo nas zonas em
que esta foi pressionada contra qualquer objeto rígido durante um período
prolongado.
Esse é um problema real para pessoas com diminuição ou ausência de
sensibilidade e/ou limitação do movimento. Normalmente são usuários de
cadeiras de rodas ou idosos. O tratamento da úlcera de pressão é demorado e
dispendioso, podendo também ser agravado pelo histórico do paciente
(fumantes, diabéticos e hipertensos), muitas vezes privando o paciente do
exercício e ou de suas atividades educacionais, recreacionais e profissionais
(RIZO, 2003).
O impacto econômico do tratamento de uma úlcera de pressão é
elevado, devido à longa permanência dos pacientes nos hospitais e às
complicações decorrentes de infecções e também devido às intervenções
cirúrgicas.
Apesar dos avanços consideráveis no conhecimento do processo de
cicatrização das feridas, ainda hoje não existe um mecanismo que explique a
patofisiologia da não cicatrização das úlceras de pressão (AI et al, 2004).
Apesar da escassez de dados estatísticos precisos em nosso país,
sobre a quantidade de pacientes ou as seqüelas e conseqüências causadas
pelas lesões da pele (MANDELBAUM, 2003), alguns trabalhos demonstram
que o impacto psíquico, social e econômico da cronificação destas lesões, em
2
especial as úlceras de pés e pernas, representa a segunda causa de
afastamento do trabalho no Brasil (ERENO, 2003).
Já em 1945, no período pós-guerra existia relatos dos primeiros estudos
de desenvolvimento de tecidos ou biofilmes pra substituição de peles devido ao
grande número de pessoas portadoras de queimaduras com várias seqüelas,
as quais sobreviveram naquela época (MANDELBAUM, 2003).
Um dos objetivos da engenharia de tecidos é suprir os profissionais da
saúde com os biomateriais para substituições de alguns tecidos do corpo
humano, que muitas vezes se encontram escassos no paciente, por exemplo,
em caso de queimaduras onde o paciente perde parte substancial da pele ou
não possui áreas doadoras compatíveis para enxertar sua pele ou mesmo
doadores homologossíveis. Assim torna-se vital a existência de uma pele
artificial, pois seria quase inviável a busca de um doador imediato de pele.
Esse fato já não acontece em casos de doação de sangue, em que é possível
ter banco de doadores à disposição, (MANSUR et al., 2006).
A engenharia de tecidos tem por objeto a manipulação de células,
visando obter uma matriz artificial que estimulará a regeneração e substituição
tecidual. Podem ser utilizadas células do próprio corpo do paciente, quando
então o sistema se denomina de autólogo, mas pode também usar células
doadas por outros indivíduos da mesma espécie – nesse caso chamadas de
alogênicas (imunologicamente inativas). Em último caso, pode-se utilizar
células xenogênicas (de espécies diferentes), que por sua vez apresentam
muitas restrições, principalmente no Brasil devido aos impedimentos da
vigilância sanitária. Todos esses sistemas apresentam características que
substituem a perda de tecidos e fornecem novas opções de terapias para as
3
doenças assim como deficiências metabólicas (ORÉFICE et al., 2006 e
RATNER et al., 2004).
A ciência dos biomateriais apresenta um caráter interdisciplinar
envolvendo áreas da engenharia com áreas de ciência da saúde - medicina,
odontologia, química, entre várias outras. Através do desenvolvimento de
técnicas de manipulação específica em ambiente de laboratórios é possível o
crescimento de moléculas, células, tecidos ou órgãos visando restaurar manter,
ou melhorar a função do tecido e, fundamentalmente, compreender as relações
entre estruturas-funções em tecidos normais e patológicos (SILVA, 2006). Isso
pode ser alcançado, seja utilizando células vivas ou atraindo células
endogênicas para auxiliar a formação do tecido ou sua regeneração (RATNER
et al., 2004).
Dentre os materiais que podem ser utilizados no tratamento de feridas
crônicas, destacam-se os polímeros naturais à base de polissacarídeos, como
a celulose.
Uma das várias vantagens em se utilizar esse tipo de material é que ele
se degrada naturalmente e os produtos gerados (debris) são imunogênicos e
desta forma, possui uma íntima interface com o ambiente biológico e
metabólico. Quando a celulose é aplicada no corpo humano pode-se evitar o
efeito tóxico, uma reação inflamatória, o que normalmente acontece com um
material que não é bem tolerado no ambiente biológico, sendo percebido como
um corpo estranho gerando várias conseqüências até mesmo uma rejeição
(YANNAS, 2004).
A demanda por esse tipo de matriz reflete a necessidade de cicatrização
das úlceras de pressão, conhecidas também como feridas crônicas.
4
Normalmente quem apresenta este diagnóstico está debilitado e ou limitado de
exercer alguma locomoção, em geral idosos acima de 65 anos. A úlcera é um
sério problema para a população idosa, pois são responsáveis por um alto
índice de morbidade e mortalidade (THOMAS, 2001 e ALLMAN, 1989).
1.1 Justificativa
Apesar do nível de conhecimento já atingido sobre processo cicatricial e
dos recursos tecnológicos já desenvolvidos, as úlceras crônicas ainda
apresentam um alto grau de incidência e prevalência (tabela 1.1),
principalmente em países menos desenvolvidos.
Tabela 1.1: Dados estatísticos sobre UP.
Quadriplegia Prevalência de 60%Fraturas femorais Incidência de 66%
Tratamento Intensivo Incidência 33% Prevalência 41%
Fonte: IRION, 2005.
Sendo assim, a busca de materiais que facilitem a diminuição ou
controle desse problema é de grande importância. Além disso, o fato de se
explorar aplicações alternativas de matéria-prima de fácil acesso e rápida
obtenção é extremamente relevante, por causa do elevado custo dos
dispositivos ou recursos tecnológicos, que são, na maioria, importados. Outro
aspecto a ser considerado com a utilização de membranas de celulose é que
essas dispensam a utilização de um tecido doador de outro local do corpo,
evitando assim, procedimentos e mais gastos cirúrgicos.
5
1.2 Biofilmes
1.2.1 Uma Matriz de celulose Subcutânea Biodegradável
De acordo com os arquétipos das pesquisas da área da saúde, são
necessárias muitas alternativas com variadas substâncias (ou biomateriais) de
modo a garantir uma melhor aproximação do processo natural de cicatrização.
Apesar dos discretos avanços verificados nas últimas décadas com relação à
descoberta de novos recursos para a reparação tissular, muito há que ser
investigado ou pesquisado em especial em nosso país, em que ainda são
elevadas a incidência e a prevalência de lesões crônicas, particularmente as
úlceras dos pés e pernas em diabéticos que representa 10% da população
brasileira. Basta lembrar que são estimados cerca de quatro milhões de
pessoas portadoras de lesões crônicas na população brasileira o que
justificaria maiores investimentos em pesquisas, sobretudo em novos
dispositivos com custo final menor, tornando assim acessível à população
(MANDELBAUM et al.,2003) atendida pelo SUS.
6
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Caracterização e análise de membranas de celulose microcristalina
regenerada visando sua aplicação em matrizes cutâneas. Foram abordados
dois tipos de caracterização: biológica in vitro, química e alguns aspectos
físicos.
2.2 Objetivos Específicos
Na caracterização biológica buscou-se avaliar o grau de compatibilidade
das membranas de celulose com organismos vivos (ou no caso específico o
grau de citotoxicidade) e também avaliar o comportamento da cinética da
biodegradação através de ensaios in vitro.
Na caracterização físico-química buscou-se investigar ou evidenciar:
• O caráter microestrutural (morfologia) da membrana de celulose
microcristalina.
• O espectro cristalográfico revelado pela difração de raios X das
membranas de celulose microcristalina (fases presentes e grau de
cristalinidade).
• O perfil da espectroscopia de infravermelho por transformada de
Fourier (FTIR) das amostras para avaliar a composição química
da membrana de celulose microcristalina Regenerada (MCCR).
7
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Estrutura e fisiologia da pele
A pele é formada por três camadas (Figuras 3.1 e 3.2) que são
interdependentes, a epiderme, a derme, e a hipoderme. A epiderme é
constituída por epitélio estratificado pavimentoso e queratinizado (JUNQUEIRA
e CARNEIRO, 2004)
A epiderme se subdivide em cinco camadas, respectivamente do exterior
para o interior: camada córnea, lúcida, granulosa, espinhosa e basal, esta se
localiza no inicio da derme. Tanto a estrutura da pele quanto a espessura
variam de acordo com o local no corpo sendo mais espessa nas mãos e nos
pés (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2004).
Figura 3.1: Camadas da pele (corte de pele da planta do pé). Fonte: JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2004.
8
A derme se localiza logo após a epiderme, é feita de tecido conjuntivo, e
é mais espessa, atingindo cerca de 3mm na planta dos pés. Ela subdivide-se
em duas camadas denominadas camada papilar (através da qual se prende a
epiderme) e camada reticular que permite a elasticidade da pele
(CABRAL,2006).
Figura 3.2: Estrutura esquemática da pele. Fonte: Adaptado de CABRAL, 2006.
9
Por último existe a camada hipodérmica que está na base inferior da
pele (camada mais profunda), também é feita de tecido conjuntivo frouxo, o
qual une de maneira pouco firme a derme aos órgãos subjacentes
(JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2004). Esta camada é rica em lipídeos tendo a
função de proteger e modelar o corpo humano.
3.2 Úlceras de Pressão – UP
A úlcera de pressão é uma ferida decorrente de isquemia tecidual que
ocorre pela alteração do reflexo de dor em pacientes com lesão medular ou
pacientes debilitados, idosos ou cronicamente doentes (RIZO, 2003). Úlcera de
pressão é qualquer lesão que ocorre na pele, gerada por pressão constante
sobre esse tecido causando danos ao tecido subjacente. Normalmente as
lesões ocorrem com uma maior freqüência em regiões que têm muitas
proeminências ósseas e aonde o corpo normalmente se apóia (Figura 3.3).
Figura 3.3: Locais mais comuns que ocorrem úlceras de pressão. Fonte: IRION, 2005.
A pele conta com uma rica irrigação sanguínea que leva o oxigênio a
todas as suas camadas. Se essa irrigação for interrompida durante mais de 2
Crista Ilíaca
Sacro Grande trocânter
Ísquio
Maléolo externo
Calcâneo
10
ou 3 horas, a pele morre, a começar pela sua camada externa (a epiderme). A
causa da freqüente redução de irrigação sanguínea na pele é gerada pela
pressão. Os movimentos normais que as pessoas realizam em seu cotidiano
fazem variar a pressão, para que a circulação sanguínea não fique obstruída
durante um longo período. A camada de gordura por baixo da pele,
especialmente sobre as saliências ósseas, atua como um acolchoamento e
evita que os vasos sanguíneos sejam obstruídos. Se a pressão interrompe o
fluxo sanguíneo, a zona de pele privada de oxigênio de início fica avermelhada,
inflamada e, depois, e depois produzindo ulcerações (IRION, 2005).
As úlceras de pressão também são denominadas como feridas crônicas,
úlceras de decúbito (termo mais antigo), escaras e alguns outros nomes
referenciados nas literaturas pertinentes à saúde.
As úlceras de pressão são classificadas em quatro estágios (Figura 3.4)
que classificam a profundidade das lesões, sendo observadas de forma física.
O fator tempo e pressão estão diretamente relacionados nas causas das
úlceras e o risco para que ocorra o seu desenvolvimento é mensurado como
uma média de pressão de 70 mmHg durante 2h para uma lesão irreversível. O
termo carga tissular é mais abrangente que o termo pressão, pois a carga
sobre os tecidos é causada por pressão, fricção e atrito e é exacerbada pela
umidade e pela temperatura sobre o local da ferida. (IRION, 2005). No estágio
1, (Figura 3.4) a úlcera não está realmente formada: a pele, intacta, está
simplesmente avermelhada. No estágio 2, a pele está avermelhada e inflamada
(muitas vezes com bolhas) e a sua destruição começa nas suas camadas mais
externas. No estágio 3, a úlcera abre-se para o exterior através da pele,
11
deixando expostas as camadas mais profundas. No estágio 4, a úlcera
estende-se profundamente através da pele e da gordura até ao músculo,
tendão e osso (RIZO, 2003).
Figura 3.4: O grau de profundidade ou estágios das lesões: 1, 2, 3 e 4 da esquerda para a direita. Fonte: IRION, 2005.
Normalmente as úlceras de pressão atingem pessoas que de alguma
forma perderam sua capacidade de movimento ou locomoção, estando
acamadas. ou portando algum tipo de paraplegia, tetraplegia, pessoas
portadoras de lesão cerebral, distrofia muscular (RIZO, 2003). Cerca de 70%
de todas as úlceras, acometem idosos acima de 65 anos com diagnóstico de
algum tipo de debilitação e ou déficit de movimento (WHITTINGTON et al.,
2000).
As úlceras de pressão são difíceis de tratar e alguns casos requerem o
transplante de pele sã para a zona danificada. Infelizmente, este tipo de
cirurgia nem sempre é possível, especialmente em pessoas idosas,
fisiologicamente frágeis, que manifestam alguma desnutrição (THOMAS, 2006).
A prevenção e o tratamento das úlceras de pressão geralmente
consistem em mudanças freqüentes de posição, inspeções regulares na pele,
cuidados com a pele, uso de dispositivos especializados em alívios da pressão
e também o tratamento da subnutrição e incontinência (HOPKINS et al., 2006).
Camadas:
• Epiderme
• Derme
• Hipodermee
12
3.3 Processos de cicatrização e fatores Bioquímicos
A cicatrização de feridas consiste em uma perfeita e coordenada
cascata de eventos celulares e moleculares que interagem para que ocorra a
repavimentação e a reconstituição do tecido (ORTONNE, 1994).
Quando o organismo é agredido, quaisquer que sejam os agentes
agressores, a resposta dos tecidos é sempre de cunho inflamatório, com
ativação de mediadores ativos e conseqüente dilatação, aumento da
permeabilidade vascular e posterior exsudação de moléculas e de células
(ORÉFICE et al, 2006).
As feridas superficiais, que atingem a epiderme são causadas por
estiramento, fricção e queimaduras leves. A cicatrização ocorre por
regeneração das células epiteliais na superfície da ferida em decorrência da
perda da inibição de contato e da migração de células epidérmicas em direção
à superfície. Em muitos casos de lesão por pressão, pode-se encontrar tecido
necrótico subjacente a uma epiderme intacta. Habitualmente, as úlceras de
pressão provocam certa dor e comichão e nas pessoas com a sensibilidade
afetada podem, inclusive, desenvolverem-se úlceras graves e profundas sem
que se note dor (IRION, 2005).
Feridas que atingem parte da espessura da derme (derme incompleta)
cicatrizam-se de uma forma semelhante à das feridas superficiais
(convencionais). Normalmente pode ocorrer dano à derme, mas as estruturas
acessórias (ossos, tendões músculos) são preservadas (MANDELBAUM et al.,
2003) e as feridas de espessura total (derme completa ou estendida ao tecido
13
celular subcutâneo) necessitam da formação de um novo tecido, denominado
de tecido de granulação. Esse é um tecido brilhante, vermelho-vivo, com
ondulações granulosas (IRION, 2005).
O processo de cicatrização de feridas é classificado em cinco fases:
coagulação, inflamação, proliferação, contração da ferida e remodelação
(FAZIO et al., 2000).
Na fase da coagulação ocorre uma complexa liberação de produtos,
substâncias vasoativas, proteínas adesivas, fatores de crescimento e proteases
são liberadas e ditam o desencadeamento de outras fases (CLARK, 1985). A
formação do coágulo serve para oferecer uma matriz ou ponte provisória para
as células ingressarem na ferida (GRINNEL et al, 1981).
A fase da inflamação inicia-se com a ruptura de vasos sangüíneos e o
extravasamento de sangue, este fato é seguido rapidamente pela ativação da
agregação plaquetária e da cascata de coagulação, liberação dos fatores de
crescimento, síntese de DNA, deposição de colágeno e à retração cicatricial,
destruição de bactérias via fagocitose e a liberação de enzimas mais radicais
livres. Em geral nessa fase existe uma destruição e uma construção no local
lesionado (IRION, 2005).
A fase proliferativa (Figura 3.5) é responsável pelo “fechamento” da
lesão propriamente dita e ela possui três subfases: Reepitelização, Fibroplasia,
Angiogênese (MANDELBAUM et al, 2003).
14
Figura 3.5: Fase proliferativa: (A) Migração de células epiteliais (B) Produção de fibroblastos e fibras colágenas. (C) Angiogênese. Fonte: IRION, 2005.
Na reepitelização ocorre a formação de tecido de granulação e em
alguns casos a contração da ferida. Já na fibroplasia (VAN, 1967) ocorre
formação da matriz, que é extremamente importante na formação do tecido de
granulação (coleção de elementos celulares, incluindo fibroblastos, células
inflamatórias e componentes neovasculares e da matriz, como a fibronectina,
as glicosaminoglicanas e o colágeno). Somente ocorre formação do tecido de
granulação quando os níveis de bactérias são baixos na ferida, caso contrário
esta é inibida. A última fase da proliferação é a angiogênese, essencial para o
suprimento de oxigênio e nutrientes para a cicatrização (MANDELBAUM et al,
2003).
Na fase de contração da ferida ocorre o movimento radial da pele
intacta das bordas da ferida em direção ao centro. Também ocorre a migração
de células para o interior da ferida sendo auxiliadas pela proteína fibronectina
que faz um gancho de ligação (IRION 2005). Ela une diversos fibroblastos,
formando uma rede.
15
A última das fases, a fase de remodelação ocorre no colágeno e na
matriz, é responsável pelo aumento da força de tensão e pela diminuição do
tamanho da cicatriz e do eritema (DOILLON et al., 1985).
Muitas variáveis tanto de ordem geral como de ordem local influenciam
esse longo e complexo processo. É fundamental uma completa e minuciosa
anamnese, para avaliação de todos os fatores que podem interferir na
cicatrização: a idade, o estado nutricional do paciente, a existência de doenças
de base, como diabetes, alterações cardiocirculatórias e de coagulação,
aterosclerose, disfunção renal, quadros infecciosos sistêmicos e uso de drogas
sistêmicas. Dos fatores locais, interferem a técnica cirúrgica, formação de
hematomas, infecção, reação de corpo estranho, uso de drogas tópicas,
ressecamento durante a cicatrização (MANDELBAUM et al, 2003).
3.4 Os Biomateriais e a Engenharia de tecidos
Segundo RATNER (2004), a ciência dos biomateriais é um estudo físico
e biológico de materiais e suas interações com o ambiente biológico.
Na tabela 3.1 estão descritas as características mais importantes para a
aplicação e uso dos biomateriais no organismo (RAMAKRISHNA et al. 2001).
Outra definição complementar para entender o objetivo da ciência dos
biomateriais é o da “biocompatibilidade”: habilidade de desempenho entre um
material e uma resposta apropriada de um hospedeiro em uma aplicação
específica (WILLIAMS, 1987).
16
Tabela 3.1: Fatores importantes na seleção de materiais para aplicação biomédica.
Descrição dos Fatores Propriedades do Material
Características químicas/biológicas
Características físicas
Características mecânicas/estruturais
1º nível Composição química Densidade
Módulo de elasticidade. Razão de Poisson’s.
Limite de escoamento. Resistência tensiva e
compressiva.
2º nível Adesão Topologia da superfície (textura e rugosidade)
Dureza. Módulo de cisalhamento. Resistência de cisalhamento.
Módulo e resistência Flexural.
Requerimento funcional específico
Biofuncionalidade (não trombogênico, adesão
de células) Bioinerte (não tóxico, não carcinogênico).
Bioativo Bioestável (resistente à
corrosão, hidrólise, oxidação).
Biodegradável
Forma (sólido, poroso, filme, fibra, pó)
Geometria.Coeficiente de expansão
termal.Condutividade elétrica
Cor, estética Índice de refração.
Opacidade ou transluscência
Tensão ou rigidez,Resistência à fratura, Resistência à
fadiga,Creep resistência,Resistência ao desgaste e fricção
Resistência à adesão,Resistência ao
impacto Resistência abrasiva
Processamento e fabricação
Reprodutibilidade, qualidade,
esterilisabilidade, empacotamento
e processabilidade secundária.
Características do hospedeiro
Tecido, organismo, espécie, idade, sexo, raça, condições de saúde, atividade,
resposta sistêmica a procedimentos
médicos/cirúrgicos, período de
aplicação/uso.
Custo Avaliação do custo x benefício.
Fonte: Adaptado de RAMAKRISHNA et al. 2001, apud ROCHA, 2006.
A engenharia de tecidos representa uma nova e emergente área
interdisciplinar aplicada como ferramenta da interface biomédica e engenharia,
que usam de células vivas ou atraem células endogênicas para auxiliar a
17
formação do tecido ou a sua regeneração no sentido de restaurar, manter, ou
melhorar a função deste tecido (RATNER et al., 2004).
As células usadas na engenharia de tecidos podem originar-se de uma
variedade de fontes incluindo aplicações específicas com células diferenciadas
ou de células não diferenciadas compreendendo progenitor ou células-tronco.
3.4.1 Características dos Suportes de Crescimento de Tecidos
Os Suportes para Crescimento de Tecidos (figura 3.6) são sistemas
abertos de células transplantadas que ficam em contato direto com o substrato
ou matriz, objetivando fornecer uma solução permanente para a substituição de
um tecido vivo. A razão fundamental no uso de sistemas abertos está baseada
em observações empíricas: células dissociadas tem o cuidado em reformar
suas estruturas originais, quando às condições do ambiente são apropriadas
para a cultura de células, mas também possuem limitações em termos de
quantidade no qual o tecido não pode ser transplantado em grandes volumes
por causa de restritas interações e limitações de difusões com o ambiente
(substrato) de nutrientes, troca gasosa, e eliminação de excrementos (RATNER
et al., 2004).
Um Suporte para Crescimento de Tecidos que atenda a engenharia de
tecidos deve ter a função de estimulação celular: fatores bioativos sobre a
superfície do material, na forma de droga e genes adsorvidos no material e sua
principal função é atuar como uma matriz artificial extracelular mimetizando as
propriedades da matriz extracelular natural (ECM), material biodegradável e o
controle de degradação e remodelação do tecido. Algumas características para
18
o projeto de uma matriz ou suporte para crescimento de tecidos são:
biocompatibilidade, flexibilidade para possuir várias formas, propriedades
mecânicas e físicas convenientes, e biodegradabilidade (RATNER et al., 2004)
Figura 3.6: Suportes para crescimento de tecidos ósseos. Fonte: Notas de aula de SILVA, 2006.
Além do uso clínico da pele artificial, várias empresas têm explorado as
possibilidades de substitutos dérmicos com propósitos de diagnósticos.
No Brasil temos algumas pesquisas promissoras envolvendo recursos
naturais como o látex da seringueira com custo bem reduzido em relação à
tecnologia importada. Esse látex testado em pacientes com feridas crônicas,
portadores de diabetes, que apresentaram resultados positivos no processo de
granulação e epitelização, devido à propriedade do látex de estimular a
angiogênese (MANDELBAUM et al., 2003).
Existem muitas pesquisas em andamento e há perspectivas de
desenvolvimento de novas tecnologias que visam não só acelerar o processo
cicatricial, como reduzir as suas complicações (MANDELBAUM et al., 2003).
Alguns dos recursos tecnológicos mais importantes utilizados no processo de
cicatrização atualmente disponíveis no Brasil envolvem ácidos graxos
essenciais (AGE), filmes semipermeáveis, membranas permeáveis ao vapor,
hidropolímeros, hidrocolóides, enzimas proteolíticas, acetato de celulose entre
outros.
19
3.5 A Celulose
A celulose é o mais abundante biopolímero encontrado amplamente na
natureza para uso comercial (KONTTURI et al., 2005). É o principal
componente da biomassa presente na membrana celular (citoesqueleto) dos
vegetais.
O interesse crescente em fibras naturais como a celulose gerou intensas
pesquisas de modo a acontecer um refinamento em sua estrutura e
consequentemente em suas propriedades, portanto viabilizando sua aplicação
como um biomaterial (GIL e FERREIRA, 2006).
Um derivado da celulose foi sintetizado pela primeira vez em 1908 por
Jacques E. Brandenberger, na tentativa de desenvolver um material para
aplicações diversas que fosse impermeável à água. Disso resultou a
descoberta do filme denominado hoje de celofane (LEVY et al., 2004).
Os polímeros naturais a priori apresentam biocompatibilidade relativa,
tem baixo custo e podem ser modificados apresentando uma variedade de
propriedades químicas, físicas e biológicas (HUTCHENS et al., 2006).
A celulose é um polissacarídeo atualmente amplamente utilizado na área
da saúde para produzir membranas de diálise, recobrimento de drogas,
coagulantes sanguíneos, testes de gravidez e muitos outros produtos
(MIYAMOTO et al. 1989).
Os materiais biocompósitos (ou bioconjugados) de base celulósica têm
sido aplicados em várias áreas da medicina não só em hemodiálise,
nomeadamente como componentes de matrizes para regeneração óssea
20
(Surgicel ®), vasos sanguíneos artificiais (BASYC ®), substitutos temporários
de pele (Biofill ®), e sistemas de liberação controlada (LEVY et al. 2004).
Os polímeros naturais ou biopolímeros (seda, celulose, colágenos,
gelatina, queratina, e outros) oferecem a vantagem de serem muito parecidos à
matriz extracelular nos tecidos vivos, frequentemente sua degradação em
ambiente fisiológico geram debris (fragmentos moleculares) idênticos às
substâncias moleculares da matriz extracelular (ECM) natural, as quais o
ambiente biológico está preparado para reconhecê-los metabolicamente
(RATNER et al 2004). Além disso, a similaridade das substâncias que ocorrem
naturalmente introduz uma capacidade interessante de se projetar biomateriais
que funcionem biologicamente como o molecular. Os polímeros naturais são
bastante imunogênicos e uma intrigante característica desses polímeros é a
sua habilidade de ser degradado naturalmente por enzimas, que é uma
garantia que o implante será eventualmente metabolizado através de
mecanismos fisiológicos (YANNAS, 2004).
Um problema encontrado nos polímeros naturais é que eles possuem
pouca resistência às mudanças na temperatura, podendo se decompor quando
implantados no corpo (RATNER, 2004). Então é relevante o estudo da
degradação de forma que aconteça num ambiente controlado, simulando o
meio fisiológico e garantindo suas características como curativos das lesões.
O incremento no uso dos polissacarídeos como biomateriais deve-se ao
fato destes compostos apresentarem na sua estrutura grupos funcionais como
grupos hidroxílicos e grupos carboxílicos. Qualquer destes grupos pode ser
usado para promover a derivatização química das moléculas ou sua ligação a
determinados ligantes de proteínas (enzimas) específicas. Desta forma, a
21
molécula natural pode ser modificada, e as suas características químicas e
físicas específicas alteradas, portanto sua aplicabilidade melhorada. Outras
vantagens da aplicação dos polissacarídeos como biomateriais incluem entre
outras: a grande variedade de compostos, densidade próxima dos meios
biológicos e a sua funcionalidade (GIL e FERREIRA, 2006).
A celulose modificada com grupamentos diferentes é utilizada em
membranas e na imobilização de células e para isso ocorrer alguns métodos
são descritos, nos quais a maioria deles parte de uma superfície considerada
ativada para acoplamento, ou seja, a superfície do material deve possuir
grupos químicos reativos como hidroxilas (-OH), aminas (-NH2), ácidos
carboxílicos (-COOH) etc. Outra opção é a inserção nas superfícies do
polímero, de peptídeos contendo a seqüência de aminoácidos RGD (Arg-Gly-
Asp) que, quando expostos ao contato celular, vão propiciar a adesão
(ORÉFICE et al., 2006).
3.5.1 Estrutura da celulose
A celulose tem uma estrutura linear ou fibrosa, na qual se estabelecem
múltiplas ligações de hidrogênio entre os grupos hidroxilas das distintas
cadeias juntapostas de glicose (figura 3.8), fazendo-as impenetráveis a água, e
originando fibras compactas que constituem a parede celular dos vegetais. É
um polissacarídeo linear constituído por unidades monoméricas de β (1-4)-D-
glucopiranose (GIL e FERREIRA, 2006).
A celulose possui uma cadeia longa de peso molecular variável, com
fórmula empírica (C6H1005)n, com um valor mínimo de n=200.
22
Figura 3.7: Estrutura da celulose.
3.5.2 A Celulose Microcristalina – MCC
A celulose microcristalina é um excipiente farmacêutico, que foi
introduzido no mercado com o nome comercial Avicel® em 1963, esta reúne
propriedades diluente-desintegrante (PASQUALOTO et al, 2005).
Derivados de celulose apresentam um importante potencial de aplicação
nas áreas farmacêuticas e biomédicas. Esses derivados são utilizados entre
outras aplicações em dispositivos com liberação controlada de fármacos e para
bioadesivos.
A Celulose Microcristalina (MCC) é uma fração da celulose presente nas
paredes celulares das fibras das plantas, constituída de lignina mais a celulose
(Figura 3.8) que foram fisicamente fragmentadas (não fibrosa). Após a hidrólise
ácida (tratamento com HCl 2,5 mol.L-1 por 15 min a 105 ºC) da polpa da
celulose, a celulose microcristalina permanece insolúvel e é separada,
submetida a atrito que faz com que se quebre em agregados cristalinos
coloidais, que são secos juntamente com carboximetilcelulose (CMC) e outros
ingredientes funcionais que garantem a redispersão dos cristais, sendo uma
forma muito pura de celulose (BEHRENS e NETTO-FERREIRA, 2006).
23
Figura 3.8: Diferentes microestruturas da celulose (A e B). Fonte: Site da FMC Corporation, 2007.
A MCC apresenta-se como pó branco (Figura 3.9), inodoro, livre de
contaminantes orgânicos e inorgânicos Ela é utilizada como excipiente de
drogas, pois tem elevada capilaridade possuindo grandes quantidades de
regiões amorfas, podendo ser facilmente desintegrada. Por ser um material
com propriedades inertes ao organismo e apresentar em sua estrutura grande
quantidade de poros, é possível que a MCC atue como um filme de proteção e
proliferação de células (Suporte para Crescimento de Tecido) em feridas
crônicas principalmente em lesões profundas (PASQUALOTO et al., 2005).
Existem no mercado alguns tipos de MCC e suas propriedades físico-
químicas variam segundo o tamanho médio de partículas, o conteúdo de
umidade e devido às técnicas de processamento do fabricante (PASQUALOTO
et al, 2005). Esta diferença de tamanhos seria obtida variando-se as condições
de hidrólise, cisalhamento e secagem durante o processamento da alfa-
celulose (DOELKER et al, 1995). Desta forma encontramos no mercado uma
gama de variações de produtos com nomes e aplicações de MCC distintos,
entre algumas delas destacam-se as marcas Avicel®, Solucel. Assim em
função da variação no tamanho médio das partículas da MCC, podemos
encontrar no mercado, por exemplo, alguns produtos comerciais assim
denominados de: Avicel® PH-101(50μm), Avicel® PH-102 (100μm), Avicel®
24
PH-105 (20μm) cuja aplicação é realizada de acordo com especificações do
fabricante (Fonte: Site da FMC Corporation, 2007).
Figura 3.9: Celulose Microcristalina em pó prensada da marca Solucel®.
Fonte: Site Bahiapulp, 2007.
3.5.3 Processos de obtenção de uma Celulose Microcristalina
Para a obtenção da celulose Microcristalina é necessário seguir as
seguintes etapas conforme o fluxograma da figura 3.10.
Figura 3.10: Fluxograma do processo de manufatura da celulose microcristalina Avicel®. Fonte: Adaptado do site da FMC Corporation, 2007.
Secagem
Pó de celulose (Avicel®)
α celulose
Hidrolise e purificação
Desintegração mecânica
Adição de hidrocolóides e outros componentes funcionais
Secagem
MCC Colóides: • Avicel® • Avicel Plus® • Novagel®
Fibras da planta
25
3.5.4 A Membrana de Celulose Microcristalina Regenerada – MCCR
Uma solução de um derivado de celulose pode ser processada
(usualmente por extrusão) para produzir o formato desejado (geralmente fibra
ou filme) e então ser tratada para remover os grupos modificadores para
reformar ou regenerar a celulose. Este material é conhecido como celulose
regenerada (GRACH, 2006).
A celulose usada na medicina é tipicamente regenerada, sendo utilizado
o processo viscose ou pode ser modificada com derivados como o acetato de
celulose ou carboximetilcelulose. Essas celuloses perdem resistência e quase
toda a sua cristalinidade e forma original (HUTCHENS et al., 2006).
Os primeiros métodos de produção de celulose regenerada remotam ao
final do século XIX. Descoberta em 1892 por Cross, Bevan e por Beandle, o
método consiste em solubilizar a celulose pela formação do xantato através do
tratamento da pasta com hidróxido de sódio e dissulfito de carbono e
posteriormente regenerada pela acidificação da solução de xantato. Este
processo é conhecido como o processo viscose. Ele é usado para a produção
de fibras têxteis e para a produção da película transparente conhecida como
celofane (GRACH, 2006). A figura 3.11 mostra a reação envolvida no processo
viscose.
Figura 3.11: Reação envolvida no processo viscose. Fonte GRACH, 2006.
26
Filmes de celulose com poros, já são produzidos e usados para a
separações, na indústria e diálise na medicina, graças as suas propriedades de
hidrofilia e biocompatibilidade (RISBUD e BHONDE, 2001).
3.6 Caracterização da Celulose Microcristalina
3.6.1 Difração de Raios-X - DRX
De acordo com MANSUR (2006) a técnica de difração de Raios-X é
utilizada para identificar as fases cristalinas presentes nos materiais, uma vez
que cada sólido cristalino possui padrão único de difração (lei de Bragg), que
pode ser usado como uma “impressão digital” para a sua identificação. É
possível ainda identificar e medir algumas propriedades estruturais destas
fases, tais como: estado de deformação, tamanho de grão, de partícula,
composição da fase, orientação preferencial e estrutura de defeitos, e é
utilizada no intuito de determinar a espessura de filmes finos e suas
multicamadas e os arranjos atômicos em materiais amorfos e em interfaces de
materiais conjugados.
As amostras de materiais que ocorrem na forma de particulado fino e
que sejam suaves ao tato não necessitam qualquer tipo de tratamento,
enquanto o particulado grosseiro deve ser triturado, visando evitar orientações
preferenciais. De modo geral, utilizam-se materiais passantes nas peneiras 200
mesh ou em malhas inferiores (MANSUR et al., 2006).
Segundo KONTTURI et al. (2005), recentemente se descobriu uma
celulose nativa que possui tanto a forma cristalina quanto a forma amorfa
27
(celulose Iα e Iβ). Desta forma em um mesmo material é possível encontrar
uma estrutura semicristalina.
As figuras 3.12 e 3.13 mostram difratogramas de raios-X típicos de pó de
celulose para várias formas de celulose com alto e baixo índice de
cristalinidade e conforme figura 3.14 é possível verificar a configuração do
espectro ou difratograma de uma celulose microcristalina - MCC, a qual
apresenta um índice semicristalino, devido à presença de um pico mais largo
junto com um pico mais alto e estreito.
10 15 20 25 30 35 40 45 10 15 20 25 30 35 40 45
2θ 2θ10 15 20 25 30 35 40 4510 15 20 25 30 35 40 45 10 15 20 25 30 35 40 4510 15 20 25 30 35 40 45
2θ 2θ Figura 3.12: Difração de raios-X de pó de celuloses com baixo índice de
cristalinidade. Fonte: MIHRANYAN et al. 2004.
Figura 3.13: Difração de raios-X de pó de celuloses com alto índice de cristalinidade. Fonte: MIHRANYAN et al. 2004.
10 15 20 25 30 35 40 4510 15 20 25 30 35 40 45 10 15 20 25 30 35 40 4510 15 20 25 30 35 40 4510 15 20 25 30 35 40 4510 15 20 25 30 35 40 452θ 2θ
28
Figura 3.14: Difração de raios-X de pó de celulose Microcristalina com um índice semicristalino. Fonte: MIHRANYAN et al. 2004.
De acordo com OH et al. (2005), é necessário criar uma linha de base no
programa Origin® para delimitar a área cristalina da área amorfa. Desta forma
as medidas das porcentagens são calculadas pelo programa, conforme figura
3.15.
Figura 3.15: Delimitação da área cristalina da área amorfa através da linha de
base. Fonte: OH et al., 2005.
29
3.6.2 Microscopia Eletrônica de Varredura - MEV
De acordo com PISCITELLI (2004), a técnica de MEV permite a
obtenção de imagem ampliada e tridimensional da amostra a partir da interação
de um feixe de elétrons com o material.
A técnica requer ambiente de vácuo para que os elétrons desloquem na
câmara. No caso de amostras de origem orgânica (biológica) é necessário que
elas sejam desidratadas e fixadas de modo a suportar ambientes de vácuo e
por se tratar de amostras não condutoras devem ser recobertas com um filme
fino (10-50 nm) de material condutor que de modo geral, utilizam-se duas
categorias de materiais: carbono ou metais preciosos, (MANSUR, 2006).
Em geral os microscópicos eletrônicos de varredura podem ser
acoplados a equipamento de micro-análise, o que permite à obtenção de
informações químicas em áreas da ordem de até alguns nanômetros.
Informações qualitativas e quantitativas a cerca dos elementos presentes são
obtidas pela captação dos raios-X característicos resultantes da interação do
feixe primário com a amostra. Essa análise é denominada de EDS,
espectroscopia de energia dispersiva, (MANSUR, 2006).
A morfologia da celulose com baixa cristalinidade – LCC - figura 3.16 (a)
apresenta um aspecto muito similar à celulose microcristalina – MCC, assim
como a AMC também apresenta uma forma bem homogênea conforme figura
3.17. Porém a celulose que apresenta alto índice de cristalinidade possui um
aspecto morfológico mais filamentoso e irregular.
30
(a) (b) Figura 3.16: Micrografias de uma celulose de baixa cristalinidade (LCC) com um aspecto liso (a), e de uma celulose Algiflor com vales e picos irregulares (b). Fonte: MIHRANYAN et al. 2004.
(a) (b) Figura 3.17: Micrografias da celulose AMC com aspecto mais uniforme (a) e da celulose Cladophora com muitos filamentos em sua morfologia (b). Fonte: MIHRANYAN et al. 2004.
Figura 3.18: Micrografias da celulose microcristalina - MCC com um aspecto liso, plano. Fonte: MIHRANYAN et al. 2004.
31
3.6.3 Espectroscopia no Infravermelho por transformada de Fourier- FTIR
A técnica de espectroscopia de infravermelho é indicada para análises
qualitativas e quantitativas de compostos orgânicos e inorgânicos (MANSUR,
2006).
A espectroscopia na região do infravermelho é uma técnica de
inestimável importância na análise qualitativa orgânica de compostos químicos,
sendo amplamente utilizada nas áreas de química de produtos naturais,
síntese e transformações orgânicas de acordo com LOPES e FASCIO, (2004).
A tabela 3.2 apresenta algumas atribuições de bandas características de
grupos funcionais presentes na estrutura da celulose (ver Figura 3.7).
Tabela 3.2: Bandas vibracionais de grupos típicos da celulose
REGIÃO
cm-1 µm Intensidade Atribuição
3575 – 3125 2,8 – 3,2 média estiramento OH
1750 – 1725 5,71 – 5,8 forte estiramento C=O
1635 –1600 6,12 – 6,25 média deformação OH
1480 – 1435 6,76 – 6,95 fraca deformação de CH2.
~ 1375 ~ 7,27 fraca deformação CH
~ 1340 ~ 7,46 fraca deformação OH
1320 – 1030 7,58 – 9,71 fraca várias bandas
~ 830 ~ 12,5 fraca deformação CH2
Fonte: Adaptado de SÓCRATES, 2001.
32
3.7 Ensaios da Celulose Microcristalina
3.7.1 Ensaio de Biocompatibilidade (ensaio colorimétrico de MTT)
Segundo MARQUES (2002), o ensaio com MTT permite fazer uma
análise qualitativa e, em alguns casos, quantitativa do material em relação à
linhagem celular escolhida. Em alguns procedimentos é possível até mesmo
verificar a quantidade de células que se fixaram na superfície do material.
A avaliação da citotoxicidade in vitro de um biomaterial é o primeiro
passo para o estudo de sua biocompatibilidade. Tanto com soluções que
simulam o meio fisiológico, quanto com células, o teste in vitro é normalmente
desempenhado com o uso de linhagem isoladas de células primárias ou
tumorais (IGNATIUS e CLAES, 1996).
Conforme descreve GÓES et al., (2006) o MTT é um ensaio que
proporciona um modelo simples e eficaz para detectar células vivas e ou em
fase de crescimento sem o uso de elementos radioativos. O princípio do
método é baseado na capacidade das enzimas desidrogenases localizadas nas
mitocôndrias de células viáveis em converter o reagente de coloração amarela
solúvel em água, isto é, o brometo de 3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-
difeniltetrazólio (MTT) em um produto de coloração azul escuro (sais de
tetrazólio) o formazan, que é insolúvel em água (MOSMANN, 1983). A
quantidade de formazan produzida é diretamente proporcional ao número de
células viáveis presente no experimento.
De acordo com SANTOS et al., (2007) no ensaio de MTT o sal insolúvel
absorve um comprimento de onda de aproximadamente 570 nm, ele é
proporcional à quantidade de células viáveis, porque somente as células
33
viáveis podem metabolizar o MTT. Assim, somente células que são
metabolicamente normais podem transformar os sais de tetrazólio em cristais
azul escuro.
A vantagem do MTT é a de não utilizar elementos radioativos e sua
leitura ser muito rápida. Os resultados obtidos são consistentes com aqueles
obtidos nos ensaios de proliferação celular que usam a captação de H-timidina
(GÓES et al., 2006).
Após os procedimentos relatados é feita uma análise estatística
conforme figura 3.19.
Figura 3.19: Viabilidade celular medida por MTT.
Fonte: Costa Jr., 2007
3.7.2 Ensaios em SBF
A solução de SBF permite simular os íons contidos no plasma do sangue
humano conforme tabela 3.3 (OYANE et al. 1999), de modo a promover um
ambiente parecido com o organismo fisiológico, propiciando ao material (a
MCCR) um teste com condições próximas do real.
34
Tabela 3.3: Concentração de íons no plasma sanguíneo humano (SBF).
Íon Concentração/Mm Plasma do sangue SBF Na+ 142,0 142,0 K+ 5,0 5,0 Mg2+ 1,5 1,5 Ca2+ 2,5 2,5 Cl– 103,0 147,8
HCO3– 27,0 4,2
HPO42 –
1,0 1,0 SO4
2 – 0,5 0,5
Fonte: OYANE et al., 1999.
3.8 Modificação na Superfície dos Biopolímeros
As modificações de superfície dos biomateriais podem ser divididas em
duas categorias. Ocorrem para uma alteração física ou química de átomos ou
moléculas nas superfícies existentes ou para recobrir uma superfície natural
com um material de diferente composição ou estrutura (filmes, enxertos, etc.).
Alguns objetivos que motivam a modificação de superfícies são, (ORÉFICE,
2006):
• Modificar a hemocompatibilidade
• Afetar a adesão e crescimento celular
• Controlar a adsorção de proteínas
• Aumentar a lubrificação
• Melhorar a resistência à abrasão e corrosão
35
4. METODOLOGIA
4.1 Materiais e Reagentes
A celulose microcristalina usada neste trabalho consistiu de um produto
comercial fornecido pela VISKASE Inc. sob a forma de uma fita, referida como
MEMBRA-CEL™ MC 40×100 ou MCCR (figura 4.1).
Ela é um material hidrofílico fabricado a partir da celulose regenerada e
sua preparação utiliza o processo viscose. Tipicamente este produto é usado
em laboratórios para diálise. Este material é encontrado no mercado na forma
de tubo ou em lâminas.
Figura 4.1: MEMBRA-CEL™ (Membrana e tubo para diálise). Fonte: Viskase Companies, Inc.
Portanto, trata-se de uma celulose microcristalina regenerada e a seguir
são apresentadas as principais características desse produto fornecidas pelo
fabricante.
O peso molecular do material situa-se na faixa de 12.000-16.000 e a
medida do poro é cerca de 25 Å. O nível de contaminantes (enxofre e metais
36
pesados) é desprezível e o material apresenta excelente compatibilidade
química com materiais de uso corrente em biologia molecular e enzimologia,
tais como CaCl2, (NH4)2SO4 e solventes orgânicos aquosos isopropanol, etanol
e acetona. O material apresenta boa resistência a temperatura, podendo ser
fervido ou esterilizado em autoclave e um tubo do material contendo solução
aquosa pode ser congelado.
Quando mantida em água contendo benzoato, ácido benzóico,
formaldeído ou pentaclorofenol, a MEMBRA-CEL apresenta resistência
microbiológica de modo que o crescimento de microorganismos celulolíticos é
impedido. No estado seco, sua capacidade de absorção de proteínas é de
menos que 1,0 nanograma por grama de material. Dadas essas características,
a MEMBRA-CEL apresenta uma ampla variedade de aplicações em
enzimologia e biologia molecular tais como: dessalinização, modificação de
tampões, remoção de traços de inibidores e imobilização enzimática.
Além da MEMBRA-CEL, em alguns testes foi também utilizada uma
outra amostra de celulose microcristalina comercializada sob o nome de
Solucel®. O material foi doado pela empresa Bahia Pulp.
4.2 Procedimentos Experimentais
A Figura 4.2 apresenta um fluxograma destacando as principais técnicas
utilizadas na caracterização da celulose microcristalina. Cada um dos
procedimentos é detalhado a seguir.
37
Figura 4.2: Fluxograma das ferramentas de caracterização para a MCCR.
4.2.1 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
As amostras foram preparadas utilizando-se cobertura com uma fina
camada de ouro por aspersão com uma baixa taxa de deposição, refrigeradas
e colocadas à máxima distância do alvo para evitar danos nas amostras da
celulose. As dimensões das amostras foram de 1×1cm.
A morfologia da membrana de MCCR foi analisada em um, microscópio
JSM 6360LV, JEOL/Noran acoplado a espectrômetro de energia dispersiva
(EDS). As imagens de elétrons secundários e elétrons retroespalhados foram
obtidas utilizando tensão de aceleração de 10kV e 20kV.
4.2.2 Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourier
(FTIR)
MEV FTIR DRX MTT
Técnicas de Caracterização de Materiais
MCCR
38
Para verificar os grupos químicos presentes na celulose microcristalina
regenerada foi realizada a análise de infravermelho (IV) utilizando modos de
transmitância e reflexão total atenuada (ATR). Os espectros foram obtidos na
faixa de 4400 a 600 cm-1 após 32 varreduras, com resolução de 2 cm-1 e
intervalo de 1 cm-1 (Paragon 1000 da Perkin Elmer, USA). Os espectros de IV
foram normalizados e as bandas de vibração foram associadas aos principais
grupos químicos. Para esta análise foram cortadas amostras nas dimensões de
1×1 cm.
4.2.3 Difratometria de Raios-X (DRX)
A caracterização da celulose MCCR através da difração de raio-X
(PHILIPS, PW1710) foi obtida a partir da radiação Kα do cobre com
comprimento de onda λ= 1,54056 Ǻ. A análise de DRX foi conduzida com 2θ
variando 3 a 90º com passo de 0,06º. As medidas das amostras foram cortadas
com as dimensões de 1 x 1 cm.
4.3 Ensaios Biológicos
Foram realizados testes biológicos para determinar parâmetros de
citotoxicidade e histocompatibilidade das membranas de MCCR in vitro. Além
desses, foram também realizados ensaios de biodegradação em condições que
simulam o meio fisiológico como a solução de PBS (tampão fosfato de sódio) e
a solução de SBF (Simulação de Fluido Corpóreo).
4.3.1 Teste de Biocompatibilidade
39
Preparo das Amostras
As amostras foram esterilizadas com óxido de etileno (EtO), processo
normalmente de difícil execução devido às inúmeras exigências de controle.
Deve haver uma relação correta entre a concentração de gás, umidade relativa,
tempo de exposição, pressão e temperatura. Qualquer alteração em uma
destas variáveis afetará as outras e implicará na redução da qualidade do
processo. Como o EtO é altamente tóxico, exige cuidados especiais na
manipulação, durante o processo e na remoção de seus resíduos (aeração),
para que se torne seguro para uso. As fases do processo de esterilização
podem ser resumidas da seguinte forma (Fonte: site SBRT, 2007):
• Carregamento da Câmara
• Aquecimento da Câmara
• Programação do Ciclo de Esterilização
• Remoção do Ar por Alto Vácuo
• Injeção do Gás Óxido de Etileno
• Tempo de Exposição
• Remoção do Gás
• Aeração (mecânica, forçada ou quarentena)
Ensaio de Contato - Citotoxicidade
Para os ensaios de biocompatibilidade foram utilizadas células VERO
(ATCC CCL-81 – fibroblastos de rim de macaco - Cercopithecus aethiops –
Macaco Verde Africano). Estas células foram expandidas em Meio Mínimo de
40
Eagle suplementado (2 mM L-glutamina, Sais de Earle - 1.5 g/L bicarbonato de
sódio , 0.1mmol.L-1 de aminoácidos não essenciais e 1.0 mmol.L-1 piruvato de
sódio; 10% de SFB – soro fetal bovino), com adição de antibióticos (10.000
U/ml de Penicilina, 10mg/ml de Estreptomicina, 1mg/ml de Fungizona).
Ensaio de MTT
Após ser transferida para uma placa de cultivo celular de 96 poços, seis
das oito amostras foram tratadas como se segue: 250 μL/poço de meio mínimo
de Eagle sem suplementação foram adicionados e o sistema foi mantido em
uma estufa de CO2 (5%) por 24 h a 37 °C. Em seguida cada poço foi semeado
com 50.000 células em 100 μL de meio mínimo de Eagle e a placa foi colocada
na estufa. Após 24 h, a placa foi tratada com 30 μL/poço de uma solução de
MTT e incubada em estufa por mais 4 h na ausência de luz. Após essa
incubação com MTT, 35 μL/poço de uma solução 10% de SDS em HCl foram
adicionados, a placa foi levemente homogeneizada e reincubada por 14-16h.
Subseqüentemente, os cristais intracitoplasmáticos foram solubilizados por
pipetagem exaustiva, tomando-se cuidado suficiente para impedir qualquer
espumação. As camadas sobrenadantes foram transferidas para outra placa de
ensaios (100 μL de cada poço) e submetida a análise espectrofométrica em
comprimento de onda de 595 nm.
Além dos poços contendo material sob investigação. Foram preparadas
algumas amostras de controle. Poços contendo apenas meio mínimo de Eagle
sem suplementação foram usados como branco; uma solução de 0,1% de
41
Triton X-100 (SIGMA) foi usada como controle positivo e a hidroxiapatita foi
usada como controle negativo.
Fixação celular
Para a microscopia eletrônica, as amostras foram fixadas com 2%
Glutaraldeído por 16 h e desidratada através de uma serie de álcoois (etanol),
mas antes elas foram secas com nitrogênio no reator for 4 h e no dessecador à
vácuo por 12 h.
4.3.2 Ensaios de Biodegradação In vitro (PBS e SBF)
Ensaios de Imersão
Este procedimento prescreve o método para ensaio de degradação da
membrana de celulose microcristalina regenerada (MCCR) nos seguintes
meios:
• Tampão de fosfato de Sódio - PBS
• Fluido de Simulação do Corpo – SBF
Desta forma, o ensaio verifica o percentual de variação de massa sofrida
pela celulose durante intervalos definidos de tempo.
Volume da solução
Para calcular o volume da solução em relação à área do material que foi
imerso ORÉFICE (2000) sugere que esse cálculo deve equivaler a 0,1cm-1,
42
desta forma o volume utilizado para o ensaio de imersão em PBS foi 90 ml de
solução para uma área de 3 x 3cm da amostra de MCCR. E uma área de 0,5 x
0,5 cm para 2,5 mL de solução.
Preparo da solução de PBS
Para o preparo de um litro de solução de PBS (Tampão de fosfato de
Sódio) foi necessário acrescentar 1000ml de água Milli-Q aos reagentes
descritos na tabela 4.1.
Tabela 4.1: Reagentes para a solução de PBS.
Reagentes Quantidade
NaCl 8,0g
KCl 0,2g
Na2HPO4 1,44g
KH2PO4 0,24g
Preparo das amostras de MCCR para imersão em PBS
As amostras foram cortadas em dimensões de 0,5 x 0,5 cm para o
primeiro ensaio e 3 x 3 cm para o segundo ensaio. Foram mantidas em estufa
com 40°C ± 1 por 24 h, de modo a verificar sua variação de massa. Não foi
identificada nenhuma variação de massa significante, desta forma, as amostras
foram pesadas para logo em seguida serem imersas em solução tampão de
Fosfato de Sódio (PBS).
Imersão das amostras em Tampão Fosfato de Sódio (PBS)
43
Os potes para armazenamento das membranas de MCCR foram lavados
e mergulhados durante 30 minutos em 20% de ácido nítrico. Após esse
procedimento, esses potes foram abundantemente lavados com água comum e
depois ambientados com água Milli-Q. Em seguida as amostras foram
mergulhadas em 90 ml de solução Tampão Fosfato de Sódio (PBS) descrito na
tabela 4.1. A solução foi tamponada com o pH 7,4 a 37°C. Após esses
procedimentos, as amostras de MCCR foram colocadas e mantidas em banho-
maria com 37°C para simular a temperatura do corpo humano. A quantidade
das amostras foi de n=3 para os tempos de 1, 2, 4, 8, 24h na versão do
primeiro ensaio no segundo ensaio foi de n=5 para cada tempo de 4, 24, 96,
120h.
É importante também relatar que as amostras foram lavadas com água
corrente e secadas novamente sendo colocadas em estufa por vinte e quatro
horas com 40ºC.
Preparo da solução de SBF
O procedimento de preparo de SBF (simulador do fluido corpóreo) é feito
através da dissolução dos seguintes reagentes químicos em seqüência
previamente determinada (tabela 4.2 ) NaCl, KCl, K2HPO4.3H2O, MgCl26H2O,
CaCl2 e Na2SO4 junto com 500 mL de água Milli-Q e tampão com o pH 7,4 a
36,5°C com TRIS e um molar de solução de HCl.
Para realizar o preparo da solução de SBF foram seguidas as etapas que
estão relacionadas abaixo:
44
A - Agitar 500mL de água deionizada usando agitador magnético com
aquecimento, mantendo a mistura a 36±1°C. Dissolva os reagentes um a um na
ordem descrita conforme tabela 4.2, sempre depois que cada reagente for
adicionado e estiver completamente diluído (aproximadamente três minutos de
intervalo).
Tabela 4.2: Reagentes para preparo de 1 litro de SBF.
Ordem Reagentes Quantidade 1º NaCl 7,9960 g 2º NaHCO3 0,3500 g 3º KCl 0,2240 g 4º K2HPO4 0,1740 g 5º MgCl26H2O 0,3050 g 6º HCl 40 mL* 7º CaCl2 0,2780 g 8º Na2SO4 0,0710 g 9º TRIS 6,0570 g
*cerca de 90% deve ser adicionado e o restante, quando se ajustar o pH no item B (KOKUBO, 1993)
B - Ajuste a temperatura da solução no béquer para 36±1 °C em banho-
maria e ajuste o pH da solução para 7,4 com agitação, usando a solução de
HCl 1,0 mol.L-1.
C - Transfira a solução para um balão volumétrico de 1000 mL, complete
com água deionizada até a risca do balão volumétrico e agite o balão para
misturar a solução.
D - Transfira a solução do balão para uma garrafa de polipropileno ou
polietileno e guarde em geladeira na temperatura de 7±3oC
Imersão das amostras em Fluido Simulador do Corpo (SBF)
45
Os potes para armazenamento das membranas de MCCR foram lavados
e mergulhados durante 30 minutos em 20% de ácido nítrico. Após esse
procedimento, esses potes foram abundantemente lavados com água comum e
depois ambientados com água Milli-Q. Em seguida as amostras foram
mergulhadas em 90 ml de Fluido Simulador do Corpo (SBF) com concentração
de íons aproximadamente igual a aqueles encontrados no plasma do sangue
humano. Finalizada a solução, ela foi tamponada com pH 7,4 a 37°C com
solução aquosa de HCl 1,0 mol.L-1. Logo após esses procedimentos as
amostras de MCCR foram colocadas e mantidas em banho-maria com cerca de
37 °C, para simular a temperatura do corpo humano. A quantidade das
amostras foi de n=3 para os tempos de 1, 2, 4, 8, 24h na versão do primeiro
ensaio e no segundo ensaio foi de n=5 para cada tempo de 4, 24, 96, 120h.
Índices de degradação da Celulose Microcristalina Regenerada no PBS
Através da massa seca inicial (Msi) e da massa seca final (Msf) foram
verificadas as porcentagens de degradação da membrana de celulose no PBS.
O cálculo do índice de degradação foi feito conforme segue:
100% ×−
=si
sfsi
MMM
ID
Massa Intumescida
46
Através da massa Intumescida (MI) e da massa seca inicial foram
encontrados os graus de intumescimento da celulose MCCR e o cálculo foi
feito conforme equação abaixo (fonte: COSTA JR, 2007e CAVALCANTI et al,
2004)
100% ×−
=si
siI
MMM
Ii
4.4 Modificação Química da Celulose MCCR
A superfície da Celulose Microcristalina Regenerada foi modificada
quimicamente de modo a alterar suas características superficiais e foram
esperados resultados que propiciassem compatibilidade biológica ainda maior
dessa membrana. As substâncias utilizadas para a modificação da MCCR
estão descritas na figura 4.3.
Figura 4.3: Fluxograma dos novos tipos de MCCR.
A solução de Isocianato (denominada solução A) foi obtida adicionando-
se 2,0 mL de 3 (trietoxisilil)propil isocianato 95+% da Aldrich a 20 mL de uma
solução 50% v/v de etanol em água Milli-Q.
A solução de isocianato-arginina (denominada solução B) foi obtida
adicionando-se 250 mg de L-Arginina ≥98% a 250 mL de PBS e tratando-se 2,0
MCCR
MCCR - ISOCIANATO MCCR – ISOCIANATO COM ARGININA
47
mL dessa mistura com 2,0 mL de 3 (trietoxisilil) propil isocianato 95+% da
Aldrich e 20 mL da solução A.
Para efetuar a modificação química, a celulose microcristalina foi cortada
em pequenos quadrados de 1×1 cm e três amostras foram mergulhadas em
cerca de 2,5 mL das soluções de isocianato (A) e isocianato-arginina (B).
Essas misturas foram mantidas durante duas horas em banho-maria a 40ºC.
4.4.1 Ensaios de Degradação
Os estudos de degradação da MCCR foram feitos através da imersão
em SBF das amostras de celulose modificadas quimicamente. Essas amostras
foram imersas em SBF por 24, 72, e 216 horas, sendo mantidas em banho-
maria à temperatura de 37°C.
Os índices de degradação foram calculados por gravimetria, avaliando-
se a diferença entre a massa inicial da celulose modificada e a massa após ser
tratada com SBF, lavada com cerca de 20 mL de água destilada e seca a 40 °C
por 24 h.
48
5. RESULTADOS E DISCUSSÕES
5.1 Espectroscopia na região do Infravermelho (FTIR)
Os principais grupos presentes na estrutura química da celulose
puderam ser identificados no espectro de FTIR da MCCR, obtido por
reflectância total atenuada (Figura 5.1).
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0C-O
C-O-C
CH2C-H
H-O-HH-CO-H 894
1019
1652
1156
13131367
28893338
% A
bsor
banc
ia
Número de onda (cm-1)
Figura 5.1: Espectros IR da Membrana – MCCR.
As atribuições dessas bandas estão resumidas na Tabela 5.1. As
vibrações de estiramento das ligações O–H e C–H aparecem em 3388 e 2889
cm–1 (SUGIYAMA et al, 1991; KONDO, 1997), respectivamente. Ambos os
grupos dão origem a vibrações de dobramento a 1367 cm-1 (CH) e 1313 cm–1
(OH). A banda em 1652 cm–1 pode ser atribuída às vibrações de dobramento
de ligações H–O–H devido a água absorvida (ADEBAJO et al. 2004). A banda
49
de estiramento anti-simétrico de ligações C–O–C em ponte aparece em 1156
cm–1, enquanto outras bandas de estiramento C–O também aparecem em 1019
e 894 cm–1, que podem ser associadas a ligações α-glicosídicas. Os resultados
de FTIR permitiram confirmar que o material se trata de celulose.
Tabela 5.1: Principais bandas no espectro de infravermelho da MCCR
Freqüência (cm-1) Atribuição
3338 Estiramento O–H 2889 Estiramento C–H do grupo CH2 1652 Dobramento de H–O–H absorvida 1418 Dobramento OH e CH2 1367 Dobramento C–H 1332 Dobramento no plano de O–H 1313 Deformação O–H e/ou “abano” de CH2 1199 Dobramento no plano de O–H 1156 Estiramento anti-simétrico da ligação em ponte C–O–C da celulose 1019 Estiramento C–O da celulose 894 Ligações β-glicosídicas da celulose 700 Dobramento fora do plano de O–H 668 Dobramento fora do plano de O–H
5.2 Difratometria de Raios-X
De acordo com BORYSIAK e DOCZEKALSKA (2005) os planos das
moléculas da celulose são alinhados aproximadamente na direção 101 e essas
mudanças estão associadas com mudanças nas ligações do hidrogênio. A
geometria da celulose nativa é monoclínica e apresenta os seguintes
parâmetros a = 8,3 Å, b = 10,3 Å, c = 7,9 Å, β = 84°.
Segundo ABE e YAMAMOTO (2005) o pico máximo para (200) ocorreria
a menos de 22°. Dois tipos diferentes de posições cristalográficas têm sido
relatados para células unitárias monoclínicas da celulose nativa, segundo
SUGIYAMA et al. (1991) e MEYER e MISCH (1937). Dependendo da posição
50
da célula monoclínica e do entrelaçamento dos planos, por exemplo, a difração
dos picos 14.7°, 16.1° e 22.5° (2θ) da celulose nativa polimórfica pode ser
designada como (1–1 0), (110), (200) (MANSIKKAMÄKI, 2007).
0 20 40 60 80 100
100
200
300
400
500
600
21,80°
12,81°_
(200)
(101)
Inte
nsid
ade
(u.a
.)
2 θ (graus)
Figura 5.2: Difratograma da MCCR identificando principais picos.
O difratograma de raios-X da MCCR (Figura 5.2) apresentou dois picos
proeminentes, um em 12,81° e outro em 21,80°, que podem ser associados
respectivamente aos planos (–1 01) e (200).
A partir do difratograma da MCCR, a área sob os picos correspondendo
tanto às regiões cristalinas (Figura 5.3) como às amorfas foi calculada
utilizando-se o programa Origin® v. 7.5, de modo que o grau de cristalinidade
pode ser estimado.
51
0 20 40 60 80 100
100
200
300
400
500
600
Inte
nsid
ade
(u.a
)
2 Theta (graus)
Figura 5.3: Difratograma da MCCR, destacando as regiões cristalina e amorfa.
Tabela 5.2: Resultados dos percentuais das regiões amorfa e cristalina
Região Cálculo % Resultado
% amorfa 10049,750.892,059.8
× 92%
% cristalina 10049,750.8
57,690× 8%
Conhecendo-se a área total sob curva fornecida pelo programa, assim
como a área sob a região amorfa (Tabela 5.2), o grau de cristalinidade foi
estimado relacionando-se as áreas cristalina e amorfa, em termos percentuais
resultando em aproximadamente 8%. O valor obtido indica que a celulose
microcristalina utilizada neste trabalho é essencialmente um material amorfo.
52
5.3 Ensaios Biológicos
5.3.1 Ensaio de MTT da celulose Solucel®
As Figuras 5.4 e 5.5 apresentam os resultados dos testes feitos com a
Solucel comparada a hidroxiapatita como controle negativo. Como controle
positivo foi utilizado o Triton X-100 0,1%. As amostras da Solucel apresentaram
um desempenho superior ao do controle celular (CC) e também apresentaram
uma grande diferença entre o controle positivo (Triton X-100 0,1%) que é
tóxico, desta forma temos um ótimo resultado quanto à viabilidade celular da
celulose da marca Solucel®.
Figura 5.4: Estatística do ensaio de MTT da celulose Solucel®.
53
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
Solucel HA CC Triton
Abs
orbâ
ncia
595
nm.
Figura 5.5: Histograma da viabilidade de células Vero com a Solucel®.
A Figura 5.6 mostra fotografias tiradas em um microscópio ótico das
células VERO (a) e dessas mesmas células crescendo sobre o controle
hidroxiapatita (b), durante os ensaios MTT. Embora a hidroxiapatita apresente
agregados de pó, em ambas as imagens podem ser identificados cristais de
metilformazan no interior do citoplasma das células. Essas imagens
representam uma situação mais favorável ao crescimento celular.
(a) (b)
Figura 5.6: Microscopia por luz transmitida: (a) Imagens do crescimento das células VERO (b) células sobre a hidroxiapatita em forma de agregados de pó,
após os ensaios MTT.
54
Para efeito de comparação, a Figura 5.7 apresenta imagens do controle
efetuado com Triton X-100 0,1%, mostrando a morfologia das células mortas,
com um aspecto circular, sem nenhuma confluência.
Figura 5.7: Células no Controle positivo (Triton X-100 0,1%).
A Solucel apresenta um aspecto rugoso e não homogêneo, com pouco
ou nenhum poro em sua estrutura (Figura 5.8). O ensaio de MTT mostrou a
viabilidade desse material no contato celular, o que foi comprovado pela
presença de cristais de metilformazan no interior das células (Figura 5.8a).
Essas imagens mostram ainda uma confluência perfeita da monocamada
celular, demonstrada pela ausência de espaços e pela forma “esticada” das
células, com um aspecto fusiforme (Figura 5.8b).
(a) (b)
Figura 5.8: Imagens da Solucel, mostrando as células viáveis (a) cristais de metilformazan e (b) aspecto fusiforme.
55
A Figura 5.9 mostra uma série de micrografias da Solucel com cultura
celular em várias ampliações. As imagens demonstram claramente a estrutura
fibrosa do material, com fibras de 10 a 20 μm de diâmetro.
Figura 5.9: Fotomicrografias de MEV da Solucel com cultura celular viva (seta) em ampliações de 150, 1000, 3000 e 4000×.
5.3.2 Ensaio de MTT da celulose MCCR
Os ensaios de MTT forneceram resultados bastante significativos em
relação à viabilidade da celulose microcristalina (MCCR). A Figura 5.10 mostra
que o material analisado apresentou um desempenho aproximado ao do
controle HA e bem superior ao do controle positivo (Triton X-100 0,1%), nas
condições do ensaio de MTT. Esses resultados são bastante encorajadores e
56
comprovam a grande importância da celulose microcristalina como um
biomaterial.
Viabilidade Celular/ensaio de contato - Células VERO x MTT
0,000,050,100,150,200,250,300,350,400,450,500,550,600,65
Mic
rocr
ista
lina
Cce
lula
r
HA
Trito
nX10
0/0,
1%
Abs
orbâ
ncia
(595
nm)
Figura 5.10: Histograma da viabilidade de células Vero com a MEMBRA-CEL™.
Figura 5.11: Estatística do ensaio de MTT da celulose MEMBRA-CEL™.
Quando os dados são analisados em termos estatísticos, os resultados
são ainda melhores (Figura 5.11). Nessas análises o parâmetro p indica o
índice de confiança e não houve diferença significativa entre o comportamento
Viabilidade de células VERO em ensaio de contato com microcristalina
100
74
5
72,36
0102030405060708090
100
CC
HA
Trito
nX10
0/0,
1%
Mic
rocr
ista
lina
Viab
ilida
de (%
)
57
da celulose microcristalina e HA (p>0,05), porém, houve diferença entre HA /
microcristalina e o controle celular (p<0.05). A diferença estatística entre
microcristalina e Triton X 100/0,1% foi bem mais acentuada (p<0,001). A
hidroxiapatita é um dos biomateriais mais biocompatíveis, tanto que é utilizada
como controle celular. Pelos resultados estatísticos é possível perceber,
portanto, que o comportamento da celulose microcristalina é bem superior ao
controle positivo e muito similar ao da hidroxiapatita no contato celular, o que
confirma a sua viabilidade.
Essa viabilidade foi comprovada ainda pela análise do material no
microscópio ótico. A Figura 5.12 mostra células VERO do controle celular e do
controle hidroxiapatita vistas ao microscópio. Os pontos escuros correspondem
a cristais de metilformazan no interior do citoplasma de células viáveis (setas
vermelhas) e representam a situação ideal.
(a) (b)
Figura 5.12: Microscopia ótica do Controle Celular (a) e da hidroxiapatita (b).
As amostras da MEMBRA-CEL também mostraram a formação de
cristais de metilformazan no interior do citoplasma celular de células viáveis
conforme indicado pelas setas na figura 5.13.
58
Figura 5.13: Microscopia ótica da MEMBRA-CEL com células viáveis.
A Figura 5.14 mostra uma série de micrografias da MCCR com cultura
celular em várias ampliações, vistas ao microscópio eletrônico. Essas imagens
complementam os resultados apresentados para microscopia ótica, mostrando
agregados de células aderidas nas membranas de MCCR.
Figura 5.14: Fotomicrografia por MEV da MCCR com cultura celular em ampliações de 3000 e 4000x.
59
5.3.3 Índice de degradação da MCCR
O índice de degradação da MCCR foi determinado tanto em PBS
(tampão fosfato de sódio) como no SBF e os resultados são mostrados na Fig.
5.15. Em PBS o material apresentou um percentual de degradação de
aproximadamente 15% até 4 horas e de 25% no período de 24 horas, à
temperatura de 37°C. Já no SBF a média foi de 15 % até 4 horas e 9% no
período de 24 horas. Esses percentuais são bastante significativos, pois
indicam que a celulose microcristalina regenerada se degrada num período
muito curto.
0 2 4 240
5
10
15
20
25
30
PBS
Indi
ce d
e D
egra
daçã
o (%
)
Tempos individuais de degradação (h)
0 5 20 250
5
10
15
20
25
30
SBF
Índi
ce d
e de
grad
ação
no
SBF
(%)
Tempos individuais de degradação (h) Figura 5.15: Índice de degradação das amostras de MCCR no PBS e SBF.
60
Os índices de intumescimento da MCCR também foram determinados
tanto em PBS como em SBF, e os resultados são apresentados na Figura 5.16.
De modo geral, a membrana de celulose apresentou maior grau de
intumescimento no SBF em relação ao PBS.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28048
12162024283236404448525660
PBS
Gra
u de
intu
mes
cim
ento
no
PBS
%
Tempos individuais de intumescimento (h)
0 2 4 6 8 22 240
10
20
30
40
50
60
70 SBF
Gra
u de
Intu
mes
cim
ento
no
SB
F %
Tempos individuais de Intumescimento (h)
Figura 5.16: Grau de intumescimento de MCCR no PBS e no SBF.
Tanto nos ensaios de degradação como nos de intumescimento
apresentados, observou-se que as medidas possuíam um desvio padrão
considerável. Isso ocorreu principalmente por que as massas utilizadas
estavam muito próximas ao próprio erro da balança. A fim de se minimizar esse
61
problema, os ensaios foram repetidos e algumas modificações foram
introduzidas.
Nessa segunda bateria de ensaios foram utilizadas amostras com
dimensões maiores, bem como um número maior de amostras, que passaram
de n=3 para n=5. Além disso, o intervalo de tempo dos ensaios foi aumentado
para 120 horas.
0 20 80 100 1200
2
4
6
8
10
12
14
16PBS
índi
ce d
e de
grad
ação
no
PBS
%
Tempos individuais de degradação (h)
0 15 30 90 105 1200
2
4
6
8
10
12
14
16 SBF
índi
ce d
e de
grad
ação
no
SB
F %
Tempos individuais de degradação (h)
Figura 5.17: índice de degradação das amostras MCCR no PBS e no SBF.
62
Os resultados do ensaio de degradação da membrana em PBS e SBF
sob essas novas condições estão mostrados na Figura 5.17. Além dos erros
observados terem sido menores, observou-se que não houve uma variação
muito grande na média dos índices de degradação, que apresentaram um
percentual de aproximadamente 12 a 14% de perda de massa da membrana
de celulose no período de 4 a 120 horas na temperatura de 37°C. tanto em
PBS como em SBF.
Esses resultados forneceram um índice mais confiável e com
percentuais de degradação mais significativos, uma vez que os desvios
padrões foram menores em comparação aos da primeira bateria de ensaios.
0 15 30 90 105 1200
10
20
30
40
50
60
70 PBS
Gra
u de
Intu
mes
cim
ento
no
PBS
%
Tempos individuais de Intumescimento (h)
0 15 30 90 105 1200
10
20
30
40
50
60
70
SBF
Gra
u de
Intu
mes
cim
ento
no
SB
F %
Tempos individuais de Intumescimento (h)
Figura 5.18: Grau de intumescimento das amostras MCCR no PBS e no SBF.
63
Os resultados dos ensaios de intumescimento em PBS e SBF foram
ainda mais confiáveis, não só por causa dos desvios padrões menores, mas
também por que os valores foram praticamente idênticos nos dois casos
(Figura 5.18). Tanto no PBS como no SBF o grau de intumescimento ficou na
faixa entre 55 e 60%. É importante lembrar que após 120 h, cerca de 15% do
material já está degradado, de modo que faixa de grau de intumescimento
dever ser maior.
5.4 Modificação Química da celulose
Os ensaios de degradação em SBF das amostras de celulose MCCR
modificadas com 3 (trietoxisilil) propil isocianato 95+% da Aldrich e L- Arginina
≥98% da Sigma, não forneceram resultados que permitissem uma avaliação do
grau de degradação da mesma. Em algumas amostras, após 40 dias a 37 °C
ocorreu deposição de um sólido sobre a superfície da celulose, provavelmente
devido à precipitação dos sais que foram adicionados na solução do SBF. Isso
contribuiu para que se obtivessem valores maiores para a massa final,
produzindo valores negativos para o percentual de degradação.
Ao contrário dos ensaios de degradação, os resultados dos ensaios de
intumescimento foram mais coerentes. As amostras de celulose modificada
com isocianato apresentaram o grau de intumescimento de 54% em SBF
enquanto que para as modificadas com isocianato-arginina esse valor ficou em
torno de 49%.
Comparando-se esses resultados com aqueles obtidos para a celulose
não modificada, pode-se concluir que a modificação química não provocou
64
mudanças significativas no grau de intumescimento da MCCR. Entretanto o
comportamento frente à degradação foi bastante afetado, embora não tenha
permitido uma avaliação quantitativa desse efeito.
6. CONCLUSÃO
• As análises microscópicas mostraram diferenças morfológicas entre a
Solucel® e a membrana de celulose microcristalina regenerada, sendo esta
mais homogênea que a primeira.
• Através da espectroscopia de infravermelho (FTIR), pode-se constatar que
o material utilizado apresenta grupos funcionais típicos de compostos
celulósicos.
• Através de análise por difratometria de raios-X, foi possível constatar que o
material utilizado apresenta cerca de 8% de cristalinidade.
• Os ensaios biológicos de MTT indicaram que a MCCR apresenta
importantes características que são pertinentes a um biomaterial, com uma
significativa tolerância em meio fisiológico e uma baixa toxicidade. Foi
possível ver, através do microscópio, as células vivas no material, indicando
que se trata de substância inerte ao organismo.
• Os testes com PBS e SBF indicaram que houve uma degradação
significativa do material, o que tornaria possível sua aplicação na
cicatrização de feridas crônicas.
• Os resultados são bastante promissores na medida em que o índice de
degradação acompanhou o comportamento do meio fisiológico, abrindo a
65
possibilidade para o crescimento do tecido de granulação, que é o local
onde ocorre todo o processo de cicatrização.
• Os resultados atestam a potencialidade do material para estudos iniciais de
engenharia de tecido no sentido de auxiliar o processo de cicatrização.
• Os produtos da modificação química com isocianato e arginina, não
apresentaram índices significativos de degradação, porém o percentual de
intumescimento da celulose se manteve com cerca de 50% . Desta forma
podemos afirmar que a membrana de MCCR é um material com um bom
potencial na relação biológica com razoáveis características de absorção
líquida, apesar de ainda não ser possível garantir sua degradação na pele
humana de forma a mimetizar o processo cicatricial natural.
7. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS
Estudos in vivo (animais) visando avaliar as aplicações do material em
situações de cicatrização de feridas a fim de investigar sua capacidade de
mimetizar as funções da pele, de modo a monitorar ao longo do tempo os
mecanismos fisiológicos (8, 24, 72 e 144 horas).
66
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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