Dissertação - Priscila Crespo Garcia
Transcript of Dissertação - Priscila Crespo Garcia
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UNIVERSIDADE CIDADE DE SÃO PAULO
PROGRAMA DE MESTRADO EM FISIOTERAPIA
PRISCILA CRESPO GARCIA
EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS SINÁPTICAS E
ESTRUTURAIS NO SISTEMA NERVOSO DE RATOS
SUBMETIDOS A DIFERENTES MODALIDADES DE
EXERCÍCIO FÍSICO
SÃO PAULO
2012
i
PRISCILA CRESPO GARCIA
EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS SINÁPTICAS E
ESTRUTURAIS NO SISTEMA NERVOSO DE RATOS
SUBMETIDOS A DIFERENTES MODALIDADES DE
EXERCÍCIO FÍSICO
Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado em Fisioterapia da Universidade Cidade de São Paulo, como requisito para obtenção do título de Mestre, sob orientação da Profa. Dra. Raquel S. Pires
SÃO PAULO
2012
ii
iii
PRISCILA CRESPO GARCIA
Expressão de proteínas sinápticas e estruturais no sistema nervoso
de ratos submetidos a diferentes modalidades de exercício físico
Dissertação apresentada ao
Programa de Mestrado em
Fisioterapia da Universidade
Cidade de São Paulo, como
requisito para obtenção do título
de Mestre
A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa da Tese de Mestrado, em sessão
pública realizada a ......../........../............., considerou
( ) Aprovada ( ) Reprovada
Examinadora:.........................................................................................................
Profa. Renata Hydee Hasue Vilibor
Universidade de São Paulo
Examinadora:.........................................................................................................
Profa. Dra Sandra Regina Alouche
Universidade Cidade de São Paulo
Presidente:.............................................................................................................
Profa. Dra Raquel Simoni Pires
Universidade Cidade de São Paulo
iv
Aos meus amados pais,
meus irmãos Gil e Sheila e,
principalmente ao meu marido
Marcelo e minha filha Ana Julia,
pelo amor incondicional, pelo apoio,
ou simplesmente por existirem!
v
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais pelo grande amor, apoio, preocupações,
incentivos, nunca deixando que a distância nos afastassem.
Aos meus irmãos, pelo simples fato de me amarem do meu
jeito.
Ao meu marido lindo que tanto amo, pelo sempre apoio,
incentivo, por estar ao meu lado me ajudando, dando seu amor
em todos os momentos.
À minha filha Ana Julia, que chegou e transformou a minha
vida, me enchendo de alegrias todos os dias, dando seu amor
incondicional, fazendo de mim uma pessoa melhor.
À minha orientadora Profa. Raquel, pelo ingresso nesse
“novo mundo”, me proporcionando muitos ensinamentos, pela
paciência e amizade.
Ao Prof. Britto, por nos abrir as portas para a pesquisa, pelos
ensinamentos, contribuições e paciência.
Às professoras Sandra Alouche e Sandra Freitas, pelos
ensinamentos, sugestões e companheirismo.
À Carol, por estar ao meu lado desde o princípio, disposta a
me ensinar, me ajudando, pela paciência e carinho, além da
grande amizade.
Ao Adilson, sempre disposto a ajudar, sempre alegre,
tornando os dias de trabalho mais felizes.
À Ana, pelo companheirismo, sugestões e ensinamentos.
A todo pessoal do laboratório da USP, pelo acolhimento e por
estarem sempre dispostos a ajudar.
vi
Aos amigos da turma de mestrado da UNICID, em especial à
Bianca, pelos momentos de companheirismo.
A Ariane, pela amizade incondicional, que devido a
correria do dia a dia e de muito trabalho eu quase nunca vejo,
mas fará sempre parte da minha vida.
E a Deus, por permitir que eu tenha ao meu lado todas essas
pessoas, que fazem de mim uma pessoa muito feliz, pela benção e
proteção.
OBRIGADA!
vii
SUMÁRIO
LISTA DE ILUSTRAÇÕES.................................................................................................... ix
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ................................................................................xi
RESUMO............................................................................................................................. xii
ABSTRACT ........................................................................................................................ xiv
1. INTRODUÇÃO............................................................................................................... 16
1.1. Neuroplasticidade e Exercício ............................................................................ 16
1.2. Marcadores de Plasticidade Sináptica................................................................ 19
1.3. Estruturas Encefálicas: Caracterização Anátomo-funcional................................ 21
1.3.1. Córtex Motor....................................................................................................... 21
1.3.2. Estriado.............................................................................................................. 22
1.3.3. Cerebelo............................................................................................................. 24
2. JUSTIFICATIVA ............................................................................................................. 25
3. OBJETIVOS................................................................................................................... 26
3.1. Objetivo Geral .................................................................................................... 26
3.2. Objetivos Específicos ......................................................................................... 26
4. MATERIAL E MÉTODOS............................................................................................... 26
4.1. Animais .............................................................................................................. 26
4.2. Desenho experimental........................................................................................ 27
4.2.1. Protocolo de Exercício em Esteira de Intensidade Moderada...........................27
4.2.2. Protocolo de Exercício Acrobático .........................................................................28
4.3. Análise Comportamental .................................................................................... 29
4.4. Protocolo de Imuno-histoquímica ....................................................................... 30
viii
4.5. Protocolo de “Immunoblotting”............................................................................ 32
4.6. Análise Estatística .............................................................................................. 33
5. RESULTADOS............................................................................................................... 34
5.1. Análise Comportamental .................................................................................... 34
5.1.1. Performance Motora .................................................................................... 34
5.1.2. Desempenho Comportamental no Rotarod .................................................. 34
5.2. Expressão de Proteínas ..................................................................................... 35
5.2.1. Córtex Motor ..............................................................................................................37
5.2.2. Estriado........................................................................................................ 42
5.2.3. Cerebelo .....................................................................................................................47
6. DISCUSSÃO.................................................................................................................. 52
6.1. Comportamento.................................................................................................. 52
6.2. Mudanças nas proteínas estruturais e sinápticas ............................................... 53
6.2.1. Córtex Motor ................................................................................................ 53
6.2.2. Estriado........................................................................................................ 56
6.2.3. Cerebelo ...................................................................................................... 58
6.2.4. Circuitos núcleos da base-tálamo-cortical X cerebelo-tálamo-cortical .......... 60
7. CONCLUSÃO ................................................................................................................ 61
8. REFERÊNCIAS.............................................................................................................. 62
ANEXO I ............................................................................................................................. 73
ANEXO II ............................................................................................................................ 74
ix
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 – Imagem digital da esteira ergométrica adaptada para ratos.....................27
Figura 2 – Imagens digitais dos obstáculos que compõem o circuito para as
atividades acrobáticas................................................................................................28
Figura 3 – Aparelho Rotarod utilizado para realização da análise comportamental..29
Figura 4 - Desempenho dos ratos no treinamento de exercícios acrobáticos avaliado
pela média do tempo gasto para realização das seis tarefas presentes no circuito por
semana.......................................................................................................................33
Figura 5 – Tempo de permanência no aparelho Rotarod avaliado no início do
treinamento (I), 2 semanas após (M) e ao final do treinamento (F)...........................34
Tabela 1 – Níveis de proteínas estruturais e sinápticas nos diferentes tipos de
exercício.....................................................................................................................35
Figura 6 – Efeitos dos diferentes tipos de exercícios sobre a proteína associada ao
microtúbulo – 2 (MAP2) no córtex motor....................................................................37
Figura 7 – Efeitos dos diferentes tipos de exercícios sobre a expressão de
neurofilamentos (NF) no córtex motor........................................................................38
Figura 8 – Efeitos dos diferentes tipos de exercícios sobre a proteína sinapsina I
(SYS) no córtex motor................................................................................................39
Figura 9 – Efeitos dos diferentes tipos de exercícios sobre a proteína sinaptofisina
(SYP) no córtex motor................................................................................................40
Figura 10 – Efeitos dos diferentes tipos de exercícios sobre a proteína associada ao
microtúbulo – 2 (MAP2) no estriado...........................................................................42
Figura 11 – Efeitos dos diferentes tipos de exercícios sobre a expressão de
neurofilamentos (NF) no estriado...............................................................................43
Figura 12 – Efeitos dos diferentes tipos de exercícios sobre a proteína sinapsina I
(SYS) no estriado.......................................................................................................44
x
Figura 13 – Efeitos dos diferentes tipos de exercícios sobre a proteína sinaptofisina
(SYP) no estriado.......................................................................................................45
Figura 14 – Efeitos dos diferentes tipos de exercícios sobre a proteína associada ao
microtúbulo – 2 (MAP2) no cerebelo..........................................................................47
Figura 15 – Efeitos dos diferentes tipos de exercícios sobre a expressão de
neurofilamento (NF) no cerebelo................................................................................48
Figura 16 – Efeitos dos diferentes tipos de exercícios sobre a proteína sinapsina I
(SYS) no cerebelo......................................................................................................49
Figura 17 – Efeitos dos diferentes tipos de exercícios sobre a proteína sinaptofisina
(SYP) no cerebelo......................................................................................................50
xi
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
- AC: Exercício Acrobático
- AE: Ambiente Enriquecido
- BDNF: Fator Neurotrófico Derivado do Encéfalo
- Cb: Cerebelo
- CG: Camada Granular
- CM: Camada Molecular
- DLS: Estriado Dorsolateral
- DMS: Estriado Dorsomedial
- EE: Exercício em Esteira
- EG: Externamente Guiado
- EV: Exercício Voluntário
- GluR: Receptor de Glutamato
- GPe: Globo Pálido Externo
- GPi: Globo Pálido Interno
- IF: Filamentos Intermediários
- IG: Internamente Guiado
- LTP: Potenciação a Longo Prazo
- MAP: Proteína Associado ao Microtúbulo
- MF: Microfilamento de Actina
- MT: Microtúbulo
- NB: Núcleos da Base
- NF: Neurofilamento
- NT: Neurotransmissor
- SED: Sedentário
- SYP: Sinaptofisina
- SYS: Sinapsina
xii
RESUMO
Introdução: Diversos tipos de exercícios físicos com seus diferentes protocolos são
capazes de promover várias mudanças plásticas no sistema nervoso. No entanto,
não há ainda muita clareza quanto às respostas plásticas dependentes de proteínas
estruturais e sinápticas em regiões motoras quando comparados dois tipos
diferentes de exercício físico, um envolvendo tarefas motoras complexas e outro
envolvido com tarefas rítmicas e automáticas. O objetivo do estudo foi avaliar a
expressão das proteínas sinapsina I (SYS), sinaptofisina (SYP), MAP2 (proteína
associada ao microtúbulo – 2) e neurofilamentos (NF) em regiões do córtex motor,
estriado e cerebelo de ratos adultos submetidos a exercício físico realizado em
esteira de intensidade moderada (EE) e exercício acrobático (AC). Além disso, foi
analisado o comportamento motor e equilíbrio de ratos dos diferentes grupos.
Métodos e Resultados: Esse estudo utilizou-se de ratos adultos machos, Wistar, os
quais foram separados em 3 grupos: controle-sedentário (n=15), EE (n=20) e AC
(n=20). No grupo EE os ratos treinaram em uma esteira com velocidade máxima de
0,6 Km/h por 40 minutos, 3 vezes por semana por 4 semanas. No grupo AC, os ratos
passaram 5 vezes pelo circuito que era composto por diversos obstáculos, 3 vezes
por semana durante 4 semanas. Na análise comportamental foi utilizado o sistema
“Rotarod”. Além disso, foi analisada a performance motora dos ratos do grupo AC
através do registro do tempo de passagem pelo circuito acrobático. Para analisar a
expressão das proteínas no córtex motor, estriado e cerebelo foram utilizadas as
técnicas de imuno-histoquímica e “immunoblotting”, e os dados submetidos à análise
estatística utilizando o teste ANOVA e o pós-teste de Tukey quando apropriado.
Adotou-se o nível de significância de 5%. A análise comportamental dos animais
revelou aumento significativo do tempo de permanência no Rotarod somente nos
grupos EE e AC, a partir da segunda semana de treinamento e que permaneceu até
o final das 4 semanas. Quanto a performance motora, após 4 semanas de
treinamento acrobático, os animais mostraram uma redução estatisticamente
significante do tempo necessário para atravessar todo o circuito. Em nossos
resultados, ratos do grupo AC mostraram aumento significante de MAP2 e SYP no
córtex motor, das quatro proteínas no estriado e de SYS no cerebelo. Por outro lado,
xiii
ratos do grupo EE apresentaram aumento significativo de SYS e SYP no córtex
motor, NF68, SYS e SYP no estriado e MAP2, NF e SYS no cerebelo, além de
redução significativa de NF no córtex motor e na camada molecular do cerebelo.
Assim, as principais alterações ocorridas no grupo AC foram vistas nas áreas
envolvidas nos circuitos núcleos da base-tálamo-corticais, enquanto que no grupo
EE as alterações foram vistas nas regiões envolvidas no circuito cerebelo-tálamo-
cortical. Conclusão: Nossos dados sugerem que o exercício realizado em esteira e
o exercício acrobático modulam proteínas sinápticas e estruturais nas áreas
encefálicas de forma distinta, desempenhando um importante papel na plasticidade
exercício-dependente em regiões motoras do encéfalo.
Palavras chave: Exercício físico, proteínas estruturais, proteínas sinápticas,
exercício acrobático, exercício em esteira, circuitos neurais motores
xiv
ABSTRACT
Aim: Several types of physical exercise with different protocols are able to promote
plastic changes in the nervous system. The relationship of these plastic responses to
structural and synaptic proteins in motor regions of the brain are less understood.
The aim of this study was to evaluate the expression of the proteins synapsin I
(SYS), synaptophysin (SYP), microtubule-associated proteins 2 (MAP2) and
neurofilaments (NF) in the motor cortex, striatum and cerebellum of adult rats
subjected to moderate intensity treadmill exercise (EE) and acrobatic exercise (AC).
In addition, we analyzed the motor behavior and balance of rats of the different
groups. Methods and results: Adult male Wistar rats, were separated into 3 groups:
control-sedentary (n=15), EE (n=20) and AC (n=20). EE rats trained on a treadmill
with a top speed of 0.6km/h for 40 minutes, 3 times a week for 4 weeks. In the AC
group, the rats covered 5 times a circuit which was composed by several obstacles,
three times a week for 4 weeks. For behavioral analyses we used the “Rotarod”
system. In addition, in the AC group we analyzed the performance of the rats, by
recording the time of passage through the acrobatic circuit. The expression of
proteins in the motor cortex, striatum and cerebellum was analysed by
immunohistochemical and immunoblotting techniques, and the data subjected to
statistical analysis using one-way ANOVA with Tukey post hoc test when appropriate.
The significance level used was 5%. Behavioral analysis showed a significant
increase in time spent on the rotarod only in groups EE and AC, from the second
week of training through the end of 4 weeks. As of the motor performance, acrobatic
animals showed a statistically significant reduction of time needed to traverse the
circuit, from 2 – 4 weeks of training. Our results also showed that rats from the AE
group showed a significant increase of MAP2 and SYP in the motor cortex, of all four
proteins in the striatum and of SYS in the cerebellum. On the other hand, the rats
from the TE group exhibited a significant increase of SYS and SYP in the motor
cortex, of NF68, SYS and SYP in the striatum, and of MAP2, NF and SYS in the
cerebellum, whereas NF was decreased in the motor cortex and molecular layer of
the cerebellar cortex. Thus, the main changes in the AC group were seen in areas
involved in basal nuclei-thalamic-cortical circuits, whereas in group EE the main
xv
changes were seen in the regions involved in cerebellar-thalamic-cortical circuits.
Conclusion: Our data suggest that exercise on a treadmill and acrobatic exercise
differentially modulate synaptic and structural proteins in different brain areas, playing
an important role in exercise-dependent plasticity in motor regions of the brain.
Keyword: physical exercise, structural proteins, synaptic proteins, acrobatic
exercise, treadmill exercise.
16
1. INTRODUÇÃO
1.1. Neuroplasticidade e Exercício
Inúmeros estudos mostram a capacidade do sistema nervoso central em mudar
sua estrutura e função, como resultado da interação de indivíduos com o seu meio.
Dependendo das características do meio e do estilo de vida, as alterações plásticas
podem ser reforçadas ou degradadas1.
A vivência em ambiente enriquecido (AE) há décadas vem sendo utilizada para
avaliar a existência de alterações plásticas que ocorrem no sistema nervoso1-7. Em
um cenário laboratorial, um ambiente é “enriquecido” em relação à condição padrão
onde os animais são alojados. No AE os animais são mantidos em gaiolas maiores
e em grupos, com oportunidade de uma interação social dentro de um ambiente
complexo que varia ao longo do período do experimento. Este ambiente pode conter
túneis, rampas, plataformas, brinquedos em geral e a alimentação é trocada de
lugar com frequência. Além disso, a esses animais são dadas oportunidades de
execução de um exercício físico voluntário realizado em rodas contidas nas
gaiolas8. A exposição a essa condição pode levar a mudanças neuronais estruturais
como aumento na arborização dendrítica, aumento na densidade dos espinhos
dendríticos, aumento de matriz extracelular e até uma diminuição da gliose4, 5. O AE
também é capaz de estimular a neurogênese em regiões do hipocampo e gerar
mudanças distintas nos sistemas de neurotransmissores, sendo observado aumento
da liberação de dopamina e acetilcolina no córtex pré-frontal de ratos adultos e
aumento de glutamato e GABA no hipocampo de ratos envelhecidos1-3, 9.
Vários modelos de exercícios vêm sendo desenvolvidos em estudos com
animais a fim de simular os exercícios físicos realizados por seres humanos.
Estudos comprovam que, independente do tipo de treinamento físico, estes são
capazes de promover melhoras no aprendizado, na memória e plasticidade10-16.
Esses modelos de exercícios físicos em animais têm protocolos que incluem
diferentes intensidades, frequência de treinamento contínua e intermitente,
realizados em um período de curta e longa duração11. Dentre os estudos utilizando
treinamento físico, os tipos mais utilizados são o exercício voluntário (EV), exercício
em esteira (EE) e/ou exercício acrobático (AC)4, 11, 12, 17-22.
17
O EV é assim chamado pois os animais correm de forma espontânea dentro de
uma roda, sendo motivados a executá-lo por si só, e não em reposta a qualquer
manipulação externa. Neste tipo de exercício é observado que alguns ratos correm
vários quilômetros por dia, enquanto outros pouco se envolvem com esta atividade.
É um exercício executado geralmente de forma intermitente, com curtos períodos de
alta a baixa intensidade durante um período de 12 horas noturnas11, 23. O EV
executado tanto a curto, quanto a longo prazo, tem um grande impacto no encéfalo
e no comportamento de animais. A maioria desses estudos analisa a
neuroplasticidade ocorrida em áreas relacionadas à aprendizagem e memória. O
uso de EV mostrou alterações como sinaptogênese no cerebelo de ratos adultos24,
neurogênese14, 25-27, aumento do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e
seu receptor TrkB21, de genes associados à plasticidade sináptica e excitabilidade
celular e de MAP Kinase no hipocampo28, 29, no cerebelo e córtex30 e alterações na
atividade de neurotransmissores no córtex frontal31. Além disso, outros estudos
mostram que este tipo de exercício promove aumento de proteínas sinápticas
(sinapsina I e sinaptofisina) em áreas como o hipocampo32 e o neocórtex13,
ressaltando a importância deste tipo de exercício em áreas relacionadas à
memória13, 31.
O EE é um método comum de treinamento utilizado pelos pesquisadores que
investigam adaptações fisiológicas causadas pelo exercício. Este tipo de
treinamento é muito utilizado devido sua simplicidade e eficácia e onde vários
animais podem treinar ao mesmo tempo. É um exercício chamado de exercício
forçado, pois os animais o executam de acordo com as determinações do
pesquisador, que estabelece a velocidade, inclinação e tempo de treinamento11.
Alguns pesquisadores classificam esse tipo de exercício como uma tarefa
externamente guiada (EG) onde estímulos visuais, auditivos e/ou proprioceptivos
são dados para a realização do movimento33. Este tipo de treinamento tem se
mostrado também capaz de promover mudanças no sistema nervoso. Vários
estudos mostram que o exercício em esteira a curto e a longo prazo pode induzir
mudanças na expressão dos receptores de glutamato do tipo AMPA (GluR1-3) no
córtex sensório-motor, estriado e cerebelo22, neurogênese em regiões do
hipocampo em ratos envelhecidos34, 35, e proliferação de astrócitos e angiogênese
no córtex e estriado, onde autores sugerem que essa indução de astrocitose e
18
angiogênese provocada pelo exercício promove uma relação entre células
endoteliais/astrócitos, modificando a função da barreira hemato-encefálica dentro da
unidade neurovascular36. Além disso, o EE após curto período de treinamento foi
capaz de provocar alterações em proteínas estruturais e sinápticas em estruturas
como estriado, cerebelo, hipocampo, substância negra e córtex motor, mostrando
ajustes na eficiência sináptica e remodelamento neuronal12.
Estudos recentes têm focado a aprendizagem motora associada ao treinamento
acrobático17, 20, 21, 37-41. Este tipo de exercício consiste em uma sequência de tarefas
destinadas a incentivar a resolução de problemas e coordenação. Nesse tipo de
exercício há a necessidade de um início voluntário do movimento, necessitando de
um planejamento de como este pode ser executado. Tarefas relacionadas como
este tipo de movimentos, são assim chamadas de tarefas internamente guiadas
(IG)33. Exercícios acrobáticos como aprender a atravessar vários tipos de obstáculos
com diferentes tamanhos de superfície e graus de instabilidade diferem de exercício
voluntário e executado em esteira, já que estes são rítmicos e repetitivos. O AC
promove alterações em proteínas neuronais como MAP2 e sinaptofisina38, aumento
de BDNF e seu receptor21, sinaptogênese em regiões do cerebelo e córtex motor24,
40, 42, 43, além de alterações comportamentais, como redução do tempo de realização
das tarefas, indicando um aumento substancial na aquisição das habilidades
motoras40.
As adaptações que o exercício causa no sistema nervoso têm implicações
também na prevenção e tratamento do declínio cognitivo associado ao
envelhecimento e em distúrbios neurológicos, como doença de Alzheimer, doença
de Parkinson, acidente vascular isquêmico e lesões medulares.
O exercício físico produz um efeito protetor, atenuando o declínio mental
decorrente do envelhecimento mostrando que em animais envelhecidos há melhora
da memória espacial, aumentando a neurogênese e suprimindo a apoptose no giro
denteado 34, 35, 44.
Exercícios também mostram um potencial na plasticidade neural em animais
induzidos a um modelo de Alzheimer, levando ao aumento da neurogênese no
hipocampo desses animais, sugerindo ser de grande valia para a estimulação da
função cognitiva em casos da doença de Alzheimer45, 46.
19
Em um modelo experimental de doença de Parkinson, o exercício físico foi
capaz de provocar menores déficits após a lesão, além de levar a maior
sobrevivência de neurônios dopaminérgicos na região nigroestriatal em comparação
aos animais lesados sedentários, demonstrando que o exercício físico melhora os
sintomas motores e déficits neuroquímicos em modelos animais de Parkinson47.
Diversos estudos têm mostrado que diferentes modalidades de exercício físico
geram um mecanismo de neuroproteção, promovendo redução da apoptose no
hipocampo48, 49 e aumento da sinaptogênese no córtex motor39 de ratos pós-lesão
encefálica, além de facilitar a recuperação funcional pós-lesão medular37, 50.
1.2. Marcadores de Plasticidade Sináptica
Estudos comportamentais têm demonstrado que a realização de exercício físico
requer a síntese de proteínas e é provável então que algumas das proteínas
sintetizadas durante o exercício físico estejam envolvidas com a plasticidade
estrutural e funcional38. Estudos recentes deram início a uma sequência de
pesquisas que avaliam o envolvimento de proteínas sinápticas, como sinapsina I e
sinaptofisina, e de proteínas responsáveis pela estrutura neuronal, na plasticidade
do sistema nervoso decorrente de exercício físico12, 13, 38, 51.
As sinapsinas representam uma família de quatro fosfoproteínas expressas
principalmente em neurônios, onde são associadas a vesículas sinápticas em
praticamente todos os terminais nervosos do sistema nervoso central e periférico.
São elas: sinapsina Ia e Ib (chamadas de sinapsina I) e sinapsina IIa e IIb (chamada
de sinapsina II)52, 53. As sinapsinas regulam a liberação de neurotransmissores (NT)
pelos terminais nervosos. A sinapsina I é a mais abundante de todas as
fosfoproteínas neuronais e quando desfosforilada encontra-se ligada à vesícula
sináptica, ancorando-a ao citoesqueleto do terminal nervoso. A condução do
impulso nervoso estimula a fosforilação da sinapsina I, soltando-se da vesícula,
deixando-a disponível para exocitose e liberação de neurotransmissores53. A
fosforilação da sinapsina I está envolvida em vários mecanismos dependentes de
Ca2+ que regulam a liberação de NT. Alguns NT estimulam ou inibem a fosforilação
da sinapsina I ligando-se a receptores pré-sinápticos, alterando, portanto, as
concentrações de Ca2+. Esta proteína está envolvida com a regulação da formação
20
de sinapses em vários estágios do desenvolvimento neuronal, regulando a
maturação estrutural e funcional das sinapses. Portanto, a sinapsina I tem um papel
importante na organização da estrutura do terminal nervoso52, 54.
A sinaptofisina é uma glicoproteína responsável pela biogênese e ancoragem
das vesículas sinápticas no terminal sináptico e resgate de proteínas dessas
vesículas por endocitose, o que é importante para uma neurotransmissão rápida e
eficiente32. O aumento de sinaptofisina pode indicar a formação de vesículas
sinápticas, podendo significar um aumento de vesículas nas sinapses já existentes,
ou a formação de novos terminais nervosos55-57.
O citoesqueleto neuronal é composto por três estruturas interligadas: os
microfilamentos de actina (MFs), os microtúbulos (MTs) e filamentos intermediários
(IFs). O diâmetro dos IFs (10nm) é “intermediário” entre microfilamentos (6nm) e
filamentos de miosina (15nm)58. Os neurofilamentos (NF) são filamentos
intermediários de neurônios, compostos por três tipos de proteínas: NF-L ou NF68,
NF-M ou NF160 e NF-H ou NF200 (polipeptídeos com pesos moleculares baixo,
médio e alto, respectivamente) que formam obrigatoriamente heteropolímeros,
sendo necessária a co-polimerização do NF68 com pelo menos uma das
subunidades mais pesadas em roedores58, 59.
Os NFs representam um dos principais componentes do citoesqueleto
neuronal59-61. A síntese e o transporte axonal de neurofilamentos têm um papel
importante no controle do calibre axonal em grandes fibras nervosas mielinizadas.
Este conceito é baseado em diversas características de um nervo normal, tais
como: i) os NFs são os elementos mais numerosos do citoesqueleto, ii) a densidade
do NF permanece constante ao longo de uma ampla gama de calibres, e iii) o
número de NFs correlaciona-se diretamente com a área axonal. O controle do
calibre axonal tem importantes implicações funcionais visto que o tamanho do
calibre axonal é um dos determinantes da velocidade da condução nervosa61. Eles
também contribuem para as propriedades dinâmicas do citoesqueleto neuronal
durante diferenciação, crescimento, regeneração e orientação axonal58, 61. Além
disso, os NF, em conjunto, agem para formar e manter a forma da célula e facilitar o
transporte de partículas e organelas no citoplasma58, 61, 62. Embora os NFs tenham
uma importante função, ainda há poucos estudos demonstrando a expressão de
NFs frente a exercícios físicos.
21
Por outro lado, perturbações em seu metabolismo e organização são
frequentemente associadas com várias doenças neurodegenerativas, incluindo
esclerose lateral amiotrófica (ELA), doença de Alzheimer e doença de Charcot-
Marie-Tooth58, 63-65.
Os microtúbulos e suas proteínas associadas (MAPs) têm papel fundamental no
desenvolvimento de axônios e dendritos. No encéfalo adulto, MAP2a e MAP2b são
as MAPs mais abundantes no dendritos. A MAP2 pode desempenhar múltiplas
funções, incluindo a nucleação e estabilização dos microtúbulos e possíveis
microfilamentos, o transporte de organelas dentro de axônios e dendritos, bem
como a fixação de proteínas reguladoras, tais como proteínas quinases, que podem
ser importantes para a transdução de sinal. Assim, as MAPs participam do processo
de crescimento e arborização dendrítica, remodelamento dendrítico pós-lesão e
estabelecimento e manutenção da sinaptogênese66, 67.
1.3. Estruturas Encefálicas: Caracterização Anátomo-funcional
As regiões encefálicas analisadas neste trabalho, córtex motor, cerebelo e
estriado, foram escolhidas por serem áreas motoras envolvidas, de uma forma
geral, com coordenação, equilíbrio e planejamento e/ou execução de movimentos,
que sofrem influência direta dos efeitos do exercício físico.
1.3.1. Córtex Motor
O córtex cerebral apresenta-se organizado em seis camadas numeradas de I a
VI, como descrito por Lorente de Nó em 194268. Estas camadas são compostas
basicamente por três tipos celulares: células granulares ou estreladas
(interneurônios); células fusiformes e células piramidais (de onde se originam fibras
eferentes do córtex cerebral), variando apenas a quantidade de cada uma na região
analisada. Nas camadas I, II e III encontramos fibras de associação, na IV estão as
fibras aferentes, na V temos células que dão origem às fibras eferentes, chamadas
também de células de Betz na área motora primária, isto é, que deixam o córtex
cerebral indo para o tronco encefálico, medula espinal e núcleos da base, e na VI
22
temos as fibras que partem desta zona em direção ao tálamo68. Em nosso estudo a
camada V foi selecionada por gerar a principal eferência cortical no contexto motor.
As áreas motoras do córtex cerebral são subdivididas em área motora primária e
em várias áreas pré-motoras (áreas motoras secundárias). A área motora primária é
responsável por executar o movimento e as outras por planejar o movimento,
participando de padrões de movimento mais complexos69. A capacidade de
reorganização funcional do córtex cerebral não se limita ao desenvolvimento e pode
ser demonstrada em um cérebro já maduro. A redistribuição das representações
sensoriais e motoras dentro do córtex cerebral de adultos tem sido demonstrada em
resposta a uma variedade de manipulações experimentais40, 70-72. Além disso, a
reorganização parece ser um processo contínuo. Estudos têm mostrado que há
mudanças no número de sinapses40, 43 e da eficiência sináptica73 no córtex motor
em associação com as mudanças nas representações do movimento no mapa
cortical40, 72. Outros pesquisadores demonstraram que a combinação de lesão
cerebral e exercício acrobático levam a incremento da sinaptogênese, onde animais
treinados apresentavam mais sinapses por neurônios na camada V do córtex
cerebral comparado aos outros grupos do estudo39.
1.3.2. Estriado
Os núcleos da base (NB) são responsáveis pela maioria dos programas motores
de rotina, além de participarem da formação de memória e aprendizado74. São
constituídos por quatro estruturas, sendo elas: estriado (acumbens, caudado e
putâmen), globo pálido (interno - GPi e externo GPe), substância negra (parte
compacta e reticulada) e núcleo subtalâmico. O estriado por sua vez, ao excluirmos
o polo anterior onde se localiza o núcleo acumbens, é subdividido pela cápsula
interna em caudado e putâmen, formando uma estrutura chamada neoestriado,
porém didaticamente encontramos referência como apenas estriado75. O estriado é
composto por vários tipos celulares, porém cerca de 90 ou 95% deles são neurônios
com espinhos dendríticos e projeções GABA-érgicas, que são alvos importantes da
aferência cortical e representam a única fonte de eferências dos NB76.
As conexões dos NB são baseadas em duas vias estriado-palidais distintas.
Uma via direta que projeta informações do estriado para o GPi e dele para o tálamo,
23
enquanto a via indireta projeta as informações para o GPe, núcleo subtalâmico, GPi
e tálamo. O GPi é considerado o principal núcleo de saída dos NB. Fibras eferentes
do tálamo enviam suas projeções para o córtex. A via direta pode promover uma
retroalimentação “positiva” e a via indireta uma retroalimentação “negativa” no
circuito entre os NB, tálamo e córtex. Essas vias eferentes (NB-tálamo-cortical) têm
efeitos opostos nos núcleos de saída dos NB e, consequentemente, nos alvos
talâmicos desses núcleos. A ativação da via direta desinibe o tálamo, aumentando a
atividade talamocortical, enquanto que a ativação da via indireta inibe os neurônios
talamocorticais. Assim, a via direta facilita o movimento e a via indireta inibe o
movimento. Essas vias estriatais são afetadas de forma distintas por projeções
dopaminérgicas proveniente da substância negra. A via direta possui receptores
dopaminérgicos D1, que facilita a transmissão, e a via indireta possui receptores D2,
que reduzem a transmissão. Desta forma, ativação das aferências dopaminérgicas
provocam o mesmo efeito, reduzindo a inibição dos neurônios talamocorticais e
facilitam os movimentos iniciados pelo comando do córtex76, 77. Alguns estudos
sugerem que os circuitos estriatais e os processos envolvidos durante as fases
precoces e tardias de aprendizagem de habilidade podem ser diferentes. Como por
exemplo, o estriado dorsomedial ou associativo (DMS – homólogo ao caudado em
primatas) que recebe aferências principalmente da áera motora suplementar e
córtex pré-frontal, sendo preferencialmente envolvido nas fases iniciais de
aprendizagem visuomotora. Por outro lado, o estriado dorsolateral ou sensório-
motor (DLS – homólogo ao putâmen em primatas), recebe aferências do córtex
sensório-motor e é principalmente ativado nas aquisições de comportamento
habituais e automáticas78.
Tarefas que são internamente guiadas (IG), ou seja, movimento iniciados
voluntariamente, são principalmente processadas pelo circuito NB-tálamo-cortical
com recrutamento do circuito cerebelo-tálamo-cortical33. Lewis e colaboradores
observaram em seu estudo que portadores de doença de Parkinson tem uma
ativação não adequada (ou pouca ativação) do circuito NB-tálamo-cortical ao
realizar tarefas IG33.
24
1.3.3. Cerebelo
O cerebelo foi escolhido para ser analisado neste estudo por estar envolvido na
manutenção do equilíbrio, tônus muscular e postura, além da coordenação dos
movimentos79.
O cerebelo de mamíferos é formado por córtex cerebelar (substância cinzenta
externa), substância branca interna e por núcleos cerebelares profundos, que
representam suas principais estruturas de saída. Ele pode ser dividido de acordo
com o desenvolvimento evolutivo ou sua funcionalidade. Funcionalmente ele é
dividido em: vestibulocerebelo, espinocerebelo e cerebrocerebelo, as quais recebem
aferências distintas, projetando-se para diferentes partes dos sistemas motores
através dos núcleos profundos. O córtex cerebelar é formado por três camadas
distintas: molecular, das células de Purkinje e granular. A disposição celular em
cada uma dessas camadas é a mesma em todos os lobos, diferindo somente na
procedência das vias aferentes e no destino das vias eferentes80, 81.
A camada molecular é basicamente uma área de sinapses e nela se encontram
além das fibras paralelas, os dendritos das células de Purkinje (formando sinapses
com as fibras trepadeiras), os dendritos das células de Golgi, as células em cesto e
estreladas, todos fazendo sinapses com as fibras paralelas. A camada das células
de Purkinje é composta de células grandes dispostas ao longo da borda superior,
próximo à camada molecular. Estas células constituem a eferência do córtex
cerebelar82.
Já na camada granular, encontramos as células granulares cerebelares, que
representa o tipo de neurônio mais numeroso no encéfalo83. Seus axônios
ascendem para a camada molecular e se bifurcam formando as fibras paralelas que
fazem sinapses excitatórias com as células de Purkinje84. Nesta camada temos
também as células inibitórias de Golgi tipo II que se localizam na parte superior da
camada, apresentando ramos dendríticos por todas as camadas do córtex
cerebelar, porém mais extensos na camada molecular84.
As duas aferências para o cerebelo são excitatórias e compostas pelas fibras
musgosas e trepadeiras. As fibras musgosas, maior fonte de aferências do cerebelo,
têm origem em núcleos do tronco encefálico e neurônios medulares que dão origem
ao trato espinocerebelar, conduzindo então informações sensoriais periféricas, além
25
de informações do córtex cerebral, e fazem sinapses excitatórias com dendritos das
células granulares na camada granular. As células granulares agem diretamente
sobre as células de Purkinje via fibras paralelas80.
A origem das fibras trepadeiras se dá no núcleo olivar inferior e formação
reticular medial, que recebem aferências do córtex cerebral, núcleo rubro e medula
espinal80. Estas conduzem informações sômato-sensórias, visuais e do córtex
cerebral. As sinapses das fibras trepadeiras ocorrem entre o soma e os dendritos
das células de Purkinje, podendo modular o efeito das fibras musgosas, por serem
muito potentes. Tanto as fibras musgosas como as trepadeiras enviam colaterais
para os neurônios dos núcleos cerebelares. Desta forma, os neurônios dos núcleos
cerebelares recebem aferências excitatórias das fibras musgosas e trepadeiras e
inibitórias das células de Purkinje. As informações aferentes provêm de receptores
da pele, olho, sistema vestibular, músculos e articulações. Após passar pelas
células de Purkinje, a informação segue para os núcleos cerebelares profundos,
para então seguir seu destino pelas vias eferentes cerebelares80.
De uma forma geral, o circuito cerebelo-tálamo-cortical (Cb-tálamo-cortical) é
organizado pelas fibras musgosas e trepadeiras, que transportam eferências do
cerebelo através de uma alça excitatória principal que passa pelos núcleos
profundos. Essa alça é modulada por uma alça lateral que passa pelo córtex
cerebelar85. Esse circuito fornece ao córtex motor informações sobre os movimentos
em andamento, além da velocidade e da força desse movimento77.
Enquanto os circuitos NB-tálamo-corticais são principalmente ativados em
tarefas que são IG, as tarefas externamente guiadas (EG), ou seja, tarefas
orientadas por estímulos visuais ou auditivas são principalmente processadas nos
circuitos Cb-tálamo-corticais, com recrutamento do circuito NB-tálamo-cortical33.
2. JUSTIFICATIVA
A neuroplasticidade que ocorre no sistema nervoso de animais e humanos
frente a diferentes tipos de exercícios físicos foram descritos por diversos autores
que revelaram mudanças distintas em diferentes áreas encefálicas. Além disso,
muitos desses estudos têm demonstrado o papel dos diferentes tipos de exercícios
físicos sobre funções cognitivas, tais como memória de curto e longo prazo. No
26
entanto, não há ainda muita clareza quanto às respostas plásticas dependentes de
proteínas estruturais e sinápticas em regiões motoras quando comparados dois
tipos diferentes de exercício físico, um envolvendo tarefas motoras complexas (AC)
e outro envolvido com tarefas rítmicas e automáticas (EE).
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo Geral
- Avaliar a expressão das proteínas neuronais em regiões encefálicas de ratos
adultos submetidos a diferentes tipos de exercícios, em paralelo com a análise do
comportamento motor desses ratos.
3.2. Objetivos Específicos
- Avaliar a expressão de proteínas sinápticas (sinapsina I e sinaptofisina) e de
proteínas estruturais (MAP2 e neurofilamentos) em animais submetidos ao exercício
em esteira e acrobáticos e compará-los aos sedentários.
- Analisar se as respostas plásticas nas regiões do córtex motor, cerebelo e
estriado são distintas entre os diferentes tipos de exercícios.
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Animais
Foram utilizados nesse estudo 55 ratos machos, adultos (2 meses), da linhagem
Wistar fornecidos pelo biotério central do Instituto de Ciências Biomédicas da USP.
Os animais foram mantidos em uma sala com temperatura constante de 23oC e.ciclo
claro/escuro invertido artificialmente de 12/12h, com alimentação e água ad libitum.
Antes do início do treinamento físico os animais ficaram 15 dias na sala para
adaptação de ciclo invertido 86, 87. Este estudo foi conduzido de acordo com os
Princípios Éticos de Experimentação Animal adotado pelo Colégio Brasileiro de
Experimentação Animal (COBEA) e foi aprovado pela COMISSÃO DE ÉTICA EM
27
EXPERIMENTAÇÃO ANIMAL (CEEA) do ICB/USP em 21/05/2010, protocolo
registrado sob nº 60 nas fls. 87 do livro 2 para uso de animais de experimentação.
4.2. Desenho experimental
Inicialmente, todos os animais foram colocados para correr na esteira por 5
minutos a uma velocidade que variou de 0,3 a 0,5 Km/h por dois dias para
selecionarmos os animais corredores evitando o emprego do choque elétrico e
assim minimizando o estresse11. Destes, 16 animais não correram e foram divididos
nos grupos sedentário e AC. Os 39 animais restantes foram divididos
aleatoriamente em três grupos, totalizando: exercício em esteira de intensidade
moderada (EF, n=20), exercício acrobático (AC, n=20) e sedentário (SED, n=15).
Os animais sedentários permaneceram no mesmo ambiente que os exercitados.
4.2.1. Protocolo de Exercício em Esteira de Intensidade Moderada
Os animais foram adaptados ao exercício por 15 minutos durante 2 dias, sendo
iniciado a uma velocidade de 0,3 km/h com incrementos de velocidade da esteira de
0,1 km/h a cada 5 minutos. Desta forma, ao fim deste período de adaptação, os
animais estavam a uma velocidade de 0,5 km/h.
Os animais foram treinados em uma esteira ergométrica programável (KT 3000
– IMBRAMED) adaptada para ratos (Figura 1). A esteira é constituída de 8 raias de
acrílico transparente pintadas de preto em sua extremidade anterior. A parte anterior
mais escura das raias propicia um ambiente para o qual os ratos são atraídos
durante o treinamento, evitando a necessidade de choques elétricos para induzir
seu deslocamento. Entretanto, em momentos em que os ratos permanecessem por
muito tempo no fundo da raia era dado um estímulo manual para que retornassem a
atividade.
O treinamento consistiu de corrida em esteira durante 40 minutos a
aproximadamente 60% do VO2 máximo12,22. O protocolo de treinamento foi
realizado 3x/semana, por 4 semanas, iniciado a 0,4 km/h com incrementos da
velocidade da esteira de 0,1 km/h a cada 1 minuto, apenas para o aumento da
velocidade ser gradativo. Assim, com 2 minutos a velocidade foi de 0,6 km/h,
28
velocidade na qual o animal correu por 38 minutos. O horário do início do
treinamento foi o mesmo para todos os grupos, ou seja, entre as 11 e 13 horas,
acontecendo no período ativo do animal87.
Figura 1. Imagem digital da esteira ergométrica adaptada para ratos.
4.2.2. Protocolo de Exercício Acrobático
Inicialmente os ratos passaram por um período de adaptação à tarefa motora
que consistiu em passar 2 vezes por todo o circuito em 2 dias seguidos. O
treinamento acrobático consistiu em atravessar um circuito constituído pelos
obstáculos: gangorra, barreiras verticais, ponte de cordas paralelas, traves paralelas
de madeira roliça, pontes de madeira roliça e corda, como mostra a Figura 2. O
circuito foi baseado no utilizado por Kleim e colaboradores40 e localizado a uma
altura de 1,50m do chão. O treinamento foi realizado três dias alternados por
semana e com 5 repetições desse circuito por dia, até completar 4 semanas de
treinamento. Quando necessário foram dados estímulos manuais leves no trem
posterior dos animais como forma de estímulo para percorrer todo o caminho. Foi
registrado o tempo necessário para cada rato percorrer cada passagem pelo
circuito43, 88. Após o término das cinco passagens de cada animal pelo circuito, todos
os obstáculos e plataformas foram limpos com etanol 70%.
29
Figura 2. Imagens digitais dos obstáculos que compõem o circuito para as
atividades acrobáticas.
4.3. Análise Comportamental
As análises comportamentais foram realizadas antes do início do
treinamento, na segunda semana e na última semana de treinamento nos 3
grupos estudados. Foi utilizado como instrumento de análise o “Rotarod”, que
permite avaliar alterações da coordenação motora e do equilíbrio89, 90. Este
aparelho foi projetado inicialmente para realizar medidas de déficits neurológicos
em roedores, e é o teste mais comumente utilizado para função motora dos
ratos89, 90. Este aparelho consiste em 4 cilindros de 7 cm de diâmetro, separados
por raias, que giram com uma velocidade que aumenta progressivamente a
cada 30 segundos. Após a queda dos ratos sobre a plataforma, o cronômetro
pára, gravando o tempo em que o animal permaneceu sobre o aparelho.
30
http://www.ugobasile.com/catalogue/product/47700_rat_rota_rod.html
Figura 3: Aparelho Rotarod utilizado para realização da análise comportamental
Os encéfalos de 35 dos 55 ratos foram processados pelo método de
“immunoblotting” e os dos outros 20 animais analisados pela técnica de imuno-
histoquímica.
4.4. Protocolo de Imuno-histoquímica
Os animais dos 3 grupos foram anestesiados com ketamina (100mg/Kg) e
xilazina (25mg/Kg) por via intraperitonial e submetidos à perfusão transcardíaca,
com solução salina 0,9%, seguida de solução fixadora constituída de
paraformaldeído 2% dissolvido em tampão fosfato 0,1 M (PB 0,1M, pH 7,4). Após a
perfusão, os encéfalos foram coletados e armazenados em paraformaldeído 2%,
durante 4 horas. Após este período, o material foi transferido para uma solução
crioprotetora de sacarose a 30% em PB 0,1M. Após 36 horas, os tecidos foram
cortados em uma espessura de 30µm em um micrótomo deslizante de
congelamento.
Os cortes histológicos foram colocados em placa de cultivo, em solução
crioprotetora, e mantidos em freezer a -20ºC até o momento do procedimento de
imuno-histoquímica. Cortes contendo o córtex motor, o estriado e o cerebelo foram
selecionados e submetidos à metodologia de imuno-histoquímica com anticorpos
31
primários específicos para detecção de sinapsina I (anticorpo policlonal de coelho
dirigido contra proteína SYS – Chemicon, Temecula, CA, EUA), na concentração
1:1000, sinaptofisina (anticorpo policlonal de coelho contra proteína SYP –
DakoCytomation, Glostrup, Dinamarca) na concentração 1:1000, MAP2 (anticorpo
monoclonal de camundongo dirigido contra a proteína MAP2 – Chemicon,
Temecula, CA, EUA), na concentração 1:1000 e neurofilamentos (anticorpo
monoclonal de camundongo dirigido contra NF’s – Zymed Laboratories, San
Francisco, CA, EUA) na concentração de 1:2000. Como o anticorpo dirigido contra
NF (PAN) reconhece região homóloga dos três neurofilamentos, NF68, NF160 e
NF200, não foi possível distinguí-los com a imuno-histoquímica, mas apenas
quando analisados pela técnica de “immunoblotting”.
A imuno-histoquímica foi processada da seguinte forma: os cortes selecionados
foram lavados em tampão fosfato (PB 0,1M) por três vezes de 10 minutos, depois
incubados com anticorpos primários específicos para os anticorpos citados acima
diluídos em PB com 0,3% de Triton X-100 e 5% de soro normal do animal em que
foi feito o anticorpo secundário e mantido por um período de 14 a 18 horas à
temperatura ambiente (24ºC).
Os cortes foram então novamente lavados em PB 0,1M à temperatura ambiente
e incubados por duas horas com anticorpo secundário biotinilado anti-coelho feito
em cabra para anti-SYS, anti-coelho feito em burro para o anti-SYP, anti-
camundongo feito em cabra para o anti-NF e anti-camundongo feito em burro para o
anti-MAP2, diluídos a 1:200 em PB contendo 0,3% de Triton-X-100. Após nova série
de lavagens à temperatura ambiente, os cortes foram colocados por duas horas em
uma solução contendo o complexo avidina-biotina-peroxidase (ABC ELITE kit,
Vector Labs.). Após nova série de lavagens, os cortes foram imersos num meio
contendo 3-3’diaminobenzidina (DAB- Sigma-Aldrich) 0,05% em tampão fosfato
0,1M por cerca de 5 minutos. A seguir foram acrescentados 3 ml de solução de
H2O2 a 0,3% em água destilada, mantendo-se os cortes neste banho sob agitação
constante até que a reação fosse evidenciada. Atingida a imunorreatividade
desejada com a coloração marrom clara, os cortes foram removidos da solução com
DAB e imersas em tampão PB 0,1M. Depois de nova série de lavagens em tampão
fosfato 0,1M com o objetivo de parar a revelação e remoção do excesso de
reagente, os cortes foram montados sobre lâminas de vidro gelatinizadas e
32
colocadas em placa quente. Após secarem, foram hidratadas em água destilada por
1 minuto, banhadas em solução de tetróxido de ósmio 0,1% por 15–30 segundos,
desidratadas por uma série de álcoois em concentrações crescentes, com Hemo-De
(Fisher) e cobertas com lamínulas, tendo como meio de montagem o Permount
(Sigma). A análise qualitativa do material e as quantificações por densitometria
foram realizadas com a utilização do microscópio óptico (E1000, Nikon) acoplado à
câmera digital e programa Nikon Imaging Software ACT-U.
A análise da densidade óptica relativa foi realizada em 4 animais de cada grupo.
Para cada animal analisamos 4 cortes dos quais foram capturados 8 campos do
córtex motor e do cerebelo, e 12 campos do estriado. As regiões do córtex foram as
M1 e M2, sendo analisada a camada V e suas imediações. No estriado foram
analisados campos das regiões dorsomedial e dorsolateral. E por fim, foi
selecionada a região paramediana do cerebelo, onde foi analisado as camadas
molecular e granular do córtex cerebelar.
As imagens foram analisadas utilizando o programa Image J (NIH).
4.5. Protocolo de “Immunoblotting”
Os animais dos 3 grupos foram decapitados e as áreas do encéfalo a serem
avaliadas foram rapidamente coletadas, congeladas em nitrogênio líquido e
armazenadas a -80ºC até o uso. As amostras foram homogeneizadas a 4ºC em
tampão de extração (Tris pH 7,4 100mM, EDTA 10mM, PMSF 2nM e aprotinina
0,01mg/ml). Os homogenatos foram centrifugados por 20 minutos a 12.000 rpm em
uma centrífuga refrigerada a 4ºC. O sobrenadante foi separado do “pellet”, uma
pequena amostra deste foi utilizada para determinação do conteúdo proteico, e o
restante tratado com tampão Laemmli contendo DTT 100mM91, fervido em banho-
maria por 5 minutos e armazenado. O conteúdo proteico do material isolado dos
diferentes grupos de animais foi dosado pelo método de Bradford (Amresco, U.S.A.) 92. Quantidades equivalentes a 100 microgramas de proteínas das amostras
armazenadas em Laemmli foram submetidas a separação por eletroforese com
corrente constante de 25mA em géis de acrilamida de 6,5% e 8% contendo dodecil
sulfato de sódio SDS (Bio-Rad, EUA). Após a separação eletroforética, as proteínas
foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose (Millipore, 0,2um de
33
diâmetro) de acordo com a técnica descrita por Towbin et al. 93. Após bloqueio com
leite desnatado (Molico, Nestlé) 5% em tampão Tris-Salina (Tris 10mM e NaCl
0,15M, pH 7,5) por 2 horas, as membranas foram incubadas com os mesmos
anticorpos utilizados na imuno-histoquímica, além do anticorpo contra β-actina
(1:10.000). Em seguida, as membranas foram lavadas com Tris-Salina e incubadas
por 2 horas com um anticorpo secundário marcado com peroxidase (Amersham
Biosciences) ou biotinilados (Vector Laboratories, Burlingame), diluído a 1:10000 ou
1:1000 em solução bloqueadora, respectivamente. O excesso de conjugado foi
removido com mais um ciclo de lavagens e os antígenos foram revelados com
solução de avidina-biotina-peroxidase, para os anticorpos biotinilados (ABC, Vector
Laboratories, Burlingame) por 1 hora. Para os anticorpos secundários marcados
com peroxidase, as membranas foram reveladas utilizando o Kit ECL (Amersham
Biosciences) de quimioluminescência. As membranas foram então incubadas com
solução “stripping” por 20 minutos à temperatura ambiente e um anticorpo contra β-
actina (Sigma, St.Louis, MO, EUA) foi utilizado como controle para quantificar a
concentração da proteína total aplicada nos géis. As bandas foram escaneadas e
analisadas quanto à densidade óptica da imunorreatividade utilizando o programa
Image J (National Institutes of Health/USA). Dos dados obtidos realizou-se uma
razão entre a densidade óptica de cada uma das proteínas estruturais (MAP2 e
NF68) e sinápticas (sinapsina I e sinaptofisina) com a β-actina, e estes dados foram
então submetidos às análises estatísticas. Os dados representados nos gráficos
foram normalizados pelo grupo controle/sedentário que assumimos ser 1, ou seja,
100%.
4.6. Análise Estatística
Os dados de densidade óptica relativa e níveis relativos de proteína obtidos
foram submetidos à análise estatística com o uso do software GraphPad Prism 5. As
comparações entre os grupos foram conduzidas a partir do teste ANOVA para
medidas repetidas, seguida do pós-teste de Tukey quando a análise de variância
apresentou diferença estatisticamente significante. Os dados estão apresentados
em termos de média e erro padrão. Para todos os testes, o nível de significância
assumido foi de p≤0,05.
34
5. RESULTADOS
5.1. Análise Comportamental
5.1.1. Performance Motora
Após 4 semanas de treinamento de exercício acrobático, os animais registraram
uma redução significativa do tempo necessário para executar todo o circuito
(p<0,001) (Figura 4). A redução significativa foi registrada a partir da segunda
semana de treinamento e persistiu até o final das 4 semanas.
Figura 4. Desempenho dos ratos no treinamento de exercícios acrobáticos avaliado
pela média do tempo gasto para realização das seis tarefas presentes no circuito
por semana. ***p<0,001.
5.1.2. Desempenho Comportamental no Rotarod
De acordo com a avaliação feita pelo Rotarod (Figura 5) os ratos pertencentes
aos grupos de exercício na esteira, exercício acrobático e sedentários mostraram
padrões semelhantes de coordenação motora no início do estudo. Pode-se observar
ainda que após 2 semanas de treinamento os grupos EE e AC obtiveram um
35
aumento significativo (p<0,05 e p<0,03, respectivamente) no tempo de permanência
no aparelho quando comparado aos seus valores iniciais, e este aumento persistiu
até o final da quarta semana (p<0,01). Já o grupo controle não apresentou diferença
no tempo de permanência no Rotarod nos três momentos de análise. Ao final do
período de treinamento os grupos AC e EE permaneceram por um tempo
significativamente maior no aparelho que os ratos sedentários (p<0,05), revelando
uma melhora no desempenho quanto ao equilíbrio e coordenação motora. Não foi
observada diferença estatisticamente significante entre os grupos treinados.
Figura 5. Tempo de permanência no aparelho Rotarod avaliado no início do
treinamento (I), 2 semanas após (M) e ao final do treinamento (F). *p<0,05, **p<0,03
e ***p<0,001.
5.2. Expressão de Proteínas
Alguns dados de “immunoblotting” corroboram com os da imuno-histoquímica e
outros não (tabela 1). Deve-se ressaltar que a técnica de imuno-histoquímica
permite uma análise dos tipos e localização das estruturas imunorreativas,
selecionando camadas específicas do córtex e subdivisões medial e lateral do
estriado, enquanto a de “immunoblotting” analisa o conteúdo proteico de toda a
estrutura removida do encéfalo, podendo assim diluir as mudanças obtidas numa
região específica de uma determinada estrutura.
36
32
35
37
5.2.1. Córtex Motor
Quanto às proteínas estruturais, a imunorreatividade produzida pelo anticorpo
MAP2 se apresentou ao longo das neurópilas, em forma difusa por toda a camada V
do córtex motor primário e secundário dos animais estudados (Figura 6). Análise da
densidade óptica relativa nessa região cortical revelou um aumento estatisticamente
significante de imunorreatividade no grupo AC em relação aos outros dois grupos
(Figura 6).
Os dados de “immunoblotting” corroboram com esses resultados, mostrando um
aumento dos níveis proteicos no grupo AC. Nesta região, os NFs foram expressos
em processos e corpos celulares, sendo identificado também um decréscimo
estatisticamente significativo da densidade óptica relativa no grupo treinado em
esteira em relação ao grupo AC (Figura 7). Os dados de “immunoblotting” revelaram
uma diminuição estatisticamente significante nos níveis proteicos dos NFs 160 e 200
no grupo EE em relação aos outros dois grupos. Já o nível de expressão de NF68
no córtex não mostrou alteração significativa entre os grupos (Figura 7).
A SYS e SYP são expressas de forma difusa, revelando uma marcação
citoplasmática, além dos corpos celulares (Figuras 8 e 9). No grupo EE, observamos
um aumento estatisticamente significante da densidade óptica relativa de SYS em
relação ao outros dois grupos (Figura 8).
Já a densidade óptica relativa de SYP mostrou-se significativamente aumentada
tanto no grupo AC quanto no grupo EE comparada ao grupo controle (Figura 9).
Entretanto, os dados de “immunoblotting” não revelaram alteração significativa
dessas duas proteínas sinápticas entre os grupos estudados (Figuras 8 e 9).
38
39
40
41
42
5.2.2. Estriado
No estriado dos três grupos estudados, a proteína MAP2 foi expressa ao longo
da neurópila de forma difusa por toda extensão rostro-caudal e médio-lateral (Figura
10). A imunorreatividade para MAP2 no estriado apresentou um aumento
estatisticamente significativo na região dorsomedial do grupo AC em relação ao
outros grupos, e na região dorsolateral em relação ao EE (Figura 10). Estes dados
corroboram com os dados de “immunoblotting”, onde houve um aumento
estatisticamente significante da expressão de MAP2 no grupo AC em relação ao
grupo EE e ao grupo controle (Figura 10).
Já a proteína NF apresentou uma marcação de forma puntiforme e agrupada em
regiões onde possivelmente há a passagem de feixes nervosos (Figura 11). A
densidade óptica relativa de NF mostrou-se similar nos três grupos do estudo. Os
dados do “immunoblotting” demonstraram que o nível proteico de NF68 aumentou
significativamente nos grupos AC e EE comparado aos animais sedentários (Figura
11). NF’s com pesos moleculares de 160 e 200 KDa não foram detectadas nesta
estrutura.
As proteínas sinápticas SYS e SYP nesta região mostraram um padrão de
marcação puntiforme e difusa por todo o estriado (Figuras 12 e 13). A densidade
óptica relativa de SYS mostrou-se significativamente aumentada na região
dorsomedial dos grupos AC e EE comparados com o grupo controle. Enquanto, na
região dorsolateral os três grupos apresentaram níveis semelhantes de SYS (Figura
12). Já os dados de “immunoblotting” não revelaram alterações estatisticamente
significantes entre os grupos treinados e controle (Figura 12).
Quanto à SYP, os dados de imuno-histoquímica revelaram um aumento
estatisticamente significante na região dorsomedial no grupo AC em relação ao
grupo controle e na região dorsolateral esse aumento foi observado no grupo EE em
relação aos outros dois grupos (Figura 13). Dados de “immunoblotting” revelaram um
aumento significativo do nível de SYP no grupo AC em relação ao controle (Figura
13).
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47
5.2.3. Cerebelo
No cerebelo dos três grupos de animais estudados foi observado que ambas as
proteínas estruturais apresentaram um padrão citoplasmático de marcação nas
células de Purkinje (Figura 14 e 15). Processos axonais e dendríticos ao longo das
camadas granular e molecular revelaram-se imunorreativos para MAP2 e NF. A
camada molecular do grupo EE mostrou um aumento significativo da densidade
óptica relativa de MAP2 quando comparada com os outros dois grupos (Figura 14).
Já a expressão de MAP2 na camada granular foi semelhante nos três grupos
estudados. Os dados de “immunoblotting” também demonstraram um aumento
estatisticamente significativo da expressão de MAP2 no grupo EE comparado aos
grupos controle e AC (Figura 14).
A análise da expressão de NF no grupo EE mostrou um aumento significativo da
densidade óptica relativa na camada granular e uma diminuição estatisticamente
significante na camada molecular em relação ao grupo controle (Figura 15). Dados
de “immunoblotting” não mostraram alterações de NF68 e NF160 entre os grupos do
estudo (Figura 15). NF200 não foi detectado nesta região.
As proteínas sinápticas no cerebelo dos grupos estudados mostraram um padrão
puntiforme de imunorreatividade entre as células de Purkinje, em aglomerados
difusos na camada molecular e esparsos na camada granular (Figura 16 e 17). Na
camada granular o grupo EE mostrou um aumento estatisticamente significante da
intensidade de marcação de SYS em relação ao grupo controle. Já na camada
molecular este aumento aconteceu nos grupos EE e AC quando comparados ao
grupo controle (Figura 16). Dados de “immunoblotting” não revelaram alterações
significativas de SYS entre os três grupos estudados (Figura 16).
A expressão de SYP nas camadas granular e molecular não apresentou
alterações estatisticamente significantes entre os grupos. O mesmo aconteceu com
os níveis relativos desta proteína demonstrados pelo “immunoblotting”, não havendo
alterações entre os grupos do estudo (Figura 17).
48
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52
6. DISCUSSÃO
6.1. Comportamento
Uma característica que define a aprendizagem de uma habilidade motora é a
melhora do desempenho do comportamento aprendido38. Isto pode ser observado
nos ratos pertencentes ao grupo acrobático, que após o final da segunda semana de
treinamento já mostraram um decréscimo significativo no tempo necessário para
passar por todo o circuito e que permaneceu até o final do treinamento. Esta
redução do tempo de passagem pelo circuito também foi observada em outros
estudos com diferentes protocolos de treinamento. Kleim e colaboradores24
treinaram ratos adultos jovens por 30 dias consecutivos, 5 repetições pelo circuito
por dia e ao décimo dia observaram redução significativa do tempo gasto para a
realização dessa tarefa. Já no estudo realizado por Klintsova e colaboradores21, os
ratos treinaram por 1, 3, 5 ou 7 dias consecutivos com 3 repetições pelo circuito e
mostraram decréscimo progressivo e significativo após o quinto dia de treinamento.
Os estudos anteriores21, 24 mostraram que esta redução do tempo foi reflexo de uma
diminuição progressiva do número de erros (falha na colocação das patas, perda
aparente do controle motor) durante a passagem no circuito. A diminuição do tempo
gasto para percorrer o circuito observado no nosso estudo e nos citados acima pode
ser atribuída às mudanças comportamentais, tais como diminuição de hesitações e
dos estímulos manuais, sugerindo que os animais passaram pela fase de adaptação
a uma nova tarefa e estão caminhando para a etapa seguinte de consolidação e
aprendizado motor.
Além da performance motora avaliada neste estudo também foram avaliadas as
alterações de coordenação motora e equilíbrio nos ratos após os diferentes tipos de
treinamento utilizando o Rotarod. Os nossos dados revelaram que antes do início do
treinamento os ratos dos 3 grupos mostraram um padrão semelhante de
coordenação motora avaliado pelo Rotarod, e somente os ratos pertencentes ao
grupo de exercício na esteira de intensidade moderada e acrobático mostraram, a
partir da segunda semana, um aumento do tempo de permanência no aparelho. Os
ratos treinados tanto na esteira como em acrobacias mostraram que, após a
segunda semana de treinamento, obtiveram uma melhora de sua coordenação
53
motora e equilíbrio observado pelo aumento no tempo de permanência no Rotarod e
este aumento persistiu até o final das 4 semanas de treinamento. Estes dados
sugerem que as realizações de exercícios físicos sejam de caráter rítmico ou
complexo mostrou-se suficiente para desencadear uma melhora da coordenação
motora e equilíbrio. Entretanto, era de se esperar que os ratos submetidos a
exercícios acrobáticos permanecessem por mais tempo sobre o Rotarod, visto que
esses exercícios demandam maior coordenação motora e equilíbrio para serem
executados. Porém, observamos que não houve diferença entre os grupos treinados
neste quesito. Uma possível explicação para isto seria que o treinamento em esteira
privilegie uma atividade motora rítmica favorecendo a permanência desses animais
sobre o aparelho e, além disso, o Rotarod incrementa sua velocidade somente a
cada trinta segundos, não promovendo grandes instabilidades para os animais.
Assim, uma das limitações na avaliação comportamental foi o uso do aparelho
Rotarod que não se mostrou sensível o suficiente para avaliar possíveis diferenças
significativas entre os grupos treinados.
6.2. Mudanças nas proteínas estruturais e sinápticas
Exercício físico, independente da modalidade, foi capaz de promover mudanças
na expressão de proteínas sinápticas e estruturais nas áreas encefálicas estudadas
aqui. Diferentes tipos de exercícios (esteira e acrobático) promoveram mudanças
distintas tanto em relação às proteínas quanto às estruturas estudadas. Esses dados
reforçam a idéia de que o sistema nervoso é um órgão dinâmico com capacidade de
adaptar-se estruturalmente e funcionalmente frente a diferentes demandas motoras.
A análise dos resultados mostrou que animais treinados por 4 semanas,
independente do tipo de exercício, apresentaram maior aumento na expressão de
proteínas estruturais em relação a proteínas sinápticas.
6.2.1. Córtex Motor
No córtex motor, as proteínas estruturais apresentaram respostas distintas frente
aos diferentes tipos de treinamento. O exercício acrobático promoveu um aumento
54
da proteína MAP2 em relação aos outros dois grupos, enquanto o EE alterou a
expressão de NFs, reduzindo o seu nível, quando comparado ao grupo controle e ao
grupo AC. A expressão destas proteínas não foi diferente diante das duas técnicas
de análise, “immunoblotting” e imuno-histoquímica. Considerando que a proteína
estrutural MAP2 participa do crescimento da arborização dendrítica, estabelecimento
e manutenção da sinaptogênese, o aumento dessa proteína no córtex motor
primário e secundário no grupo AC sugere um remodelamento estrutural,
evidenciando um aumento na arborização dendrítica e um aumento da área de
contato sináptico numa região envolvida com o planejamento de movimentos mais
complexos. Derksen e colaboradores38 também demonstraram um aumento de
MAP2 nos animais treinados por 1, 3, 5 e 7 dias em quatro diferentes circuitos
acrobáticos progressivamente mais difíceis, mas esse aumento não estava
relacionado ao aumento da complexidade da tarefa. Estudos com mapeamento
cortical demonstraram que após treinamentos de novas habilidades motoras em
ratos e primatas ocorreu uma expansão da área cortical envolvida com os
movimentos utilizados para a realização dessas tarefas71, 72. O aumento da
expressão de MAP2 no córtex motor frente ao treinamento acrobático pode estar
envolvido no crescimento da árvore dendrítica e estabelecimento de novas sinapses,
resultando num aumento da área cortical envolvida no controle dessa atividade
motora.
Os animais do grupo EE apresentaram uma redução de NFs no córtex motor
quando comparado aos outros dois grupos estudados, com ambas técnicas
empregadas. Se considerarmos que esse tipo de exercício é facilmente aprendido e
automatizado, não havendo a necessidade de grande recrutamento desta região e
sim de outras áreas encefálicas12, 94, torna-se compreensível que a diminuição da
expressão de NFs no córtex motor faz parte do remodelamento axonal dos
neurônios dessa área. Além disso, de acordo com Holschneider e Maarek95, uma
possível atenuação da ativação do córtex motor em períodos mais tardios pode
ocorrer devido a habituação ao exercício. Ferreira e colaboradores12 já haviam
demonstrado uma redução do nível da expressão de NFs em animais que realizaram
exercício em esteira, porém após um curto prazo de treinamento (3 dias).
55
A expressão das proteínas sinápticas SYS e SYP no córtex motor dos animais
AC e EE não apresentou mudanças em relação aos animais sedentários quando
analisados pela técnica de “immunoblotting”; entretanto, quando analisadas pelo
método de imuno-histoquímica, observamos aumento significativo de SYS e SYP no
grupo EE e de SYP no grupo AC. Discrepâncias como essas são encontradas na
literatura, e a explicação mais plausível estão nas diferentes características das
metodologias empregadas. A ausência de mudanças nas expressões das proteínas
sinápticas corrobora com alguns estudos prévios12, 13 e são diferentes de outros que
mostraram um aumento da densidade sináptica no córtex motor de ratos treinados39,
40, 72, 96. O treinamento acrobático diário por 6 semanas não afetou a expressão dos
níveis de SYP no córtex motor de ratos adultos analisado pelo método de ELISA13;
da mesma forma, no estudo de Ferreira e colaboradores12, dados de
“immunoblotting” não mostraram alteração na expressão de proteínas sinápticas no
córtex motor de ratos treinados em esteira por um curto prazo de tempo (3, 7 e 15
dias). O fato de não encontrarmos mudanças dessas proteínas sinápticas frente a
esses dois tipos de treinamento pode ser devido ao método de análise empregado,
que quantifica estas proteínas por toda a estrutura, não sendo capaz de detectar
mudanças pré-sinápticas como as mostradas pelos outros estudos que utilizaram
análises morfológicas. Os nossos dados de imuno-histoquímica, revelando aumento
da expressão de SYS e SYP no córtex motor dos animais treinados, foram obtidos
com análises de densidade óptica relativa na camada V. Esses dados corroboram
com vários estudos que mostraram um aumento de sinapses por neurônio na
camada V em ratos que realizavam exercício acrobático comparados aos animais
controle39, 40, 72, 96, sugerindo que o treinamento acrobático foi capaz de induzir
sinaptogênese e potenciação sináptica em áreas corticais envolvidas com o
planejamento dessa atividade motora. Além disso, os nossos dados mostram que o
EE também induziu um possível aumento na eficiência sináptica na camada V do
córtex motor, decorrente do aumento da expressão das proteínas SYS e SYP nessa
região.
As respostas plásticas distintas desencadeadas pelos dois tipos de exercício
físico no córtex motor (M1 e M2), caracterizada por aumento da arborização
dendrítica e sinaptogênese na camada V no grupo AC e remodelamento axonal
56
gerado pela diminuição de NF com possível melhora simultânea da eficiência
sináptica na camada V no grupo EE sugere que o exercício acrobático necessitou de
um maior envolvimento do córtex motor tanto no planejamento dessas habilidades
complexas (ativação da área motora suplementar, M2) quanto na execução
(ativação da área motora primária, M1), enquanto o EE, de característica rítmica e
automática, necessitou somente da ativação da área motora primária (M1) para a
execução motora.
6.2.2. Estriado
Os exercícios físicos do tipo AC e EE promoveram alterações na expressão das
proteínas estruturais e sinápticas do estriado. Em relação às proteínas estruturais, o
treinamento AC induziu um aumento da expressão de MAP2 e NF68, enquanto o EE
aumentou somente NF68 no estriado, revelando um remodelamento dendrítico e
axonal, além do possível estabelecimento da sinaptogênese. O estriado é uma
estrutura encefálica envolvida tanto com a fase inicial do aprendizado de novas
habilidades e sequências motoras, como com a automatização dessas habilidades
motoras numa fase mais tardia77, 97. Sendo assim, esse padrão distinto de aumento
das proteínas estruturais entre o grupo AC e EE parece dar suporte aos diferentes
papéis exercidos pelo estriado na aquisição de uma habilidade motora complexa
exigida no treinamento acrobático e de consolidação ou automatização de uma
atividade motora rítmica presente na corrida em esteira78.
Nossos dados das proteínas sinápticas dos grupos AC e EE, obtidos pelo
método de “immunoblotting”, não demonstraram mudanças na expressão da SYS no
estriado dos animais treinados. Entretanto, o exercício acrobático foi capaz de
aumentar significativamente a expressão de SYP após 4 semanas treinamento. O
aumento de SYP no estriado pode ser decorrente do aumento de liberação de
glutamato que está diretamente relacionado à fosforilação da SYP, sugerindo uma
possível potenciação de longo prazo (LTP)98. A ausência de mudanças na
expressão de SYS no estriado do grupo EE é discordante do obtido por Ferreira e
colaboradores12 que demonstraram um aumento de SYS após 3 e 7 dias de
treinamento e retornando a níveis basais no décimo quinto dia de treinamento.
57
Esses dados parecem sugerir um maior envolvimento da SYS nos momentos inicias
de treinamento.
A imuno-histoquímica revelou um aumento da SYS e SYP nas regiões
dorsomedial e dorsolateral dos animais treinados, diferentemente dos dados de
“immunoblotting”. Esta discordância parece ser devida às diferentes formas de
reconhecimento e ligação dos anticorpos aos seus epítopos. Entretanto, esse
possível aumento da eficiência sináptica nessas regiões do estriado induzida pelo
treinamento de habilidades motoras estão de acordo com o incremento do potencial
excitatório pós-sináptico observados nos registros eletrofisiológicos do estriado de
camundongos submetidos a realização de habilidades motoras78.
Os dados de imuno-histoquímica apresentados aqui sugerem uma reorganização
estrutural e funcional do estriado dorsal dependente do tipo de atividades motoras
treinadas. Estudos realizados em primatas e roedores demonstraram envolvimento
de diferentes circuitos do estriado durante a fase inicial e a tardia do aprendizado de
uma habilidade motora78, 99. No nosso estudo observamos que o treinamento de
atividades motoras complexas no circuito acrobático induziu aumento de MAP2, SYS
e SYP na região dorsomedial do estriado; já o EE, que requer um padrão motor
rítmico e automático, promoveu aumento de SYS na região dorsomedial e de SYP
na região dorsolateral do estriado. O padrão de reorganização estrutural e funcional
do estriado demonstrado neste trabalho corrobora com estudos anteriores que
sugerem um papel funcional distinto para essas regiões dorsomedial e dorsolateral
com base na origem das suas aferências corticais, córtex de associação e sensório-
motor, respectivamente78, 99. Portanto, o estriado dorsomedial (homólogo ao
caudado em primatas) parece estar preferencialmente envolvido nos estágios iniciais
do aprendizado de habilidades motoras, enquanto o dorsolateral (homólogo ao
putâmen em primatas) parece estar envolvido com a consolidação e automatização
motora78, 99.
Desta forma, os nossos achados com o treinamento acrobático sugerem que a
região dorsomedial do estriado está envolvida com o controle de ações motoras
complexas e dirigida a um alvo, e a dorsolateral do estriado, modificada pelo EE,
envolvida com respostas motoras habituais e automáticas.
58
Ao notarmos que também há uma alteração de menor proporção, mas
mostrando um aumento de MAP2 na região dorsolateral também no grupo AC,
sugerimos que, por se tratar de um treinamento realizado a longo prazo, a região
relacionada a automatização motora, também já comece a sofrer alterações,
tornando-os automáticos. Apesar de somente os dados de “immunoblotting”
evidenciaram alterações de NF68 no estriado, podemos concluir que ambos os tipos
de treinamento conseguiram promover um remodelamento, causando um possível
aumento do diâmetro axonal. Vários estudos também mostraram outras alterações
plásticas nesta região provocadas pela realização de EE e AC a curto e/ou a longo
prazo, como aumento de astrócitos, angiogênese36, da neurotransmissão
dopaminérgica89, e de receptores de glutamato do tipo AMPA (subunidade GluR1)22.
6.2.3. Cerebelo
As maiores alterações encontradas nessa estrutura foram provocadas pela
realização de exercícios em esteira de intensidade moderada, quando comparada
ao exercício acrobático. Os dados de “immunoblotting” mostraram um aumento na
expressão de MAP2 no grupo EE e, quando analisadas separadamente as camadas
molecular e granular pela técnica de imuno-histoquímica, observamos que o
acréscimo no nível de expressão de MAP2 ocorreu na camada molecular. Esse
aumento de MAP2 na camada molecular, local onde são encontrados os dendritos
das células de Purkinje, das células de Golgi e das células em cestos e estreladas,
mostra que este tipo de exercício é capaz de gerar um aumento da arborização
dendrítica, aumentando a área de contato sináptico destas células com as fibras
trepadeiras e musgosas. Black e colaboradores88 observaram que ratos submetidos
a exercício em esteira por 30 dias consecutivos promoveram um aumento do fluxo
sanguíneo no córtex cerebelar do lóbulo paramediano. Este aumento da área de
ativação do córtex cerebelar pode ser devido a um aumento de sinapses que estão
ocorrendo nesse local. Nossos dados mostram que o aumento de MAP2 provocado
pelo EE pode ser um dos substratos estruturais responsáveis por essa maior
ativação.
59
A outra proteína estrutural, NF, mostrou alterações induzidas pelo EE apenas
quando analisamos sua expressão nas camadas específicas (CM e CG), e não na
estrutura como um todo (“immunoblotting”). Mudança na expressão de NF no
cerebelo observada por “immunoblotting” foi observada após curto período de
treinamento em esteira retornando aos níveis controle após 15 dias12. Já dados de
imuno-histoquímica revelaram aumento de NF na camada granular do lóbulo
paramediano do cerebelo do grupo EE, demonstrando uma restruturação axonal
com um possível aumento no calibre e/ou extensão dos axônios nessa região.
Portanto, o emprego de diferentes técnicas pôde demonstrar que o EE foi capaz de
promover alterações desta proteína, quando realizado tanto a curto como a longo
prazo.
A alteração da proteína sináptica sinapsina I também só foi evidenciada com a
técnica de imuno-histoquímica. Um aumento da expressão dessa proteína foi
observado nos grupos AC e EE, sendo essas alterações vistas na camada molecular
no grupo AC e nas camadas granular e molecular no grupo EE. Um aumento desta
proteína também foi observado com outro protocolo de EE, quando ratos foram
submetidos a EE por 7 e 15 dias consecutivos12. Como a SYS está envolvida na
liberação de neurotransmissores no terminal nervoso, esta alteração pode então
sugerir uma maior eficiência sináptica nesta região. Estudos mostraram que o
exercício acrobático é capaz de promover sinaptogênese24, 42, 88, como observado
por Kleim e colaboradores, onde animais submetidos a 30 dias consecutivos de
acrobacias apresentaram um aumento do número de sinapses por célula de
Purkinje24. Nossos dados mostraram um aumento da densidade óptica relativa
apenas de SYS na camada molecular no grupo AC, não sendo suficiente para apoiar
os achados obtidos por Kleim e colaboradores24. Uma possível explicação para isto
é que as metodologias de análise empregadas foram distintas e, além disso, a
frequência de treinamento utilizada por Kleim e colaboradores24 foi de 30 dias
consecutivos, quando o nosso foi 3 vezes por semana durante um mês. Entretanto,
esse possível aumento da eficiência sináptica na camada molecular cerebelar do
grupo acrobático pode ser decorrente da intensa coordenação motora necessária
para realização destas tarefas acrobáticas.
60
Nossos dados mostram então que o exercício realizado em esteira, que é um
exercício rítmico, automatizado, conseguiu provocar uma grande ativação no
cerebelo, seja através de sinaptogênese, observada pelo aumento de proteínas
estruturais, como também pelo aumento da eficiência sináptica sugerida pelo
aumento de SYS.
6.2.4. Circuitos núcleos da base-tálamo-cortical X cerebelo-tálamo-
cortical
Nossos dados demonstram que modalidades diferentes de exercícios físicos
promovem mudanças distintas em regiões que estão presentes nos circuitos
motores. O exercício acrobático, que requer maior atenção, planejamento e
orientação, necessitando de um início voluntário para realização do movimento
(tarefa internamente guiada - IG) produziu mudanças plásticas estruturais e
funcionais no circuito núcleos da base-tálamo-cortical como um substrato para a
aquisição de uma nova e complexa habilidade motora. Por outro lado, o exercício
realizado em esteira, que é composto por movimentos rítmicos já aprendidos e
automatizados, guiados externamente, produziu mudanças no circuito cerebelo-
tálamo-cortical.
Holschneider e colaboradores77 mostraram que a realização de exercício em
esteira por 6 semanas promove aumento do fluxo sanguíneo em áreas
correspondente ao circuito cerebelo-tálamo-cortical. Lewis e colaboradores33
propuseram que os circuitos núcleos da base-tálamo-cortical e cerebelo-tálamo-
cortical trabalham em equilíbrio, e durante a realização de tarefas IG há uma
dominância na ativação do circuito núcleos da base-tálamo-cortical e um pequeno
recrutamento do circuito cerebelo-tálamo-cortical. Quando a tarefa é externamente
guiada ou automática, por outro lado, ocorre a predominância do circuito cerebelo-
tálamo-cortical com recrutamento do circuito núcleos da base-tálamo-cortical33.
Podemos observar nos nossos dados que as alterações sofridas pelas proteínas
estruturais e sinápticas no cerebelo, estriado e córtex motor mostraram-se de acordo
com essa organização neural proposta por Lewis33, onde as maiores alterações
ocorridas no grupo AC foram vistas nas áreas presentes do circuito núcleos da base-
61
tálamo-cortical, enquanto que no grupo EE foram vistas nas regiões presentes do
circuito cerebelo-tálamo-cortical. Porém, os nossos dados parecem sugerir o início
de uma maior ativação do circuito cerebelo-tálamo-cortical no grupo AC após longo
período de treinamento revelado pelo aumento do MAP2 no estriado dorsolateral e
SYS na camada molecular do cerebelo. A somatória dessas informações podem
indicar a passagem da fase de adaptação de uma nova habilidade motora para a
consolidação desta aprendizagem.
7. CONCLUSÃO
Nossos dados mostram que as diferentes modalidades de exercícios
empregadas neste estudo foram capazes de gerar respostas comportamentais e
neurais. O exercício acrobático promoveu aumento das proteínas estruturais e
sinápticas no córtex motor e estriado, suportando o envolvimento dessas regiões no
processo de aprendizagem de novas habilidades motoras. O exercício em esteira,
por outro lado, promoveu alterações mais difusas, aumentando a expressão de
proteínas sinápticas e estruturais no córtex motor, estriado e cerebelo. Esses
resultados confirmam que o tipo de exercício é um fator determinante de quais
regiões encefálicas são mais afetadas e sugerem que as diferentes proteínas estão
relacionadas com esta plasticidade. O entendimento da relação entre os diferentes
tipos de exercícios, mecanismos neurais da plasticidade e mudanças no
comportamento motor podem facilitar na determinação de possíveis intervenções
terapêuticas.
62
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73
ANEXO I
74
ANEXO II
Artigo submetido
75
Different protocols of physical exercise produce
different effects on synaptic and structural proteins in
motor areas of the rat brain
Priscila C. Garcia1, Caroline C. Real2, Ana F. B. Ferreira2, Sandra R. Alouche1, Luiz R.
G. Britto2, Raquel S. Pires1
Physical Therapy Graduate Program, City University of São Paulo, São Paulo, SP,
Brazil; 2Department of Physiology and Biophysics, Institute of Biomedical Sciences,
University of São Paulo, São Paulo, SP, Brazil.
Corresponding author:
Raquel S. Pires Laboratory of Neuroscience and Motor Activity Physical Therapy Graduate Program City University of São Paulo R. Cesário Galeno, 448/475 São Paulo, SP 03071-000, Brazil Phone: 55-11-2178-1479 E-mail address: [email protected]
76
ABSTRACT
The plastic brain responses generated by the training with acrobatic exercise (AE) and
with treadmill exercise (TE) may be different. We evaluated the protein expression of
synapsin I (SYS), synaptophysin (SYP), microtubule-associated protein 2 (MAP2) and
neurofilaments (NF) by immunohistochemistry and Western blotting in the motor cortex,
striatum and cerebellum of rats subjected to TE and AE. Adult male Wistar rats were divided
into 3 groups: sedentary (Sed) (n=15), TE (n=20) and AE (n=20). The rats were trained 3
days/week for 4 weeks on a treadmill at 0.6 Km/h, 40 min/day (TE), or moving through a
circuit of obstacles 5 times/day (AE). The rats from the TE group exhibited a significant
increase of SYS and SYP in the motor cortex, of NF68, SYS and SYP in the striatum, and of
MAP2, NF and SYS in the cerebellum, whereas NF was decreased in the motor cortex and
molecular layer of the cerebellar cortex. On the other hand, the rats from the AE group
showed a significant increase of MAP2 and SYP in the motor cortex, of all four proteins in the
striatum, and of SYS in the cerebellum. In conclusion, AE induced changes in the expression
of synaptic and structural proteins mainly in the motor cortex and striatum, which may
underlie part of the learning of complex motor tasks. TE, on the other hand, promoted more
robust changes of structural proteins in all three regions, especially in the cerebellum, which
is involved in learned and automatic tasks.
Keywords: treadmill exercise; acrobatic exercise; synaptic plasticity; structural plasticity;
striatum; cerebellum; motor cortex.
77
1. INTRODUCTION
Exercise induces several positive effects in the central nervous system of humans
(Dustman et al., 1990; Lupinacci et al., 1993) and animals (Ferreira et al., 2010; Ferreira et
al., 2011; Kleim et al., 1996; Kleim et al., 1997; Real et al., 2010), such as improvement of
learning, memory and plasticity (Lambert et al., 2005; van Praag et al., 1999a; Vaynman et
al., 2006), increased neuronal activation (Holschneider et al., 2007; Lewis et al., 2007) and
neurogenesis (Ferreira et al., 2011; van Praag et al., 1999a; van Praag et al., 1999b).
Changes of neurotransmitters and their receptors (Del Arco et al., 2007b; Real et al., 2010)
and of the expression of genes related to synaptic plasticity (Ferreira et al., 2010; Molteni et
al., 2002), which are responsible for changing the number, structure and function of neurons
(Ang et al., 2006; van Praag et al., 1999a), have also been observed.
Voluntary, treadmill and acrobatic exercise (VE, TE and AE, respectively) induce distinct
plastic responses in different brain regions (Kleim et al., 2002; Klintsova et al., 2004;
Vaynman et al., 2006). Studies using electron microscopy have shown that animals
submitted to all three of these modalities presented plastic changes in the cerebellum and
motor cortex. In the cerebellum, for example, there was an increase of the number of
synapses of parallel fibers and Purkinje cells and an increased number of synapses per
Purkinje cell, higher in the AE than the VE. This increase persisted with time (Black et al.,
1990; Kleim et al., 1997; Kleim et al., 1998b). Furthermore, it was observed that the AE
group completed the designated tasks in less time, indicating a substantial gain of motor
abilities (Kleim et al., 1996; Kleim et al., 2002).
A series of studies have focused on the participation of synaptic (Ferreira et al., 2010;
Lambert et al., 2005; Vaynman et al., 2004) and structural proteins (Derksen et al., 2007;
Ferreira et al., 2010; Ferreira et al., 2011) in exercise-induced plastic changes. Microtubule-
associated protein 2 (MAP2) and synaptophysin (SYP) have been studied after short-term
AE and increases of SYP have been observed in the motor cortex, possibly related to the
first 5 days of learning a motor skill. MAP2 changes, on the other hand, did not seem to
increase according to the duration or difficulty of the acrobatic training (Derksen et al., 2007).
Other authors have also reported increases of NF68, SYS and SYP in the striatum after
short-term TE, which was accompanied by increases of SYS and NF68 in the cerebellum
and a decrease followed by increase of NFs in the motor cortex (Ferreira et al., 2010).
Learning a new motor skill can induce dendritic reorganization, synaptogenesis and
changes of synaptic morphology, which requires protein synthesis (Derksen et al., 2007).
Training rats on a novel motor task can be an effective option to study the brain motor
78
circuits in response to learning. A distinction has been made between tasks that require a
high amount of attentional guidance (skilled training, internally guided) and those that do not
(overlearned, automatic, and externally guided), and each has been linked with different
patterns of functional brain activation and recruitment of different motor circuits (Adkins et al.,
2006; Holschneider et al., 2007). In addition, it is becoming increasingly recognized that no
single exercise paradigm is likely to fulfill all therapeutic needs (Cotman and Berchtold,
2007).
Various exercise protocols have been used to study its beneficial effects, such as
acrobatic exercise, wheel running, and treadmill exercise of low to high intensity, continuous
or intermittent, and of short and long duration (Ferreira et al., 2010; Kleim et al., 1997; Real
et al., 2010). Enriched environments have also been used, and all these modalities have the
purpose of investigating specific exercise-induced plastic changes that occur in different
brain regions (Del Arco et al., 2007a; Mora et al., 2007). We evaluated here if TE and AE
could change structural and synaptic proteins in the same fashion in different motor areas of
the rat brain. This could be used to help understanding how different regions of the brain
contribute to the motor learning process triggered by different exercise modalities and how
this could contribute to the development of therapeutic strategies.
2. RESULTS
2.1. Balance and Coordination
Using the Rotarod to evaluate motor skills, we observed that all groups presented the
same level of motor skills in the initial evaluation. On the second week of training, we could
observe that both exercise groups significantly increased the time spent on the Rotarod (AE:
p<0.01; TE: p<0.001) and this increase persisted until the fourth week of training (AE:
p<0.05; TE: p<0.001) (Fig. 1). We did not observe, however, differences between the two
exercise modalities used here in this evaluation.
2.2. Acrobatic Performance
After 4 weeks of AE, the animals presented a significant reduction of the time necessary
to complete the AE task (p<0.01) (Fig. 1). This reduction was observed after the second
week of AE training and persisted for all evaluation periods until the end of the 4 weeks of
training. We also observed that the animal hesitated less from one obstacle to the other and
consequently less manual guidance was used.
79
2.3. Protein Expression
Protein expression of MAP2, NF, SYS and SYP in the three brain regions studied here
was evaluated using immunohistochemistry and Western blotting. The results of these
analyses are summarized in Table 1 and described in detail below.
Table 1 about here.
2.3.1. Motor Cortex
In the motor cortex, the staining for MAP2 was present along the neuropil throughout
layer V of the primary and secondary motor cortices, with a significantly higher intensity of
staining in the AE group (p<0.03). The staining of NFs, on the other hand, was observed
along the neuropil and perikarya and was significantly less intense in the TE group in relation
to the AE group (p<0.05). Protein analysis of the motor cortex corroborated with the
immunohistochemistry findings, as we observed increased levels of MAP2 after AE (p<0.03)
and decreased levels of NF160 and NF200 after TE (p<0.001 and p<0.03, respectively) with
no changes for NF68 (Fig. 2).
Figure 2 about here.
The staining for SYS and SYP exhibited a cytoplasmic pattern throughout the motor
cortex and we observed higher intensity of staining of SYS in the TE group (p<0.03),
whereas a higher intensity of staining of SYP was observed in both exercised groups
(p<0.03). Protein analysis, however, did not show any changes of synaptic proteins in the
motor cortex (Fig. 3).
Figure 3 about here.
2.3.2. Striatum
In the striatum, we observed staining for MAP2 along the neuropil throughout the rostro-
caudal striatum, especially in the medial region. The intensity of the staining for MAP2 was
higher in the dorsomedial striatum of the AE group (p<0.03) and also in the dorsolateral
striatum in relation to the TE group (p<0.05). As for the staining of NFs, we observed a
punctate pattern gathered in bundles where axons pass throughout the region, with no
differences among the groups. Protein analysis of the striatum revealed increases of MAP2
and NF68 protein levels after AE (p<0.03 and p<0.05, respectively), whereas TE increased
only NF68 protein levels (p<0.001) (Fig. 4).
Figure 4 about here.
80
The staining for SYS and SYP in this region exhibited a diffuse punctate pattern of
staining throughout the striatum. The intensity of staining for SYS was significantly higher in
the dorsomedial striatum in both exercised groups (p<0.03). As for the staining of SYP, the
intensity was significantly higher in the dorsomedial striatum of the AE group (p<0.05) and in
the dorsolateral striatum of the TE group (p<0.03). The protein analysis of these synaptic
proteins revealed increases only of SYP after AE (p<0.05), whereas SYS remained
unchanged. (Fig. 5).
Figure 5 about here.
2.3.3. Cerebellum
In the cerebellum, we observed a cytoplasmic pattern of staining of the Purkinje cells for
both MAP2 and NFs. On the granular and molecular layers we observed staining along the
axons and dendrites. This staining of neuropil and perikarya was observed throughout the
cerebellum. The dendrites immunoreactive for MAP2 were in the innermost region of the
molecular layer, proximal to the Purkinje cell dendrites, and extend diffusely throughout the
molecular layer, where we observed a higher intensity of staining in the TE group (p<0.03).
The staining for NFs was also diffusely distributed in the granular layer, where we observed a
higher intensity of staining in the TE (p<0.05), and in the molecular layer, where we observed
a lower intensity of staining in the TE group (p<0.05). Protein analysis of the cerebellum
revealed an increase of MAP2 levels after TE (p<0.001), whereas NF68 levels remained
unchanged and AE did not produce changes of either protein in this region (Fig. 6).
Figure 6 about here.
As for the synaptic proteins studied, we observed a punctate pattern of staining for both
SYS and SYP among the Purkinje cells, and a diffusely distributed staining along the
molecular layer. Little staining was observed in the granular layer. We were able to observe
higher intensity of staining for SYS in the granular layer of the TE group (p<0.03) and in the
molecular layer of both AE and TE groups (p<0.03). Protein analysis, however, did not show
any changes for either synaptic protein in the cerebellum (Fig. 7).
Figure 7 about here.
3. DISCUSSION
Our results show that, independently of the modality, physical exercise was able to
induce improvement of motor skills and changes of protein expression in the motor brain
81
areas studied here. However, these changes were distinct for treadmill and acrobatic
exercise, varying according to the brain region and proteins studied.
3.1. Behavioral analysis
Both AE and TE groups increased the time spent on the Rotarod, starting in 2 weeks of
exercise, whereas the sedentary group did not increase its scores. This suggests
improvement of coordination and balance of these rats in response to AE and TE and this
improvement persisted until the end of the exercise protocols. Since acrobatic exercises
demand more motor skills, such as balance and coordination, we expected the AE group to
spend more time on the Rotarod than the TE group. However, this did not happen, as the TE
group presented the same scores as the AE group. We hypothesize that, since the treadmill
is a rhythmic activity similar to the cylinders of the Rotarod, and the speed increments of the
Rotarod happen only every 30 seconds, this might not have caused enough instability.
Therefore, the Rotarod evaluation might not have been sensitive enough to differentiate the
balance and coordination improvements caused by the treadmill and acrobatic exercise.
One of the characteristics that define learning of a motor ability is the improvement of
performance to complete the learned task/behavior (Derksen et al., 2007). We observed
evidence of further motor learning of our AE rats, as they were able to complete the acrobatic
circuit in less time and with less hesitation 2 weeks after the beginning of the protocol. This
reduction of the time necessary to complete an acrobatic circuit has also been observed by
other groups using different training protocols. Kleim et al (1998) trained young adult rats for
30 consecutive days, during which the rats repeated the circuit task 5 times each day and by
the 10th day of training they were able to observe a reduction of the time necessary to
complete this task. Klintsova et al (2004), however, trained their rats for 1, 3, 5 or 7
consecutive days, during which the rats repeated the circuit task 3 times each day, and
observed that the time necessary to complete the task progressively decreased after the 5th
day of training. Furthermore, these previous studies have shown that the reduction of the
time necessary to complete an acrobatic circuit is due to the progressive reduction of the
number of mistakes along the circuit (misplacement of the paws, deficient motor control)
(Kleim et al., 1998b; Klintsova et al., 1998).
3.2. Changes in protein expression
The present study also showed that the different types of exercise training induced
distinct changes of MAP2, NFs, SYS and SYP in the various brain regions studied. In
addition, we could also observe that the structural proteins underwent more general changes
82
in all brain regions studied, as we could find changes in protein levels by Western blotting,
whereas the changes of synaptic proteins were detected more frequently by
immunohistochemistry, as these were only focal changes. It is noteworthy, that these two
methods offered complementary data facilitating a global comprehension.
3.2.1. Motor cortex
Our results in the cortex showed increased MAP2 and SYP after AE and decreased
levels of NF160 and NF200, and increased SYS and SYP after TE.
Increased MAP2 has also been observed by other groups in regions such as the
hippocampus after short-term treadmill exercise (Ferreira et al., 2011) and the motor cortex
after different types of acrobatic training (Derksen et al., 2007). In the latter study, the
authors evaluated the expression of MAP2 in the motor cortex of adult rats submitted to 4
different acrobatic circuits of increasing complexity for 1, 3, 5 and 7 days. They observed that
MAP2 protein levels increased, although there was no correlation between the protein levels
and the complexity of the circuit. Studies of new motor skill learning exhibited a significant
increase in mean area of movement representations (Kleim et al., 1998a) and increased
synaptic density within the rodent motor cortex (Jones et al., 1999). Increased MAP2 and
SYP in the motor cortex after acrobatic training can be involved in dendritic arborization
growing and synaptogenesis that are consistent with an expansion and higher activation of
motor cortex in association with motor skill learning.
There is still scarce data on changes of neurofilaments in response to exercise (Ding et
al., 2006; Ferreira et al., 2010; Ferreira et al., 2011). We did, however, observe decreased
protein levels of NF160 and NF200 after TE in the motor cortex. Ferreira et al. (2010)
observed decreased levels of NF68 e NF160 after 3 days and increased levels of NF68 after
15 days of treadmill exercise in the motor cortex and brainstem (specifically the reticular
formation). Since treadmill exercise should be automated relatively fast and should stimulate
other brain regions (Holschneider and Maarek, 2008), this is in accordance with decreased
NF expression that support a possible attenuation of the motor cortex activation occurred at
a later time due to habituation. On the other hand, increased SYS and SYP in the motor
cortex after TE was observed only by immunohistochemistry, that was able to detect focal
changes. Both SYS and SYP are associated to neurotransmitter release and are responsible
for the formation and anchoring of synaptic vesicles, as well as contributing to a fast and
efficient neurotransmission (Vaynman et al., 2006).
In summary, increased MAP2 and SYP in the motor cortex after AE and decreased NFs
and increased SYS and SYP after TE could be interpreted as a distinct cortical
83
reorganization influenced by different types of motor activity. AE induced an increased
plasticity possibly due to the fact that this region is involved in the planning and execution of
complex movements (M2 and M1, respectively). TE, on the other hand, which is a rhythmic
and automatic activity, may need mainly the primary motor cortex (M1) activation to be
executed.
3.2.2. Striatum
Moderate treadmill exercise, as well as protocols designed to promote learning of a new
motor skills are widely used to demonstrate plastic changes in the striatum (Ferreira et al.,
2010; Lambert et al., 2005; Meeusen et al., 1997) and other regions of the rodent brain
(Kleim et al., 2002; Klintsova et al., 1998; Real et al., 2010). The present study showed that
both exercise protocols used here induced more robust changes of structural proteins then
synaptic proteins in the striatum. AE increased MAP2 and NF68, whereas TE increased
NF68 in the striatum. It is noteworthy that MAP2 and NF68 have important functions in the
brain, as NF68 ensures structural support to axons and MAP2 participates in the growth and
branching of dendrites, establishing and maintaining synaptogenesis (Sanchez et al., 2000).
Some studies suggested that the striatum is involved in initial phases of motor task learning
and in later phases of movement automation (Miyachi et al., 2002; Yin, 2010). Thus, the
differential pattern of the expression between AE and TE may support these distinct striatum
roles in the acquisition of complex motor skill and consolidation or automation of the rhythmic
motor activity, respectively.
The only change of synaptic protein observed by protein analysis was an increase of
SYP after AE in the striatum. We did, however, observe local immunostaining increases of
SYS and SYP in both exercised groups studied. In the striatum, we could observe increased
SYP expression in the dorsomedial striatum (involved in complex motor control and learning
of motor tasks) after AE and in the dorsolateral striatum (involved in consolidation and motor
automation) (Miyachi et al., 2002; Yin, 2010) after TE, whereas SYS increased after AE and
TE only in the dorsomedial striatum. Both SYS and SYP are associated to neurotransmitter
release and are responsible for the formation and anchoring of synaptic vesicles, as well as
they contribute to a fast and efficient neurotransmission (Vaynman et al., 2006). Other
studies have observed changes of the levels of SYS after different exercise protocols. After
short-term treadmill exercise, increased SYS levels are observed in the striatum (Ferreira et
al., 2010). SYS has also been shown to increase after voluntary exercise. Vaynman et al.
(2006) have observed increased SYS levels after 3 days of wheel running and that the
84
neurotrophic factor BDNF is directly involved in the exercise-dependent regulation of SYS
and SYP.
Finally, the differential pattern of structural and synaptic protein expression induced by
AE and TE in the striatum corroborates with previous studies that have shown distinct
functional roles of the dorsomedial (or associative) striatum and dorsolateral (or
sensorimotor) striatum, based on their major inputs (Yin, 2010).
3.2.3. Cerebellum
Our results showed that the cerebellum was influenced almost exclusively by TE,
resulting in increases of MAP2 protein levels, and higher staining for NFs and SYS, with the
only effect of AE being an increased pattern of staining of SYS restricted to the molecular
layer. Black et al. (1990) have shown that TE rats had a greater density of blood vessels in
the molecular layer than did either AC or inactive animals, suggesting that increased synaptic
activity elicited compensatory angiogenesis. Our results showed an increase of MAP2
protein levels and increased staining for SYS induced by TE, which can be substrates for an
intense synaptic activity observed in the cerebellar molecular layer (Black et al., 1990).
However, neither of the present exercise protocols induced changes of NF protein levels in
the cerebellum, even though we could observe an increased staining pattern in the granular
layer and decreased staining pattern in the molecular layer after TE. This might suggest that
the NF68 response is more important after shorter periods of exercise (Ferreira et al., 2010),
and that after 30 days this protein has already returned to control levels.
Electron microscopy studies have also shown that animals trained for 30 consecutive
days on a complex motor learning task had increased number of synapses per Purkinje cell
within the cerebellar cortex (Black et al., 1990; Kleim et al., 1997). These studies showed an
increased pattern of staining for SYS in the molecular layer after AE, that can be interpreted
as increased synaptic efficiency in this region due to its participation in balance and motor
coordination.
3.3. Motor training and functional circuits
The present study showed that the different types of exercise training induced distinct
changes on the motor circuitries analysed. AE increased MAP2 and SYP in the motor cortex
and increased MAP2, NF68, SYS and SP in the striatum, suggesting that this type of
exercise targeted the basal ganglia-thalamic-cortical circuit in detriment of the cerebellum.
On the other hand, the cerebellum-thalamic-cortical circuit was influenced almost exclusively
85
by TE, resulting in increases of MAP2, NFs and SYS in the cerebellum, with the only effect of
AE being an increased pattern of staining for SYS, restricted to the molecular layer. A
distinction has been made between tasks that require a high amount of attentional guidance
(i.e. skilled training) and those that do not (overlearned, automatic, or endurance based), and
each has been linked with different patterns of functional brain activation (Adkins et al.,
2006). Lewis et al. (2007) stated that for internally guided movements, such as acrobatic
exercises, there is a predominant activation of basal ganglia-thalamic-cortical circuits. As
learning progresses, movements are refined and become automatic, therefore with an
externally guided control, and there is a predominant activation of cerebellar-thalamic-cortical
circuits, which would be the case of treadmill exercise. These circuits work together in
balance and are more or less activated depending on the task (Lewis et al., 2007). Other
authors support this theory, such as Holschneider et al. (2007), who showed that treadmill
exercise for 6 weeks increases cerebral blood flow in areas of the cerebellar-thalamic-cortical
circuit. Furthermore, the increase of SYS in the molecular layer of the cerebellar cortex after
AE possibly suggests the beginning of a shift to a predominantly activated cerebellar-
thalamic-cortical circuit, since the acrobatic circuit may become automatic after 30 days of
training.
4. CONCLUSION
Our results show that both exercise modalities induce improvements of motor behavior
and plasticity. Acrobatic exercise induced increases of structural and synaptic proteins in the
motor cortex and striatum, supporting the involvement of these regions in the process of
learning new skills. Treadmill exercise, on the other hand, produced a more diffuse effect,
increasing structural and synaptic proteins in the motor cortex, striatum and cerebellum.
These results confirm that the type of exercise is a determining factor of which brain regions
are more affected and suggest that different proteins participate in the underlying plasticity,
even when the behavioral outcome is the same. The understanding of the relationship
between these different types of exercise, mechanisms of neural plasticity, and changes in
motor behavior may facilitate the development of more effective rehabilitation interventions.
5. EXPERIMENTAL PROCEDURES
5.1. Animals
86
Male 2 month-old Wistar rats weighing ca. 250 g (obtained from the Animal Facility of the
Institute of Biomedical Sciences of the University of São Paulo) were housed in groups in
standard polyethylene cages with food and water ad libitum, room temperature of 23oC and a
12/12h light-dark inverted cycle (Holmes et al., 2004). Animals were randomly divided into
three groups: treadmill exercise (TE) (n=20), acrobatic exercise (AE) (n=20) and sedentary
(Sed) (n=15). All protocols were approved by the Ethics Committee for Animal Research of
the University of São Paulo and experimental procedures were performed in accordance with
the guidelines of the Brazilian College for Animal Experimentation (COBEA) and the animal
care guidelines of the National Institutes of Health (NIH/USA).
5.2. Evaluation of balance and coordination
Before the rats went through their designated exercise modality, an initial evaluation of
motor skills was conducted. This evaluation was then repeated after 2 weeks and then again
after 4 weeks of the exercise period for all three groups. We chose to use a Rotarod, as this
instrument allows us to evaluate balance and coordination (Brooks and Dunnett, 2009). The
Rotarod was initially designed to measure neurologic deficits in rodents and represents the
most commonly used instrument to test motor function in rats (Brooks and Dunnett, 2009).
The rats are placed on top of the 4 individual cylinders (7cm-diameter) which rotate at a
progressively increasing speed (increments every 30 seconds). Once the rat falls from the
cylinder, it lands on a pressure-sensitive platform which records how long the rat stayed on
the cylinder.
5.3. Acrobatic exercise protocol
An acrobatic circuit was built based on what was used by Black et al. (1990), which
constituted of the following obstacles placed at a height of 1.5m from the ground: see-saw,
balance beams, rope ladder, thin dowels and rope bridge. All animals went through a two-
day adaptation period to the acrobatic task during which they passed through the entire
circuit twice each day. The acrobatic task was performed 3 times a week for a period of 4
weeks during which the rats were allowed 5 trials each day. When necessary, rats were
gentle guided manually to continue to next obstacle. The time spent to complete the task on
each trial was recorded (Black et al., 1990; Kleim et al., 1996). Platforms and bridges were
cleaned with 70% ethanol after each rat completed its session.
5.4. Treadmill exercise protocol
87
All animals went through a two-day adaptation period to a treadmill (KT 3000 –
IMBRAMED, Brazil, adapted for rats) during which they were allowed to explore the
equipment and the treadmill was turned on for only 15 minutes at low speeds (0.3 to 0.5
km/h). This procedure has the purpose of excluding animals which are intolerant to the
treadmill and refuse to run, providing a homogenous group of rats for the TE group. These
rats exercised for 40 minutes a day, 3 times a week at 10m/min (0.6 km/h) in the middle of
the active cycle (between 11am and 1pm), whereas the sedentary group remained in the
cages near the treadmill. The inverted cycle and this period of training were used to avoid the
development of internal desynchronization, similar to the effect observed in night-shift
workers, which was previously detected in rats that exercised during their light cycle
(Salgado-Delgado et al., 2008).
5.5. Immunohistochemistry
5.5.1. Tissue processing
After the exercise period, the animals (4 animals per group) were deeply anesthetized
(ketamine, 20mg/100g of body weight; xylazine, 2mg/100g, i.m.) and perfused transcardially
with 300mL of 0.1M phosphate buffered saline (PBS) followed by 300mL of 2%
paraformaldehyde in 0.1M sodium phosphate buffer (PB), pH 7.4. The brains were then
removed and post-fixed for 4 hours in the same fixative at 4oC and cryoprotected with a 30%
sucrose solution (in PB) for 48 hours at 4oC. Coronal sections (30µm) were cut on dry ice
using a sliding microtome (Leica SM 2000R – Nussloch, Germany). Sections were stored in
PB at 4ºC until use.
5.5.2. Immunostaining
Free-floating sections were stained with a series of antibodies, namely rabbit polyclonal
anti-SYS (1:1000) (Chemicon, Temecula, USA), rabbit polyclonal anti-SYP (1:250)
(DakoCytomation, Glostrup, Denmark), mouse monoclonal anti-NFs (PAN, recognizing
68kDa, 160kDa and 200kDa neurofilaments) (1:2000) (Zymed Laboratories, San Francisco,
CA, USA) and mouse monoclonal anti-MAP2 (1:1000) (Chemicon, Temecula, USA). All
antibodies are routinely used by several laboratories. The secondary antibodies were
biotinylated goat anti-rabbit antisera for SYS, donkey anti-rabbit antisera for SYP, donkey
anti-mouse antisera for MAP2 (all from Jackson Immuno Research Lab., West Grove,
Pennsylvania, USA) and a goat anti-mouse antiserum for NFs (Vector, Burlingame, CA,
USA). The primary antibodies were diluted in PB with 0.3% Triton X-100 and 5% normal goat
serum (for anti-SYS and anti-NFs) or normal donkey serum (for anti-SYP and anti-MAP2)
88
and the sections were incubated overnight (14-20 h) at room temperature (ca. 24oC). After
washing the sections with PB (3 x 10 min), they were incubated with the corresponding
secondary antibodies, which were all diluted 1:200 in PB with 0.3% Triton X-100 for 2 hours
at room temperature. Following additional washes (3 x 10 min), the sections were incubated
with the avidin-biotin-peroxidase complex (ABC Elite kit, Vector Labs., Burlingame, CA, USA)
for 2 hours at room temperature. Labeling was developed with 0.05% diaminobenzidine
tetrahydrochloride (DAB) and 0.03% (final concentration) hydrogen peroxide in PB. To
confirm the specificity of the antibodies, a separate set of sections from each group was
incubated only with the secondary antibodies, a condition in which no staining was present.
After the staining procedure, the sections were mounted on glass slides and the staining was
intensified with 0.05% osmium tetroxide in water. They were then dehydrated and
coverslipped using Permount (Fisher, Pittsburg, PA, USA). The region of interest were
identified based on a stereotaxic atlas (Paxinos and Watson, 2005) and the corresponding
images captured using a Nikon DMX1200 digital camera and quantified by using integrated
optical density, normalized to the background optical density, measured in the same way in
the same section with the aid of Image J (NIH/USA). For primary (M1) and secondary (M2)
motor cortex we analyzed 8 areas of 540.000 µm2 of the motor cortex for each rat between
the planes designated as bregma 2.52-1.56. For the striatum we analyzed 12 areas of
300.000 µm2 from dorsomedial and dorsolateral areas for each rat between bregma 1.80-
0.36, and in the cerebellum we analyzed the cerebellar cortex (paramedian lobule) in 8 areas
of 160.000 µm2 for each rat.
5.6. Western blotting
The animals (12 animals per group) were decapitated and regions of interest were
quickly collected, frozen in liquid nitrogen and stored at -70oC until use. The tissue was then
homogenized at 4ºC in extraction buffer (Tris, pH 7.4, 100 mM; EDTA 10 mM; PMSF 2 mM;
aprotinin 0.01 mg/ml). The homogenates were centrifuged at 12,000 rpm (15294g)
(Eppendorf Centrifuge 5804R – Westbury, NY, USA) at 4oC for 20 min, and the protein
concentration of the supernatant was determined using a protein assay kit (Bio-Rad,
Hercules, CA, USA) (Bradford, 1976). The material was stored in a sample buffer (Tris/HCl
125mM, pH 6.8; 2.5% (p/v) SDS; 2.5% 2-mercaptoethanol, 4mM EDTA and 0.05%
bromofenol blue) (Laemmli, 1970) at -70ºC until starting the assays. Samples containing
100µg of total proteins in Laemmli buffer were boiled for 5 min and separated by 6.5% and
8% acrylamide SDS gels (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) at 25mA (Laemmli, 1970) and
89
electrophoretically transferred to nitrocellulose membranes (Millipore, Temecula, CA, USA)
at 100 V for 80 min using a Trans-Blot cell system (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). The
membranes were then blocked for 2 hours at room temperature with PBS containing 0.05 %
Tween-20 (TTBS) and 5 % non-fat milk, and incubated overnight at 4°C with the same
primary antibodies used for immunohistochemistry at a concentration of 1:1000. The
membranes were then incubated for 2 hours with anti-rabbit-HRP IgG for SYS and SYP, and
anti-mouse-HRP IgG for NFs and MAP2 (Amersham, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK)
diluted 1:10,000 in TTBS with 1% non-fat milk. The probed proteins were developed by using
a chemiluminescent kit (ECL, Amersham Biosciences, NJ, USA). The membrane was then
incubated for 30 min at room temperature with stripping buffer and an anti-β-actin antibody
(Sigma, St. Louis, MO, USA) was used to quantify β-actin as a loading control. The bound
antibodies were visualized using radiographic films which were placed in contact with the
membranes, then developed and fixed. The quantification of band intensity was performed
with Image J (NIH Image). Subsequently, the normalized data were treated to evaluate
protein changes in the experimental structures in relation to the controls.
5.7. Statistical analysis
Data are expressed as the mean ±SEM. Statistical analyses were performed using one-
way ANOVA with Tukey post-hoc test for behavioral, immunohistochemistry and Western
blotting data. The significance level used was 5%.
ACKNOWLEDGEMENTS
This study was supported by FAPESP and CNPq (R.S.P.; L.R.G.B.). The authors would
like to thank Adilson S. Alves for helping with experimental protocols. C.C.R. and A.F.B.F.
are the recipients of fellowships from FAPESP.
90
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Yin, H.H., 2010. The sensorimotor striatum is necessary for serial order learning. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30, 14719-23.
93
94
FIGURES AND LEGENDS
Fig. 1 - Behavioral evaluation. (A) See-saw, balance beams rope ladder and thin dowels as
examples of the obstacles of the acrobatic circuit. (B) Evaluation of the acrobatic
performance considering the recorded time to complete the acrobatic circuit each week. (C)
Balance and coordination evaluation using the Rotarod considering the time spent on the
equipment on the first day (0W), on the second week (2W) and on the forth week (4W) of the
protocols.
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Fig. 2 - Effects of AE and TE on MAP2 (A) and NFs (B) in the rat motor cortex. Digital
images of coronal sections of the motor cortex stained for MAP2 and NFs. Mean ratio of
MAP2 and NFs integrated density data in the motor cortex (M1 and M2) in relation to the
background optical density (N=6-8 per group). Mean ratio of MAP2/β-actin and NF68/β-actin,
NF160/β-actin, NF200/β-actin (N=7-14 per group). Density data relative to the sedentary
group (normalized) and typical immunoblots in each condition. AE: acrobatic exercise; TE:
treadmill exercise; Sed: sedentary; MAP2: microtubule-associated protein 2; NF:
neurofilaments; NF68: 68kDa neurofilament; NF160: 160kDa neurofilament; NF200: 200kDa
neurofilament; IHC: immunohistochemistry (*p<0.05; **p<0.03; ***p<0.001).
Fig. 3 - Effects of AE and TE on SYS (A) and SYP (B) in the rat motor cortex. Digital images
of coronal sections of the motor cortex stained for SYS and SYP. Mean ratio of SYS and
SYP integrated density data in the motor cortex (M1 and M2) in relation to the background
optical density (N=6-8 per group). Mean ratio of SYS/β-actin and SYP/β-actin densitometry
(N=7-14 per group). Density data relative to the sedentary group (normalized) and typical
immunoblots in each condition. AE: acrobatic exercise; TE: treadmill exercise; Sed:
sedentary; SYS: synapsin I; SYP: synaptophysin; IHC: immunohistochemistry (**p<0.03).
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Fig. 4 - Effects of AE and TE on MAP2 (A) and NFs (B) in the rat striatum. Digital images of
coronal sections of the striatum stained for MAP2 and NF68. Mean ratio of MAP2 and NF68
integrated density data in the dorsomedial and dorsolateral striatum in relation to the
background optical density (N=6-8 per group). Mean ratio of MAP2/β-actin and NF68/β-actin
densitometry (N=7-14 per group). Density data relative to the sedentary group (normalized)
and typical immunoblots in each condition. AE: acrobatic exercise; TE: treadmill exercise;
Sed: sedentary; MAP2: microtubule-associated protein 2; NF: neurofilaments; NF68: 68kDa
neurofilament; IHC: immunohistochemistry (*p<0.05; **p<0.03; ***p<0.001).
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Fig. 5 - Effects of AE and TE on SYS (A) and SYP (B) in the rat striatum. Digital images of
coronal sections of the striatum stained for SYS and SYP. Mean ratio of SYS and SYP
integrated density data in the dorsomedial and dorsolateral striatum in relation to the
background optical density (N=6-8 per group). Mean ratio of SYS/β-actin and SYP/β-actin
densitometry (N=7-14 per group). Density data relative to the sedentary group (normalized)
and typical immunoblots in each condition. AE: acrobatic exercise; TE: treadmill exercise;
Sed: sedentary; SYS: synapsin I; SYP: synaptophysin; IHC: immunohistochemistry (*p<0.05;
**p<0.03).
98
Fig. 6 - Effects of AE and TE on MAP2 (A) and NFs (B) in the rat cerebellum. Digital images
of coronal sections of the cerebellar cortex stained for MAP2 and NFs. Mean ratio of MAP2
and NFs integrated density data in the granular and molecular layer in relation to the
background optical density (N=6-8 per group). Mean ratio of MAP2/β-actin, NF68/β-actin and
NF160/β-actin densitometry (N=7-14 per group). Density data relative to the sedentary group
(normalized) and typical immunoblots in each condition. AE: acrobatic exercise; TE: treadmill
exercise; Sed: sedentary; MAP2: microtubule-associated protein 2; NF: neurofilaments;
NF68: 68kDa neurofilament; NF160: 160kDa neurofilament; IHC: immunohistochemistry
(*p<0.05; **p<0.03; ***p<0.001).
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Fig. 7 - Effects of AE and TE on SYS (A) and SYP (B) in the rat cerebellum. Digital images
of coronal sections of the cerebellar cortex stained for SYS and SYP. Mean ratio of SYS and
SYP integrated density data in the granular and molecular layer in relation to the background
optical density (N=6-8 per group). Mean ratio of SYS/β-actin and SYP/β-actin densitometry
(N=7-14 per group). Density data relative to the sedentary group (normalized) and typical
immunoblots in each condition. AE: acrobatic exercise; TE: treadmill exercise; Sed:
sedentary; SYS: synapsin I; SYP: synaptophysin; IHC: immunohistochemistry (*p<0.05;
**p<0.03;).