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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Dissertação de Mestrado
SÍNTESE E AVALIAÇÃO PRELIMINAR DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E ANTICHAGÁSICA DE NOVAS
ISOXAZOLIL-ARIL-SEMICARBAZONAS, E TIOSSEMICARBAZONAS E ISOXAZOLIL-NITROFURFURIL-
HIDRAZONAS.
GLEYBSON CORREIA DE ALMEIDA
RECIFE - PE
FEVEREIRO DE 2010
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
SÍNTESE E AVALIAÇÃO PRELIMINAR DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E ANTICHAGÁSICA DE NOVAS
ISOXAZOLIL-ARIL-SEMICARBAZONAS E TIOSSEMICARBAZONAS, E ISOXAZOLIL-NITROFURFURIL-
HIDRAZONAS.
GLEYBSON CORREIA DE ALMEIDA
MESTRANDO
PROF. DR. ANTÔNIO RODOLFO DE FARIA
ORIENTADOR
PROFa. VALÉRIA REGO ALVES PEREIRA
CO-ORIENTADORA
Recife – PE
Fevereiro de 2010
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas do Centro de Ciências da Saúde da UFPE, como requisito para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Almeida, Gleybson Correia de
Síntese e avaliação preliminar da atividade antimicrobiana e antichagásica de novas isoxazolil-aril-semicarbazonas, e tiossemicarbazonas e isoxazolil-nitrofurfuril-hidrazonas / Gleybson Correia de Almeida. – Recife: O Autor, 2010.
166 folhas: il., tab., fig., gráf., esquema.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCS. Ciências Farmacêuticas, 2010.
Inclui bibliografia e anexos.
1. Isoxazolinas. 2. Semicarbazonas. 3. Tiossemicarbazonas. 4. Hidrazonas. 5. Nitrofuranos. I. Título.
615.03 CDU (2.ed.) UFPE
615.19
CDD (20.ed.) CCS2010-158
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
REITOR
Prof. Amaro Henrique Pessoa Lins
VICE-REITOR
Prof. Gilson Edmar Gonçalves e Silva
PRÓ-REITOR PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
Prof. Anísio Brasileiro de Freitas Dourado
DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
Prof. José Tadeu Pinheiro
VICE-DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
Prof. Márcio Antônio de Andrade Coelho Gueiros
CHEFE DO DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Prof. Dalci José Brandini
VICE-CHEFE DO DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Prof. Antônio Rodolfo de Faria
COORDENADOR DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
Prof. Pedro Rolim Neto
VICE-COORDENADOR DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
Prof.a Beate Saegesser Santos
Dedico este trabalho
a meus pais e irmãos;
AGRADECIMENTOS
A Deus, por me dar paz e saúde para me manter sempre motivado a
trabalhar;
Aos meus pais, José Cupertino e Iracema, pelo amor e carinho, incentivando-
me durante minha vida, e pela dedicação em prol de seus filhos;
A meus irmãos Dayvisson e Jeyvson, e irmãs Emilia, Amanda e Dayna pela
compreensão e apoio nos momentos difíceis. E por trabalhar junto comigo na
realização deste sonho.
À minha sogra Etiane e namorada Ramaiana por estar sempre ao meu lado
ajudando e confortando ao longo destes dois anos.
Ao tutor e orientador Professor Antônio Rodolfo, idealizador deste projeto, a
quem possuo grande gratidão e admiração, e pela sua grande colaboração nos
aspectos técnicos deste trabalho. E ao amigo Rodolfo pelos cinco anos de
convivência, pela confiança e por acreditar nesta parceria que vem dando certo.
Ao grande amigo Charles Mendes que esteve sempre ao meu lado, sofrendo
e se divertindo durante os dois anos de pesquisa.
Ao amigo Valderes pela atenção e colaboração nos aspectos técnicos durante
os anos de convivência no LaSOF.
À professora Valéria e sua equipe, pela realização dos ensaios anti-
chagásicos e orientação;
À professora Magali e sua equipe pelo empenho nos testes antimicrobianos;
À Professora Nely pela colaboração ao ceder o laboratório.
Aos técnicos da Central Analítica, Ricardo, Abene e Eliete pela realização das
análises espectrométricas.
Aos amigos do Lasof, Leilane, Marlene, Nayara, Adriano, Lucas, Rafaela,
Karina, Silvio, Juliana, Ronmilson e Hugo por todos os momentos compartilhados no
laboratório;
A CAPES, pelo auxílio financeiro.
Aos amigos, colegas e professores, que não citei o nome, mas que tanto
colaboraram com a minha formação intelectual.
Muitos foram os que contribuíram para que esta dissertação chegasse a essa
forma em que agora se encontra. Dentra dela, muitas palavras, fórmulas e números;
fora, pessoas que impulsionaram sua conclusão.
Nenhum homem realmente produtivo pensa como se estivesse escrevendo uma dissertação.
Albert Einstein
Se A é o sucesso, então A é igual a X mais Y mais Z. O trabalho é X; Y é o lazer; e Z é manter a boca fechada.
Albert Einstein
Brincar é condição fundamental para ser sério.
Arquimedes
Não sei qual é o maior, a vida ou a morte, mas sei que o amor de Deus é maior que os dois.
Gleybson Correia
SUMÁRIO
o Resumo........................................................................................................ xii
o Abstract........................................................................................................ xiii
o Lista de figuras............................................................................................. xvi
o Lista de Esquemas....................................................................................... xv
o Lista de tabelas........................................................................................... xvi
o Lista de siglas e abreviaturas...................................................................... xvii
I - INTRODUÇÃO
1.0 – Introdução.................................................................................................... 19
II – REVISÃO BIBLIGRÁFICA
2.0 – Revisão da Literatura................................................................................... 23
2.1 – Isoxazolinas........................................................................................... 23
2.1.1 – Atividade Biológica e Aplicação Terapêutica............................... 23
2.2 – Hidrazonas............................................................................................ 28
2.2.1 – Atividade Biológica e Aplicação Terapêutica............................... 28
2.3 – Nitrofuranos........................................................................................... 31
2.3.1 – Atividade Biológica e Aplicação Terapêutica............................... 31
2.4. - Semicarbazonas e Tiossemicarbazonas............................................... 34
2.4.1 – Atividade Biológica e Aplicação Terapêutica............................... 34
III – OBJETOS
3.0 – Objetivos....................................................................................................... 40
3.1 – Objetivos Gerais.................................................................................... 40
3.2 – Objetivos Específicos............................................................................ 41
IV – ESTUDO QUÍMICO
4.0 – Rota Sintética............................................................................................... 42
5.0 – Resultados e Discussão............................................................................... 46
5.1 – Síntese dos ésteres derivadas de N-(benzoil)-2-Isoxazolina[5,4-
b]piperidina e N-(benziloxicarbonil)-2-piperidina.......................................................
46
5.2 – Síntese das Semicarbazonas e Tiossemicarbazonas derivadas do
aza-biciclo piperídinico..............................................................................................
48
5.2.1 – Síntese dos Alcoóis do biciclo piperidínicos................................... 48
5.2.2 – Síntese dos Aldeídos do biciclo piperidínicos................................ 49
5.2.3 – Sintese das semicarbazonas e Tiossemicarbazonas 68................. 51
5.3 – Síntese das semicarbazonas e tiossemicarbazonas derivadoas dos
aza-biciclos isoxazolínicos.........................................................................................
59
5.3.1 – Síntese dos Alcoóis pirrolídinicos.................................................... 59
5.3.2 – Síntese dos Aldeídos pirrolidincos.................................................. 60
5.3.3 – Síntese das Semicarbazonas e Tiossemicarbazoas 80.................. 61
5.4 – Síntese das hidrazidas 81 e Hidrazonas 82 derivadas do heterobiciclo
2-Isoxazolina[5,4-b]pirrolidina 88...............................................................................
67
5.4.1 – Síntese das hidrazidas 81 derivadas do heterobiciclo 2-
Isoxazolina[5,4-b]pirrolidina.......................................................................................
67
5.4.2 – Síntese das hidrazonas 82 derivadas do heterobiciclo 2-
Isoxazolina[5,4-b]pirrolidina.......................................................................................
72
6.0 – Procedimento Experimental.................................................................. 78
6.1 – Síntese semicarbazonas e tiossemicarbazonas derivados de 2-
isoxazolinas piperidínicas..........................................................................................
79
6.2 – Síntese semicarbazonas e tiossemicarbazonas de derivados de 2-
isoxazolinas pirrolidínicas..........................................................................................
96
6.3 – Síntese de hidrazonas de derivados de 2-isoxazolinas
pirrolidínicas...............................................................................................................
120
V – ESTUDO BIOLÓGICO
7.1 – Atividade Antimicrobiana........................................................................... 128
7.1.1 – Introdução......................................................................................... 128
7.1.2 – Materiais e Metodos......................................................................... 128
7.1.3 – Resultados e Discussão................................................................... 130
7.2 – Atividade Antichagásca.............................................................................. 133
7.2.1 – Introdução.......................................................................................... 133
7.2.2 – Materiais e Metodos.......................................................................... 136
7.2.2.1 – Animais..................................................................................... 136
7.2.2.2 – Obtenção de Células esplênicas.............................................. 136
7.2.2.3 – Avaliação da Atividade tóxica dos compostos em células de
camundongos isogênicos..........................................................................................
137
7.2.2.4 – Cultura de Trypanosoma cruzi................................................. 138
7.2.2.5 – Avaliação da atividade dos compostos contra T. cruzi............. 138
7.2.3 – Discussão.......................................................................................... 139
VI – CONCLUSÕES
8.0 – Conclusões............................................................................................ 144
VII – PERSPECTIVAS
9.0 – Perspetivas............................................................................................. 145
BIBLIOGRAFIA
10.0 – Referências Bibliográficas................................................................... 146
ANEXOS
11.0 – Espectros de RMN de 1H e 13C........................................................... 157
RESUMO:
Na literatura, há um grande número de trabalhos que buscam obter derivados de
semicarbazonas e tiossemicarbazonas, contendo heterociclos, com aplicações farmacológicas,
como antimicrobiana, antichagásica, antifúngica, antineoplásica e anticonvulsivante.
Pesquisas vêm obtendo sucesso na busca de novos compostos bioativos híbridos dos núcleos
2-isoxazolina[5,4-b]piperidina e 2-isoxazolina[5,4-b]pirrolidina, como por exemplo os
derivados aril-hidrazonas e amidas deste biciclos que apresentaram ação antinociceptiva e
anti-inflamatória, respectivamente. Desta forma, dez novos derivados isoxazolil-aril-
semicarbazonas e tiossemicarbazonas foram desenvolvidos através de uma condensação
catalítica ácida da 4-fenil-semicarbazida ou 4-fenil-tiossemicarbazida com aldeídos
isoxazolínicos. No presente estudo, ésteres, derivados da reação de cicloadição [3+2] do
óxido de nitrila (CEFNO) com enecarbamato N-benziloxicarbonil-2-pirrolina ou enamidas
piperidínicas benzoíladas, foram reduzidos aos respectivos alcoóis pelo NaBH4, que em
seguida, foram submetidos a uma oxidação de Swern, resultando nos aldeídos isoxazolínicos.
Uma segunda abordagem deste trabalho foi a síntese de uma série de hidrazonas
isoxazolínicas conjugadas ao grupamento farmacofórico nitrofurfuril. A presença do
farmacóforo nitrofurano em compostos bioativos vem sendo bastante relatada na literatura,
demonstrando uma diversidade de atividades biológicas, como antimicrobiana, antichagásica
e antifúngica. Para síntese destes novos híbridos isoxazolínicos, foram postos em reação
ésteres pirrolidínicos com hidrazina 80%, produzindo as isoxazolil-hidrazidas que foram
condensadas ao 5-nitro-2-furfuraldeído. Todos os compostos supracitados foram conduzidos a
testes antimicrobianos pelo método de difusão em disco, numa concentração de 100 µg/µL,
contra cepas de Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeroginosa, Escherichia coli, Candida
albicans e Aspergillus Níger. Os novos derivados isoxazolínicos não apresentaram atividade
antifúngica, formando apenas alguns halos parciais sobre a C. albicans. Contudo, as
hidrazonas se sobressaíram contra as cepas bacterianas analisadas, formando halos de inibição
superiores a 15 mm, sendo considerados bons agentes antibacterianos. Todos os novos
híbridos isoxazolínicos também foram conduzidos a testes de citotoxicidade e atividade
inibitória frente à forma epimastigota das cepas Y de Tripanosoma cruzi. Todos os compostos
testados foram ativos em baixas concentrações, tendo destaque para as tiossemicarbazonas
que apresentaram as menores citotoxidades (acima de 100 µg/mL), e a nitrofurfuril-hidrazona
isoxazolínica p-F-substituída (citotoxicidade 25 µg/mL e IC50 igual a 1,17 µg/mL) que
demonstrou ser mais ativo que o benznidazol (citotoxicidade 25 µg/mL e IC50 igual a 1,73
µg/mL), em testes in vitro, além de possuir um alto potencial bactericida (halo de inibição em
média 20 mm).
Palavras-chave: Isoxazolinas, Semicarbazonas, Tiossemicarbazonas, Hidrazonas,
Nitrofuranos, Atividade Antimicrobiana e Antichagásica.
ABSTRACT
In literature, there are a large number of academic publishing related to the obtainment of
semicarbazones and thiosemicarbazones derivatives, containing heterocycles, with
pharmacologic application, such as antimicrobial, antichagasic, antifungal, antineoplasic and
anticonvulsant. Researches have been acquiring success in the search for novel hybridized
bioactive compounds with 2-isoxazoline[5,4-b]piperidine and 2-isoxazoline[5,4-b]pyrrolidine
nuclei, for example, the aryl-hydrazones and amides from these bicycles that have presented
antinociceptive and anti-inflammatory activities, respectively. Thus, ten novel isoxazolyl-aryl-
semicarbazones and thiosemicarbazones were developed through acid catalytic condensations
of 4-phenyl-semicarbazide or 4-phenyl-thiosemicarbazide with isoxazolinic aldehydes. In the
present study, esters, derived from the cycloaddition [3+2] reaction of the nitrile oxide
(CEFNO) with the enecarbamate N-benziloxycarbonyl-2-pyrroline or benzyl piperidinic
enamides, have been reduced to the respective alcohols, by the NaBH4, and afterwards, have
been submitted to Swern’s oxidation, resulting on the isoxazolinic aldehydes. A second
approach of this work was the synthesis of a series of isoxazolinic hydrazones conjugated
with the 5-nitro-2-furanyl pharmacophoric group. The presence of such pharmacophore in
bioactive compounds has been largely related in the literature, showing a diversity of
biological activities, such as antimicrobial, antichagasic, antifungal. To carry out the synthesis
of these new isoxazolinic hybrids, pirrolidinic esters were reacted with hydrazine 80%
producing the isoxazolyl-hydrazides, that were, thereafter, condensed to the 5-nitro-2-
furaldehyde. All the aforementioned compounds were conducted to antimicrobial tests by the
disc diffusion method, at a concentration of 100 µg/µL, with strains of Staphylococcus
aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Candida albicans and Aspergillus niger.
The novel isoxazolinic derivatives have not presented antifungal activity, forming just some
partial halos on C. albicans. Nevertheless, the hydrazones excelled against analyzed bacterial
strains, forming inhibition halos superior to 15 mm, being considered to be good antibacterial
agents. All the novel isoxazolinic hybrids were also conducted to cytotoxicity tests and
inhibitory activity on epimastigote form of the Y strain of Trypanosoma cruzi. All the tested
compounds were active at low concentrations, with emphasis to the thiosemicarbazones that
have shown the lowest cytotoxicity (above 100 µg/mL), and to the isoxazolinic 5-nitro-2-
furanyl-hydrazone 4-fluoro-substituted (cytotoxicity of 25 µg/mL and IC50 equal to 1,17
µg/mL) that showed to be more active than the Benznidazol (cytotoxicity 25 µg/mL and IC50
equal to 1,73 µg/mL), in in vivo tests, besides possessing high bactericidal potential
(inhibition halo in an average of 20 mm).
Keywords: Isoxazolines, Semicarbazones, Thiosemicarbazones, Hydrazones, Nitrofurans,
Antimicrobial and Antichagasic Activities.
LISTA DE FIGURAS
Página
Figura 01 – Isoxazóis, isoxazolinas e isoxazolidinas 23
Figura 02 – Forma SYN e ANTI de um dos cicloadutos da série pirrolidínicos 65. 47
Figura 03 – Dados espectroscópicos de RMN de 1
H e 13
C da tiossemicarbazona 68a.
Deslocamento químico em ppm.
55
Figura 04 –Respectivos espectros de IV-FT, RMN de 13
C e RMN de 1H da
tiossemicarbazona 68a.
58
Figura 05 – Dados espectroscópicos de RMN de 1
H e 13
C da semicarbazona 80e.
Deslocamento químico em ppm. 63
Figura 06 – Espectros de IVFT, DEPT, RMN de 1H,
13C, DEPT da semicarbazona
80e. 66
Figura 07 – Espectros RMN de 1H, RMN de
13C e IV-FT da hidrazida 81c
71
Figura 08 – Dados espectroscópicos de RMN de 13
C e de 1H da hidrazona 82c.
Deslocamento químico em ppm
74
Figura 09 – Espectros RMN de 13
C, RMN de 1H e IVFT da hidrazona 82c 76
Figura 10 – Diasteroisômero das hidraznas 82 (E) e 82 (Z). 77
Figura 11 – Halos de Inibição contra Staphylococcus aureus, Pseudomonas
aeruginosa, Escherichia coli, e Candida albicans. 130
Figura 12 – Placas de Petri em Agar Nutritivo, mostrando os Halos de Inibição
contra Staphylococcus aureus (A,B), Pseudomonas aeruginosa(D,C), Escherichia
coli (E,F).
131
Figura 13 – Série das acil-aril-hidrazonas isoxazolínicas 38a-b, com atividade
antinociceptiva e sem ação antimicrobiana, Série das nitrofurfuril-hidrazonas
isoxazolínicas 82, potente antimicrobiano.
132
Figura 14 – Ciclo Biológico do T. cruzi. 134
Figura 15 – Megacólon chagásico crônico. 135
Figura 16 – Hipertofia em miocardio e dilatação das cavidades do coração com a
presença de trombos no coração chagásico crônico. 135
LISTA DE ESQUEMAS
Página
Esquema 01 – Rota sintética das isoxazolil-nitrofurfuril-hidrazonas a partir do éster
isoxazolínico. 40
Esquema 02 – Rota sintética das isoxazolil-semicarbazonasma e tiosemicarbazonas a
partir do éster isoxazolínico. 40
Esquema 03 – Cicloadiçao [3+2] entre o 2-pirrolilan ou 2-piperidina e o precursor do
CEFNO. 42
Esquema 04 – Rota sintética utilizada para obtenção das semicarbazonas e
tiosemicarbazonas a partir da pirrolidina (n=1) ou piperidina (n=2). 43
Esquema 05 – Síntese das isoxazolil-hidrazonas IX a partir do éster isoxazolínico. 45
Esquema 06 – Rota sintética utilizada para obtenção dos ésteres dos heterociclos 2-
isoxazolina[5,4-b]pirrolidina e 2-isoxazolina[5,4-b]piperidina 46
Esquema 07 – Redução do éster piperidinico 65 a álcool 66. 48
Esquema 08 – Oxidação do álcool piperídinico 66. 49
Esquema 09 – Reação padrão de Swern.
50
Esquema 10 – Síntese de tiossemicarbazonas por uma reação catalítica one-pot. 52
Esquema11 – Síntese das semicarbazonas e tiossemicarbazonas do biciclo 2-
isoxazolínico piperidínico. 53
Esquema 12 – Síntese dos alcoóis isoxazolínicos 78. 59
Esquema 13 – Síntese dos aldeídos isoxazolínicos 79. 60
Esquema 14 – Síntese das semicarbazonas e tiossemicarbazonas do 2-biciclo
isoxazolínico pirrolidínico 80. 61
Esquema 15 – Síntese das hidrazidas isoxazolínicas a partir de ésteres isoxazolínico
piperidínico 65. 67
Esquema 16 – Ataque da hidrazina na função amida em N7. 68
Esquema 17 – Degradação do núcleo isoxazolínico piperidínico 94 68
Esquema 18 – Síntese das hidrazidas isoxazolínicas 81. 69
Esquema 19 – Síntese das hidrazonas isoxazolínicas 82. 72
LISTA DE TABELAS
Página
Tabela 01 – Substituintes e rendimentos dos alcoóis isoxazolínicos
piperidínicos. 49
Tabela 02 – Substituintes e rendimentos dos aldeídos isoxazolínicos
piperidínicos 51
Tabela 03 – Substituintes e rendimentos das isoxazolil-semicarbazonas e
isoxazolil-tiossemicarbazonas piperidínicas 53
Tabela 04 – Substituintes e rendimentos dos alcoóis isoxazolínicos
pirrolidínicos. 59
Tabela 05: Substituintes e rendimentos dos aldeídos isoxazolínicos
pirrolidínicos. 60
Tabelas 06 – Substituintes e rendimentos das isoxazolil-semicarbazonas e
tiossemicarbazonas pirrolidínicas. 61
Tabelas 07 – Substituintes e rendimentos das hidrazidas isoxazolínicas. 69
Tabelas 08 – Substituintes e rendimentos das isoxazolil-nitrofurufuril-
hidrazonas. 72
Tabela 09 – Valores de Citotoxicidade e IC50 sobre a forma epimastigota do
T. cruzi das semicarcarbazonas e tiosemicarbazonas isoxazolínicas 140
Tabela 10 – Valores de Citotoxicidade e IC50 sobre a forma epimastigota do
T. cruzi das Nitrofurfuril-hidrazonas-isxazolínicas. 142
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
AIDS ou SIDA – Acquired Imunodefiency Syndrome (Síndrome da Imunodeficiência
Adquirida).
AZT – Zidovudina
BHI – Brain Heart Infusion (Infusão de Coração e de Cérebro).
BZD – Benznidazol
CEFNO – Óxido de Carboetoxiformonitrila
CEUA – Comissão de Ética no Uso de Animais
DIBAL-H – Hidreto de diisobutilalumínio
DNA ou ADN – Ácido Desorribonucléico
FIOCRUZ – Fundação do Instituto Oswaldo Cruz
GABA – Ácido Gama-Aminobutírico
HRMS – High Resoltion Mass Spectrometry (Espectrometria de Massas de Alta Resolução).
IC50 – Half Inhibitory Concentration (Concentração Inibitória de 50%).
IMP-1 – Imipinemase-1.
IT/TOF – Ion Trap/Time of Flight (Tempo de voo).
IV-FT – Infravermelhor/Transformada de Fourier.
LCMS – Liquid Cromagrafy Mass Spectrometry (Cromatografia Liquida/Espectrometria de
Massas).
NB2 – Nível de Biosegurança 2.
Nfx – Nifurtimox.
PO – Proliloligopeptidase
QSAR – Struture Activity Relationship Quantitative (Relação Quantitativa Estrutura
Atividade).
Rf – Retation facture (Fator de Retenção).
RMN – Ressonância Magnética Nuclear
RNA ou ARN– Ácido Ribonucléico
RPMI – Instituto Roswell Park Memorial
SAR – Struture Activity Relationship (Relação Estrutura Atividade)
SFB – Soro Fetal Bovino
Tc I e II – Triapnossoma cruzi I ou II
TDR – Tropical Disease Research (Pesquisa de Doenças Tropicais).
TEA – Trietilamina
THF – Tetraidrofurano
TNF – Tumoral Necrouse Factor (Fator de Necrose Tumoral)
TR – Tripanotiona Redutase.
UFC – Unidade Formadora de Colônia.
UFPDA – Universidade federal de Pernambuco/ Departamento de Antibióticos.
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Introdução
Introdução
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Introdução Página 19
1. INTRODUÇÃO:
A descoberta da penicilina foi um marco histórico na química medicinal [01]
. Desde
então, tem se obtido, comercializado e utilizado uma variedade de classes de antimicrobianos,
além dos betalactâmicos [01, 03]
, e tais sucessos fizeram com que a humanidade pudesse
acreditar que as enfermdiades produzidas por microrganimos desapareceriam [01]
.
No entanto, após a revolução causada por esta descoberta, outro problema surgiu, a
capacidade de adaptação dos microrganismos em sobreviver ao ataque destas drogas [02, 04]
. A
partir de então se tornou urgente a necessidade de descobrir não só drogas mais seguras, mas
que também fossem capazes de superar os mecanismos de resistências antimicrobianos [05]
.
As pesquisas sobre esse assunto não são recentes como se pode perceber no estudo
publicado por Demerec em 1948 [06]
, onde ele avaliou a capacidade de resistência da E. coli e
S. aureus, sobre a penicilina e estreptomicina [06]
.
A resistência a antimicrobianos não é uma característica particular de bactérias [02]
. Há
também relatos de resistência desencadeados por outros parasitas como os protozoários [23]
,
um dos maiores exemplos encontrados na literarura são de cepas de Trypanossoma cruzi que
suportam o ataque de quimioterápicos de escolha para o tratamento da tripanossomíase
americana [08, 23, 71]
.
O T. cruzi (família Trypanosomatidae da ordem Trypanosomatida) [87, 96, 99, 101, 102]
é
um protozoário hemoflagelado de grande letalidade [12, 14]
, transmitido normalmente por
insetos-vetor da subfamília dos Triatomíneos [09, 13, 14, 83, 101]
. O ciclo biológico do protista é
bastante complexo, caracterizado por uma etapa em um hospedeiro vertebrado e a outra em
um hospedeiro invertebrado, apresentando-se em três formas diferentes [87, 96, 98, 99, 101]
.
No homem, a infecção se dá de forma aguda (normalmente em crianças) com duração
de dois meses, seguida, por uma fase indeterminada (nem sempre pode ser caracterizada),
chegando à fase crônica que perdura por toda a vida do indivíduo (apresentado lesões no
miocárdio, esôfago e vísceras) [16, 86, 87, 88, 90, 96, 99, 101]
.
Descrito pela primeira vez em 1909 por Carlos Chagas [20, 101]
, esta zoonose é
endêmica na América Latina [14, 96, 99]
e mata mais de 14000 pessoas anualmente, atingindo
cerca de 8-10 milhões de indivíduos, deixando mais 60 milhões com risco de contaminação
[16,20]. Além disso, 25 a 35% dos casos desencadeiam comprometimento cardíaco
[17, 86],
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Introdução Página 20
desenvolvendo incapacidades e aposentadoria precoce, provocando um grande impacto sócio-
econômico e cultural nos países atingidos [14, 17]
.
No início da década de XC, a América Latina possuía 16-18 milhões de pessoas
contaminadas e cerca 100 milhões em áreas de risco, e com o crescimento de 300 mil novos
casos por ano [19]
. Estudos estão sendo revisados e demonstram uma redução para cerca de 11
milhões de doentes, atualmente [19]
. A maioria deste sucesso é decorrente das iniciativas
regionais de controle de transmissão vetorial e tratamento de bancos de doação de sangue,
além dos casos por via congênita [19]
.
Houve um acordo, em 1991, entre os governantes de países do Cone-sul, Argentina,
Brasil, Chile, Paraguai, Uruguai, e depois o Peru; para erradicação do meio de transmissão
vetorial [19]
. Uruguai (1997) e Chile (1999) conseguiram controlar a trasnmissão vetorial do T.
cruzi, da mesma forma seis estados brasileiros já conseguiram o mesmo sucesso, Rio de
Janeiro, São Paulo, Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Goiás e Paraíba e Minas Gerais [19]
. O
Brasil gasta cerca de um bilhão de dólares para o tratamento da doença anualmente [20]
.
Na contramão dessas informações está o crescimento de casos de infecção por T. cruzi
fora do Cone-sul americano, como Canadá, Europa, Japão e Austrália [16, 31, 32]
. Apesar de
serem raros os relatos de contaminação vetorial, fica claro o risco de uma doença até então
considerada de pessoas pobres, exclusiva de áreas rurais de países latino-americanos, tornar-
se um problema de saúde mundial [16, 31, 32]
. Nestas áreas, é crescente o número de casos de
contaminação por outros meios como transfusão sanguínea, transplante de órgãos e de forma
congênita vertical, mesmo que a quase totalidade das amostras contaminadas tenham partido
de imigrantes oriundos das áreas endêmicas das Américas. [16, 31, 32]
.
A fim de desenvolver uma droga eficaz para o tratamento etiológico da Doença de
Chagas, foi analisado um número grande e variado de diferentes combinações, com uma série
de drogas, obtendo-se resultados, freqüentemente, desanimadores [08, 13, 92, 97, 98]
. No entanto, o
tratamento etiológico atual está baseado na administração de Nifurtimox (3-metil-N-[(5-nitro-
2-furfuril) metileno]-4-tiomorfolinoamina-1,1-dioxido) 1; e Benznidazol (2-nitro-N-
(fenilmetil)-1H-imidazol-1-acetamida) 2; que são nitroderivados com ação tripanossomicida
[08] descobertos empiricamente
[13, 22, 23]. Apesar da sua relativa eficácia para tratamento da
fase crônica da doença [08, 13, 23, 24, 71]
, tendo atividade significativa apenas na fase aguda [08, 23,
24, 71], com até 80% de cura parasitológica dos pacientes são as únicas substâncias com
aplicabilidade clínica comprovada [08, 13, 23, 71]
.
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Introdução Página 21
O Nifurtimox (Lampit®) 1, produzido em El Salvador pela Bayer, e o Benznidazol 2
(Radanil®), produzido pela Roche, inibem a síntese de DNA, RNA e das proteínas, e também
aceleram a degradação dessas macromoléculas [25]
. Os danos causados nessas moléculas são
desencadeados pelo Nifurtimox e/ou seus produtos metabólicos citotóxicos, dentre eles: os
radicais livres do oxigênio gerando assim um nitroderivado [25, 26]
. O nitrofurano, em presença
de um sistema redutor forma a hidroxiamina correspondente [25, 26]
. Por último, uma redução
similar leva a produção do derivado amino [25, 26]
. Reações similares ocorrem com os
nitroimidazois que é representado pelo Benznidazol [25, 26]
.
O
N N SO2
O2N1
NN
O2N
N
O
H
2
Os nitros e hidroxilamino derivados dos nitrofuranos o nitroimidazóis são conhecidos
por sua toxicidade [08, 13, 22, 23, 26]
, e essas reações podem ocorrer tanto no T. cruzi como no
hospedeiro, porém, o T. cruzi é um organismo deficiente em enzimas antioxidantes, por
exemplo, catalases e superóxidos, o que não ocorre com o hospedeiro [08, 13, 22, 23, 26]
. Esta
diferença determina um maior efeito dos fármacos no parasito [08, 13, 23, 26]
. Os produtos da
redução dos nitroimidazóis, tanto o radical nitroanión como os derivados nitroso e
hidroxilamina, podem reagir com o DNA formando adutos que facilitam a ruptura das cadeias
nucleotídicas [08, 13, 23, 25, 26]
. Esses efeitos se somam aos do superóxido e do radical hidroxila
[08, 13, 22, 23, 25, 26].
A produção de efeitos adversos e a existência de cepas de T. cruzi resistentes ao
Nifurtimox e o Benznidazol impõem a necessidade de desenvolver novos fármacos que os
substituam [08, 13, 17, 23, 71]
, tornando-se assim um campo aberto de investigação [13, 17, 23, 26, 71]
.
Uma das alternativas bastante relatadas na literatura para se conseguir novas
substâncias com atividade antimicrobiana e antichagásica é a síntese de compostos contendo o
grupo nitrofurano 3 [15, 22, 26]
, que pode oferecer a habilidade de produzir radicais livres a
molécula, capazes de induzir a cascata de materiais reduzidos, tóxicos aos parasitas [08, 22, 26]
.
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Introdução Página 22
Este tem sido o mecanismo proposto para os nitrocompostos, podendo ser usado também
como antibiótico e antineoplásico [08, 22, 26]
.
OR
O2N
3
H NN N
R H
X
R'
H
4
Outra alternativa bastante utilizada por diversos grupos de pesquisas espalhados pelo
mundo são as semicarbazonas (X= O) 4a e tiossemicarbazonas (X= S) 4b que com sua
flexibilidade e habilidade para se coordenar, estando na sua forma neutra ou desprotonada [28,
29, 72], tornam-se uma classe interessante de combinações com uma gama de aplicações
farmacológicas [25]
.
Em estudos prévios realizados por De Faria [30]
, foi desenvolvido uma nova série de
heterobiciclos piperidínicos 5 ou pirrolidínicos 6 conjugados a 2-isoxazolina, onde derivados
amidas e hidrazonas em C3, desses heterociclos, desenvolvidos por hibridização molecular
(conjugação de características estruturais definidas de dois compostos bioativos distintos [112]
)
apresentaram-se biologicamente ativos [30]
.
2-isoxazolina[5,4-b]piperidina 2-isoxazolina[5,4-b]pirrolidina
N
N
O56
3a
6a
43
1
2
1
2
N
N
O
35
6 7a
4
7
3a
5 6
Portanto, a proposta deste estudo é sintetizar novas semicarbazonas,
tiossemicarbazonas e nitrofurfuril-hidrazonas condensados aos heterobiciclos 5 e 6, visando
uma posterior investigação biológica, quanto à atividade antimicrobiana e antiparasitária,
especialmente anti-chágasica, e desta forma, desenvolver uma possível ampliação da ação
farmacológica dos heterobiciclos isoxazolínicos.
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Revisão Bibliográfica
Revisão da Literatura
Isoxazolinas
Hidrazonas
Nitrofuranos
Semicarbazonas
Tiossemicarbazonas
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Revisão Bibliográfica Página 23
2. REVISÃO DA LITERATURA:
2.1 – ISOXAZOLINAS:
Dentre as inúmeras variedades de compostos que demonstra alguma atividade
biológica, uma grande parte é constituída de heterociclos, sendo estes obtidos naturalmente ou
por via sintética [33, 34]
.
A literatura relata que muitos desses heterociclos bioativos possuem átomos de
nitrogênio e oxigênio em seus núcleos [33, 35]
, com destaque para as 2-isoxazolinas 8a [35]
, que
são obtidas comumente por cicloadição 1,3-dipolar [35]
, e apresentam diversas ações
biológicas, tais como: antiparasitário [36]
, antineoplásico [37]
, e anti-inflamatória [38]
.
8
O
N
O
N
O
N
10911
O
N
72-Isoxazolina 3-Isoxazolina 4-Isoxazolina
O
N
1
2
34
5
1
2
34
5
34
5
1
2
34
5
1
2
34
5
1
2
Figura 1: Isoxazóis, isoxazolinas e isoxazolidinas.
2.1.1 – ATIVIDADE BIOLÓGICA E APLICAÇÃO TERAPÊRUTICA
A literatura relata a produção de derivados de 2-isoxazolinas 8 com atuação biológica
tanto intracelularmente, com modificações estruturais no DNA e em enzimas de
microrganismos patógenos [39]
, quanto sistêmica, como ação sobre o Sistema Nervoso Central
[52]. Adiante, serão listados alguns dos trabalhos relatados na literatura, ilustrando a grande
importância químico-biológica das mesmas.
Através de uma cicloadição 1,3-dipolar entre óxidos de nitrilas e álcool alílico acilado,
foi desenvolvida a 2-isoxazolina 12, contendo o bromo como grupo de saída, na posição C3.
O produto desta cicloadição deu origem, depois da retirada do bromo e substituição com
nucleotídeos, a análogos de dideoxinucleotídeos 13, com B igual à timina, uracila ou adenina
e R igual à OH e OCOPh [35]
.
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Revisão Bibliográfica Página 24
NO
Br OCOPh
12
NO
B R
13
Outros nucleotídeos ligados a isoxazolinas, também na posição C3, foram produzidos
por uma cicloadição 1,3-dipolar entre óxidos de nitrila nucleosídicos e cetenos fosforilados,
formando os compostos 14, 15 e 16 [40]
.
ON
OCOPh
R1
O
R2
O
14
N
N
ON
OCOPh
H
O
H
O
15
N
N
ON
OCOPh
OCH3
CH3O 16
Buscando compostos com ação antiviral, derivados 2-isoxazolínicos fosforilados
conjugados a nucleosídeos foram sintetizados por Romeo e col. [41]
. As substâncias 17 e 18
foram desenvolvidas por uma reação de cicloadição 1,3-dipolar; onde “B” poderia ser timina,
citosina e 5-fluorouracil, e quando avaliados quanto a sua atividade inibitória antirretroviral e
sua ação contra o herpes vírus simples apresentaram baixa citotoxicidade e atividade
antirretroviral comparáveis ao AZT [41]
.
N O
BP
O
EtO
EtO
17
B
N O
P
O
EtO
EtO
18
Também contendo os ciclos 2-isoxazolinas, foi desenvolvido um conjunto de
derivados retinóicos 19 e 20 [37]
. Alguns destes, contendo um grande potencial para promover
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Revisão Bibliográfica Página 25
apoptose, morte celular programada, de células neoplásicas. Abaixo dois dos exemplares
sintetizados [37]
.
O
N
CO2CH3
19
N
O
CO2CH3
20
Em um intrigante trabalho realizado por Bal e col. [36]
pôde-se desenvolver inibidores
de Proliloligopeptidase (PO) a partir de polímeros de isoxazolinas 21. PO é uma enzima que
hidrolisa o colágeno e pode estar envolvida na invasão do T. cruzi nas células dos mamíferos
degradando os componentes da matriz extracelular. Estes compostos poderiam prevenir a
invasão do parasita em células dos mamíferos, pois o T. cruzi é mais sensível a inibidores da
PO, e desta forma, conseguindo ação antitripanossomídica com alguns prolilisoxazóis [36]
.
NN
O
NR
R2
O
O
R3 21
O advento da epidemia de AIDS vem contribuindo para o desenvolvimento de outro
grave problema, a tuberculose [113]
. Por isso, a busca de novas drogas anti-tuberculóticas é
algo de grande valor para medicina [42]
. Com este objetivo, foi desenvolvida uma série de
derivados 2-isoxazolínicos 22, que com modificações na região C3 do anel isoxazolínico e no
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Revisão Bibliográfica Página 26
anel C permitiu a produção de inúmeros compostos que apresentaram ótimo desempenho com
relação à ação bactericida [42]
.
N O
O
O
NN
A
B
C
22
Continuando a busca por novos agentes antituberculóticos foram elaborados derivados
nitrofuranos contendo anéis isoxazolínicos 23 e 24 [39]
. Todos os compostos apresentaram
excelente atividade em testes in vitro [39]
.
N N
ON
O
O2N
R
23
N
ON
O
O2N 24
Outras pesquisas com um número maior de microrganismos foram realizadas. Uma
delas alcançou a síntese e avaliação antibacteriana de isoxazolinil oxazolidinonas 25, o qual
comprovou que a mistura racêmica da isoxazolil 25 exibe uma atividade in vitro superior ao
Eparozolide em várias espécies de bactérias resistentes. Os compostos que apresentavam
substituição em p-Cl, m-Cl e m-NO2, m-OMe apresentam atividade contra Gram-negativos,
Klebsiella pneumoniae, sendo o p-Cl o de maior atividade [43]
.
NO
NN
O
O
N
R
O
NHCOCH3
F25
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Revisão Bibliográfica Página 27
Eparazolide
NO
NN
O
O
NHCOCH3
F
HO
Também na busca de novas agentes antimicrobianos foram sintetizados uma série de
compostos contendo o anel isoxazolina 26 [44]
. O estudo foi realizado sobre os
microrganismos Staphylococcus aureus, Engerococcus faecalis, Engerococcus faecium,
Escherichia coli, onde os compostos testados apresentaram desempenho semelhante ao
linezolide [44]
.
ON
NO
O
R
NHAc
F 26
O N NO
F
O
NHAc
Linezolide
Em outro estudo, introduziu-se os ciclos de isoxazolinas, isoxazolidinas, e isoxazóis
por reação de cicloadição 1,3-dipolar em derivados carbapenemos 27 [45]
. Onde muitos
compostos apresentaram uma ótima atividade contra uma gama de organismos Gram-
positivos e Gram-negativos comparáveis ao meropenem [45]
.
NS
NHOH
H
OCO2H
N
O
HO
27
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Revisão Bibliográfica Página 28
Foi relatado recentemente que substâncias esteróidais, contendo o núcleo 2-
isoxazolina em sua estrutura, apresentaram excelente atividade anti-inflamatória e alta
afinidade com os glico-receptores. Os fármacos 28 e 29 apresentaram-se 5 e 5,3 vezes
respectivamente mais potente que a prednisolona, um corticosteróide usado na terapêutica [38]
.
28 29
O
O
EtO
O
ON
F
O
O
OH
EtO
O
ON
F
2.2 – HIDRAZONAS:
2.2.1 – ATIVIDADE BIOLÓGICA E APLICAÇÃO TERAPÊRUTICA
As Hidrazonas são uma das funcionalidades de maior potencial biológico e se têm
vários registros de suas propriedades farmacológicas na literatura, como anti-inflamatória,
anticonvulsivante, antitumoral, antichagásica e especialmente antimicrobiana [46]
.
Nas últimas décadas é crescente a prevalência de microrganismos resistentes a várias
drogas reconhecidas de escolha no combate a infecções microbianas [02]
. Na busca de
compostos capazes de solucionar este grave problema de saúde, derivados hidrazonas têm
sido uma importante ferramenta [47]
.
Em um trabalho que objetivava encontrar uma nova alternativa para superar a
resistência bacteriana a antibióticos β-lactâmicos, tentou-se a síntese de Inibidores da metallo-
β-lactamase IMP-1 [47]
. Estudos de modelagem molecular da enzima IMP-1 delinearam a
formação de derivados de N-arilsufonil-hidrazonas 30, 31 e 32 como uma classe importante
de inibidores da metallo-β-lactamase [47]
.
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Revisão Bibliográfica Página 29
NH
NSH
OH
O
R
O
30
NH
NSH
OCH3
O
R
O
31
NH
NSH
O
R
O
32
Um trabalho, onde se buscou avaliação da atividade antichagásica de uma série de
derivados acil-hidrazonas aromáticas p-substituídas 33, demonstrou que a presença do NO2,
na posição para, é de grande valor, pois foi um dos compostos de maior atividade dentre os
sintetizados, sendo mais potente que a droga de escolha para o estudo in vitro antichagásico,
cristal de violeta [109]
.
E a presença da carbohidrazida é considerada importante devido ao melhoramento da
lipossolubilidade oferecida ao produto heterocíclico intermediário, sendo comprovado por
estudos de modelagem molecular e SAR/QSAR [109]
.
N
NN
O
X
H
N
Y
X=HY=NO2
33
Com este mesmo objetivo foi realizada a síntese da hidrazida a partir do éster e depois
condensado com aldeído aromático formando uma acil-hidrazona 34 [49]
. Foram sintetizados
uma série de compostos 1H-pirazolo[3,4-b]piridina, onde alguns mostram atividade anti-
chagásica, comparados ao cristal de violeta, onde o composto que possuía X= H e Y=OH foi
o mais ativo da série [49]
.
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Revisão Bibliográfica Página 30
A
B
N
N
NO
H
NH3C
X
Y
C
34
Foi elaborada a síntese de novos Cl-DMSO-Ru-(II) complexos das hidrazonas 35 e 36,
com ligações entre o Rutênio e o ligante, localizadas no nitrogênio insaturado e na carbonila,
em busca de novos agentes antineoplásicos, onde os complexos apresentaram capacidade de
se ligar ao DNA [50]
. Neste trabalho, ligantes e complexos foram conduzidos a testes contra
cepas de Staphylococcus epidermidis; Shigella sonnei, E. coli, S. aureus, K. pneumoniae, e
revelaram ter grande potencial antimicrobiano [50]
.
X
N
R
N
O
H
X= S, O.R= H, CH3.
35
N
R
N
O
N
H
36
Outro grupo de hidrazonas foi utilizado como ligantes de complexos dos metais níquel
(II), cobre (II) e zinco (II) [51]
. Os ligantes e seus respectivos complexos (Cu e Ni) foram
direcionados a testes antineoplásicos e demonstraram inibição sobre células leucêmicas
humanas [51]
. Além disso, o ligante 37a e os complexos de cobre e zinco 37b apresentaram
inibição da síntese de DNA [51]
.
N
N N
N
H
O
R
O
a= H b= CH3
R
37
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Revisão Bibliográfica Página 31
De Almeida [52]
desenvolveu derivados de hidrazonas contendo o biciclo isoxazolínico
pirrolidínico 38a-b. As duas séries sintetizadas foram levadas a testes biológicos que
revelaram em ambas as séries uma grande capacidade antinocicepitiva e baixa toxicidade
aguda [52]
.
N
N
O
NO
N
O
R1
HH
O
N
N
O
NO
N
O
R1
HH
R2
38a 38b
2.3 – NITROFURANOS:
2.3.1 – ATIVIDADE BIOLÓGICA E APLICAÇÃO TERAPÊUTICA
Desde a descoberta da Doença de Chagas, há cem anos [20]
, ainda não se encontrou
uma vacina ou tratamento etiológico específico disponível para amplas intervenções de saúde
pública [13, 23]
, estando este baseado apenas a duas drogas com aplicabilidade clínica
comprovada [08]
, o “Nifurtimox” (1965) 1; e o “Benznidazol” (1971) 2. Estas são derivados
nitrofuranos com ação tripanossomicida relativa [08]
, e com efeitos colaterais tóxicos [08, 22, 23,
26]. Além disso, eles apresentam baixa eficácia para tratamento da fase crônica da doença
[08,
22, 23, 26], tendo atividade apenas na fase aguda, com até 80% de cura parasitológica dos
pacientes [13]
.
Dentre as muitas pesquisas direcionadas ao desenvolvimento de um medicamento que
combata efetivamento o parasita, deve-se ressaltar um interesse peculiar na produção de
novos derivados de nitrofuranos 3, os quais desencadeiam a formação de uma série
subprodutos tóxicos aos parasitas [22, 54]
, que são os responsáveis pelo estresse oxidativo a que
são submetidos os microrganismos e desta forma, originando diferentes mecanismos de ação,
como: (a) ação direta do radical nitroânion em macromoléculas, como DNA; (b) geração de
oxiradicais que é o agente tóxico principal no caso de nifurtimox (derivado 5-nitrofurfural)
[54]; (c) produção de derivado nitroso de hidroxilamina, que possuem uma citotoxicidade bem
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Revisão Bibliográfica Página 32
alta; e (d) inibição direta de Tripanotiona Redutase (TR), um sistema de enzimas
antioxidantes contra radicais livres, peróxides e peróxido de hidrogênio do T. cruzi [22, 54]
.
Dentro desta linha de pesquisa se pode destacar alguns trabalhos de estudo de docking,
como por exemplo, os derivados de nitrila do 5-nitro-arilidenemalononitrilas 39 [26]
, e de
semicarbazonas 5-nitrofurano 40 [54]
, demonstrando que o grupo nitrofurano agiria como
grupo-puxador e assim poderia se ligar ao sítio ativo de centro dissufeto da Tripanotiona
Redutase [10, 22, 26, 54]
. Relatando-se, deste modo, propriedades antichagásicas tão eficazes
quantos às drogas de referência [26, 54]
.
H
CNR
NO2
39
OO2N
N N
N
RO
H
H
40
Além desses, temos outros trabalhos buscando estudos de QSAR, em síntese dos
nitrocompostos, visando à atividade anti-chágasica [10, 22, 54]
. No primeiro, derivados de N-
óxido de benzo [1,2-c]1, 2,5-oxadiazol (benzofuroxano) 41 exibiram uma boa atividade, in
vitro [22]
, em relação ao nifurtimox (Nfx). E revelaram a importante presença do grupamento
Nitro e N-óxido, ao lado do benzil, contribuindo para interação π com grupo eletropositivo do
possível receptor [22]
.
No segundo, derivados semicarbazônicos e tiossemicarbazônicos do 5-nitro-2-
furaldeído (Nitrofurazonas) 42 também mostraram uma interessante atividade, in vitro, contra
a forma epimastigota do T. cruzi [10]
, revelando dados interessantes sobre a importante
presença do anel furano [10]
, onde o nitrofurano agiria na redução do dissufeto da Tripanotiona
Redutase [10]
.
N
O
N
O2N
O
41Benzofurazono X= S, O
XN
N N
N
R2O
R1
O
O
H
42
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Revisão Bibliográfica Página 33
Outro método de obtenção de moléculas bioativas é o de modificação molecular que
tem sido um dos mais promissores meios de se encontrar novas drogas [55]
. Com este objetivo
foi sintetizada a hidroximetilnitrofurazona 44 a partir do 5-nitro-2-
furfurilidenessemicarbazona 43, que é considerado um agente antimicrobiano contra bactérias
Gram-positivas e usada apenas em infecções tópicas. Assim a hidroximetilssemicarbazona 44,
em menor concentração, apresentou ótima atividade contra tripomastigotas e amastigotas,
comparado ao benznidazol e ao nifurtimox, além de uma menor toxicidade [55]
.
OO2N
NN
H
NH2
O
43
OO2N
NN
H
N
O
OH
H44
Outro trabalho que tentava alcançar novas drogas com atividade antimicrobiana foi o
realizado por Hurdle e col. [56]
. Onde foi sintetizado um grupo substâncias contendo o
farmacóforo nitrofurano 45 e 46, sendo altamente ativos contra as cepas de Mycobaterium
tuberculosis multiresistentes, comparáveis a rifampicina, e superiores a isoniazida e etambutol
[56]. Abaixo exemplares destes nitrofuranos.
O
ON
N N
O2N
45
O
ON
N N
O2N
O
O
46
Além dos trabalhos anteriormente citados, outros estudos onde derivados
isoxazolínicos contendo o heterociclo nitrofurano foram produzidos e apresentam boa
atividade, como por exemplo, os compostos 23 e 24 capazes de combater M. tuberculosis [39]
,
e as semicarbazonas 50 desenvolvidas por Otero e col. [09]
demonstraram ser ativos contra o T.
cruzi, em relação às drogas de escolha [09]
.
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Revisão Bibliográfica Página 34
2.4 – SEMICARBAZONAS E TIOSSEMICARBAZONAS:
2.4.1 – ATIVIDADE BIOLÓGICA E APLICAÇÃO TERAPÊRUTICA
As semicarbazonas 4a e tiossemicarbazonas 4b heterocíclicas são um grande alvo de
interesse de vários grupos de pesquisa espalhados pelo mundo [72, 76]
, pois possuem uma
grande versatilidade como ligante de metais devido à presença de vários átomos doadores de
elétrons [28, 72, 76]
. Sua atividade biológica pode ser por três tipos de mecanismos: (i) inibição
da enzima redutase ribonucleotídea fosfatase (essencial para síntese de DNA), (ii) criação de
lesões em DNA por extresse oxidativa, (iii) e liganções a bases nitrogenadas de DNA e RNA
bloqueando ou impedindo a replicação das bases [28, 72, 76]
.
Não é recente o interesse pelas propriedades farmacológicas das tio/semicarbazonas 4.
Isto pode ser comprovado por um trabalho realizado em 1949, por Hoggarth e col. [21]
,
almejando conseguir compostos contra M. tuberculosis [21]
. Um ano depois, outra pesquisa
publicada por Hanre e col. [57]
visava à formação de derivados de tiossemicarbazonas testando
a mesma atividade antimicrobiana [57]
.
Neste período, outros dois grupos de pesquisa, o primeiro coordenado por Lum &
Smith [58]
buscou atividade contra o vírus da Influenza [58]
, e o segundo liderado por Bauer e
col. [59]
, objetivando combater o vírus da Varíola [59]
, conseguiram desenvolver cada grupo,
conjuntos de compostos contendo o farmacóforo tiossemicarbazona [58, 59]
. Abaixo, exemplo
de um dos derivados tiossemicarbazonas 47 [59]
.
N
O
H
NN
CSNR2́ ´
R
R´ 47
Além desses, outro trabalho, realizado em 1960, por Benns e col. [60]
, já explorara a
capacidade quelante das tiossemicarbazonas. Neste, foram sintetizados inúmeros complexos
de cobre de tiossemicarbazonas alifáticas e aromáticas, dos quais se tentaram uma atividade
fungicida [60]
.
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Revisão Bibliográfica Página 35
Atualmente, as peculiaridades destes grupamentos farmacofóricos continuam sendo
bastante explorados. Como por exemplo, os complexos dos metais cobalto II, níquel II e cobre
II, onde a síntese do ligante se dá entre tiofeno-3-carboxaldeído e tiossemicarbazida 48, em
proporção de 1:1, em etanol absoluto em pH levemente ácido [29]
.
S
N NH
NH2
S
48
Em outro trabalho, que se propunha formar complexos de níquel (II), cobre (II) e
cádmio (II), usando como ligante a tiossemicarbazona 49, pode-se comprovar a versatilidade
e a ação quelante das tiossemicarbazonas perante aos metais de transição [61]
, onde nas
posições do enxofre e do átomo de nitrogênio da hidrazida [29]
podem-se coordenar aos metais
como moléculas neutras ou, depois de desprotonar, como ligantes aniônicos [28]
.
O
N N
NH2
S
H
49
Na busca de drogas com atividade anti-T. cruzi [09]
, deve-se relatar um trabalho no qual
foram formados semicarbazonas dos derivados do N4-butil do 3-(5-nitrofuril)acroleína 50 e
seus complexos de rutênio [09]
, onde foram realizados, testes in vitro, contra T. cruzi e testes
de captação de oxigênio com os complexos de rutênio e seus respectivos ligantes [09]
. A série
de complexos 50 demonstou excelente capacidade de ligação com o DNA, e bons resultados
no estudo de liberação de oxigênio, que revelaram a participação no ciclo de geração de
redução, promovendo extresse oxidativo agudo no parasita, semelhante aos dos Nfx [09]
.
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Revisão Bibliográfica Página 36
Rn= 1 e 0 Hbutil
50
O
NN
O2N
N
O
R
HH
Ru
PPh3
ClO
Cl
n
Deve-se destacar também, outro trabalho visando à atividade contra T. cruzi com
tiossemicarbazonas e semicarbazonas, este agora, complexando com o metal cobre (II) [25]
.
Estes derivados contêm o 5-nitro-2-furaldeído 51a, o 5-nitrotiofeno-2-carboxaldeído 51b e o
5-nitrofuril 51c e provaram ser tão ativas quanto às drogas de referência, nifurtimox e
benznidazol [25]
.
O2N
N
CH3
N
NS
R2
R1
51
a (R1= H, R2= CH3)
c (R1 e R2= [CH2]4)
b (R1= CH3, R2= CH3)
Outra aplicação farmacológica destes farmacóforos que se vem encontrando
freqüentemente é na busca de novos agentes antimicrobianos.
Um exemplo é o trabalho elaborado por Chandra e col. [28]
que avaliava a atividade
antimicrobiana das tiossemicarbazonas 52 e seus complexos de zinco e mercúrio sobre as
bactérias Gram-positivas, S. aureus e S. epidermides, e Gram-negativas, E. coli e
Pseudomonas aeruginosa, além dos fungos Candida albicans e Aspergillus niger [28]
. O
estudo microbiológico mostra que o ligante 52 é mais ativo que o complexo do zinco,
enquanto no estudo micológico o complexo é o composto mais ativo. O complexo com o
mercúrio, além de um desempenho melhor sobre atividade antifúngica, uma maior atividade
antimicrobiana que o ligante [28]
.
N
NN NH2
H
S
H
52
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Revisão Bibliográfica Página 37
Bons resultados também foram encontrados em testes contra os microrganismos E.
coli, Bacillus subtilis, S. aureus, P. aeruginosa, C. albicans, Saccharomyces cerevisiae, A.
niger e Penicillum citrinum, em dois trabalhos publicados por Kasuga e col. [62, 63]
. No
primeiro, os complexos de antimônio III, usando as semicarbazonas e tiossemicarbazonas 53,
54b e 55, como ligantes [62]
.
N
NN
H
N
O
S53
N
NN
H
NH2
O X (a= O e b=S).
54
N N
S
N N
H
N
S
NN
H
N
55
No segundo estudo, sintetizaram-se complexos de zinco II, dos ligantes 53, 54a e 54b,
56, 57a e 57b [63]
.
N
NNH
S N
O
NHN
SN
O
56
57
N
NNH
X NH2
NHN
XH2N
Xa = S e Sb= O e O
Em ambos os trabalhos, tanto os ligantes quanto os complexos apresentaram-se ativos
[62, 63].
Aril-semicarbazonas têm sido bastante documentadas [65]
, e promovido avanços
crescentes no desígnio de drogas antiepiléticas e com ação bloqueadora sobre canais de sódio
voltagem-dependentes [64, 65]
. Uma nova série de tiossemicarbazonas 58 derivadas do GABA
foram sintetizadas pelo método de aproximação bioisostéricos, e a maioria destes demonstrou
melhor atividade anticonvulsivante que os seus análogos bioisostéricos, nos modelos
aplicados para o estudo de proteção aos surtos apopléticos [65]
.
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Revisão Bibliográfica Página 38
O
OH
NHNH
S
N
R2
R1
58
Além deste último, uma ação anticonvulsivante foi recentemente encontrada em várias
semicarbazonas aril-substituídas [64]
. Neste, parte do programa de design é estudar o efeito de
ciclização destas aril-semicarbazonas 59 sobre a atividade anticonvulsivante, como 1,2,4-
triazóis [64]
. O mecanismo de ação para alguns destes derivados triazóis 60 provam que vários
receptores estão envolvidos em sua atividade anticonvulsivante, e que todos os compostos
sintetizados, cilcizados ou não, são ativos na maior parte dos modelos utilizados. A 4,5-
difenil-2H-1,2,4-triazol-3(4H)-ona, com os substituintes R (NO2), R1(2-CH3) e R2 (4-CH3)
apresentou-se como o mais potente, promovendo o aumento do nível de GABA em mais de
100 vezes em relação ao controle [64]
.
NH
N
O
H N
R
R2
R1
59
N
NN
R
O
H
R2
R1
60
Em outros trabalhos anteriormente citados, pôde-se encontrar grupamentos
semicarbazônicos e tiossemicarbazônicos 4a e 4b co-atuando na atividade biológica, como
por exemplo, os derivados nitrofuranos 40, 42 e 44 que revelaram ação antichágasica [10, 54, 55]
.
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Revisão Bibliográfica
Objetivos:
Gerais
Específicos
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Objetivos Página 40
3.0 OBJETIVOS
3.1 - OBJETIVOS GERAIS
Ampliação da aplicação química e biológica dos heterociclos 2-isoxazolina aza-
bicíclico, introduzindo o grupamento nitrofurano, conhecido farmacóforo para
atividade antimicrobiana e antichagásica, através de modificação molecular
(hibridização). A introdução da funcionalidade nitrofurfurila, poderá expandir os
efeitos biológicos das acil-aril-hidrazonas, derivadas do 2-isoxazolina[5,4-
b]pirrolidina (esq. 01).
Éster da 2-isoxazolina pirrolidínica Hidrazidas Nitrofurfuril-Hidrazonas
N
N
O
O
OO
R1
N
N
O
O
NHONH2
R1
N
N
O
O
NO
R1
H
N
H
O
NO2
Esquema 01: Rota sintética das isoxazolil-nitrofurfuril-hidrazonas a partir do éster isoxazolínico.
Exploração sintética, formação dos alcoóis e aldeídos derivados dos heterociclos 2-
isoxazolina[5,4-b]piperidina e 2-isoxazolina[5,4-b]pirrolidina. E obtenção de novas
substâncias bioativas semicarbazônicas (X= O) e tiosemicarbazônicas (X= S),
derivadas de ambos os biciclos, avaliando o seu potencial biológico antichagásico e
antimicrobiano. (esq. 02).
N
N
O
O
OO
R1
n
n = 1 ou n=2n
N
N
O
O
N
R1
N N
X
H
H H
N
N
O
O
OH
R1
n
2-isoxazolina pirrolidínica n = 12-isoxazolina piperidínica n = 2
Alcooóis
X= S e O.
N
N
O
O
H
R1
O
n
Aldeídos
Esquema 02: Rota sintética das isoxazolil-semicarbazonasma e tiosemicarbazonas a partir do éster
isoxazolínico.
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Objetivos Página 41
3.2 - OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Sintetizar hidrazidas e acil-nitrofurufuril-hidrazonas derivadas de N-benzoil-2-
isoxazolina[5,4-b]pirrolidina;
Redução da função éster em C3 da isoxazolina 65 e 77, ao respectivo aldeído
isoxazolínico das isoxazolina[5,4-b]piperidina e N-benzoil-2-isoxazolina[5,4-
b]pirrolidina.
Condensação dos aldeídos isoxazolínicos 67 e 79 com semicarbazidas e
tiosemicarbazidas aromáticas, para produção das respectivas isoxazolil-aril-
semicarbazonas e tiosemicarbazonas de ambos os biciclos isoxazolínicos.
Avaliação preliminar da atividade antimicrobiana e antichagásica das isoxazolil-aril-
semicarbazonas e tiosemicarbazonas e nitrofurfuril-hidrazonas isoxazolínicas
sintetizadas.
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Químico
Estudo Químico
Rota Sintética
Resultados e Discussão
Procedimento Experimental
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Químico Página 42
4. ROTA SINTÉTICA:
Em trabalhos anteriores, foi desenvolvido uma nova metodologia sintética [30]
, baseada
nas reações de cicloadição 1,3-dipolar de enecarbamatos (R= OEt, OBn) 74 e enamidas
endocíclicas (R= Arila) 64 de 5 e de 6 membros, n = 1 ou 2, respectivamente, com N-óxidos
de nitrila 83 (esq. 03) [30]
.
+
N
O R
N
O
COOEt
n
N
O R
n
n = 1 ou 2
enecarbamatos e enamidas endocíclicas
83
cicloadutos84
COOEt
C
N
OH
Cl
COOEt
C
N
O
ET3N
Esquema 03: Cicloadiçao [3+2] entre o 2-pirrolilan ou 2-piperidina e o precursor do CEFNO.
Os cicloadutos obtidos, contendo os novos heterobiciclos: 2-isoxazolina[5,4-
b]piperidina 5 e 2-isoxazolina[5,4-b]pirrolidina 6 foram aplicados na obtenção de derivados
potencialmente bioativos [66, 67]
.
Dentre os vários derivados do novo heterociclo, aqueles substituídos com grupamentos
benzoíla no nitrogênio N6 e N7, e aril-hidrazonas e carboxamida na posição C3, dos
respectivos núcleos 70 e 85, apresentaram excelentes atividades biológicas, como:
antinociceptiva (teste de nocicepção induzida por ácido acético) [07, 11, 68]
e anti-inflamatória
(teste de peritonite por carragenina em camundongos) [27, 66]
.
N
O
N
O
H
H
NHN
H
R1
R2
70
R2 = F, OMe, Cl
R1 = F e Cl
56
3a
6a
43
1
2
R=p-F, m-NO2, p-NO2,
p-OMe, p-tBu
N
O
N
O
NH2
O
H
H
R
85
5
6
3a
7a
43
12
7
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Químico Página 43
Diante dos bons resultados obtidos em trabalhos anteriores que visavam à modificação
molecular por hibridização dos aza-biciclos e posterior avaliação biológica [52, 68]
, pretende-se
ampliar a aplicação sintética e farmacológica dos híbridos isoxazolínicos.
Estudo Químico:
Abordagem I: Obtenção das Semicarbazonas e Tiossemicarbazonas dos heterociclos
2-isoxazolina [5,4-b]piperidina e 2-isoxazolina[5,4-b]pirrolidina.
Como já foram comentados anteriormente, os inúmeros relatos de semicarbazonas e
tiossemicarbazonas 4 com uma grande variedade de ações biológicas [10, 28, 64]
induziu a busca
por derivados desses grupamentos farmacofóricos que contenham os núcleos isoxazolínicos 5
e 6. Este novo grupo de moléculas poderia oferecer mais uma característica farmacológica aos
novos núcleos isoxazolínicos, mais especificamente antimicrobiana e antiparasitária, tendo
como alvo principal o T. cruzi, pois vários são os relatos na literatura de semicarbazonas e
tiossemicarbazonas desenvolvidas com este objetivo [10]
.
I II
Etapa 4
X=S e O.
N N
N
n
n
n
N
O
N
O
H
H
OH
R1
n
N
O
N
O
O
H
H
H
R1
n
Etapa 5
N
H
n
Etapa 1 N
O
R1
n
N
O
N
O
CO2Et
R1
n
n
N
O
N
O
H
H
NHN
H
R1
N
X
H
Etapa 6
n=2, R1= F e OMe.
n=1, R1 = F, NO2e Cl.
Etapa 2
III
IVVVIVII
n=1 e 2
Etapa 7
Etapa 3
N
n
63
Esquema 04 – Rota sintética utilizada neste trabalho para obtenção das semicarbazonas e tiossemicarbazonas
derivadas dos heterociclos 2-isoxazolina[5,4-b]pirrolidina e 2-isoxazolina[5,4-b]piperidina.
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Químico Página 44
Para se alcançar a produção dos semicarbazonas e tiossemicarbazonas VII, foram
utilizados cicloadutos isoxazolinicos 5 e 6, desenvolvidos por De Faria e col. [30]
.
O esquema 04 mostra a seqüência de reações envolvidas em uma das etapas deste
trabalho, visando à obtenção das semicarbazonas e tissemicarbazonas derivadas dos núcleos
isoxazolínicos pirrolidínicos e piperidínicos.
Para se alcançar a síntese dos ésteres isoxazolínicos de 5 e de 6 membros IV, material
de partida do trabalho, foi utilizado as respectivas 1-pirrolidina (n=1) e 1-piperidina (n=2) I,
estes heterociclos foram trimerizados II, e posteriormente N-acilados, com cloretos de acilas
desejados, originando o enecarbamato N-benziloxicarbonil-2-pirrolina (n=1) e as enamidas N-
(benzoil)-2-piperideína (n=2), etapa 3, os quais reagiram com o N-óxido de nitrila (etapa 4)
formando os respectivos cicloadutos 2-isoxazolina[5,4-b]pirrolidina (n=1) e 2-
isoxazolina[5,4-b]piperidina (n=2) V [30]
.
A escolha dos substituintes “R” em N6 e N7, nos respectivos cicloadutos de
pirrolidínicos e piperidínicos, varia desde grupamentos elétron atratores, a elétrons doadores,
para se averiguar os possíveis efeitos eletrônicos nas atividades biológicas avaliadas.
A funcionalidade éster IV em C3 é reduzida ao respectivo álcool V, por boroidreto de
sódio [69]
, etapa 5 (figura 04). Os alcoóis V sofrem uma posterior oxidação de Swern [70]
,
originando os respectivos aldeídos VI, derivados de ambos os biciclos isoxazolínicos de 5 e 6
membros, n= 1 e 2, respectivamente. Os derivados de semicarbazonas e tiossemicarbazonas
VII foram obtidos a partir da condensação direta entre aldeídos VI e uma semicarbazonas e
tiossemicarbazida aromática 69, em meio ácido [73]
.
Abordagem II- Obtenção das nitrofurfuril-hidrazonas do heterociclo 2-
isoxazolina[5,4-b]pirrolidina.
Como verificado anteriormente, existe um número considerável de compostos com
atividade anti-chágasica que apresentam em sua constituição o farmacóforo nitrofurano 3 [08]
,
o qual oferece a seus derivados um potencial para produzir radicais livres que são tóxicos aos
microrganismos que possuem enzimas sensíveis ao ataque de agentes oxidantes,
desencadeando na morte desses patógenos [22, 54]
.
Logo, percebeu-se a oportunidade de desenvolver um novo grupo de derivados dos
heterobíciclos 5 e 6, conjugando o grupamento farmacofórico nitrofurano 3 à porção hidrazida
da 2-isoxazolina[5,4-b]pirrolidina VIII.
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Químico Página 45
N
N
O
CO2Et
O
R1
Etapa 9
N
N
O
NHO
NH2
O
R1
R1 = F, NO2, Cl
N
N
O
NO
N
O
HH
R1
O
NO2
IV VIII
IX
Etapa 8
Esquema 05: Sintese das isoxazolil--hidrazonas IX a partir do éster isoxazolínico.
Para a síntese das nitrofurfuril-hidrazonas IX, partiu-se dos ésteres de cicloadutos de 5
membros (n=1) IV, que foram submetidos à reação com hidrazida 80%, em meio etanólico
[52]. As hidrazidas VIII, contendo R1 como Cl, F e NO2, foram condensadas diretamente, em
meio ácido, com o 5-nitro-2-furfuraldeído 92, e desta forma, originando as hidrazonas IX
[74,75].
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Químico Página 46
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO:
5.1 – SÍNTESE RACÊMICA DO ÉSTER ISOXAZOLÍNICO A PARTIR DAS
ENAMIDAS ENDOCÍCLICAS PIPERÍDINICAS E ENECARBAMATO
ENDOCÍCLICO N- (BENZILOXICARBONIL)-2-PIRROLINA [30]
.
Em um trabalho realizado por De Faria e col. [30]
foi desenvolvido a via sintética de
duas séries de ésteres isoxazolínicos biciclos pirrolidínicos e piperidínicos, materiais de
partida para síntese dos novos derivados isoxazolínicos [30]
.
74
73
72
77
76
75
64
63
62
65
N
H
N N
N
N
Etapa 1
Etapa 3
Etapa 2
N
H
Etapa 1
N N
N
N
N
OBnON
OBnO
N
O
CO2Et
N
N
O
CO2Et
H
Etapa 5
Etapa 4
Etapa 3
Etapa 2
N
N
O
CO2Et
O
R1
N
O
N
O
CO2Et
R1
N
O
R1
6171
Esquema 06: Rota sintética utilizada para obtenção dos ésteres dos heterociclos 2-isoxazolina[5,4-b]pirrolidina
e 2-isoxazolina[5,4-b]piperidina.
De Faria e col. [30]
támbem caracterizaram as peculiaridades reacionais da síntese de
ambos os biciclos, como por exemplo, a síntese do cicloaduto pirrolidínico 75, cujos
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Químico Página 47
respectivos enecarbamatos endocíclicos de 5 membros foram obtidos através da N-acilação da
1-pirrolina 73, à -78°C, segundo o método de Kraus
[110], que é desprotogido por Pd°/C em
metanol, na posição N6, formando o éster N-desprotegido 76, sendo seguidamente N-acilado
por ET3N, CHCl3 anidros e o cloreto de acila escolhido, formando o cicloaduto N-substituído
77 [30]
.
Enquanto, para a síntese das enamidas endocíclicas de seis membros foi adaptada dos
homólogos de 5 membros [111]
, a partir do seu respectivo trímero (da 1-piperideína), visto que
o mesmo procedimento utilizado para síntese do enecarbamato de 5 membros [110]
oferecia
rendimentos de apenas 3% do cicloaduto de 6 membros. No entanto, ao partir da enamida 64
substituída em N7, obtinha-se o cicloaduto 65 com rendimentos variando entre 93-98%.
Para a síntese do N-óxido de nitrila - CEFNO, utilizado na reação de cicloadição 1,3-
dipolar, foi obtido in situ, através do seu precursor clorooximidoacetato de etila 83, que foi
preparado através da oxidação do cloridrato da glicina esterificada 93 por NaNO2, em meio
ácido (HCl) [114]
.
Além disso, neste estudo de De Faria e col. [30]
pôde-se confirmar a formação de dois
estereoisômeros após a reação de cicloadição (etapa 3), dando origem aos isômeros SYN e
ANTI, na proporção de 1:1, dos cicloadutos de ambas as séries.
H
N
ON
O
H2NOC
H
F
N
O F
O
N
CONH2
HH
Figura 2: Forma SYN e ANTI de um dos cicloadutos da série pirrolidínicos 65.
A síntese de derivados amídicos derivados dos ésteres 65 e 77 realizada no trabalho de
De Faria e col. [30]
deu origem a outros projetos, já finalizados [52, 68]
, em um dos quais se
comprovou a presença de rotâmeros por um Estudo de Dinâmica de Ressonância Nuclear
como característica do biciclo pirrolidínico, enquanto o biciclo piperidínico é comum a
presença de sinais largos em espectros de RMN de 1H
[52].
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Químico Página 48
Apesar de amplamente dominada, pôde ser realizada melhorias em algumas etapas da
síntese do cicloaduto de 5 membros 77. Por exemplo, na etapa 2, deixou-se de usar gelo seco
e etanol (-78°C), e passou a recolher o monômero à temperatura ambiente ou à 0°C, e em
ambas conseguiram-se rendimentos próximos do que era encontrado a -78°C. Outra
interessante economia foi a retirada de cromatografia em coluna flash, utilizada na purificação
dos ésteres 77, e passou a purificar por recristalização em etanol.
Os ésteres isoxazolínicos 65 e 77 foram então utilizados como materiais de partida no
presente trabalho, e a escolha dos substituintes N-benzoíla foi em decorrência da tentativa de
potencializar a atividade antiparasitária, como relata Aguirre e col. [22]
.
5.2 – SÍNTESE RACÊMICA DAS SEMICARBAZONAS E TIOSSEMICARBAZONAS
DERIVADAS DE N-(BENZOIL)-2-ISOXAZOLINA[5,4-b]PIPERIDINA:
5.2.1 – SÍNTESE DOS ALCOÓIS 66 DERIVADOS DA MISTURA RACÊMICA DO
HETEROBICICLO 2-ISOXAZOLINA[5,4-b]PIPERIDINA 65 [68]
.
No trabalho realizado por Reis [68]
tinha-se o desafio de sintetizar derivados aldeídos a
partitr dos esteres isoxazolínicos 77 [68]
. Tentativas mostraram-se falhas quando se buscou a
oxidação direta do éster de 5 membros 77 aos respectivos aldeídos isoxazolínicos, com
DIBAL-H ou superidreto [(Et3AlH)Li]. Neste criterioso estudo realizado por Reis [68]
,
conseguiu-se chegar a um produto intermediário, o álcool isoxazolínico 78, que
posteriormente foi oxidado ao respectivo aldeído.
Esquema 07: Redução do éster piperidinico 65 a álcool 66
CH3OH seco65 66N
O
N
O
OO
R1
N
O
N
O
OH
R1
NaBH4
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Químico Página 49
Embora a primeira opção parecesse mais viável, com os resultados negativos também
encontrados com cicloadutos piperidínicos 65, decidiu-se utilizar a mesma metodologia
empregada na obtenção dos aldeídos de 5 membros, que é a redução do ésteres isoxazolínicos
através do NaBH4, em metanol seco, originando os respectivos alcoóis 66a-b [68]
.
Esta reação se mostrou bastante conveniente, pois é rápida, oferece rendimentos
consideráveis, de 70-89 %, e permite uma posterior oxidação para se chegar ao aldeído.
Promoveu-se variação dos substituintes em R1 com propriedades estéreo-eletrônicas distintas,
utilizando um elétron-retirador e outro elétron-doador.
Tabela 01–Substituintes e rendimentos dos alcoóis isoxazolínicos piperidínicos.
ÁLCOOL SUBSTITUINTE RENDIMENTO (%)
66a R1 =OMe 70%
66b R1 = F 89%
Espectros RMN de 1
H e 13
C dos alcoóis 66 foram obtidos, onde se puderam comprovar
os hidrogênios diasteroisotópicos do grupamento hidroximetila, como dubletos, em 4,35 e
4,45 ppm respectivamente, em RMN de 1H, com uma constante de acoplamento de 14,0 Hz,
comprovando a formação do álcool. A presença do sinal próximo de 6,0 ppm e do carbono
próximo de 90,0 ppm, evidenciam o álcool isoxazolínico 66.
5.2.2 – OBTENÇÃO DOS ALDEÍDOS ISOXAZOLÍNICOS 67, ATRAVÉS DA
OXIDAÇÃO DE SWERN DOS ÁLCOOIS ISOXAZOLÍNICOS 66 [70]
.
Como foi anteriormente discutido, desenvolveu-se uma rota eficiente para se obter os
aldeídos isoxazolínicos, via oxidação do álcool. Com o álcool 66 em mãos ter-se-ia agora que
oxidá-los, de forma branda, para não se obter o ácido, na posição C3, da carbonila.
Esquema 08: Oxidação do álcool piperídinico 66.
67
66
N
O
N
O
HO
R1
N
O
N
O
OH
R1
DMSO, CH2Cl2, TEA
cloreto de oxalila, -78°C
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Químico Página 50
A primeira alternativa idealizada foi o procedimento experimental padrão da oxidação
de Swern [70]
(esquema 09), o qual possui como etapa inicial a reação do dimetilsulfóxido
(DMSO) com o cloreto de oxalila a. O primeiro intermediário b rapidamente se decompõe
liberando dióxido e monóxido de carbono, produzindo o cloreto de dimetilclorosulfônio c.
Após a adição do álcool isoxazolínico 66, o cloreto reage com o álcool para formar o
intermediário-chave, catiônico, alcoxisulfônio d. Com a adição de dois equivalentes de
trietilamina, o intermediário será desprotonado, havendo liberação de dimetilsulfeto e
resultando no aldeído desejado e, após passagem por um estado de transição cíclico de cinco
membros, que se apresenta como um ilídeo. Após esta última reação, ainda se forma no meio
o cloreto de trietilamônio como produto secundário.
S
O
S
O
O
ClCl
O
e
78°C
O
S Cl
O
O
Cl
C OO
C O
S
Cl
Cl
N
N
O
O
S
H
H
O
R1
álcool oxadiazolínico
66 (n=2)
HCl
TEA
N
N
O
O
S
H
H
O
R1
Cl
N
N
O
H O
O
R1
Me2S
bc
d
a
N
n n= 1 e 2nn
Esquema 09: Reação padrão de Swern.
A reação foi rápida e após purificação em coluna cromatográfica proporcionou bons
rendimentos, permitindo a síntese dos aldeídos isoxazolínicos de ambos os núcleos.
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Químico Página 51
Tabela 02–Substituintes e rendimentos dos aldeídos isoxazolínicos piperidínicos.
ALDEÍDO SUBSTITUINTE RENDIMENTO
67a R1 = OMe 60 %
67b R1 = F 43 %
Os aldeídos 67 foram conduzidos a análises espectrométricas, onde os espectros RMN
de 1H e
13C revelaram os sinais característicos dos núcleos isoxazolínicos com hidrogênios
próximos de 4,10 e 6,5 ppm (sinais largos), e os carbonos em 92,0 ppm, comprovando que o
biciclo piperidínico está intacto, além desses, a presença de hidrogênios acima de 1,5 ppm e
os próximos de 3,0 ppm completam os sinais do biciclo isoxazolínico. Pôde-se comprovar o
sucesso da oxidação de Swern pela presença dos hidrogênios acima de 9,0 ppm e carbonos na
faixa de 185,0 ppm; bem desblindados, características de carbonila de aldeídos, além da
ausência do hidrogênio diasterotópicos (4,36 ppm) e do singleto largo próximos de 3,0 ppm.
5.2.3 – SÍNTESE RACÊMICA DAS SEMICARBAZONAS E
TIOSSEMICARBAZONAS 68, DERIVADAS DO HETEROBICICLO 2-
ISOXAZOLINA[5,4-b]PIRROLIDINA [73]
.
Foi encontrada na literatura uma variedade de vias para a síntese de
tiossemicarbazonas e semicarbazonas [28, 29, 48, 72, 73, 76]
. Um recente estudo publicado por
Cunha e col. [48]
, que relatava a síntese de tiossemicarbazonas por uma reação catalítica one-
pot, oferecia uma interessante metodologia que poderia produzir derivados
tiossemicarbazônicos dos núcleos isoxazolínicos de 5 e 6 membros [48]
.
Foram realizados testes dissolvendo, sob refluxo e em metanol, quantidades
equimolares de aldeídos para-substituídos 86, hidrazina 80% 87 e p-Cl-fenil-isocianato 88
(esquema 10), e como descrito em literatura, a reação apresentou-se simples e direta, e quase
que instantaneamente, pôde-se observar a formação de um precipitado [48]
.
As reações foram acompanhadas por CCD, a qual revelou o total consumo dos
produtos de partida num período de 1-2 horas. Quando o solvente foi removido, obteve-se um
sólido amarelo bastante impuro. Até então, acreditava-se ter desvendado a questão
fundamental do presente trabalho, porém, encontrou-se uma grande dificuldade no processo
de purificação do produto bruto reacional.
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Químico Página 52
86
87
88
89
R= Cl e F.
O H
R
H2N NH2
C
O
N
Cl
R
H N
NH
O
N
H
Cl
Esquema 10: Síntese de tiossemicarbazona por reação catalítica one-pot.
Ainda durante a reação, a CCD revelou a formação de inúmeros subprodutos, tentou-
se purificar a tiossemicarbazona 89 por recristalização em etanol, metanol e acetato de etila,
separadamente, mas não houve progresso. A possibilidade de se usar uma cromatografia em
coluna flash não pareceu ser a melhor opção, pois as impurezas se localizam muito próximas
do produto desejado, e seriam necessárias várias cromatografias para se alcançar o produto
puro.
Suspeitou-se que o insucesso dessas reações tenha sido decorrente do uso de
isocianato 88 de baixa qualidade, pois os outros regentes utilizados foram usados em outros
projetos no mesmo período e não haviam apresentado quaisquer inconvenientes.
A utilização da técnica one-pot para síntese de tiossemicarbazonas desenvolvida por
Cunha e col.[48]
(esquema 10) poderia proporcionar uma maneira valiosa de se conseguir
vários derivados tiossemicarbazônicos dos biciclos isoxazolínicos 5 e 6. Porém, o pouco
tempo que se tinha forçou o adiamento da síntese dos novos híbridos isoxazolínicos pela
técnica one-pot para trabalhos futuros.
Diante do exposto, uma nova metodologia fazia-se necessário, um estudo de revisão,
realizado por Góes e col. [76]
, elucidava as diversas vias a que poder-se-ia recorrer. Uma das
alternativas era obtenção indireta, onde se poderia sintetizar tiossemicarbazidas, utilizando
hidrazina e outros reagentes, com uma posterior condensação do aldeído isoxazolínico 67 [28]
.
A outra metodologia era a reação direta entre o aldeído isoxazolínico 67 e tiossemicarbazidas
comerciais [29]
.
Optou-se pela via direta, pois demonstrava ser a mais rápida. Com as 4-fenil-
tiossemicarbazidas e 4-fenil-semicarbazidas 69, adquiridas comercialmente, desejava-se obter
seus respectivos derivados isoxazolínicos 68.
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Químico Página 53
67
68
N
N
O
O
HO
R1
N
N
O
O
N
R1
HNH
X
NH
69
H2NNH
NHX
a= Ob= SX
Esquema 11: Síntese de semicarbazonas e tiossemicarbazonas do biciclo 2-isoxazolínico piperidínico.
Na maioria das condensações entre semicarbazidas ou tiossemicarbazidas 69, e
aldeídos, em meio ácido, empregava-se refluxo por um longo período [28, 29, 48, 72]
. No entanto,
necessitava-se de uma reação branda, pois, apesar de serem bastante estáveis a baixas
temperaturas, os aldeídos isoxazolínicos são sólidos termossensíveis e muito reativos em
solução, e poderiam ser degradas nestas condições de reação [28, 29, 48, 72]
.
Foi adaptada a metodologia praticada por Gligorijević e col. [73]
, condensando a 4-
fenil-tiossemicarbazida 69a e 4-fenil-semicarbazida 69b, com o aldeído 67, catalisado por
ácido clorídrico concentrado, dissolvidos em etanol. A reação foi rápida e simples, podendo-
se observar a formação do precipitado mesmo antes da completa adição do último reagente
(aldeído 67). O produto bruto foi purificado por recristilazação em etanol e acetato de etila,
obtendo-se sólidos de cor bege à branco com rendimentos de 31-90%.
Tabela 03 – Substituintes e rendimentos das isoxazolil-semicarbazonas e isoxazolil-
tiossemicarbazonas piperidínicas.
Os rendimentos das reações de condensação 68a-d apresentaram-se dentro da faixa
que é relatada na literatura [28, 29, 48, 72]
, para outras semicarbazonas e tiossemicarbazonas,
para condensações similares com outros aldeídos, no entanto, o composto 68d apresentou
31%, considerado um pouco abaixo do esperado. Mas isso se deveu, provavelmente, ao
SUBSTÂNCIA SUBSTITUINTES RENDIMENTO
68a (R1 =OMe; X= O) 88%
68b (R1 = OMe, X= S) 89%
68c (R1 = F; X= O 79%
68d (R1 = F; X= S) 31 %
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Estudo Químico Página 54
processo de purificação, pois durante o procedimento ocorreram algumas perdas do produto.
Esses compostos ainda podem apresentar melhores rendimentos, ao ser feito um
aprimoramento do processo de purificação.
As figura 03A e 03B apresentam a estrutura da tiossemicarbazona 68a, como exemplar
a ser demonstrado, com todos os sinais de RMN de 1H e RMN de
13C, respectivamente. Os
sinais característicos do heterobiciclo, aparecem em torno de 6,20 ppm em RMN de 1H e 90
ppm em RMN de 13
C, respectivamente do hidrogênio e do carbono do metino (α ao átomo de
nitrogênio) da junção dos anéis, que confirmam a presença da 2-isoxazolina azabicíclica, os
picos dos hidrogênios metilênicos em 1,60; 2,03 e os 3,02 e 3,70; confirmam que é o núcleo
de 6 membros.
1,60
9,97
12,08
4,04
3,70 e 3,026,20
7,47
7,38
RMN de 1H 7,93
2,03 e 1,60
N
N
O
O
N
O
HNH
S
NH
3,80
7,02
7,027,38
7,24
A
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Estudo Químico Página 55
39,6
56,0
90,0
22,3
113,8
19,5
128,2
125,8
129,3138,7
126,2176,5
160,7
133,4
RMN de 13C
171,1
126,9
55,3
N
N
O
O
N
O
HNH
S
NH
129,3
113,8
162,2
Figura 03 A-B – Dados espectroscópicos de RMN de 1
H e 13
C da tiossemicarbazona 68a.
Deslocamento químico em ppm.
Com o deslocamento químico próximos de 7,90 ppm e 12,0 ppm aparecem os
hidrogênios das ligações N-H, e o CH=N entre 9-10 ppm, demonstrou ser comum entre
tiossemicarbazonas sintetizadas. Além desses, a presença do carbono C=S em 176,5 ppm,
caracteriza a formação da tiossemicarbazona (fig. 3). No IVFT, a presença das bandas em
3332 cm-1
; e 1010 cm-1
e 1082 cm-1
, caracterizam a presença de NH e C=S, respectivamente,
da tiossemicarbazona.
Nas figuras 04 A, B e C são apresentados, de forma representativa, os espectros IV-
FT, RMN de 13
C e RMN de 1H, respectivamente, da tiossemicarbazona 68a.
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Estudo Químico Página 56
IV-FT Pastilha de KBr
A
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Estudo Químico Página 57
ppm
RMN de 13C
B
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Estudo Químico Página 58
Figuras 04 A, B e C: Respectivos espectros de IV-FT, RMN de 13
C e RMN de 1H da
tiossemicarbazona 68a.
RMN de 1H
Tiossemicarbazona 68b
ppm
C
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Estudo Químico Página 59
5.3 – SÍNTESE RACÊMICA DAS SEMICARBAZONAS E TIOSSEMICARBAZONAS
DERIVADAS DE N-(BENZOIL)-2-ISOXAZOLINA[5,4-b] PIRROLIDINA.
Os substituintes Cl, F e NO2 foram escolhidos com o intuito de direcionar aos
produtos finais, semicarbazonas, tiossemicarbazonas e nitrofurfuril-hidrazonas, maiores
efeitos nas atividades biológicas a serem avaliados, conforme revisão bibliográfica [22,54]
.
5.3.1 – SÍNTESE DOS ÁLCOOIS ISOXAZOLÍNICOS 78. [69]
Não se pôde chegar ao aldeído diretamente, porém, foi contornado este desafio através
da redução do éster, ao respectivo álcool 78 na posição C3, com NaBH4. Este foi objetivo de
um dos trabalhos já realizados pelo grupo de pesquisa [68]
, o qual permitiu uma variedade de
alternativas para síntese de novos derivados híbridos isoxazolínicos, inclusive a oxidação ao
aldeído.
Para tal, foi dissolvido o éster 77 em metanol seco, e adicionaou-se, três vezes, um
equivalente-mol de boroidreto de sódio, e em duas horas o produto bruto foi extraído e
purificado por cromatografia em camada delgada, obtendo-se bons rendimentos. No presente
trabalho, decidiu-se acrescentar mais uma alternativa, o álcool isoxazolínico p-NO2 78c, que
ainda não tinha sido produzido.
O
N
N
OO
O
R1
00C
MeOH
NaBH4
77 78
O
N
N
OH
O
R1
Esquema 12: Síntese dos alcoóis isoxazolínicos 78.
Tabela 04 – Substituintes e rendimentos dos álcoois isoxazolínicos pirrolidínicos. ÁLCOOL SUBSTITUINTES RENDIMENTO (%)
78a R1 =F 88 %
78b R1 = Cl 90%
78c R1= NO2 95 %
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Estudo Químico Página 60
Espectros de RMN de 1H e C
13, IV-FT foram realizados, os hidrogênios
diasteroisotópicos do grupamento hidroximetila dos álcoois 78 apresentaram-se como
dubletos em RMN de 1H, em 4,35 e 4,45 ppm respectivamente, com uma constante de
acoplamento de 14 Hz. Os álcoois 78 também apresentaram nos espectros de IV-FT, bandas
características em torno de 3505 cm-1
, relativamente finas e intensas, caracterizando o
estiramento da ligação O-H do grupamento hidroximetila em C3.
5.3.2 – OBTENÇÃO DOS ALDEÍDOS ISOXAZOLÍNICOS 79, ATRAVÉS DA
OXIDAÇÃO DE SWERN DOS ÁLCOOIS ISOXAZOLÍNICOS 78 [70]
.
Como já foi comentado anteriormente, a melhor opção para se chegar ao aldeído a
partir dos ésteres isoxazolínicos, era passando por um produto intermediário, o álcool que
sofre uma posterior oxidação.
Utilizou-se o procedimento experimental padrão da reação de Swern descrtio no
esquema 10, pois é uma oxidação branda que permite a síntese dos aldeídos isoxazolínicos 79
com ótimos rendimentos.
O
N
N
OH
O
R1
79
DMSO
TEA
cloreto de oxalila
CH2Cl2
-600C
78
O
N
N
H
O
R1
O
Esquema 13: Síntese dos aldeídos isoxazolínicos 79.
Foram sintetizados três aldeídos isoxazolínicos, em C3, dentre os quais um com
substituinte p-NO2-fenil na posição N6, um novo derivado. Os aldeídos 79 são sólidos
estáveis a temperaturas baixas de colorção branca.
Tabela 05 – Substituintes e rendimentos dos alcoóis isoxazolínicos pirrolidínicos. ÁLCOOL SUBSTITUINTE RENDIMENTO (%)
79a R1 = F 80 %
79b R1 = Cl 48%
79c R1= NO2 65 %
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Estudo Químico Página 61
A oxidação de Swern dos álcoois 78 foi muito bem sucedida e os respectivos aldeídos
79 foram caracterizados, principalmente pelos sinais em 9,8 ppm e 185,0 ppm nos espectros
RMN de 1H e de
13C, respectivamente. Em relação aos espectros no IVFT, os aldeídos 79
apresentaram uma banda intensa em 1710 cm-1
, característica do estiramento da carbonila do
aldeído.
5.3.3 – OBTENÇÃO DE ISOXAZOLIL-SEMICARBAZONAS E
TIOSSEMICARBAZNAS DE 5 MEMBROS 80 [73]
.
A metodologia empregada na síntese das semicarbazonas e tiossemicarbazonas do
biciclo pirrolidínico é análoga ao piperidínico [73]
. Logo, houve a solubilização da 4-fenil-
semicarbazida ou 4-fenil-tiossemicarbazida em etanol, aplicando o ácido clorídrico
concentrado como catalizador, e por fim adiciona os aldeídos 79a-c. As condensações foram
acompanhadas por CCD, e em cerca de 40 minutos, houve o total consumo dos reagentes
limitantes. Após a filtração e lavagem do precipitado reacional, as isoxazolil-semicarabazonas
e tiossemicarbazons 80a-f foram obtidas como sólidos (branco à bege), que foi purificado e
devidamente identificado por espectrometria de RMN e I.V.
N
N
O
O
NH
HN
X
NH
R1
N
N
O
O
H
R1
O
7980
69
H2NNH
NHX
a= Ob= SX
Esquema 14: Síntese das semicarbazonas e tiossemicarbazonas do 2-biciclo isoxazolínico pirrolidínico 80.
Tabela 06 – Substituintes e rendimentos das isoxazolil-semicarbazonas e tiosemicarbazonas
pirrolidínicas. COMPOSTO SUBSTITUINTES RENDIMENTO (%)
80a (R1 =F; X= O) 62%
80b (R1 = F; X= S) 92%
80c (R1 = Cl; X= O) 59%
80d (R1 = Cl; X= S) 66%
80e (R1 = NO2; X= O) 33%
80f (R1 = NO2; X= S) 66%
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Químico Página 62
A disparidade dos rendimentos talvez tenha acontecido devido ao método de
purificação que se pretende otimizadar.
As isoxazolil-semicarbazonas ainda não foram descritas na literatura, portanto não se
pode fazer analogia de deslocamentos químicos dos hidrogênios de outras semicarbazonas.
No entanto, pode-se caracterizar como sinal peculiar das isoxazolil-semicarbazonas o
hidrogênio NN-H da função semicarbazona que se apresenta como um singleto entre 11,03–
11,12 ppm em RMN de 1H, em ambas as séries, diferente do que relata a literatura
[55], onde
se encontra dupletos na faixa de 7,0–8,0 ppm. Esta carcteristica pode ser explicada pela
peculiaridade estrutural que as semicarbazonas isoxazolinícas parsesentam, função
semicarbazona pertencente a uma espécie de heterodieno associado à isoxazolina [52]
.
Outro fato, é que, os hidrogênios das semicarbazonas HC=N têm seus sinais
geralmente próximos dos sinais dos hidrogênios aromáticos, 8,75 e 7,85 (fig. 5A); sendo
detectada a presença dos mesmos pela integração dos sinais. Com relação aos espectros de
IV-FT (Fig. 6A), bandas finas e relativamente intensas, correspondentes ao estiramento NN-
H, estão presentes entre 3240-3270 cm-1
, confirmando assim, a função hidrazona nas
estruturas dos híbridos 54.
A caracterização do biciclo pirrolidina[3,2-d]-2-isoxazolina, presente no cicloaduto 75
e também em 76, 77, 78, 79 e 80, 82 se faz facilmente através de espectrometria de RMN,
nas quais, sinais diagnósticos da formação do cicloaduto são evidentes, com dubletos ou
sinais largos próximos de 6,5 ppm em 1H RMN, referente ao H6a e um sinal próximo a 95
ppm em 13
C RMN, referente ao C6a. Com exceção da isoxazolina desprotegida 76, todos os
derivados isoxazolínicos da 2-pirrolina 75, 77, 78, 79, 80 e 82 possuem uma função amida ou
carbamato em N6. Este fato fez com que os mesmos apresentassem sinais de rotâmeros em 1H
e 13
C RMN. A presença de rotâmeros, devido à alta barreira rotacional energética das ligações
amídicas e carbamídicas, deixa os espectros de RMN complexos. Todavia, em trabalhos
anteriores, foi realizado um estudo de dinâmica de ressonância magnética, onde os espectros
foram obtidos à 60 oC, ocorrendo a total coalescência dos sinais de rotâmeros, esclarecendo
esta peculiaridade dos núcleos isoxazolínicos [30]
.
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Químico Página 63
2,28
7,04
11,11
4,43
4,10
6,17 e 6,71rotâmeros
7,30
1H RMN
7,55
3,11 e 3,39rotâmeros
7,85
8,35
N
N
O
O
NH
HN N
NO2
O
H
H
H
H
H
H
H
8,75
7,30
2,38
7,85
8,35
A
51,0 e 49,3rotâmeros
43,8 e 47,1rotâmeros
94,0 e 91,6rotâmeros
27,3 e 28,5rotâmeros
122,9
129,0
123,7
141,6
120,1
128,6
148,3
152,4
13C RMN
167,3 e 166,9rotâmeros
157,9
131,1
N
N
O
O
NH
HN NH
NO2
O
HH
H
138,5128,6
122,9
B
Figura 05 A e B – Dados espectroscópicos de RMN de
1H e
13C da semicarbazona 80e.
Deslocamento químico em ppm.
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Estudo Químico Página 64
A
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Estudo Químico Página 65
RMN de 1H
N
N
O
O
NH
HN
O
NH
NO2
H
H
80e
11,11
8,75 7,85
B
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Químico Página 66
Figura 06 A, B e C– Respectivos espectros de IV-FT, RMN de
1H e
13C da semicarbazona
80e.
RMN de 13C
N
N
O
O
NH
HN
O
NH
NO2
80e
C
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Estudo Químico Página 67
5.4 – SÍNTESE RACÊMICA DAS HIDRAZIDAS 81 E HIDRAZONAS 82
DERIVADAS DO HETEROBICICLO 2-ISOXAZOLINA[5,4-b]PIRROLIDINA 77.
5.4.1 – SÍNTESE DAS HIDRAZIDAS 81 DERIVADAS DO HETEROBICICLO 2-
ISOXAZOLINA[5,4-b]PIRROLIDINA 77.
Em um trabalho realizado por De Almeida [52]
, visando à síntese de hidrazidas em C3,
a partir do éster da série pirrlidínicos 77 e piperidínica 65, foi demonstrado que a reação entre
os cicloadutos 65, hidrazina 80% e etanol como solvente resumtaram-se infrutíferas [52]
(esquema 15).
Esquema 15: Síntese das hidrazidas isoxazolínicas a partir de ésteres isoxazolínico piperidínico 65.
A reação não aconteceu como esperado, não ocorrendo a formação da função
hidrazida na “posição 3” do anel isoxazolínico, considerando experiências prévias com
reações de amonólise da função éster 65 [66, 67]
, na qual as respectivas amidas 85 foram obtidas
em ótimos rendimentos [66, 67]
.
Nesta série piperidínica, não houve a possibilidade de obtenção das respectivas
hidrazonas, devido ao fato de que na tentativa de obtenção das hidrazidas, necessárias para a
condensação com os aldeídos, houve a degradação do núcleo isoxazolínico piperidínico no
meio reacional, precipitando a hidrazida da porção benzoíla, o que impossibilitou a seqüência
sintética dessa série (esquema 16).
Utilizando a hidrazina como nucleófilo, obteve-se benzoil hidrazidas 94 em
rendimentos quantitativos (esquema 16). Ocorreu um ataque da hidrazina na função amida em
N7 ao invés do éster em C3. As benzoil hidrazidas 94 foram identificadas por RMN de 1H e
13C.
etanol
NH2NH2.H2O
65
XIIIHidrazida isoxazolínica
N
O
N
O
NHO
NH2
R
N
O
N
O
OO
R
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Químico Página 68
N
N
O
O
R
OEtO
H
H
N
O
R
NH2H
precipitado isolado
N
N
O
OEtO
H
H
degradou no meioreacional
94NH2NH2
65
Esquema 16: Ataque da hidrazina na função amida em N7.
A amida piperidínica, provavelmente, está se comportando reacionalmente como uma
cetona ativada perante a hidrazina, devido a fatores estéricos. O orbital não ligante do átomo
de nitrogênio possivelmente não está em ressonância com a ligação dupla da carbonila,
fazendo com que a mesma fique mais reativa do que o éster etílico na posição C3, tendo
apenas o efeito indutivo retirador de elétrons do átomo de nitrogênio. Este fato não ocorreu
com a série pirrolidínica, ocorrendo o ataque da hidrazina à carbonila da função éster em C3 e
não na função amida, como esperado, o que possibilitou a obtenção dos produtos finais sem
maiores problemas.
O núcleo isoxazolínico piperidínico livre não foi mais detectado no meio reacional,
devido a uma possível degradação, pois já foi percebido em reações de tentativa de
desproteção por hidrogenólise, que o núcleo isoxazolínico piperidínico desprotegido em N7
desaparece do meio, produzindo vários sub-produtos não identificáveis, detectados pela
cromatografia de camada delgada (esquema 17).
N
N
O
OEtO
H
HH
N
N
O
OEtO
H
H
DEGRADAÇÃO
H2, Pd/C
N
N
O
OEtO
H
H
O O
65
Esquema 17: Degradação do núcleo isoxazolínico piperidínico 94.
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Químico Página 69
No entanto, a síntese de hidrazonas a partir do núcleo pirrolidínico permitiu a
utilização do éster isoxazolínico 77, para síntese de hidrazidas 81 e posterior formação das
nitrofurifuril-hidrazonas.
Os ésteres 77a-c foram submetidos a reações com hidrazina 80% (esquema 14),
originando as hidrazidas isoxazolinas pirrolidínicas 81a-c. Para tal, solubilizaram-se as 2-
isoxazolinas pirrolidínicas 77 em etanol e, em seguida, adicionou-se calmamente a hidrazina
80%. Acompanhada através de CCD, onde se percebeu o início da formação da hidrazida
(precipitado cristailino branco), logo após, a adição da hidrazida, a reação possuía um tempo
médio de uma hora, quando se percebia o total consumo do éster.
N
N
O
O
R1
OO
N
N
O
NHO
NH2
O
R1
NH2NH2 80%, etanol
77
81
Esquema 18: Síntese das hidrazidas isoxazolínicas pirrolidínicas 81.
Tabela 07 – Substituintes e rendimentos das hidrazidas isoxazolínicas. HIDRAZIDA SUBSTITUINTE RENDIMENTO (%)
81a R1 = F 64 %
81b R1 = Cl 53 %
81c R1= NO2 75 %
Percebeu-se uma peculiaridade quando se repetiu a síntese das hidrazidas, pois os
mesmos rendimentos, entre 80% e 94%, outrora encontrados, não foram repetidos. Ao
observar o histórico das diversas repetições da síntese deste derivado, constatou-se que os
melhores rendimentos normalmente eram vistos quando se obtinham grandes quantidades,
mais de um grama, do produto de partida. Vale salientar que não se pode julgar a reação como
algo inesperado, pois ela sempre foi acompanhada por CCD e era decretado seu fim apenas
quando não se observava mais o éster 77. No entanto, para cristalização das hidrazidas,
quando se tinha em mãos, boas quantidades do produto bruto, podia-se lavar várias vezes com
etanol, por filtração à vácuo, o que oferecia uma pequena perda. Já em pequenas quantias,
tornava-se mais conveniente, seguidas centrifugações do precipitado com etanol, a qual
possivelmente promoveria o arraste de uma boa parte das hidrazidas 81 pelo solvente, e desta
forma, diminuía-se o rendimento.
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Químico Página 70
Pode-se concluir tal fato, pois nas CCD dos sobrenadantes da centrifugação, os quais
foram armazenados, podia-se constatar grandes manchas nas bandas correspondentes as
hidrazidas 81.
Todas as hidrazidas 81a-c foram devidamente identificadas por métodos
espectrométricos RMN de 1
H e RMN de 13
C. As figuras 07A-C apresentam os espectros de
RMN de 1
H, RMN de 13
C e IVFT, respectivamente, da hidrazida 81c. Em 4,56 ppm um sinal
largo referente aos hidrogênios NH2 e em 9,89 ppm um singleto do hidrogênio N-H. O
hidrogênio referente ao metino da junção dos anéis, α ao átomo de nitrogênio aparece em 6,1
ppm e 6,65 ppm. Este sinal duplicado é devido a presença de rotâmeros. Os demais sinais
estão todos de acordo com a molécula em questão.
10 9 8 7 6 5 4 3 2
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
2.14 2.11 2.062.06 1.981.00 0.690.64 0.410.33
2.2
1
2.5
0
3.0
7
3.3
4
4.1
14.2
7
4.5
6
6.0
96.1
1
6.6
56.6
5
7.8
1
8.3
3
9.8
9
RMN de 1H
N
N
O
NHO
NH2
O
NO2
H
H
A
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Estudo Químico Página 71
Figura 07 A, B e C – Espectros RMN de 1H, RMN de
13C e IV-FT da hidrazida 81c.
N
N
O
NHO
NH2
O
NO2
H
H
RMN de 13C
Hidrazzida 81c 81c
C
B
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Estudo Químico Página 72
5.4.2 - SÍNTESE DAS HIDRAZONAS 82, DERIVADAS DA MISTURA RACÊMICA
DO HETEROBICICLO 2-ISOXAZOLINA[5,4-b]PIRROLIDINA 81 [74,75]
.
A condensação das hidrazidas é um método freqüentemente utilizado quando se deseja
sintetizar hidrazonas [74,75]
, e já se tinha experiências bem sucedidas com esta reação,
utilizando hidrazidas isoxazolínicas, com vários aldeídos fenil-parasubstituídos (F, Cl e NO2)
com propriedades eletrônicas diversas na porção arila.
Esquema 19: Síntese das Hidrazonas isoxazolínicas 82.
Contudo, no corrente estudo pôde-se acrescentar ao núcleo um novo grupo de
hidrazonas, contendo um novo anel aromático substituído, o nitrofurano, com propriedades
farmacofóricas ainda não encontradas nos derivados hidrazônicos do núcleo isoxazolínico 6
(fig. 10).
Foram preparadas misturas de hidrazidas 81a-c e etanol, e realizada uma catalise ácida
(1-2 gotas de HCl concentrado), à temperatura ambiente, entre as soluções de hidrazidas e o
aldeído 92 (nitrofurfuraldeído). A reação se processou instantaneamente, com precipitação da
hidrazona em menos de 2 minutos. E em 30 minutos de exaustiva precipitação da hidrazona,
uma CCD confirmou o final da reação.
A recristalização foi realizada através de centrifugações sucessivas do precipitado com
etanol, após remoção do solvente reacional, pôde-se obter sólidos brancos cristalinos e
bastante estáveis puros, hidrazonas 82a-c, com rendimentos variando entre 59% e 72% (tab.
08).
Tabela 08 – Substituintes e rendimentos das isoxazolil-nitrofurufuril-hidrazonas.
HIDRAZONA SUBSTITUINTE RENDIMENTO (%)
82a R1 = F 60%
82b R1 = Cl 72%
82c R1= NO2 60%
N
N
O
NHO
NH2
O
R1
EtOH, HCl (cat)
81
N
N
O
NO
N
O
R1
H H
O
NO282OO2N
O
H
92
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Estudo Químico Página 73
As novas N-acil-nitrofurfuril-hidrazonas 82 obtidas têm um sítio de substituição R1, o
que proporciona a produção de uma gama de derivados, com propriedades estéreo-eletrônicas
distintas.
As estruturas das hidrazonas 82 foram devidamente elucidadas por métodos
espectrométricos (RMN de1H, RMN de
13C e IV-FT). As figuras 08 A e 08B apresentam a
estrutura da hidrazona 82c com todos os sinais de RMN de 1H e RMN de
13C,
respectivamente. Os sinais característicos do heterobiciclo, aparecem em torno de 6,0 ppm em
RMN de 1H e 90,0 ppm em RMN de
13C, respectivamente do hidrogênio e do carbono do
metino (α ao átomo de nitrogênio) da junção dos anéis, que confirmam a presença da 2-
isoxazolina azabicíclica. Com deslocamento químico em 12,53 ppm e 8,34 ppm aparecem
respectivamente o hidrogênio da ligação N-H e CH=N (fig. 08A).
2,32
8,34
12,53
4,37
4,14 e 3,45rotâmeros 6,21 e 6,75
rotâmeros
7,83
7,78
1H RMN VERMELHO
N
N
O
O
NO
H
N
H
NO2
H
H
H
H
H
H
O
NO27,27
3,17 e 3,34rotâmeros
7,83
8,38
8,38
A
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52,0 e 50,1rotâmeros
43,8 e 46,3rotâmeros 94,9 e 92,5
rotâmeros
26,7 e 28,2rotâmeros
123,8
123,8
128,8
152,0
115,8
114,5
148,4137,0
155,6
13C RMN AZUL
N
N
O
O
NO
H
N
H
NO2
H
H
H
H
H
H
O
NO2
167,3 e 167,0rotâmeros
154,5 e 153,8rotâmeros
151,3
128,8
B
Figura 08 A e B – Dados espectroscópicos de RMN de
13C e de
1H da hidrazona 82c.
Deslocamento químico em ppm
Na figura 09A, 09B e 09C são apresentados, de forma representativa, os espectros
RMN de 1H e RMN de
13C e IV-FT da hidrazona 82c.
RMN de 13C
A
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Estudo Químico Página 75
ppm
B RMN de 1H
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Estudo Químico Página 76
Figura 09 A, B e C– Espectros RMN de 13
C, RMN de 1H e IV-FT da hidrazona 82c.
Uma análise minuciosa dos espectros de RMN de 1H das hidrazonas 82a-c foi
realizada para determinar a estereoquímica relativa da ligação CH=N.
Durante a formação da funcionalidade hidrazona, nas reações de condensação das
hidrazidas 81a-c com aldeídos aromáticos, poderiam, a priori, ser formados dois
C
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Estudo Químico Página 77
diastereoisômeros (E) e (Z), como pode ser observado na figura 12. Para todas as hidrazonas
sintetizadas 82a-c, a CCD indicou a presença de um único produto formado, que foi atribuído
como diastereoisômero 82 (E), baseado nos trabalhos prévios de Karabastos e col. [103]
que
determinaram a configuração relativa de hidrazonas, em que o hidrogênio imínio do
diastereoisômero (E) aparece com deslocamento químico 0,2 a 0,3 ppm menor que o
correspondente diastereoisômero 82 (Z) [103]
.
Todas as hidrazonas sintetizadas 82a-c, apresentaram um singleto, com integração
para um hidrogênio, referente ao hidrogênio CH=N, com deslocamento entre 8,3 e 8,5 ppm
(fig. 11). Curiosamente todos os espectros analisados, apresentaram um sinal pouco intenso,
quase imperceptível, com deslocamento químico aproximadamente 0,3 ppm menor que o
sinal do hidrogênio (E), o que possivelmente indica a existência de traços do diastereoisômero
(Z), como pode ser observado no espectro RMN de 1H da figura 11B, sinal em destaque em
aproximadamente 8,0 ppm.
N
N
O
NO
N
R1
HH
O
NO2
N
N
O
NO
N
R1
H
H
O
NO2
diastereoisômero 82 (E) diastereoisômero 82 (Z)
Figura 10 – Diastereoisômeros das hidrazonas 82 (E) e 82 (Z).
Como pode ser observado nas figuras 10A e 11B, a presença de sinais duplicados,
devido a presença de rotâmeros, é bastante característico neste tipo de estrutura. Uma
discussão mais ampla sobre a presença de rotâmeros foi realizado em trabalhos anteriores [52]
.
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Estudo Químico Página 78
6.0. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL:
MATERIAIS E MÉTODOS:
As reações de síntese de enecarbamatos endocíclicos de 5 membros da enamidas
endocíclicas de 6 membros e também as reações de cicloadição 1,3-dipolar são sensíveis à
umidade e foram realizadas sob atmosfera de argônio, em aparato previamente seco em estufa
por quatro horas (120°C).
As reações de hidrogenólise foram realizadas sob pressão positiva de hidrogênio,
borbulhando-se o gás no meio reacional.
Clorofórmio foi seco sob cloreto de cálcio anidro. Metanol foi tratado com Mg0/I2 e
destilado antes do uso. Tetraidrofurano (THF), benzeno e tolueno foram tratados com
sódio/benzofenona e destilados imediatamente antes do uso; e o DMSO foi tratado em peneira
molecular, previamente seco em estufa por 4h (120°C). Acetato de etila e N-hexano,
utilizados em colunas cromatográficas, foram bidestilados. Quando não mencionado,
reagentes e solventes foram utilizados sem prévio tratamento.
A análise por cromatografia em camada delgada (CCD) foi efetuada em cromatofolhas
de alumínio (gel de sílica 60), com espessura de 0,2 mm, contendo indicador para 254 nm. A
visualização das manchas foi efetuada com lâmpada de U.V. ENF – 2400 C/F, ácido
fosfomolíbdico 7% em etanol, seguido de aquecimento ou por absorção de iodo.
E as colunas cromatográficas foram empacotadas com gel de sílica 60 (230 – 400
mesh) e eluidas sob pressão (Flash).
As centrifugações foram realizadas por um Centrifugador Excelsa 2, 205N de 7
rotações -Fanem LTDA. Os produtos sólidos tiveram seu ponto de fusão aferidos em
aparelhos POLAX WRS – 1, e não foram corrigidos.
Os espectros no infravermelho (I.V-FT) foram obtidos em aparelhos Bruker IFS 66
(transformada de Fourier), com as freqüências de absorção sendo expressas em cm-1
,
utilizando-se pastilhas ou janelas de KBr.
Os espectros de massas de alta resolução foram obtidos em aparelho Shimadzu LCMS
IT/TOF, bomba LC 20AD, Injetor SIL-20 A, tendo como fonte de ionização elétron spray
(ESI).
Os espectros RMN de 1H, e RMN
13C foram obtidos em aparelhos Variam Unity 300
MHz. Os deslocamentos químicos (δ) são expressos em ppm, tendo como padrão interno o
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Estudo Químico Página 79
tetrametilsilano para RMN 1H e o solvente da análise (DMSO-d6 ou CDCl3) para RMN de
13C. Os sinais dos espectros de RMN
1H são designados da seguinte forma: deslocamento
químico (ppm), multiplicidade (s = singleto, d = dubleto, dl = dubleto largo, t = tripleto, tl =
tripleto largo, q = quarteto, dd = duplo dubleto, dt = duplo tripleto, ddl = duplo dubleto largo,
m = multipleto, ml = multipleto largo, sl = sinal largo), constante de acoplamento (Hz) e
números de hidrogênios.
6.1 – SÍNTESE RACÊMICA DOS DERIVADOS SEMICARBAZONAS E
TIOSEMICARBAZONAS DE 2-ISOXAZOLINAS PIPERIDINICAS.
6.1.1 – TRÍMERO DA 1-PIPERIDEÍNA(ISÔMERO α) 62 [77]
.
N
H
N N
N
61 62
6.1.1.1 – PREPARAÇÃO DO ACETATO DE PIPERIDÍNIO 90
N
H
NH H
O
O
9061
- 5o C
AcOH
Em um balão de duas bocas colocou-se 23,0 mL (0,24 mol) de piperidina 61 e em
seguida resfriou-se a - 5°
C. Sob forte agitação e sem ultrapassar a temperatura de 10° C,
adicionou-se lentamente 13,4 mL (0,24 mol) de ácido acético glacial, através de um funil de
adição. Periodicamente, colocou-se gelo picado no meio reacional para dissolver o produto
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Químico Página 80
formado. Obteve-se uma solução aquosa, límpida e viscosa, correspondendo ao acetato de
piperidínio 90.
6.1.1.2 – PREPARAÇÃO DA N-CLOROPIPERIDINA 91
N
Cl
NH H
O
O Ca(OCl)2
0o
C, 12h
9190
Em um balão de duas bocas de 250 mL, colocou-se 280 mL de um solução 0,93 M de
hipoclorito de cálcio (0,26 mol de Ca(OCl)2 )1. Em seguida, resfriou-se essa solução em banho
de gelo/NH4Cl. Sob forte agitação e mantendo-se a temperatura do banho sempre abaixo de
0° C, adicionou-se lentamente, durante 1,5h, a solução de acetato de piperidínio 90 preparada
anteriormente. Deixou-se a solução resultante em agitação por mais 15 min. Em seguida, fez-
se a extração da solução amarelada resultante com éter etílico (3 x 100 mL). O extrato etéreo
incolor foi seco durante a noite sob Na2SO4 anidro e armazenado em geladeira. Concentrou-se
o extrato etéreo seco em banho de água (~50° C), nunca ultrapassando 60° C. A solução
etérea concentrada foi utilizada logo em seguida na reação subseqüente.
6.1.1.3 – PREPARAÇÃO DO TRÍMERO DA 1-PIPERIDEÍNA 62
63
N
Cl
91
N 24h - t.a.
N
N
N
62
KOH/Etanol
Refluxo
55%
1 Utilizou-se hipoclorito de cálcio HTH para piscinas (65%). A solução foi aferida pelo método iodométrico (KI,
Na2S2O3).
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Estudo Químico Página 81
A um balão de duas bocas de 500 mL, equipado com funil de adição com equalização
de pressão e condensador de refluxo, foram colocados 30,6 g (0,53 mol) de hidróxido de
potássio e 150,0 mL de etanol seco. Após completa dissolução do hidróxido de potássio em
etanol, sob refluxo, adicionou-se lentamente durante três horas, via funil de adição, a solução
concentrada de N-Cloropiperidina 91 preparada no dia anterior, mantendo-se sempre agitação
magnética vigorosa. Após o término da adição, a suspensão amarelada resultante foi deixada
sob refluxo por mais duas horas e em seguida mantida em repouso absoluto a temperatura
ambiente durante 24 horas.
Filtrou-se o cloreto de potássio precipitado em funil de vidro sinterizado, lavando-se o
precipitado com etanol. Após completa remoção do etanol em evaporador rotatório, obteve-se
um líquido oleoso de cor castanha.
O sal foi solubilizado em 150 mL de água destilada e em seguida foi feita a extração
(3 x 80 mL de éter etílico), obtendo-se uma solução etérea do trímero 62, que possivelmente
tenha sido retida no sal. Ao produto obtido da evaporação do etanol foi vertida a solução
etérea, secando-se a solução resultante sob Na2SO4 anidro.
Após remoção completa do solvente2, obteve-se um líquido oleoso de cor castanha,
que foi solubilizado em 9,0 mL de acetona. A cristalização foi efetuada a -18° C (freezer). Os
cristais obtidos, ainda congelados, foram lavados com acetona resfriada (abaixo de -20°C).
Obtiveram-se 9,3 g do trímero 62, correspondendo a um rendimento de 47,0 %. Os cristais
podem ser armazenados por mais de um ano em recipientes secos. Dados de RMN 1
H e 13
C do
produto estão de acordo com a literatura para o isômero α.
Propriedades Físicas de 62
- Cristais amarelos
- Ponto de Fusão 58° C (conforme literatura).
DADOS ESPECTROMÉTRICOS DE 62
RMN de 1H (300 MHz,CDCl3) δ, t.a
1,28 (m, 3 H);1,56 (m, 6 H); 1,71 (m, 9H); 2,03 (m, 3 H); 2,79 (dd; 3 H); 3,12 (m, 3 H).
RMN 13
C (75 MHz, CDCl3) δ, t.a
82,0 (CH); 46,4 (CH2); 29,2 (CH2); 25,8 (CH2); 22,3 (CH2)
2 A remoção do solvente deve ser eficiente, pois traços do solvente podem dificultar a cristalização.
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Químico Página 82
6.1.2 – N-(4-METOXIBENZOIL)-2-PIPERIDEÍNA 64a
N N
N N
O
OCH362 64a
Uma solução do trímero da 1-piperideína 62 (1,80 g; 7,20 mmol) e trietilamina (TEA)
(2,01 mL; 14,40 mmol) em THF seco (80,0 mL) foi levada à refluxo. A esta solução sob
refluxo adicionou-se lentamente, via seringa, durante 30 min, uma solução de cloreto de 4-
nitrobenzoíla (2,46 g; 14,45 mmol em 4,0 mL de THF seco). Após o termino da adição,
obteve-se uma suspensão levemente amarelada, que foi deixada em agitação por mais três
horas adicionais.
A suspensão amarelada foi filtrada em funil sinterizado e após remoção do solvente,
obteve-se um óleo amarelado. O produto foi submetido à cromatografia em coluna “flash”
(gel de sílica, AcOEt/hexano 3:7). Obteve-se 3,0 g da enamida 64a, correspondendo a um
rendimento de 97%.
Propriedades Físicas de 64a
- Líquido viscoso incolor
- Rf = 0,25 (AcOEt/hexano 1:4)
DADOS ESPECTROMÉTRICOS DE 64a
RMN de 1H (300 MHz,CDCl3) δ, t.a, presença de rotâmeros.
1,93 (sl, 2H); 2,11 (m, 2H); 3,80 (sl, 2H); 3,82 (s, 3H); 4,84 e 5,17 (sl, 1H, rotâmeros); 6,52
(sl, 1H); 6,90 (dl, J = 8,7 Hz, 2H); 7,47 (dl, J = 8,7 Hz, 2H).
RMN de 13
C (75 MHz, CDCl3) δ, t.a
21.9 (CH2); 21.8 (CH2); 41.2 (CH2); 55.3 (CH3); 107.2 (CH); 113.5 (CH); 127.1 (CH); 127.9
(C); 130.3 (CH); 161.1 (C); 169.0 (C=O).
I.V. (janela de KBr, cm-1
) principais sinais.
3.080, 3.000, 2.930, 2.830, 1.629, 1.510, 1.407, 1.375, 1.253, 1.175, 1.029, 992, 842, 760,
720, 586.
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6.1.3 – N-(4-FLUORBENZOIL)-2-PIPERIDEÍNA 64b
N N
NN
O
F62 64b
Procedimento experimental idêntico ao item 6.1.2.
Trímero da 1-piperideína 62 (1,80 g; 7,20 mmol), trietilamina (2,01 ml; 14,4 mmol) e
THF seco (80,0 mL), cloreto de 4-fluorobenzoíla (2,30 g; 14,4 mmol em 4,0 mL de THF
seco). Cromatografia em coluna “flash” (gel de sílica, AcOEt/hexano 1:3) forneceu 2,95 g da
enamida 64b, correspondendo a um rendimento de 98%.
Propriedades Físicas de 64b
- Líquido incolor.
- Rf = 0,4 (AcOEt/hexano 1:4)
DADOS ESPECTROMÉTRICOS DE 64b
RMN de 1H (300 MHz,CDCl3) δ, t.a, presença de rotâmeros.
1,95 e 1,81 (m, 2H, rotâmeros); 2,13 (m, 2H); 3,81e 3,57 (m, 2H, rotâmeros); 4,88 e 5,24 (m,
1H, rotâmeros); 6,45 e 7,23 (d, J = 8,1 Hz, 1H, rotâmeros); 7,10 (m, 2H); 7,51 (m, 2H).
RMN de 13
C (75 MHz, CDCl3) δ, t.a, presença de rotâmeros.
21.6 (CH2); 21.8 (CH2); 41.2 e 46,7 (CH2, rotâmeros); 108.0 e 110,0 (CH, rotâmeros); 115.4
(d, J = 21,6 Hz, CH); 127.3 e 124,7 (CH, rotâmeros); 129.9 (C); 130.6 (d, J = 8,4 Hz, CH);
163.7 (d, J = 249 Hz, C); 168.2 (C=O).
I.V. (janela de KBr, cm-1
) principais sinais.
3.110, 2.920, 2.875, 2.800, 1.633, 1.601, 1.507, 1.409, 1.377, 1.227, 993, 848, 757, 723,
577.
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Estudo Químico Página 84
6.1.4 – CLOROOXIMIDOACETATO DE ETILA 83
H3N
OEt
O O
N
Cl
EtOOH
Cl
9383
Em um balão de 250 mL foi adicionado o cloridrato do éster etílico da glicina 93
(10,20 g; 73,0 mmol), água destilada (15,0 mL); e ácido clorídrico concentrado (6,3 mL; 73,0
mmol). Em seguida resfriou-se essa solução em banho de gelo/NH4Cl. Sob forte agitação e
mantendo-se a temperatura do banho nunca acima de 0° C, adicionou-se lentamente, via funil
de adição, a solução de nitrito de sódio (5,1 g; 73,0 mmol; 9,0 mL de água). Ao término desta
adição repetiu-se o processo, adicionando-se mais um equivalente de HCl concentrado e de
nitrito de sódio. Deixou-se a solução resultante em agitação por mais 15 min à mesma
temperatura. Em seguida o produto foi extraído com clorofórmio (4 x 40,0 mL) e seco sob
sulfato de sódio anidro.
Após remoção do solvente, ocorreu intensa precipitação de cristais brancos, após a
adição de N-hexano, onde esses foram lavados com N-hexano e secos sob vácuo. Obteve-se
5,0 g do produto identificado como 83, correspondendo a um rendimento de 45,0 %.
Propriedades Físicas de 83
- Ponto de Fusão 80° C, conforme literatura.
6.1.5 – 7-(4-METOXIBENZOIL)-3a,4,5,6,7,7a-HEXAHIDROISOXAZOLO[5,4-
b]PIRIDINA-3-CARBOXILATO DE ETILA 65a
N
O
N
O
OCH3
COOEt
N
O
OCH364a 65a
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Químico Página 85
A um balão de 100 mL, acoplado com funil de adição com equalizador de pressão e
agitador magnético, foi adicionado a enamida 64a (2,80 g; 12,90 mmol), a base trietilamina
(2,17 mL; 15,6 mmol) e clorofórmio seco (26,0 mL). A esta solução, sob vigorosa agitação,
foi adicionada lentamente durante duas horas a solução clorofórmica do precursor do CEFNO
83 (2,14 g; 14,19 mmol; 5,0 mL de clorofórmio). Logo após o término desta primeira adição,
aplica-se um segundo equivalente de trietilamina e do precursor nas mesmas condições e
quantidades do primeiro equivalente. A reação é acompanhada através de cromatografia de
camada delgada, onde se percebe a formação do produto (cicloaduto) logo após o início da
adição do precursor.
Lavou-se a fase orgânica com água destilada (50,0 mL) e após separação das fases, a
fase aquosa foi extraída com clorofórmio (2 x 40,0 mL). As fases orgânicas foram combinadas
e secas sob Na2SO4 anidro. Após remoção do solvente obteve-se um óleo amarelo escuro e
bastante viscoso. O produto bruto foi submetido à cromatografia em coluna “flash” (gel de
sílica, AcOEt/Hexano 1:3). Obteve-se 2,78 g do cicloaduto 65a, correspondendo a um
rendimento de 65%.
Propriedades Físicas de 65a
- Óleo levemente amarelo
- Rf = 0,15 (AcOEt/hexano 1:3)
DADOS ESPECTROMÉTRICOS DE 65a
RMN de 1H (300 MHz,CDCl3) δ, t.a
1,36 (t, J = 7,2 Hz, 3H); 1,68 a 1,93 (m, 4H); 3,21 (m, 1H); 3,36 (m, 1H); 3,82 (s, 3H); 4,34
(m, 3H); 6,33 (sl, 1H); 6,92 (dl, J = 9 Hz, 2H); 7,50 (dl, J = 9,0 Hz, 2H).
RMN de 13
C (75 MHz, CDCl3) δ, t.a
14,0 (CH3); 18,9 (CH2); 21,7 (CH2); 39,5 (CH2); 41,3 (CH ); 55,3 (CH3); 62,1 (CH2); 91,6
(CH); 113,8 (CH); 126,4 (C); 129,7 (CH); 155,9 (C); 160,0 (C); 161,4 (C=O).
I.V. (janelha KBr, cm-1
) principais sinais.
2.958, 1.722, 1.651, 1.606, 1.417, 1.344, 1.251, 1.176, 1.129, 1.024, 921, 843, 763.
E.M – Alta Resolução (m/z). Calculado 332.13722, encontrado 332.12713. Principais
sinais.
77.02489, 107.03699, 135.03258 (100%), 217.09206, 332.12713 (M+).
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Químico Página 86
6.1.6 – 7-(4-FLUORBENZOIL)-3a,4,5,6,7,7a-HEXAHIDROISOXAZOLO[5,4-
b]PIRIDINA-3-CARBOXILATO DE ETILA 65b
Procedimento experimental idêntico ao item 6.1.5.
Enamida 64b (2,17 g; 10,6 mmoles), clorofórmio seco (22,0 mL), duas aplicações
alternadas entre trietilamina (1,78 mL; 12,8 mmoles), e precursor 83 (1,76 g; 11,6 mmoles;
5,0 mL de clorofórmio).
Cromatografia em coluna “flash” (gel de sílica AcOEt/hexano 1:3) forneceu 2,37 g do
cicloaduto 65b correspondendo a um rendimento de 70%.
Propriedades Físicas de 65b
- Óleo incolor
- Rf = 0,18 (AcOEt/hexano 1:3)
DADOS ESPECTROMÉTRICOS DE 65b
RMN de 1H (300 MHz,CDCl3) δ, t.a, presença de rotâmeros.
1,36 (t, J = 7,2 Hz, 3H); 1,70 a 2,08 e 2,51 (m, 4H, rotâmeros); 3,24 (m, 1H); 3,37 e 3,80 (m,
1H, rotâmeros); 4,34 (m, 3H); 6,16 (sl, 1H); 7.12 (m, 2H); 7,59 (m, 2H).
RMN de 13
C (75 MHz, CDCl3) δ, t.a.
13,9 (CH3); 18,9 (CH2); 21,6 (CH2); 39,0 (CH2); 41,3 (CH ); 62,1 (CH2); 91,4 (CH); 115,6 (d,
J = 21,5Hz, CH); 129,9 (d, J = 8,5 Hz, CH); 130,0 (d, J = 8,4 Hz, C); 155,8 (C); 159,9 (C=O);
165,3 (d, J = 250 Hz, C); 171,2 (C=O).
I.V. (janela de KBr, cm-1
) principais sinais.
2.980, 1.725, 1.644, 1.602, 1.417, 1.376, 1.348, 1.233, 1.128, 922, 851, 762.
E.M – Alta Resolução (m/z). Calculado 320.11724, encontrado 320.11768. Principais
sinais.
75.02981, 95.03430, 123.03420 (100%), 205.10546, 247.10365, 303.11120, 320.11768 (M+).
N
O
N
O
F
COOEt
N
O
F64b 65b
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Químico Página 87
6.1.7 – SÍNTESE DA (3-HIDROXIMETIL-3a,5,6,7a-TETRAHIDRO-4H-
ISOXAZOLO[5,4-b]PIRIDINO-7-IL)-(4-METOXI-FENIL)-METANONA 66a [69]
.
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O
OO
O
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O
OH
O
65a66a
A uma solução do éster 65a (2,0 g; 5,74 mmol) em metanol seco (176,0 mL), a 0ºC e
vigorosa agitação, adicionou-se NaBH4 (0,66 g; 17,24 mmol; 3 equivalentes-mol em relação
ao éster isoxazolínico) em três porções de um equivalente. Após a total adição do agente
redutor, permitiu-se agitação por cerca de uma hora à 0o
C e mais uma hora à t.a. Quando
através de CCD, decretou-se o término da reação, identificando formação do álcool desde o
início da adição do NaBH4.
Após completo consumo do éster 65a, remoção do metanol e solubilização do produto
em 50,0 mL de acetato de etila, adicionou-se 30,0 mL de solução de saturada de NaCl, e
seguiu-se a extração, utilizando-se acetato de etila (3 x 30,0 mL). As fases orgânicas foram
combinadas e secas sob Na2SO4 anidro, e após filtração e remoção do solvente, seguiu-se uma
cromatografia em coluna “flash” (gel de sílica, AcOEt/Hexano a 7:3), obteve-se 1,17 g do
respectivo álcool puro 66a, com um rendimento de 70,2%.
Propriedades Físicas de 66a
- Rf: 0,15 (acetato de etila/ hexano 1:1).
- Liquido viscoso incolor.
DADOS ESPECTROMÉTRICOS DE 66a
RMN de 1H (300 MHz; CDCl3; ppm; J (Hz)) δ, t.a.
1,71 (m, 4H); 2,90 (sl, 1H); 3,12 (m, 1H); 3,19 (m, 1H); 3,81 (s, 3H); 4,18 (sl, 1H); 4,29 (d;
J= 14,4; 1H); 4,37 (d; J= 14,4; 1H); 6,11 (sl, 1H); 6,90 (d; J= 8,4; 2H); 7,52 (d; J= 8,4; 2H);
7,52 (d; J= 8,4; 2H).
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Químico Página 88
6.1.8 – SÍNTESE DA (4-FLUORO-FENIL)-(3-HIDROXIMETIL-3a,5,6,7a-
TETRAHIDRO4H-ISOXAZOLO[5,4-b]PIRIDIN-7-IL)-METANONA [69]
.
N
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O
O
OO
F
N
N
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O
OH
F
65b66b
Procedimento experimental idêntico ao item 6.1.7
Éster isoxazolínico 65b (1,85 g; 5,52 mmol), metanol (170,0 mL), NaBH4 (0,63 g;
16,57 mmoles).
Após a remoção do solvente, e efetuada a extração, promoveu-se uma cromatografia
em coluna “flash” (gel de sílica, AcOEt/Hexano 65%), obtendo-se 1,36 g do respectivo álcool
puro 66b, o que caracteriza um rendimento de 88,53%.
Propriedades Físicas de 66b
- Rf: 0,23 (AcOEt/hexano 65%)
- Liquido viscoso incolor.
DADOS ESPECTROMÉTRICOS DE 66b
RMN de 1H (300 MHz; CDCl3; ppm; J (Hz)) δ, t.a.
1,72 (m, 4H); 3,10 (sl, 1H); 3,18 (m, 2H); 4,19 (sl, 1H); 4,28 (d; J= 14; 1H); 4,36 (d; J= 14,0;
1H); 5,97 (sl, 1H); 7,01 (t; J= 9,0; 2H); 7,54 (m, 2H).
RMN de 13
C (75 MHz, CDCl3; ppm; J (Hz)) δ, t.a.
18,8 (CH2); 20,7 (CH2); 38,9 (CH2); 42,6 (CH); 57,1 (CH2); 88,8 (CH); 115,6 (d; J= 21,0;
CH); 129,9 (d; J= 8,6; 2H); 130,6 (C); 162,9 (C=N); 163,8 (d; J=250,0; C–F; em 165,4 e
162,1); 171,4 (C=O).
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Químico Página 89
6.1.9 – OBTENÇÃO DO 7-(4-METOXI-BENZOIL)-3a,4,5,6,7,7a-
HEXAHIDROISOXAZOLO[5,4-b]PIRIDINO-3-CARBALDEÍDO 67a [70]
.
N
N
O
O
HO
O
N
N
O
O
OH
O
66a 67a
Adicionou-se a um balão, 0,38 mL de cloreto de oxalila (4,43 mmol) e 9,5 mL de
CH2Cl2 (seco) e deixou-se sob agitação à temperatura de –72ºC, sob atmosfera de argônio.
Concomitantemente, são elaboradas mais outras duas soluções a t.a.; a primeira (solução 1)
contendo 0,60 mL de DMSO seco (8,42 mmol) em 1,8 mL de CH2Cl2 (seco) e a segunda
(solução 2) contendo o álcool 66a (1,14 g; 3,71 mmol) em 2,28 mL de CH2Cl2 (seco).
Estabilizaram-se a agitação e a temperatura, a –72 °C, adicionou-se a solução 1 ao balão
reacional e deixou-se em agitação por 2 minutos. Em seguida, a solução 2 foi adicionada
lentamente durante 5 minutos, deixando-se em agitação por mais 15 minutos. Por fim,
adicionou-se a trietilamina (2,70 mL; 19,24 mmol), deixando-se a reação em agitação por 5
minutos. Através de CCD verificou-se que todo o álcool havia sido consumido, evidenciando-
se a formação do aldeído 67a, parou-se a reação, removendo-se o banho.
Rapidamente dirigiu-se uma extração com 10 mL de água destilada e diclorometano
P.A. (3 x 20,0 mL), secando-se a água com sulfato de sódio anidro. Após remoção do
solvente, o produto bruto foi submetido à cromatografia em coluna “flash” (gel de sílica
AcOET/Hexano 3:7), no qual obteve-se 0,65 g do aldeído 67a puro, correspondendo a um
rendimento de 60,0 %.
Propriedades Físicas de 67a
- Precipitado amorfo bege.
- Rf: 0,57 (acetato de etila/ hexano 1:1)
- Ponto de fusão: 89°C
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Químico Página 90
DADOS ESPECTROMÉTRICOS DE 67a
RMN de 1H (300 MHz; CDCl3; ppm; J (Hz)) δ, t.a.
1,55–1,95 (m, 4H); 3,22 (m, 1H); 3,39 (m, 1H); 3,84 (s, 3H); 4,12 (sl; 1H); 6,42 (sl 1H); 6,93
(d; J= 8,7; 2H); 7,55 (d; J= 8,4; 2H); 9,83 (s, 1H).
RMN de 13
C (75 MHz, CDCl3; ppm; J (Hz)) δ, t.a.
18,6 (CH2); 20,8 (CH2); 39,0 (CH); 40,0 (CH2); 55,4 (CH3);92,3 (CH); 113,8 (CH); 126,3 (C);
129,7 (CH); 161,5 (C=N); 162,6 (C–O); 172,2 (C=O); 185,7 (CHO).
6.1.10 – OBTENÇÃO DO 7-(4-FLUORO-BENZOIL)-3a,4,5,6,7,7a-
HEXAHIDROISOXAZOLO[5,4-b]PIRIDINO-3-CARBALDEÍDO 67b [70]
.
N
N
O
O
HO
F
N
N
O
O
OH
F66b
67b
Procedimento experimental idêntico ao item 6.1.9.
Cloreto de oxalila 0,40 mL (4,67 mmol), 10,0 mL de CH2Cl2 seco; solução 1: 0,70 mL
de DMSO seco (2,0 mmol) em 2,0 mL de CH2Cl2 seco; solução 2: contendo o álcool 66b
(1,36 g: 3,95 mmol) em 2,5 mL de CH2Cl2 seco e (2,80 mL; 20,0 mmol) de trietilamina
Ao termino da reação, promoveu-se a extração e removeu-se o solvente. Quando
purificado por cromatografia em coluna “flash” (gel de sílica AcOET/Hexano 3:7), pôde-se
obter 0,47 g do aldeído 67b puro, que corresponde a um rendimento de 43,0 %.
Propriedades Físicas de 67b
- Precipitado amorfo branco
- Rf: 0,48 (acetato de etila/ hexano 2:3)
- Ponto de fusão: 135°C
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Químico Página 91
DADOS ESPECTROMÉTRICOS DE 67b
RMN de 1H (300 MHz; CDCl3; ppm; J (Hz)) δ, t.a.
1,75 (m, 4H); 3,26 (m, 1H); 3,42 (m, 1H); 4,16 (sl, 1H); 6,26 (sl, 1H); 7,13 (t; J= 8,5; 2H);
7,59 (m, 2H); 9,83 (s, 1H).
RMN de 13
C (75 MHz, CDCl3; ppm; J (Hz)) δ, t.a.
18,6 (CH2); 20,8 (CH2); 39,1 (CH); 40,0 (CH2); 92,4 (CH); 115,7 (d; J= 22,0; CH); 130,0 (d;
J= 8,5; CH); 130,4 (C); 162,5 (C=N); 163,9 (d; J=250; C–F; em 165,5 e 162,3); 171,4 (C=O);
185,6 (CHO).
6.1.11 – OBTENÇÃO DO N-FENIL-N-(4-METOXI-FENIL)-(3a, 5,6,7,7a-TETRAHIDRO-
4H-ISOXAZOLO[5,4-b]PIRIDINO-7-IL)METANONA-HIDRAZINA-
CARBOXAMIDA 68a [73]
.
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HO
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N
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HNH
O
NH
67a 68a
Adicionaram-se a 4-fenil-semicarbazida 69a (85,12 mg; 0,56 mmol) em etanol P.A.
(6,0 mL), HCL(aq.) concentrado (1 gota), e o aldeído isoxazolínico p-OMe 67a (154,6 mg; 0,54
mmol), lentamente. O sistema apresentou cor âmbar e aspecto oleoso. Em seguida, formou-se
um precipitado de coloração ambar, onde com 40 min. uma CCD confirmava o final da
reação.
Removeu-se o solvente, promoveu-se a purificação por recristalização, em etanol P.A.,
do precipitado, que se constituiu de 201,1 mg de semicarbazona isoxazolínica p-OMe 68a
pura, cujo o rendimento ofereceu 88,42%.
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Químico Página 92
Propriedades Físicas de 68a
- Precipitado amorfo branco a bege.
- Rf = 0,21 (Isopropanol/hexano 1:4).
- Ponto de fusão: 203-204 °C.
DADOS ESPECTROMÉTRICOS DE 68a
RMN de 1H (300 MHz; DMSO-D6; ppm; J (Hz)) δ, t.a.
1,63 (m, 3H); 1,97 (m, 1H); 3,03 (m, 1H); 3,77 (m, 1H); 3,80 (s, 3H); 4,04 (sl, 1H); 6,19 (sl,
1H); 7,04 (m, 3H); 7,30 (t; J= 8,1; 2H); 7,48 (d; J= 8,4; 2H); 7,54 (d; J= 7,5; 2H); 7,74 (s,
1H); 8,69 (s, 1H); 11,06 (s, 1H).
I.V. (pastilha de KBr, cm-1
) principais sinais.
3299; 3198; 3147; 2949; 1685; 1615; 1521; 1430; 1262; 1171; 1151; 760.
HRMS – IT-TOF (eltrospray) M++1.
422,1833.
6.1.12 – OBTENÇÃO DO N-FENIL-N-(4-METOXI-FENIL)-(3a,5,6,7,7a-
TETRAHIDRO-4H-ISOXAZOLO[5,4-b]PIRIDINO-7-IL)METANONA-HIDRAZINA-
CARBOTIOAMIDA 68b [73]
.
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O
HO
OMe
N
N
O
O
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OMe
HNH
S
NH
67a68b
A 4-fenil-tiossemicarbazida 69b (102,26 mg; 0,61 mmol) foi dissolvida em etanol
P.A. (6,5 mL), após a adição de HCL(aq.) concentrado (1 gota), aplicou-se, lentamente, o
aldeído isoxazolínico p-OMe 67a (167,9 mg; 0,58 mmol). A reação apresentou um aspecto de
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Químico Página 93
óleo amarelo viscoso, formando rapidamente um precipitado amarelado, cuja uma CCD
demonstrou o seu fim em 40 minutos.
Após remoção do solvente, recristalizou-se em etanol P.A., obtendo-se 229,0 mg de
tiossemicarbazona isoxazolínica 68b pura, e um rendimento 89,93 %.
Propriedades Físicas de 68b
- Precipitado amorfo amarelo claro.
- Rf = 0,34 (Isopropanol/hexano 1:4).
- Ponto de fusão: carbonizou em 193 °C.
DADOS ESPECTROMÉTRICOS DE 68b
RMN de 1H (300 MHz; DMSO-D6; ppm; J (Hz)) δ, t.a, presença de rotâmeros.
1,60 (m, 3H); 2,03 (m, 1H); 3,02 (m, 1H); 3,70 (m, 1H); 3,80 (s, 3H); 4,04 (sl, 1H); 6,20 (sl,
1H); 7,02 (d; J= 8,7; 2H); 7,24 (t; J= 8,7; 1H); 7,38 (t; J= 8,1; 2H); 7,47 (m; 4H); 7,93 (s,
1H); 9,97 (s, 1H); 12,08 (s, 1H).
RMN de 13
C (75 MHz, DMSO-D6, ppm)- DEPT δ, t.a.
19,5 (CH2); 22,3 (CH2); 39,6 (CH); 55,3 (CH3); 56,0 (CH2); 90,0 (CH); 113,8 (CH); 125,8
(CH); 126,2 (CH); 126,9 (C); 128,2 (CH); 129,3 (CH); 133,4 (C); 138,7 (C); 160,7 (C); 162,2
(C); 171,1 (C); 176,5 (C).
I.V. FT (pastilha de KBr, cm-1
) principais sinais.
3227; 3003; 2941; 2856; 1654; 1604; 1523; 1421; 1249; 1175; 939; 736; 609.
HRMS – IT-TOF (elerospray) M++1:
438,1609.
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Químico Página 94
6.1.13 – OBTENÇÃO DO N-FENIL-N-(4-FLUORO-FENIL)-(3a, 5,6,7,7a-
TETRAHIDRO-4H-ISOXAZOLO[5,4-b]PIRIDINO-7-IL)METANONA-HIDRAZINA-
CARBOXAMIDA 68c [73]
.
N
N
O
O
HO
F
N
N
O
O
N
F
HNH
O
NH
67b 68c
Em um balão de 25 mL, sob temperatura ambiente, preparou-se uma solução contendo
90,0 mg (0,60 mmol; 5% em excesso ao aldeído) da 4-fenil-semicarbazida 69a e 6,3 mL de
etanol P.A., logo depois, o meio foi acidificado com uma gota de ácido clorídrico
concentrado. Sob intensa agitação, adicionou-se lentamente ao sistema incolor 156,7 mg (0,57
mmol) do aldeído isoxazolinico p-F 67b. Quase que momentaneamente notou-se a formação
de um precipitado branco no recipiente reacional, e em 40 minutos foi realizada uma CCD, a
qual evidenciou o total consumo do reagente limitante.
Após remoção do solvente em evaporador rotatório, promoveu-se a purificação por
recristalização com etanol P.A., obtendo-se 93,9 mg de semicarbazona isoxazolínica 68c pura,
e rendimento 79,43%.
Propriedades Físicas de 68c
- Precipitado amorfo branco.
- Rf = 0,42 (Isopropanol/hexano 1:4).
- Ponto de fusão: carbonizou em 229° C.
DADOS ESPECTROMÉTRICOS DE 68c
RMN de 1H (300 MHz; DMSO-D6; ppm; J (Hz)) δ, t.a.
1,65 (m, 3H); 1,98 (m, 1H), 3,05 (m, 1H); 3,77 (m, 1H); 4,07 (sl, 1H), 6,09 (sl, 1H); 7,04 (t,
J= 7,2, 1H); 7,30 (m, 4H); 7,34 (s, 1H); 7,56 (m, 4H); 8,68 (s, 1H); 11,03 (s, 1H).
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Químico Página 95
RMN de 13
C (75 MHz, DMSO-D6, ppm; J (Hz))- DEPT δ, t.a.
19,2 (CH2); 21,9 (CH2); 36,9 (CH2); 40,2 (CH); 90,0 (CH); 115,5 (d; J= 21,0; CH); 120,2
(CH); 123,0 (CH); 128,5 (CH); 129,8 (d; J= 8,5; CH); 131,6 (CH); 138,5 (C–N); 152,3
(C=O); 161,7 (C=N); 163,0 (d, J=246; C–F; em 164,6 e 161,3); 170,4 (C=O).
I.V.-F.T. (Pastilha de KBr, cm-1
) principais sinais.
3303; 3207; 3152; 2952; 1685; 1620; 1523; 1436; 1228; 1160; 759.
HRMS. IT-TOF (elétrospray) M++1.
469,0291.
6.1.14 – OBTENÇÃO DO N-FENIL-N-(4-FLUORO-FENIL)-(3a, 5,6,7,7a-TETRAHIDRO-
4H-ISOXAZOLO[5,4-b]PIRIDINO-7-IL)METANONA-HIDRAZINA-
CARBOTIOAMIDA 68d [73]
.
N
N
O
O
HO
F
N
N
O
O
N
F
HNH
S
NH
67a68b
A temperatura ambiente, dissolveu-se a 4-fenil-tiossemicarbazida 69b (66,99 mg; 0,40
mmol; 5% em excesso do aldeído isoxazolínico) em etanol P.A. (4,25 mL), e após a
acidificação do meio com HCL(aq.) concentrado (1 gota), adicionou-se o aldeído isoxazolínico
p-F 67b (10,4 mg; 0,38 mmol) lentamente. Em poucos minutos percebeu-se a formação de um
precipitado, onde se seguiu uma CCD que confirmava o final da reação em 40 minutos.
Com a remoção do solvente, seguiu-se a purificação por recristalização em etanol
P.A., obtendo-se 51,0 mg de tiossemicarbazona isoxazolínica 68d pura, de rendimento 31,5%.
Propriedades Físicas de 68d
- Precipitado amorfo bege.
- Rf = 0,47 (Isopropanol/hexano 1:4).
- Ponto de fusão: carbonizou em 218°C.
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Estudo Químico Página 96
DADOS ESPECTROMÉTRICOS DE 68d
RMN de 1H (300 MHz; DMSO-D6; ppm; J (Hz)) δ, t.a.
1,60 (m, 3H); 2,01 (m, 1H), 3,05 (m, 1H); 3,73 (m, 1H); 4,15 (sl, 1H), 6,01 (sl, 1H); 7,20-7,60
(m, 9H); 7,91 (s, 1H); 9,99 (s, 1H); 12,09 (s, 1H).
RMN de 13
C (75 MHz, DMSO-D6, PPM; J (Hz))- DEPT δ, t.a.
19,3 (CH2); 22,3 (CH2); 39,0 (CH2); 39,8 (CH); 90,4 (CH); 115,5 (d; J= 20,0; CH); 125,9
(CH); 126,3 (CH); 128,3 (CH); 129,8 (CH); 131,5 (C); 133,4 (CH); 138,7 (C–N); 162,2
(C=N); 163,0 (d; J= 246,0; em 164,6 e 161,3; C–F); 170,6 (C=O); 170,4 (C=S).
I.V.-F.T. (Pastilha de KBr, cm-1
) principais sinais.
3348; 3166; 3010; 2964; 2875; 1622; 1600; 1546; 1436; 1253; 1190; 914; 839.
HRMS. IT-TOF (elétrospray) M++1.
426,1377.
6.2 – SÍNTESE RACÊMICA DOS DERIVADOS SEMICARBAZONAS E
TIOSEMICARBAZONAS DE 2-ISOXAZOLINAS PIRROLIDÍNICAS.
6.2.1 – TRÍMERO DA Δ1-PIRROLINA (ISÔMERO α) 72
N
H
N N
N
7172
Na2S2O8 25%
NaOH(aq)
AgNO3 cat.
0ºCH2O
Uma solução aquosa de hidróxido de sódio (5,74 g; 144,0 mmol) foi preparada, e a
uma temperatura de 0°C, sob vigorosa agitação, aplicaram-se a pirrolidina 71 (5,8 mL; 72,0
mmol), e nitrato de prata (59,0 mg; 0,33 mmol), em um total de 70,0 mL de água. Por fim,
uma solução 25% de persulfato de sódio (6,91 g; 72,0 mmol; 67,0 mL) foi adicionada,
lentamente, ao sistema pré-reacional, o qual permaneceu em agitação por uma hora a 0°C e
mais duas horas à temperatura ambiente.
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Estudo Químico Página 97
A solução escura resultante foi extraída com diclorometano (4 x 30,0 mL). Secou-se a
fase orgânica sob sulfato de sódio anidro e após remoção do solvente obteve-se 4,13 g de um
líquido amarelado viscoso, correspondendo a um rendimento de 83,0 % do trímero 72.
O trímero 72 é utilizado, o mais rápido possível, sem qualquer purificação adicional,
na preparação do enecarbamato N-(benziloxicarbonil)-2-pirrolina, devido a sua instabilidade.
Propriedades Físicas de 72
- Óleo amarelo viscoso;
- Sensível a solventes próticos.
DADOS ESPECTROMÉTRICOS 72
RMN de 1H (CDCl3, δ, ppm, 300 MHz, t.a.).
(parte do monômero está presente, devido ao equilíbrio).
1,75 (m); 2,28 (m); 2,50 (m); 2,99 (m); 3,82(m); 7,59 (s).
6.2.2 – N-(BENZILOXICARBONIL)-2-PIRROLINA 74
N N
N
N
OO
7274
N
73
Promoveu-se a co-destilação da solução de trímero da Δ1-pirrolina 72 (2,30 g; 11,14
mmol; 113,0 mL de THF seco) a 80°C, em atmosfera anidra, recolhendo-se a solução límpida
incolor em um recipiente a 0°C. Ao término da destilação, juntaram-se a solução destilada,
em refluxo, a trietilamina (3,15 mL; 22,28 mmol) e a solução 50% de cloroformato de benzila
(7,5 mL; 22,28 mmol), em tolueno, esta adicionada lentamente, mantendo-se o refluxo
durante quatro horas.
A suspensão foi filtrada em funil sinterizado e após remoção do solvente, obteve-se
um óleo amarelado. O cloreto de benzila, presente como subproduto, foi removido por
filtração simples em coluna cromatográfica “flash”, utilizando-se apenas hexano e
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Estudo Químico Página 98
AcOEt/hexano 1:9. Obteve-se 1,54 g de um líquido incolor correspondendo a um rendimento
de 68% do enecarbamato 74.
Propriedades Físicas de 74
- Óleo incolor
- Rf = 0,26 (AcOEt/hexano 1: 9)
DADOS ESPECTROMÉTRICOS 74
RMN de 1H (CDCl3, δ, ppm, 300 MHz, t.a.), presença de rotâmeros.
2,64 (ql; J = 9,7 Hz; 2H); 3,77 (q; J = 9,1 Hz; 2H); 5,02 e 5,07 (m, 1H, rotâmeros); 5,17 (s;
2H); 6,54 e 6,63 (m, 1H, rotâmeros); 7,35 (m; 5H).
I.V. (filme, cm-1
), principais sinais.
3.032, 2.956, 1.706, 1.618, 1.422, 1.342, 1.214, 1.128, 756, 698.
6.2.3 – ÉSTER 6-BENZIL-3-ETIL DO ÁCIDO 3a,4,5,6a-TETRAHIDROPIRROLO
[3,2-d]ISOXAZOL-3,6-DICARBOXÍLICO 75
O
N
N
OO
O O
N
OO
7574
Em um balão acoplado a um funil de adição com equalizador de pressão e contendo
um agitador magnético, foi adicionado o enecarbamato 74 (3,83 g; 18,87 mmol),
tetrahidorfurano seco (40,0 mL) para dissolver o enecarbamato. Em seguida, aplicou-se a
trietilamina (5,26 g; 37,73 mmol, excesso de dois equivalentes-mol em relação ao
enecarbamato, aplicada em duas partes alternadas a solução do precursor do CEFNO). A este
sistema, sob forte agitação, deixar gotejar calmamente, a solução de clorooximidoacetato de
etila 83, precursor do dipolo 84, (5,7 g; 37,73 mmol, excesso de dois equivalentes-mol em
relação enecarbamato; em 36,0 ml de THF seco, aplicado em duas vezes). A reação foi
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Estudo Químico Página 99
acompanhada através de CCD, onde se percebeu a formação do produto, cicloaduto 75, desde
o início da adição do precursor 83 do N-óxido de nitrila.
Após 2 horas de reação e total consumo do material de partida, removeu-se o solvente.
O sal formado, cloreto de trietilamônio, foi filtrado em funil sinterizado, utilizando-se uma
mistura de acetato de etila. Após remoção do solvente, obteve-se um óleo amarelo escuro e
bastante viscoso. O produto bruto foi submetido à cromatografia em coluna “flash” (gel de
sílica, AcOEt/Hexano 2:3), obtendo-se 5,12 g do cicloaduto 75, correspondendo a um
rendimento de 87%.
Propriedades Físicas de 75
- Óleo amarelo claro viscoso.
- Rf = 0,47 (AcOEt/hexano 1:1)
DADOS ESPECTROMÉTRICOS 75
RMN de 1H (CDCl3, δ, ppm, 300 MHz, t.a.), presença de rotâmeros.
7,36 (m; 5H); 6,53 e 6,42 (d; J=7,5Hz; 1H; rotâmeros); 5,2 (m; 2H); 4,36 (m; 2H); 4,08 (m;
1H); 3,84 (m; 1H); 3,18 (dt; J= 11,1Hz; J= 11,1Hz; J=6,3; 1H); 2,23 (m; 2H); 1,37 (t;
J=7,2Hz; 3H).
6.2.4 – ÉSTER ETÍLICO DO ÁCIDO 3a,4,5,6,6a-TETRAHIDROPIRROLO[3,2-
d]ISOXAZOL-3-CARBOXÍLICO 76
O
N
N
H
OO
O
N
N
OO
O O
7576
Dissolveu o cicloaduto 75 (2,03 g; 11,03 mmol) em metanol P.A. (186,0 mL). Em seguida,
adicionou-se o paládio/carbono 10% (103,1 mg) e à mistura reacional, sob agitação vigorosa,
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Químico Página 100
borbulhou-se o gás hidrogênio durante uma hora, quando por CCD se pode confirmar o fim
da reação.
Promoveu-se uma filtração à vácuo, sob camada de celite, após a remoção do solvente,
e pôde-se obter 1,0 g da isoxazolina N-desprotegida 76 pura, correspondendo a um
rendimento quantitativo. O composto 76 foi utilizado nas reações subseqüentes sem
necessidade de submetê-lo a qualquer procedimento de purificação.
Propriedades Físicas de 76
- Óleo incolor
- Rf = 0,25 (AcOEt/hexano 1:1).
DADOS ESPECTROMÉTRICOS 76
RMN de 1H (CDCl3, δ, ppm, 300 MHz, t.a.), presença de rotâmeros.
6,07 (d; J= 6,9Hz; 1H); 4,32 (m; 2H); 3,87 (m; 1H); 3,12 (m; 1H); 2,81 (ml; 2H); 2,07 (m;
2H); 1,35 (t; J=6Hz; 3H).
RMN de 13
C (CDCl3, δ, ppm, 75 MHz, t.a.).
160,5 (C); 152,3 (C); 100,8 (CH); 61,9 (CH2); 49,1 (CH2); 42,8 (CH); 29,9 (CH2); 14,0 (CH3).
6.2.5 – ÉSTER ETÍLICO DO ÁCIDO 6-(4-FLUOROBENZOIL)-4,5,6a
TETRAHIDRO-3aH-PIRROLO[3,2-d]ISOXAZOL-3-CARBOXÍLICO 77a
O
N
N
OO
O
F
O
N
N
H
OO
76 77a
Em um balão de 250 mL foram solubilizados a isoxazolina N-desprotegida 76 (1,39 g;
7,55 mmol) e trietilamina seca (1,02 mL; 8,31 mmol), em clorofórmio seco (200,0 mL). Sob
vigorosa agitação, adicionou-se cloreto de 4-fluorobenzoíla (0,98 mL; 8,31 mmol), que foi
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Químico Página 101
adicionado lentamente durante 10 minutos e sob atmosfera de argônio. A reação foi deixada
sob agitação, à temperatura ambiente, por mais uma hora adicional.
Após remoção do solvente, promoveu-se uma extração com 20,0 mL de acetato de
etila para dissolver o produto reacional, seguida de 10,0 mL de água destilada e mais 4 x 20,0
mL de acetato de etila, retirou-se a água com sulfato de sódio anidro, seguida de uma filtração
simples, onde por fim removeu-se o solvente no evaporador rotatório.
O produto foi purificado através de recristalização em etanol P.A., e uma posterior
remoção do solvente por evaporador rotatório, obtendo-se assim 2,05 g do N-(benzoil)-
isoxazolina 77a, o que corresponde a um rendimento de 88,4 %.
Propriedades Físicas de 77a
- Precipitado branco cristalino.
- Rf = 0,39 (AcOEt/hexano 1:1)
- Ponto de fusão: 74°C.
DADOS ESPECTROMÉTRICOS 77a
RMN de 1H (CDCl3, δ, ppm, 300 MHz, t.a.), presença de rotâmeros.
1,38 (t; J = 7,0 Hz; 3H); 2,22 (m; 1H); 2,40 (dd; J = 6,0Hz; J = 13,5Hz; 1H); 3,20 (ml; 1H);
4,12 (t; J = 8,0Hz; 1H); 4,36 (m; 3H); 6,22 (sl; 1H); 7,12 (m; 2H); 7,69 (sl; 2H).
RMN de 13
C (CDCl3, δ, ppm, 75 MHz, t.a.)
14,08 (CH3); 27,95 (CH2); 43,53 (CH2); 51,19 (CH); 62,4 (CH2); 96,17(CH); 115,6(d; J =
21,5Hz; CH); 130,4(CH); 164,1(d; J = 250,0Hz; C-F); 131,0(C); 152,4(C); 159,8(C=O);
168,7(C=O).
I.V. - FT (janela de KBr, cm-1
), principais sinais.
3.030, 2.986, 2.860, 1.721, 1.652, 1.600, 1.509, 1.408, 1.270, 1.131; 931, 853.
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Químico Página 102
6.2.6 – ÉSTER ETÍLICO DO ÁCIDO 6-(4-CLOROBENZOIL)-4,5,6,6a-
TETRAHIDRO-3aH-PIRROLO[3,2-d]ISOXAZOL-3-CARBOXÍLICO 77b
O
N
N
OO
O
Cl
O
N
N
H
OO
76 77b
Procedimento experimental idêntico ao item 6.2.5.
Isoxazolina N-desprotegida 76 (1,01 g; 5,48 mmol), trietilamina seca (0,82 mL; 6,03
mmol), clorofórmio seco (145,0 mL) e cloreto de 4-clorobenzoila (0,77 mL; 6,03 mmoles).
Uma extração com acetato de etila, seguida de uma cromatografia em coluna “flash”
(gel de sílica AcOEt/hexano 3:7), forneceu 1,59 g do cicloaduto 77b, correspondendo a um
rendimento de 92,0 %.
Propriedades Físicas de 77b
- Precipitado branco cristalino.
- Rf = 0,38 (AcOEt/hexano 1:1).
- Ponto de Fusão: 63-65°C
DADOS ESPECTROMÉTRICOS 77b
RMN de 1H (CDCl3, δ, ppm, 300 MHz, t.a.) presença de rotâmeros.
1,36 (t;J = 7,0Hz; 3H); 2,19 (ml; 1H); 2,37 (ddl; J = 5,9Hz; J = 12,9Hz; 1H); 3,17 (sl; 1H);
4,07 (m;1H); 4,35(m; 3H); 6,16 (sl; 1H; rotâmero em 6,97); 7,4 (dl; J = 8,4Hz; 2H); 7,6 (ml;
2H).
RMN de 13
C (CDCl3, δ, ppm, 75 MHz, t.a.)
14,0(CH3); 27,8(CH2); 43,5(CH2); 51,1(CH); 62,3(CH2); 95,8(CH); 128,6(CH); 129,5(CH);
133,1(C); 137,0(C); 152,2(C); 159,7(C=O); 168,5(C=O).
I.V. - FT (janela de KBr, cm-1
), principais sinais.
2.985, 1.724, 1.650, 1.591, 1.408, 1.270, 1.180, 1.132, 1.015, 931, 836, 756.
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Químico Página 103
6.2.7 – ÉSTER ETÍLICO DO ÁCIDO 6-(4-NITROBENZOIL)-4,5,6a-TETRAHIDRO-
3aH-PIRROLO[3,2-d]ISOXAZOL-3-CARBOXÍLICO 77c
N
N
O
O
OO
NO2
N
N
O
H
OO
7677c
Procedimento experimental idêntico ao item 6.2.5.
Isoxazolina N-desprotegida 76 (160,0 mg; 0,87 mmol), trietilamina seca (0,25 mL; 0,9
mmol, ligeiro excesso), clorofórmio seco (25,0 mL) e cloreto de 4-nitrobenzoíla (161,3 mg;
0,87 mmol; em 4,0 mL de clorofórmio), a reação foi deixada sob agitação por mais um hora a
t.a.
Após remoção do solvente, o produto foi extraído em acetato de etila (1 x 10,0 mL + 4
x 20,0 mL) e água destilada (10,0 mL); e foi purificado através de recristalização em etanol
P.A., em seguida removeu-se o excesso de solvente. Obtiveram-se assim 0,24 g do produto
77c, correspondendo a um rendimento de 82%.
Propriedades Físicas de 77c.
- Precipitado branco cristalino
- Rf = 0,35 (AcOEt/hexano 1:1)
- Ponto de Fusão: 110°C.
DADOS ESPECTROMÉTRICOS DE 77c
RMN de 1H (300 MHz,CDCl3) δ, t.a, presença de rotâmeros.
1,36 (t;J = 7,2 Hz; 3H); 2,24 (m; 1H); 2,42 (dd; J = 6,1Hz; J = 13,3Hz; 1H); 3,21 (ml; 1H);
4,13 (m; 1H); 4,35(m; 3H); 6,07 (d; J =7,8Hz; 1H; rotâmero em 6,91); 7,83 (dl; J = 7,8Hz;
2H); 8,28 (d; J = 8,7; 2H).
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Químico Página 104
RMN de 13
C (75 MHz, DMSO) δ, t.a.
13,9 (CH3); 27,6 (CH2); 43,5 (CH2); 51,4 (CH); 62,4 (CH2); 95,3 (CH); 123,7 (CH); 129,0
(CH); 140,6 (C); 148,9 (C); 152,4 (C); 159,6 (C=O); 167,5 (C=O)
I.V. - FT (janela de KBr, cm-1
), principais sinais.
2.970, 1.722, 1.652, 1.600, 1.524, 1.414, 1.350, 1.272, 1.130, 829.
E.M. – Alta Resolução (m/z), calculado 333,09609, encontrado 333,09763. principais
sinais.
59.0484 (100%), 76.03306, 101.06232, 120.04708, 150.02432, 218.06591, 234.06628,
316.09288, 333.09763 (M+).
6.2.8 – OBTENÇAO DO ÁLCOOL (4-FLUOROFENIL)-(3-HIDROXIMETIL-
3a,4,5,6a-TETRAHIDRO-PIRROLO[3,2-d]ISOXAZOL-6-IL-METANONA 78a [69]
N
N
O
O
F
OO
N
N
O
O
F
OH
77a 78a
A uma solução de éster 77a (2,05g; 6,7 mmol) e metanol seco (180,0 mL), a 0ºC e sob
vigorosa agitação, adicionou-se NaBH4 (0,76 g; 20,04 mmol; 3 equivalentes-mol do éster
isoxazolínico) em três partes iguais. Ao término da adição, deixou-se sob agitação por cerca
de uma hora à 0o
C e uma hora à t.a. A reação foi acompanhada através de CCD, onde se
visualizou a formação do álcool desde o início da adição do NaBH4.
Após remoção do metanol, promoveu-se uma extração solubilizando o produto em
50,0 mL de acetato de etila, seguida da adição de 30,0 mL de água destilada e acetato de etila
(3 x 30,0 mL). Retirou-se a água com Na2SO4 anidro, o solvente foi filtrado e removido.
Conseguindo-se um óleo incolor bastante viscoso, no qual, após cromatografia em coluna
“flash” (gel de sílica, AcOEt/Hexano 4:3 no início, e 7:3 após saída do produto), pode-se
obter 1,56 g do respectivo álcool puro 78a, com um rendimento de 88,2 %.
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Estudo Químico Página 105
Propriedades Físicas de 78a
- Óleo incolor viscoso.
- Rf = 0,10 (AcOEt/hexano 1:1)
DADOS ESPECTROMÉTRICOS 78a
RMN de 1H (CDCl3, δ, ppm, 300 MHz, t.a.), presença de rotâmeros.
2,06 (m, 1H); 2,27 (dd; J = 12,6; J = 5,7 Hz; 1H); 3,00 (m, 1H) rotâmero em 3,40; 4,00 – 4,20
(m, 2H); 4,24 (m, 2H); 5,39 (t; J = 6,0 Hz; 1H OH); 6,03 (d; J = 7,5 Hz; 1H); rotâmero em
6,53; 7,33 (m; 2H); 7,67 (m; 2H).
RMN de 13
C (CDCl3, δ, ppm, 75 MHz, t.a.), presença de rotâmeros.
25,9 (CH2) rotâmero 27,3; 43,5 (CH2) rotâmero 47,4; 52,8 (CH) rotâmero 50,8; 55,2 (CH2);
92,7 (CH) rotâmero 90,1; 115,3 (d; J = 21,0 Hz; CH); 130,3 (CH); 132,1 (C); 159,9 (C=N);
164,7 e 161,5 (d; J = 240 Hz, C); 167,9 (C=O);
I.V. - FT (janela de KBr, cm-1
), principais sinais.
3506, 3052, 2970, 2884, 1639, 1597, 1500, 1415, 1210, 1153, 845
6.2.9 – OBTENÇÃO DO ÁLCOOL (4-CLOROFENIL)-(3-HIDROXIMETIL-3a,4,5,6a-
TETRAHIDRO-PIRROLO[3,2-d]ISOXAZOL-6-IL-METANONA 78b [69]
.
N
N
O
O
Cl
OO
N
N
O
O
Cl
OH
77b 78b
Procedimento experimental idêntico ao item 6.2.9.
Éster isoxazolínico 78b (1,23 g; 4,0 mmol), metanol (120,0 mL), NaBH4 (0,46 g;
12,20 mmol).
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Químico Página 106
Foi obtido um óleo incolor bastante viscoso, no qual, após cromatografia em coluna
“flash” (gel de sílica, AcOEt/Hexano 7:3), obteve-se 1,0 g do respectivo álcool puro 78b,
com um rendimento de 90 %.
Propriedades Físicas de 78b
- Óleo incolor viscoso
- Rf = 0,11 (AcOEt/hexano 1:1)
DADOS ESPECTROMÉTRICOS 78b
RMN de 1H (CDCl3, δ, ppm, 300 MHz, t.a.), presença de rotâmeros.
2,00 – 2,20 (m, 1H); 2,30 (dd, J = 13 Hz; J = 5,7 Hz; 1H); 2,90 – 3,65 (m, 2H); 4,00 (m, 1H);
4,35 (d; J = 14,1 Hz; 1H); 4,44 (d; J = 14,1; 1H); 5,97 (d; J = 7,0 Hz; 1H) rotâmero em 6,72;
7,40 (d; J = 8,1 Hz, 2H); 7,64 (dl; J = 8,0 Hz, 2H).
RMN de 13
C (CDCl3, δ, ppm, 75 MHz, t.a.)
26,7 (CH2); 43,4 (CH2) rotâmero em 47; 52,6 (CH); 56,8 (CH2); 93,3 (CH) rotâmero em 91;
128,6 (CH); 129,6 (CH); 133,3 (C); 136,9 (C); 158,9 (C=N); 169,1 (C=O).
I.V. - FT (janela de KBr, cm-1
), principais sinais.
3508, 3080, 2970, 2888, 1632, 159, 1505, 1420, 1215, 848.
6.2.10 – OBTENÇÃO DO ÁLCOOL (4-NITROFENIL)-(3-HIDROXIMETIL-3a,4,5,6a-
TETRAHIDRO-PIRROLO[3,2-d]ISOXAZOL-6-IL-METANONA 78c [69]
.
N
N
O
O
NO2
OO
N
N
O
O
NO2
OH
77c 78c
Procedimento experimental idêntico ao item 6.2.8.
Éster isoxazolínico 77c (0,78 g; 2,342 mmol), metanol (70,0 mL), NaBH4 (0,27 g; 7,03
mmol).
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Químico Página 107
Foi obtido um óleo amarelado escuro bastante viscoso, o qual, após cromatografia em
coluna “flash” (gel de sílica, AcOEt/Hexano 2:3 no início, e 7:3 depois), apresentou 0,65 g do
respectivo álcool puro 78c e um rendimento de 95 %.
Propriedades Físicas de 78c
- Precipitado branco.
- Rf = 0,11 (AcOEt/hexano 1:1)
- Ponto de Fusão: 110°C
DADOS ESPECTROMÉTRICOS 78c
RMN de 1H (300 MHz; DMSO-D6; ppm; J (Hz)) δ, t.a, presença de rotâmeros.
2,23 (m, 2H); 3,08 (m; 1H); 3,70 (m; 1H); 4,24 (m, 1H); 4,28 (sl, 1H); 5,16 (s; 1H; rotâmero
em 5,14); 6,40 (d; J= 7,8; 1H); 7,38 (m, 4H).
RMN de 13
C (75 MHz, DMSO-D6, ppm)- DEPT δ, t.a.
26,9 (CH2; rotâmero em 27,7); 44,2 (CH2), 50,8 (CH; rotâmero em 49,7); 94,2 (CH; rotâmero
em 95,0); 128,4; 127,9; 127,7; 127,5 (dois CH com rotâmeros); 136,4 (C); 152,5 (C); 152,6
(C=N; rotâmero em 153,3); 159,4 (C=O).
I.V.-F.T. (Pastilha de KBr, cm-1
) principais sinais.
3406; 3108; 3077; 2954; 1639; 1599; 1523; 1424; 1350; 843.
HRMS- IT- TOF (elétrospray); M++1
292,0909.
6.2.11 – OBTENÇÃO DO 6-(4-FLUORBENZOIL)-4,5,6,6a-TETRAHIDRO-
3aHPIRROLO[3,2-d]ISOXAZOL-3-CARBALDEÍDO 79a [70]
N
N
O
O
F
HO
N
N
O
O
F
OH
78a 79a
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Químico Página 108
Adicionou-se a um balão, 0,50 mL de cloreto de oxalila (5,86 mmol) e 10,9 mL de
CH2Cl2 seco e deixou-se sob agitação à temperatura de –72ºC, sob atmosfera de argônio.
Concomitantemente, são elaboradas mais outras duas soluções a t.a.; a primeira (solução 1)
contendo 0,84 mL de DMSO seco (11,77 mmol) em 2,5 mL de CH2Cl2 e a segunda (solução
2) contendo o álcool 78a (1,25g: 4,73mmol) em 3,0 mL de CH2Cl2. Estabilizaram-se a
agitação e a temperatura, a –72 °C, e adicionou-se a solução 1, ao balão reacional, deixou-os
em agitação por 2 minutos. Em seguida, a solução 2 foi aplicada lentamente durante 5
minutos, deixando-se em agitação por mais 15 minutos. Por fim, adicionou-se a trietilamina
(3,35 mL; 23,87 mmol), deixando-se a reação em agitação por 5 minutos. Através de CCD
verificou-se que todo o álcool havia sido consumido, evidenciando-se a formação do aldeído
79a, parando a reação com a aplicação direta de água destilada no meio reacional.
Promoveu-se uma extração com diclorometano P.A. (3 x 20,0 mL), retirando-se a água
com sulfato de sódio anidro. Após remoção do solvente, o produto bruto foi submetido à
cromatografia em coluna “flash” (gel de sílica AcOET/Hexano 1:4), permitindo a obtenção de
1,0 g do aldeído 79a puro, correspondendo a um rendimento de 80,62%.
Propriedades Físicas de 79a
- Sólido amorfo amarelo claro
- Rf =0,45 (AcOEt/hexano 2:3)
- Ponto de fusão: 129 ºC.
DADOS ESPECTROMÉTRICOS 79a
RMN de 1H (CDCl3, δ, ppm, 300 MHz, t.a.), presença de rotâmeros.
2,10 – 2,20 (m, 2H); 3,13 (sl; 1H) rotâmero em 3,66; 4,04 (t; J= 8,1 Hz; 1H); 4,44 (sl; 1H);
6,24 (sl; 1H); 7,12 (t; J = 8,4 Hz; 2H); 7,69 (sl; 2H); 9,88 (s, 1H).
RMN de 13
C (CDCl3, δ, ppm, 75 MHz, t.a.), presença de rotâmeros.
27,3 (CH2); 43,4 (CH2); 48,4 (CH); 97,1 rotâmero em 94,3; 115,6 (d; J = 21 Hz; CH); 130,5
(CH); 132,0 (C); 159,1 (C=N); 162,5 e 165,8 (d; J= 250 Hz, C); 168,6 (C=O); 185,2 (C=O).
IV- FT (pastilha de KBr, cm-1
), principais sinais.
3048, 2960, 2857, 1700, 1626, 1590, 1388, 1230, 854.
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Químico Página 109
6.2.12 – OBTENÇÃO DO 6-(4-CLOROBENZOIL)-4,5,6,6a-TETRAHIDRO-3aH-
PIRROLO[3,2-d]ISOXAZOL-3-CARBALDEÍDO 79b [70]
N
N
O
O
Cl
HO
N
N
O
O
Cl
OH
78b 79b
Procedimento experimental idêntico ao item 6.2.11.
Cloreto de oxalila 0,47 mL (5,42 mmol), 10,08 mL de CH2Cl2 seco, solução 1: 0,77
mL de DMSO seco (10,89 mmol) em 2,23 mL de CH2Cl2 (seco), solução 2: contendo o álcool
78b (1,23 g: 4,38 mmol) em 2,7 mL de CH2Cl2 e (8,0 mL; 57,0 mmol) de trietilamina.
Finalizou-se a reação executa-se uma extração, removeu-se o solvente e obteve-se 0,59
g do aldeído 79b puro, após cromatografia em coluna “flash” (gel de sílica AcOET/Hexano
1:4), o correspondente a um rendimento de 48,3 %.
Propriedades Físicas de 79b
- Sólido amorfo amarelo claro
- Rf = 0,43 (AcOEt/hexano 2:3)
- Ponto de fusão: 124 ºC
DADOS ESPECTROMÉTRICOS 79b
RMN de 1H (DMSO-D6, δ, ppm, 300 MHz, t.a.), presença de rotâmeros.
2,00 – 2,40 (m, 2H); 3,07 (m, 1H) rotâmero em 3,94; 4,16 (m, 2H); 6,30 (d; J = 6,6 Hz; 1 H)
rotâmero em 6,81; 7,61 (sl; 4H); 9,81 (s, 1H).
RMN de 13
C (DMSO-D6, δ, ppm, 75 MHz, t.a.),presença de rotâmeros.
26,2 (CH2; rotâmeros em 27,6); 43,6 (CH2; rotâmero em 46,7); 48,6 (CH; rotâmero em 47,3);
96,9 (CH; rotâmero em 94,0); 128,6 (CH); 129,6; (CH);
IV - FT (pastilha de KBr, cm-1
), principais sinais.
3030, 2980, 2861, 1650, 1626, 1580, 1398, 1250, 1090, 915, 843.
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Químico Página 110
6.2.13 – OBTENÇÃO DO 6-(4-NITROBENZOIL)-4,5,6,6a-TETRAHIDRO-
3aHPIRROLO[3,2-d]ISOXAZOL-3-CARBALDEÍDO 79c [70]
N
N
O
O
NO2
HO
N
N
O
O
NO2
OH
78c 79c
Procedimento experimental idêntico ao item 6.2.11.
Cloreto de oxalila 0,37 mL (4,26 mmoles), 7,9 mL de CH2Cl2 seco, solução 1: 0,61
mL de DMSO seco (8,54 mmoles) em 1,82 mL de CH2Cl2 seco, solução 2: contendo o álcool
78c (1,00 g: 3,433 mmoles) em 2,13 mL de CH2Cl2 seco e (2,43 mL; 17,32 mmoles ) de
trietilamina.
Com o fim da reação promoveu-se a extração, removeu-se o solvente e procedeu-se a
purificação através de uma cromatografia em coluna “flash” (gel de sílica AcOET/Hexano
1:4), obtendo-se assim 1,03 g do aldeído 79c puro, rendimento correspondente a 65,2%.
Propriedades Físicas de 79c
- Sólido amorfo amarelo claro
- Rf =0,45 (AcOEt/hexano 2:3)
- Ponto de fusão: 81 ºC
DADOS ESPECTROMÉTRICOS 79c
RMN de 13
C e 1H (DMSO-D6, δ, ppm, 300 MHz, t.a.).
Substância degradou em solução, porém, sinal em 9,79 ppm, referente ao hidrogênio aldeídico
aparece, em RMN 1H, assim como o sinal 186,1; referente ao carbono aldeídico em RMN
13C.
A análise de RMN será repetida imediatamente após a diluição da amostra.
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Químico Página 111
I.V. - FT (pastilha de KBr, cm-1
), principais sinais.
3080, 2986, 2862, 1702, 1625, 1580, 1389, 1266; 1167, 1090; 921, 841; 759; 484.
HRMS- IT- TOF (elétrospray); M++1
396,1469.
6.2.14 – OBTENÇÃO DA N-FENIL-N-(4-FLUORO-FENIL)--3a,4,5,6a-TETRAHIDRO-
PIRROLO[3,2-d]ISOXAZOLO-6-IL-METANONA-HIDRAZINA-CARBOXIAMIDA
80a [73]
.
79a
80a
N
N
O
O
NH
HN
O
NH
F
N
N
O
O
H
F
O
Em um balão de 25 mL, são adicionados a temperatura ambiente, a 4-fenil-
semicarbazida 69a (196,0 mg; 1,23 mmol), etanol P.A. (14,5 mL), e ácido clorídrico
concentrado P.A (2 gotas). Ao mesmo instante que se aplica a solução o aldeído isoxazolinico
p -F 79a (340,0 mg; 1,30 mmol), nota-se a formação de um precipitado branco, e em 30
minutos uma CCD demonstra o final da reação.
Após remoção do solvente, recristalizou-se a tiosemicarbazona isoxazolinica 80a, em
etanol P.A., obtendo-se 317,10 mg do produto puro, com 61,85% de rendimento.
Propriedades Físicas de 80a
- Precipitado amorfo branco.
- Rf = 0,56 (Isopropanol/hexano 1:4).
- Ponto de fusão: 235-237°C.
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Químico Página 112
DADOS ESPECTROMÉTRICOS DE 80a
RMN de 1H (300 MHz; DMSO-D6; ppm; J (Hz)) δ, t.a, presença de rotâmeros.
2,24 (m, 1H); 2,37 (m,1H); 3,06 (m; 1H; rotâmero em 3,44); 4,13 (m; 1H; rotâmero em 3,75);
4,41 (t, J= 8,0; 1H); 6,23 (sl; 1H; rotâmero em 6,72); 7,04 (t; J= 7,0; 1H); 7,30 (t, J= 7,2; 2H);
7,40-7,80 (m, 6H); 7,82 (s, 1H); 8,72 (s; 1H; rotâmero 8,69); 11,10 (s; 1H; rotâmero 11,0).
RMN de 13
C (75 MHz, DMSO-D6, ppm)- DEPT δ, t.a., presença de rtoâmeros.
27,5 (CH2; rotâmero em 29,0); 43,6 (CH2, rotâmero em 49,0), 55,3 (CH; rotâmero em 50,8);
94,6 (CH; rotâmero em 91,7); 115,4 (d; J= 21,0 CH); 120,1(CH); 120,2 (CH); 128,6 (CH);
130,3 (CH); 132,0 (CH; rotâmero em 131,4); 138,6 (C–N); 152,4 (C=O); 157,9 (C=N;
rotâmero em 157,2); 161,5 (C; rotâmero em 161,8); 166,4 (d; J=240,0; C; em 167,9 e 164,8);
171,0 (C=O).
I.V.-F.T. (Pastilha de KBr, cm-1
) principais sinais.
3300; 3198; 3147; 2949; 1685; 1615; 1603; 1521; 1445; 1430; 1262; 1152; 760.
HRMS- IT- TOF (elétrospray); M++1
396,1469.
6.2.15 – OBTENÇÃO DA N-FENIL-N-(4-FLUORO-FENIL)--3a,4,5,6a-TETRAHIDRO-
PIRROLO[3,2-d]ISOXAZOLO-6-IL-METANONA-HIDRAZINA-CARBOTIOAMIDA
80b [73]
.
79a
80a
N
N
O
O
NH
HN
S
NH
F
N
N
O
O
H
F
O
Sob temperatura ambiente, preparou-se uma solução contendo 4-fenil-
tiossemicarbazida 69b (197,70 mg; 1,18 mmol) em 13,2 mL de etanol P.A., em seguida,
acidificou-se o meio com duas gotas de ácido clorídrico concentrado P.A. Sob agitação
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Químico Página 113
vigorosa, adicionou-se lentamente ao sistema o aldeído isoxazolinico p-F 79a (310,0 mg;
1,182 mmol). Uma suspensão amarelo-clara de precipitado branco foi se formando com
decorrer da aplicação do aldeído, e em 30 minutos uma CCD revelou o final da reação.
Removeu-se o solvente em evaporador rotatório, realizou-se uma purificação por
recristalização em etanol P.A., obtendo-se 446,10 mg da tiossemicarbazona isoxazolinica 80b,
oferecendo rendimento 91,72 %.
Propriedades Físicas de 80b
- Precipitado amorfo branco.
- Rf = 0,39 (Isopropanol/hexano 1:4).
- Ponto de fusão: 151-155° C.
DADOS ESPECTROMÉTRICOS DE 80b
RMN de 1H (300 MHz; DMSO-D6; ppm; J (Hz)) δ, t.a, presença de rotâmeros.
2,21 (m, 1H); 3,08 (m; 1H; rotâmero em 3,41); 4,11 (m; 1H; rotâmero em 3,46); 4,38 (m;
1H); 6,25 (sl; 1H; rotâmero em 6,74); 7,23 (t; J= 7,5; 1H); 7,25-7,60 (m; 6H); 7,70 (m, 2H);
8,00 (s, 1H); 10,02 (s; 1H); 12,14 (s; 1H).
RMN de 13
C (75 MHz, DMSO-D6, ppm)- DEPT δ, t.a., presença de rotâmeros.
27,7 (CH2; rotâmero em 29,1); 43,8 (CH2, rotâmero em 47,5), 50,6 (CH; rotâmero em 48,8);
94,8 (CH; rotâmero em 92,1); 115,4 (d; J= 22,0 CH); 125,8 (CH); 126,1 (CH); 128,3 (CH);
130,3 (CH); 132,0 (C); 133,1 (CH); 138,8 (C–N); 158,2 (CH; rotâmero em 157,4); 163,2 (C–
F; d; em J= 164,8 e 161,6); 168,0 (C=O); 176,5 (C=S).
I.V.-F.T. (Pastilha de KBr, cm-1
) principais sinais.
3447; 3292; 2998; 2962; 1626; 1602; 1512; 1421; 1206; 886.
HRMS- IT- TOF (elétrospray); M++1
412,1223.
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Químico Página 114
6.2.16 – OBTENÇÃO DA N-FENIL-N-(4-CLORO-FENIL)--3a,4,5,6a-TETRAHIDRO-
PIRROLO[3,2-d]ISOXAZOLO-6-IL-METANONA-HIDRAZINA-CARBOXIAMIDA
80c [73]
.
79b
80cN
N
O
O
NH
HN
O
NH
Cl
N
N
O
O
H
Cl
O
A 4-fenil-semicarbazida 69a (135,4 mg; 0,90 mmol) e o etanol P.A. (9,5 mL) são
adicionados em um balão de 25 mL, formando uma suspensão, a qual logo após a aplicação
do ácido clorídrico concentrado P.A (2 gotas), é desfeita. Notou-se que minutos seguintes à
adição do aldeído isoxazolinico p-F 79b (237,70 mg; 0.85 mmol), formou-se um precipitado,
e em 30 minutos uma CCD revelou o desfecho da reação.
Seguidamente a remoção do solvente, purificou-se o precipitado por uma
cromatografia em coluna “flash” (gel de sílica, isopropanol/ hexano 1:9, inicialmente; 3:7
depois de saída da impureza). Foram obtidos 205,0 mg do produto puro 80c, que representa
58,8 % de rendimento.
Propriedades Físicas de 80c
- Precipitado amorfo bege.
- Rf = 0,35 (Isopropanol/hexano 1:4).
- Ponto de fusão: 207-209°C.
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Químico Página 115
DADOS ESPECTROMÉTRICOS DE 80c
RMN de 1H (300 MHz; DMSO-D6; ppm; J (Hz)) δ, t.a, presença de rotâmeros.
2,25 (m, 1H); 2,37 (m, 1H), 3,08 (m; 1H; rotâmero em 3,42); 4,11 (m; 1H; rotâmero em 3,40);
4,41 (t; J= 8,0; 1H); 6,23 (sl; 1H; rotâmero em 6,70); 7,04 (t; J=7,5; 1H); 7,30 (t; J=7,5; 2H);
7,56 (m, 6H); 7,81 (sl, 1H); 8,74 (s, 1H); 11,10 (s, 1H).
RMN de 13
C (75 MHz, DMSO-D6, ppm)- DEPT δ, t.a., presença de rotâmero.
27,4 (CH2; rotâmero em 26,8); 43,6 (CH2; rotâmero em 47,2); 50,8 (CH; rotâmero em 49,0);
94,4 (CH; rotâmero em 91,8); 120,0 (CH); 122,9 (CH); 128,5 (CH); 129,6 (CH); 131,3 (CH);
134,3 (C); 135,2 (C); 138,5 (C); 152,3 (C=O); 157,9 (C=N, rotâmero em 157,2); 167,9
(C=O).
I.V.F.T. (pastilha de KBr, cm-1
) principais sinais.
3368, 3197, 3109, 3063, 2954, 2879, 1698, 1643, 1596, 1541, 1408, 1173, 846, 747.
HRMS–IT-TOF (elétrospray) M++1.
412;1160.
6.2.17 – OBTENÇÃO DA N-FENIL-N-(4-CLORO-FENIL)--3a,4,5,6a-TETRAHIDRO-
PIRROLO[3,2-d]ISOXAZOLO-6-IL-METANONA-HIDRAZINA-CARBOTIOAMIDA
80d [73]
.
N
N
O
O
NH
HN
S
NH
Cl
N
N
O
O
H
Cl
O
79b
80d
Em um balão de 25 mL, pesou-se a 4-fenil-tiossemicarbazida 69b (97,21 mg; 0,58
mmol). Em seguida, uma parte do solvente reacional é adicionada (etanol P.A., 2,5 mL),
iniciou-se a agitação a t.a., onde se pôde observar uma pequena solubilização do reagente. Na
seqüência, acrescentaram-se duas gotas de ácido clorídrico conc. P.A, e rapidamente se pôde
verificar a completa solubilização do reagente. Por fim, acrescentou-se, gota-a-gota, uma
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Químico Página 116
solução de aldeído isoxazolinico p-Cl 79b (162,60 mg; 0,58 mmol; 4,0 mL de etanol P.A.).
Durante a adição, notou-se a mudança de coloração, do incolor a amarelo escuro, e em 45
minutos foi realizada uma CCD que confirmou o final da reação.
Com a retirada do solvente formou-se um precipitado amarelo, que quando
recristalizado em etanol, deu origem a 163,90 de tiossemicarbazona isoxazolinica p-Cl 80d
pura, cujo rendimento corresponde a 65,92%.
Propriedades Físicas de 80d
- Precipitado amorfo bege.
- Rf = 0.56 (Isopropanol/hexano 1:4).
- Ponto de fusão: 146-148°C.
DADOS ESPECTROMÉTRICOS DE 80d
RMN de 1H (300 MHz; DMSO-D6; ppm; J (Hz)) δ, t.a, presença de rotâmeros.
2,22 (m, 1H); 2,34 (m, 1H); 3,08 (m, 1H), 3,08 (m; 1H; rotâmero em 3,44); 4,10 (m; 1H;
rotâmero em 3,45); 4,39 (t; J= 7,5; 1H); 6,24 (d; J= 7,5; rotâmero em 6,72; 1H); 7,23 (t, J=
7,5; 1H); 7,38 (d; J= 7,5; 2H); 7,50 (d; J= 7,5; 2H); 7,61 (m; 4H); 8,0 (s, 1H); 9,99 (s, 1H);
12,12 (s, 1H).
RMN de 13
C (75 MHz, DMSO-D6, ppm)- DEPT δ, t.a., presença de rotâmero.
27,6 (CH2); 43,7 (CH2); 50,6 (CH; rotâmero em 48,7); 94,7 (CH; rotâmero 92,0); 125,7
(HC=N); 125,9 (CH); 128,2 (CH); 128,4 (CH); 129,6 (CH); 133,1 (CH); 134,2 (C); 135,2 (C–
Cl); 138,7 (C–N); 158,1 (C=N); 167,9 (C=O); 176,5 (C=S).
I.V.FT (pastilha de KBr, cm-1
) principais sinais.
3394; 3288; 3164; 2974; 2891; 1626; 1599; 1566; 1416; 1260; 1205; 1090; 885; 845; 735.
HRMS – (IT-TOF) – eletrostrey M+ +1
428,0933.
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Químico Página 117
6.2.18 – OBTENÇÃO DA N-FENIL-N-(4-NITRO-FENIL)--3a,4,5,6a-TETRAHIDRO-
PIRROLO[3,2-d]ISOXAZOLO-6-IL-METANONA-HIDRAZINA-CARBOXIAMIDA
80f [73]
.
N
N
O
O
NH
HN
O
NH
NO2
N
N
O
O
H
NO2
O
79c
80e
Em um balão de 25 mL, foram adicionados a 4-fenil-semicarbazida 69a (128,5 mg;
0,85 mmol), e etanol (9,0 mL), formando uma suspensão incolor. Ao aplicar, o ácido
clorídrico conc. P.A, rapidamente se formou uma solução. Em seguida, acrescentou-se o
aldeído isoxazolínico p-NO2 79c (234,20 mg; 0,81 mmol), formando um precipitado branco
viscoso. Uma CCD revelou o final da reação em 45 minutos.
Com a remoção do solvente, e depois de recristalizado em etanol, pôde-se obter 200,0
mg semicarbazona isoxazolinica p-NO2 80e pura, cujo rendimento corresponde a 33,3 %.
Propriedades Físicas de 80e
- Sólido amorfo branco.
- Rf = 0,24 (Isopropanol/hexano 1:4).
- Ponto de fusão: 225-228°C.
DADOS ESPECTROMÉTRICOS DE 80e
RMN de 1H (300 MHz; DMSO-D6; ppm; J (Hz)) δ, t.a, presença de rotâmeros.
2,28 (m, 1H); 2,38 (m, 1H); 3,11 (m,1H; rotâmero em 3,39); 4,10 (m,1H); 4,43 (t; J= 7,7;
1H); 6,17 (d; J= 7,5; rotâmero em 6,71); 7,04 (t; J= 7,2; 1H); 7,30 (t; J=7,2; 2H); 7,55 (d; J=
7,8; 2H); 7,85 (m; 3H); 8,35 (d; J= 8,0; 2H; rotâmero em 8,29); 8,75 (s; 1H); 11,11 (s, 1H).
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Químico Página 118
RMN de 13
C (75 MHz, DMSO-D6, ppm)- DEPT δ, t.a.; presença de rotâmeros.
27,3 (CH2, rotâmero em 28,5); 43,8 (CH2; rotâmero em 47,1); 51,0 (CH; rotâmero 49,3); 94,0
(CH; rotâmero em 91,6); 120,1 (CH); 122,9 (CH); 123,7 (CH); 128,5 (CH); 129,0 (CH);
131,1 (CH); 138,5 (C); 141,6 (C); 148,3 (C=N–O); 152,4 (C da uréia); 157,9 (C–NO2;
rotâmero 157,2); 167,3 (C da amida; rotâmero em 166,9)
I.V.-FT (pastilha de KBr, cm-1
) principais sinais.
27,3 (CH2; rotâmero em 28,5); 43,8 (CH2; rotâmero em 47,1); 51,0 (CH; rotâmero em 49,3);
94,0 (CH; rotâmero em 91,6); 120,1 (CH); 122,9 (CH); 123,7 (CH); 128,5 (CH); 129,0 (CH),
131,1 (CH); 138,5 (C); 141,6 (C); 148,3 (C=N–O); 152,4 (C uréia); 157,9 (C–NO2; rotâmero
em 157,2); 167,3 (C amida; rotâmero em 166,9).
HRMS– (IT-TOF) eletrospray M++1.
423,1400
6.2.19 – OBTENÇÃO DA N-FENIL-N-(4-FLUOR-FENIL)--3a,4,5,6a-TETRAHIDRO-
PIRROLO[3,2-d]ISOXAZOLO-6-IL-METANONA-HIDRAZINA-CARBOTIOAMIDA
80f [73]
N
N
O
O
NH
HN
S
NH
NO2
N
N
O
O
H
NO2
O
79c
80f
Procedimento semelhante à reação 6.2.17.
Foram adicionados a 4-fenil-tiosemicarbazida 69b (135,8 mg; 0,81 mmol), etanol
absoluto (8,63 mL), duas gotas de HCl 37%, e aldeído pirrolidínico 79c (223,7 mg; 0,77
mmol), em um balão de 25 mL, onde se formou uma suspensão com precipitado amarelado.
A retirada do solvente deu origem a um precipitado amarelo, que quando recristalizado
em etanol, ofereceu 233,40 mg de tiosemicarbazona isoxazolinica p-NO2 80f pura, cujo
rendimento corresponde a 65,71%.
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Químico Página 119
Propriedades Físicas de 80f
- Sólido amorfo branco.
- Rf = 0,41 (Isopropanol/hexano 1:4).
- Ponto de fusão: Carbonizou em 210°C.
DADOS ESPECTROMÉTRICOS de 80f
RMN de 1H (300 MHz,DMSO-D6, ppm, J= (Hz)); δ, t.a, presença de rotâmeros.
2,25 (m, 1H); 2,37 (m, 1H); 3,12 (m; rotâmero em 3,39; 1H); 4,06 (m,1H); 4,41 (tl, 1H); 6,19
(d; J= 7,8; rotâmero em 6,72); 7,23 (tl; J= 7,2; 1H); 7,38 (t; J= 7,5; 2H); 7,49 (d; J= 7,5; 2H);
7,86 (d; J= 8,4; 2H); 7,99 (s, 1H); 8,34 (m, 2H); 10,00 (s, 1H); 12,12 (s, 1H).
RMN de 13
C (75 MHz, DMSO-D6, ppm) δ, t.a, presença de rotâmeros.
27,5 (CH2); 43,8 (CH2; rotâmero em 47,1); 50,7 (CH); 94,3 (CH; rotâmero em 92,0); 123,6
(CH); 125,8 (CH); 125,9 (CH); 128,2 (CH); 129,0 (CH); 132,8 (C); 138,2 (C); 141,5 (C);
148,3 (C); 158,1 (C); 167,3 (C); 176,5 (C).
I.V. - FT (pastilha de KBr, cm-1
), principais sinais.
3344; 3321; 3268; 3200; 2980; 1729; 1627; 1598; 1519; 1427; 1348; 1266; 1193; 901; 844.
HRMS– (IT-TOF) eletrospray M++1.
439,1191.
6.3 – SÍNTESE RACÊMICA DOS DERIVADOS NITRO-FURANO-HIDRAZONAS 2-
ISOXAZOLINAS PIRROLIDÍNICAS.
6.3.1 – HIDRAZIDA DO ÁCIDO 6-(4-FLUOROBENZOIL)-4,5,6,6a-TETRAHIDRO-
3aH-PIRROLO[3,2-d]ISOXAZOL-3-CARBOXÍLICO 81a.
N
N
O
O
OO
F
N
N
O
O
NHNH2O
F77a 81a
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Químico Página 120
A um balão de 10,0 mL foi adicionado a 2-isoxazolina pirrolidínica 77a (343,2 mg;
1,12 mmol) e 4 mL de etanol absoluto. Sobre esta solução, em agitação e temperatura
ambiente, adicionou-se gota-a-gota a hidrazina 80% 87 (1,09 mL; 1,12 mmol). A mistura
reacional foi mantida em agitação por duas horas, quando CCD indicou final da reação.
Após remoção do solvente a hidrazida 81a precipitou. Recristalização em etanol
forneceu 208,8 mg da hidrazida 81a pura, correspondendo a um rendimento de 63,78 %.
Propriedades Físicas de 81a
- Pó amorfo branco
- Faixa de Fusão 191 – 193°C.
- Rf = 0,23 (AcOEt)
DADOS ESPECTROMÉTRICOS de 81a
RMN de 1H (300 MHz,CDCl3) δ, t.a, presença de rotâmeros.
2,17 (m; 2H); 3,03 e 3,40 (m; 1H; rotâmero); 4,13 (m; 1H); 4,24 (m; 1H); 4,53(sl; 2H); 6,16 e
6,65 (sl; 1H; rotâmero); 7,32 (sl; 2H); 7,65 (sl; 2H); 9,87 (s; 1H).
RMN de 13
C (75 MHz, DMSO) δ, t.a, presença de rotâmeros.
26,7 e 28,1(CH2; rotâmero); 43,5 47,4 (CH; rotâmero); 50,4 e 52,2 (CH2; rotâmero); 91,5 e
94,3 (CH; rotâmero); 1115,3 e 115,6 (CH, d, 2J = 21,5 Hz); 130,2 (CH); 131,9 (C); 154,4
(C=N); 157,9 (C=O); 161,5 e 164,8 (C, d, 1J = 246 Hz); 168 (C=O).
I.V. - FT (pastilha de KBr, cm-1
), principais sinais.
3314, 3271, 2966, 2901, 1687, 1653, 1598, 1400, 1219, 1167, 930, 845, 796, 601.
6.3.2 – HIDRAZIDA DO ÁCIDO 6-(4-CLOROBENZOIL)-4,5,6,6a-TETRAHIDRO-
3aH-PIRROLO[3,2-d]ISOXAZOL-3-CARBOXÍLICO 81b
N
N
O
O
OO
Cl
N
N
O
O
NHNH2O
Cl
77b 81b
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Químico Página 121
Procedimento experimental semelhante item 6.3.1.
Foram adicionados 2-isoxazolina pirrolidínica 77b (190,1 mg; 0,59 mmoles), etanol
(1,35 mL) e hidrazina 80% 87 (0,59 mL; mmol).
Uma recristalização em etanol forneceu 96,6 mg da hidrazida 81b correspondendo a
um rendimento de 53,0 %.
Propriedades Físicas de 81b
- Cristais brancos em forma de agulha
- Faixa de Fusão 148 – 150°C.
- Rf = 0,22 (AcOEt)
DADOS ESPECTROMÉTRICOS de 81b
RMN de 1H (300 MHz,CDCl3) δ, t.a, presença de rotâmeros.
2,18 (sl; 2H); 3,05 e 3,49 (sl; 1H; rotâmero); 4,11 (sl; 1H); 4,25 (m; 1H); 4,51(sl; 2H); 6,16 e
6,63 (sl; 1H; rotâmero); 7,57 (sl; 4H); 9,82 (sl; 1H).
RMN de 13
C (75 MHz, DMSO) δ, t.a, presença de rotâmeros.
26,7 e 27,5(CH2; rotâmero); 43,5 e 47,4 (CH; rotâmero); 50,4 e 52,3 (CH2; rotâmero); 91,5 e
94,1 (CH; rotâmero); 128,4 (CH); 129,5 (CH); 134,2 (C); 135,3 (C); 154,5 (C=N); 157,9
(C=O); 167,9 (C=O).
I.V. - FT (pastilha de KBr, cm-1
), principais sinais.
3325, 3277, 2992, 2966, 2901, 1678, 1655, 1589, 1405, 1273, 1021, 931, 837, 760, 601.
6.3.3 – HIDRAZIDA DO ÁCIDO 6-(4-NITROBENZOIL)-4,5,6,6a-TETRAHIDRO-3aH-
PIRROLO[3,2-d]ISOXAZOL-3-CARBOXÍLICO 81c
N
N
O
O
OO
NO2
N
N
O
O
NHNH2O
NO277c 81c
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Químico Página 122
Procedimento experimental semelhante item 6.3.1.
Aplicaram-se 2-isoxazolina pirrolidínica 77c (230,50 mg; 0,70 mmol), etanol (1,50
mL) e hidrazina 80% 87 (0,69 mL; mmol), em um balão adequado.
Recristalização em etanol forneceu 166,60 mg da hidrazida 81c correspondendo a um
rendimento de 75,40 %.
Propriedades Físicas de 81c
- Pó amorfo branco
- Faixa de Fusão 175 – 177°C.
- Rf = 0,23 (AcOEt)
DADOS ESPECTROMÉTRICOS de 81c
RMN de 1H (300 MHz,CDCl3) δ, t.a, presença de rotâmeros.
2,21 (sl, 2H); 3,08 e 3,42 (m; 1H; rotâmeros); 4,11 (sl; 1H); 4,27 (sl; 1H); 4,55 (sl; 2H); 6,10
e 6,63 (d; J =7,8Hz; 1H; rotâmeros); 7,82 (m; 2H); 8,34 (m; 2H); 9,88 (s; 1H).
RMN de 13
C (75 MHz, DMSO) δ, t.a, presença de rotâmeros.
26,6 e 28,1 (CH2; rotâmeros); 43,6 e 47,1 (CH); 50,6 e 52,4 (CH2; rotâmeros); 91,4 e 93,8
(CH; rotâmeros); 123,7 (CH); 129,0 (CH); 141,4 (C); 148,4 (C); 154,5 (C=N); 157,8 (C=O);
167,3 (C=O)
I.V. - FT (pastilha de KBr, cm-1
), principais sinais.
3334, 3286, 3190, 2957, 2284, 1662, 1598, 1398, 1351, 1112, 922, 833, 724, 701.
6.3.4 – (4-NITROFURANO)-HIDRAZIDA DO ÁCIDO-6-(4-FLUORO-BENZOIL)-
4,5,6,6a-TETRAHIDRO-3aH-PIRROLO[3,2-d]ISOXAZOL-3-CARBOXÍLICO 82a [74]
.
N
N
O
O
NHNH2O
F
N
N
O
O
NHO
F
N
H
O
NO2
81a 82a
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Químico Página 123
A uma solução da hidrazida 81a (208,8 mg; 0,68 mmol) em etanol absoluto (7,6 mL),
contendo duas gotas de ácido clorídrico 37%, foi adicionado, gota-a-gota (74,4 mg, 0,71
mmol) o 5-nitro-2-furfuraldeído 92. A mistura reacional ficou sob agitação a temperatura
ambiente durante 30 minutos, onde se pode evidenciar uma coloração amarela.
O solvente foi removido e recristalizado em etanol, fornecendo 170,0 mg da hidrazona
82a pura, correspondendo a um rendimento de 60,2 %.
Propriedades Físicas de 82a
- Pó amorfo amarelo.
- Faixa de Fusão: Carbonizou em 234°C
- Rf = 0,24 (isopropanol/hexano 1:9)
DADOS ESPECTROMÉTRICOS de 82a
RMN de 1H (300 MHz,DMSO-D6, ppm, J= (Hz)); δ, t.a, presença de rotâmeros.
2,29 (m, 2H); 3,12 (m; rotâmero em 3,44; 1H); 4,15 (m; rotâmero em 3,53; 1H); 4,34 (sl, 1H);
6,29 (sl; rotâmero em 6,75; 1H); 7,30 (m, 3H); 7,70 (m, 3H); 8,40 (s, 1H); 12,52 (s, 1H).
RMN de 13
C (75 MHz, DMSO-D6, ppm) δ, t.a, presença de rotâmeros.
26,8 (CH2, rotâmero em 28,0); 43,7 (CH2); 51,7 (CH; rotâmero em 49,7); 95,3 (CH; rotâmero
em 92,3); 114,5 (CH); 115,2 (CH); 115,4 (CH); 130,1 (CH); 131,7 (C); 136,8 (CH); 151,3
(C); 152,0 (C); 154,3 (C=O); 155,7 (C=N); 163,2 (d; J= 246 em 164,8 e 161,5; C–F); 167,8
(C=O).
I.V. - FT (pastilha de KBr, cm-1
), principais sinais.
3197; 3137; 3071; 1682; 1662; 1644; 1481; 1352; 1258; 847.
HRMS-IT-TOF (elétrospray) M++1.
416,1032.
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Químico Página 124
6.3.5 – (4-NITROFURANO)-HIDRAZIDA DO ÁCIDO-6-(4-CLORO-BENZOIL)-
4,5,6,6a-TETRAHIDRO-3aH-PIRROLO[3,2-d]ISOXAZOL-3-CARBOXÍLICO 82b [74]
.
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N
O
O
NHNH2O
Cl
N
N
O
O
NHO
Cl
N
H
O
NO2
81b82b
Procedimento experimental semelhante ao item 6.3.4.
Hidrazida 81b (96,6 mg; 311,88 μmol), etanol (3,5 mL), uma gota de ácido clorídrico
37% e o 5-nitro-2-furfuraldeído 92 (32,61 μL; 44,0 mg; 0,31 mmol).
A recristalização di produto bruto em metanol forneceu 97,7 g da hidrazona 82b
correspondendo a um rendimento de 72,52 %.
Propriedades Físicas de 82b
- Pó amorfo amarelo.
- Ponto de Fusão: Carbonizou em 209°C
- Rf = 0,24 (isopropanol/hexano 1:9)
DADOS ESPECTROMÉTRICOS de 82b
RMN de 1H (300 MHz,DMSO-D6, ppm, J= (Hz)); δ, t.a, presença de rotâmeros.
2,29 (m, 2H); 3,12 (sl; rotâmero em 3,44; 1H); 4,14 (sl; rotâmero em 3,53; 1H); 4,34 (t, J= 8,0
Hz; 1H); 6,27 (sl; rotâmero em 6,75; 1H); 7,27 (d; J= 3,9; 1H); 7,60 (m, 4H); 7,78 (d, J= 3,9;
1H); 8,40 (s, 1H); 12,53 (s, 1H).
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Químico Página 125
RMN de 13
C (75 MHz, DMSO-D6, ppm) δ, t.a, presença de rotâmeros.
26,7 (CH2); 43,6 (CH2); 51,7 (CH); 95,2 (CH; rotâmero em 92,7); 114,5 (CH); 115,8 (CH);
128,5 (CH); 129,5 (CH); 134,1 (C); 135,4 (C); 136,9 (HC=N); 151,3 (C–O); 152,0 (C); 154,4
(C=O); 155,7 (C); 167,9 (C=O).
I.V. - FT (pastilha de KBr, cm-1
), principais sinais.
3277; 3168; 3138; 3089; 2989; 2960; 1683; 1648; 1537; 1477; 1410; 1351; 1261; 954; 833;
813.
HRMS– (IT-TOF) eletrospray M++1.
432,0700.
6.3.6 – (4-NITROFURANO)-HIDRAZIDA DO ÁCIDO-6-(4-NITRO-BENZOIL)-
4,5,6,6a-TETRAHIDRO-3aH-PIRROLO[3,2-d]ISOXAZOL-3-CARBOXÍLICO 82c [74]
.
N
N
O
O
NHNH2O
NO2
N
N
O
O
NHO
NO2
N
H
O
NO2
81c 82c
Procedimento experimental semelhante ao item 6.3.4.
Hidrazida 81c (191,30 mg; 0,60 mmol), etanol (6,7 mL), duas gotas de ácido
clorídrico 37% e o 5-nitro-2-furfuraldeído 92 (65,65 µL; 0,63 mmol).
Recristalização em metanol forneceu 166.4 mg da hidrazona 82c correspondendo a um
rendimento de 59,71 %.
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Químico Página 126
Propriedades Físicas de 82c
- Pó amorfo amarelo.
- Ponto de Fusão: Carbonizou em 215°C
- Rf = 0,14 (isopropanol/hexano 1:9)
DADOS ESPECTROMÉTRICOS de 82c
RMN de 1H (300 MHz,DMSO-D6, ppm, J= (Hz)); δ, t.a, presença de rotâmeros.
2,32 (m, 2H); 3,17 (sl; rotâmero em 3,14; 1H); 4,14 (sl; rotâmero em 3,45; 1H); 4,37 (sl, 1H);
6,21 (sl; rotâmero em 6,75; 1H); 7,27 (s, 1H); 7,80 (m, 3H); 8,36 (m, 3H); 12,53 (s, 1H).
RMN de 13
C (75 MHz, DMSO-D6, ppm) δ, t.a, presença de rotâmeros.
26,6 (CH2; rotâmero em 28,2); 43,8 (CH2; rotâmero em 47,3); 52,0 (CH; rotâmero em 50,1);
94,9 (CH; rotâmero em 92,5); 114,5 (CH); 115,8 (CH); 123,8 (CH); 128,8 (CH); 137,0 (CH);
141,3 (C); 148,4 (C); 151,3 (C); 152,0 (C); 154,5 (C, rotâmero em 153,8); 155,6 (C); 167,3
(C, rotâmero em 167,0).
I.V. - FT (pastilha de KBr, cm-1
), principais sinais.
3208,; 3074; 2883; 1667; 1566; 1525; 1484; 1413; 1352; 1255; 1192; 866; 839; 816.
HRMS– (IT-TOF) eletronspray M++1.
433,0942.
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Biológico
Estudo Biológico
Atividade Antimicrobiana
Atividade Antichagásica
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Biológico Página 128
7. ATIVIDADES BIOLÓGICAS
7.1 – ATIVIDADE ANTIMICROBIANA
7.1.1 – Introdução:
Um dos maiores problemas nas grandes emergências hospitalares espalhadas pelo
mundo é a ocorrência de bactérias multiresistentes [02, 78]
. Apesar dos avanços da medicina
sobre o conhecimento dos microrganismos patogênicos, o advento da epidemia de HIV e o
uso indiscriminado de antibióticos tornaram fundamentais uma nova alternativa para o
controle dessas infecções [02, 78, 113]
.
Várias são as pesquisas imbuídas na busca de uma nova droga capaz de atingir um
amplo espectro de microrganismos, baixa toxicidade e oferecer segurança em seu uso nas
rotinas das clínicas [28, 42, 43,45]
.
Diante das várias moléculas que vem sendo propostas como agentes antimicrobianos,
faz-se necessário um mecanismo seguro que comprove a veracidade do potencial biológico da
substância. Uma ferramenta bastante solicitada e que há anos vem correspondendo a este
objetivo é o ensaio de difusão em Agar [80]
desenvolvido por Bauer e col. [80]
.
Também chamado de teste de difusão em disco, a técnica descrita por Bauer [80]
informa se o microrganismo é sensível ou resistente ao antibiótico ou quimioterápico testado,
quando em um meio de cultura se aplica um disco de difusão contendo a substância analisada,
e após período de incubação se desenvolve um halo de inibição, que caso seja maior que 10,0
mm a substância pode ser considerada inibidor do microrganismo [80]
.
7.1.2 - Materiais e Métodos:
Em trabalhos realizados por Chandra e col. [28]
, e Kasuga e col. [62, 63]
que visava à
busca de novos antimicrobianos a partir de semicarbazonas e tiossemicarbazonas, na forma de
ligante livre ou como complexos metálicos, encontravasse um similaridade entre os
microrganismos inibidos. Através desta peculiaridade pôde-se vislumbrar ação antimicrobiana
das semicarbazonas, tiosemicarbazonas e nitrofurfuril-hidrazonas derivados dos bíciclos
isoxazolínicos sobre os patógenos citados abaixo:
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Biológico Página 129
Staphilococcus aureus (Gram-positiva) – UFPEDA 02
Escherichia coli (Gram-negativa) – UFPEDA 224
Pseudomonas aeruginosa (Gram-negativa) – UFPEDA 416
Aspergillus Níger (Levedura) – UFPEDA 2003
Candida albicans – UFPEDA 1007
Todos os microorganismos testes são procedentes da coleção de microorganismos do
Departamento de Antibióticos da UFPE. E o estudo de atividade antimicrobiana foi realizado
segundo o método de difusão em Agar desenvolvido por Bauer e col. [80]
. As substâncias 68a-
d, 80a-f e 82a-c, obtidas sinteticamente neste trabalho, foram submetidos ao “screening”
antimicrobiano, sendo utilizado os seguintes meios de cultura:
Agar-Nutritivo (AN)
Agar Sabouraud (SAB)
Foram pesados 10,0 mg de cada um dos produtos a serem testados e solubilizados em
1,0 mL de uma solução DMSO/etanol (1:1), correspondendo a uma concentração de 10.000
µg/mL. Em seguida, foi diluído de 1:10 utilizando a mistura de solventes, chegando a uma
solução de 1000,0 µg/mL.
Os meios de cultura Agar Nutritivo e Agar Sabouraud foram preparados segundo as
instruções dos seus fabricantes e esterilizados em autoclave à 121° por 15 minutos. O meio
Agar-Nutritivo foi utilizado para a avaliação da atividade antibacteriana e o meio Agar
Sabouraud, para avaliação da atividade antifúngica.
Em placas de Petri estéreis de 9,0 cm de diâmetro, foram adicionados 10,0 mL do
meio de cultura, e colocadas em superfície plana até completa solidificação.
Os inóculos bacterianos foram obtidos a partir de uma cultura de 24 horas de cultivo.
As suspensões foram preparadas utilizando-se água destilada esterilizada e turbidez para o
grau 2, da escala de Mac Farland [81]
, equivalente a 107
– 108 UFC/mL. Desta suspensão,
foram retirados 100,0 µL e espalhada com alça de Drigalski em toda superfície da placa.
Discos de papel de filtro com diâmetro de 6 mm foram saturados com 100,0 µL da
solução da substância a ser testada, correspondendo a 100,0 µg de cada produto no disco.
Após completa evaporação do solvente nos discos de papel, estes foram aplicados na
superfície dos meios. As placas foram incubadas por 24 horas em estufa à 37° C para as
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Biológico Página 130
bactérias e 48 horas à 30° C para os fungos. Após incubação, foram efetuadas as leituras dos
diâmetros dos halos de inibição em milímetros (mm).
7.1.3 – Resultados e Discussão:
Todos os compostos produzidos neste trabalho (semicarbazonas, tiossemicarbazonas e
nitrofurfuril-hidrazonas) foram submetidos, em duplicata, aos testes antimicrobianos contra as
bactérias Gram-positivos S. aureus; Gram-negativos P. aeruginosa, E. coli; e os fungos C.
albicans e A. niger.
Como era previsto, as novas nitrofurfuril-hidrazonas isoxazolínicas 82a, 82b e 82c
formaram halos expressivos, inibindo o crescimento de todas as bactérias testadas, como pode
ser visto na figura 14. Todas as hidrazonas 82 formaram halos acima de 15,0 mm, como pode
ser observado na figura 13, sendo 82a a de maior potencial antimicrobiano, apresentando o
maior halo de inibição, 21,0 mm sobre a S. aureus, e a maior média de inibição (20,0 mm).
Entranto, as hidrazonas 82a-c não demonstraram atividade fungicida, apresentando apenas a
formação de um halo de 14,0 cm da substância 82a sobre o fungo C. albicans, enquanto as
outras não formaram halos de inibição contra os fungos testados.
Figura 11: Halos de Inibição contra Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa,
Escherichia coli, e Candida albicans.
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Biológico Página 131
No entanto, as semicarbazonas e tiossemicarbazonas isoxazolínicas 68 e 80 não
apresentaram o mesmo desempenho sobre os procariotas analisados, e apenas a 80a conseguiu
mostrar uma pequena inibição contra P. aeruginosa (12,5 mm), contrariando o que era
apresentado na literatura [28, 62, 63]
, onde trabalhos de Chandra e col. [28]
e Kasuga e col. [62,63]
desenvolveram complexos de semicarbazonas e tiossemicarbazonas, que também na forma de
ligantes, demonstraram-se ativos sobre os microrganimos S. aureus, E. coli, e P. aeruginosa
em baixas concentrações [28]
.
Figura 12: Placas de Petri em Agar Nutritivo, mostrando os Halos de Inibição contra
Staphylococcus aureus (A, B), Pseudomonas aeruginosa(D, C), Escherichia coli (E, F). 82a
(1), 82b (2) e 82c (3).
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Biológico Página 132
Outro resultado inesperado foi a atividade fungicida dos semicarbazonas e
tiossemicarbazonas 68 e 80, que não foram ativos contra A. niger, e apresentaram halos
considerados parciais, 80d (15,0 mm), 80f (14,0 mm), e 82a (14,5 mm) contra C. albicans.
Pois, apesar de a literatura [28, 62, 63]
revelar uma atividade moderada dos derivados
semicarbazônicos e tiossemicarbazônicos sobre os fungos testados, era esperado uma melhor
atividade inibitória das substâncias 68 e 80, principalmente sobre a C. albicans, o qual se tem
relatos de sofrerem grande ação fungicida de semicarbazonas e tiossemicarbazonas, como
pode ser visto no estudo de Kasuga e col. [62]
.
Em um trabaho realizado por De Almeida [52]
foi desenvolvido duas séries de
derivados acil-aril-hidrazonas 38a-b que apresentaram baixa toxicidade aguda e boa atividade
anti-inflamatória (teste de peritonite induzida por carragenina) [27]
e antinociceptiva (teste de
nocicepção induzida por ácido acético) [07, 11]
, porém nenhuma atividade antimicrobiana
(testes de difusão em disco) [80]
. Tal estudo serviu de base para síntese das nitrofurfuril-
hidrazonas 82a-c, a qual foi desenvolvida por analogia com semelhante rota sintética.
N
N
O
NO
N
O
R1
H H
ArO
38b
ONO2
38aR2
82
Figura 13: Série das acil-aril-hidrazonas isoxazolínicas 38a-b, com atividade antinociceptiva
e sem ação antimicrobiana, Série das nitrofurfuril-hidrazonas isoxazolínicas 82, potente
antimicrobiano.
Como exposto na revisão, tem sido comum o interesse pelas propriedades químicas e
biológicas do grupamento nitrofurano [22, 39, 54]
, que em alguns trabalhos atuam como principal
grupo farmacofórico de substâncias bioativas [22, 39, 42, 54]
. A presença do nitro parece ser
essencial para ativiadade antimicrobiano das nitrofurfuril-hidrazonas 82, pois como relatado
no trabalho de De Almeida [52]
, as hidrazonas 38a e especialmete 38b não apresentavam o
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Biológico Página 133
grupamento nitrofurfuril conjugado a porção hidrazona, e concomitantemente não possuíam
qualquer ação inibtória sobre as bactérias testadas.
E desta forma, no corrente trabalho, comprovou-se a grande colaboração do
nitrofurano para formação de novos híbridos do nosso aza-biciclo, pois esta importante
capacidade de produção de radicais incorporou às novas séries de hidrazonas um
extraordinário potencial bacterícida.
7.2 – ATIVIDADE ANTICHAGÁSICA:
7.2.1 – Introdução:
A Trypanossomiase americana é o resultado de uma infecção causada por um
protozoário hemoflagelado, o Trypanossoma cruzi [83]
. Também é chamada de doença de
Chagas, porque, em 1909, o brasileiro Carlos Chagas foi o primeiro a descobrir um caso de
doença humana, desvendado desde o vetor, e o ciclo biológico do parasita, até os sintomas da
doença, fato único na história da medicina [83]
.
O T. cruzi infecta uma gama de espécies de triatomíneos (Hemíptera, Reduvidae)
(Figura 16) e mamíferos, inclusive o homem [83, 96]
. E se distribui entre essas espécies de
hospedeiros em toda Américas Central e Sul; chegando ao México, e ao sul e sudeste dos
EUA [83]
. Sua taxonomia divide-o em dois grupos: TcI, mais comum em áreas do México,
Venezuela e Amazônia [84]
, e contamina 91,5% dos mamíferos; e TcII, distribuído em 5
subgrupos, TcIIa-TcIIe, atingindo 5,1% dos hospedeiros [83]
, além desses, 3,4% dos infectados
possuem a mistura de TcI/TcII [83, 84]
.
Todos os triatomíneos podem ser vetor do T. cruzi, porém os mais importantes são
aqueles adaptados as habitações humanas e tem um curto intervalo entre a alimentação e a
defecação [85]
.
O ciclo de vida do parasita envolve três fazes morfológicas distintas, entre hospedeiros
vertebrados e invertebrados (Fig. 16): a) Epimastigota, encontrado no vetor e em cultura
axênica; b) tripomastigota, comum na circulação sanguínea dos mamíferos, e considerada a
forma mais infectante (comum no estágio agudo); e c) amastigota, forma replicante
intracelular dos mamíferos (comum no estágio crônico) [15, 16, 86, 96]
(Fig. 16).
A transmissão para os humanos ocorre quando, logo após a refeição, o parasita (forma
epimastigota), nas fezes do inseto contaminado; e na membrana das mucosas da boca, nariz, e
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Biológico Página 134
conjuntiva, instala-se nas células macrocitárias e outras células do hospedeiro como pode ser
observado na figura 16 [87, 96]
. O parasita se multiplica intracelularmente (amastigota)
comprimindo a célula do hospedeiro, lisando-as, e se espalhando pela corrente sanguínea F
(tripomastigota). Em seguida, esses novos protozoários infectam as células adjacentes ou se
propagam através de tecidos linfáticos e sanguíneos distantes H, C, D e E [87, 96]
, completando
o ciclo quando os triatomíneos ingerem sangue contaminado G (Fig. 16) [87, 96]
.
Figura 14: Ciclo Biológico do T. cruzi. Retirado de Andrade, L.O.; Andrews, N. W.; Nature
Reviews Microbiology, 2005, doi:10.1038/nrmicro1249.
A infecção do T. cruzi se inicia com a multiplicação do parasita no macrófago [85]
. A
síndrome pode acontecer de forma aguda [87, 88]
, que é freqüentemente não diagnosticada (66-
99%), assintomática e subclínica, podendo apresentar febre e mal estar [87, 88]
; ou crônica,
quando os parasitas dificilmente se encontram no sangue periférico [88]
. A fase crônica só é
percebida anos após, segunda e quarta década de vida, quando o doente se apresenta com
megaesôfago (10 %), megacólon (Fig. 17) e condições anormais do miocárdio (20-30 %)
(Fig. 18) [87, 88]
, que são os maiores problemas dos pacientes com doença de chagas crônica,
causada pela desenervação desses órgãos decorrente da destruição dessas células pelo parasita
[87].
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Biológico Página 135
Outras rotas de transmissão também são encontradas: transfusão sanguínea,
transplantes e transmissão vertical [31, 87]
, e ingestão de alimentos contaminados [83, 84, 89]
. No
presente, o número de pessoas infectadas com esta doença é cerca de 10-12 milhões no
mundo [31]
.
Fig. 15 e 16: Megacólon em paciente com morte subita causada pela cardiomiopatia da
doença de Chagas (Escola de Medicinada USP, USP, Ribeirão Preto, Brasil), e Hipertofia em
miocardio e dilatação das cavidades do coração com a presença de trombos no coração
chagásico crônico. Retirado de Coura, J. R.; Mem Inst Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2007,
102, 113-122 [101]
.
Recentemente têm sido diagnosticados casos da doença, nos EUA, Canadá, e Europa
[31, 32], onde há pouco tempo relatos de infecção por T. cruzi eram novidades
[31, 32]. No
entanto, os movimentos migratórios de regiões endêmicas para não endêmicas vem mudando
a proliferação da epidemiologia desta doença [31, 32]
, crescendo o risco da Doença de Chagas
se tornar um problema de saúde e sócio-econômico mundial [31, 32]
.
Nos últimos 10 anos, uma série de iniciativas multinacionais, com relação ao controle
da contaminação vetorial e transfusional [94]
, levaram significante redução dos impactos
sociais e econômicos da doença de chagas [19]
. Porém, desde a descoberta desta doença, há
cem anos [20]
, ainda não se encontrou uma vacina ou tratamento específico disponível para
amplas intervenções de saúde pública [94]
.
O tratamento da doença de Chagas é um grave problema, pois não é efetivo [87, 91]
.
Nifurtimox (Lampit, Bayer 2502) e benznidazol (Radamil, Roche 7-1051) são as duas drogas
freqüentemente usadas [87, 91]
. Ambas as drogas reduzem a duração e a severidade da fase
aguda da doença de chagas congênita [87, 91]
, mas alcançam cura parasitológica apenas em
50% dos casos, devendo ser levado por longos períodos, causando vários efeitos colaterais [87,
91]. As taxas de cura parasitológica alcançadas com nifurtimox ou benznidazol são
semelhantes em pacientes cronicamente infectados, e são poucas as evidências de que tal
tratamento altera o curso natural da doença de Chagas, o uso das duas drogas em pacientes
com infecções crônicas T. cruzi é controverso [87, 91]
.
16 15
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Biológico Página 136
Por outro lado, apesar de não ter surgido nenhuma nova droga de atividade expressiva
para o tratamento específico da infecção chagásica nos últimos 30 anos [12]
, há um grande
número de estudos a fim produzir drogas mais seguras e efetivas [92]
, com um número
significante de publicações interessadas no desenvolvimento de novos agentes
quimioterápicos contra T. cruzi [26]
.
Para alcançar esta meta, a Organização Mundial de Saúde (OMS) tem adotado em sua
rede de pesquisas do programa de Pesquisa de Doenças Tropicais (TDR), um protocolo
experimental padrão baseado em uma única cepa do T. cruzi, o que tem permitido a produção
de resultados de alta qualidade que podem ser comparados pelos diferentes laboratórios
acadêmicos e industriais da rede [15]
. Este é um aspecto de grande relevância, especialmente
na área de doença negligenciadas, onde existe uma necessidade premente de ações globais
capazes de promover maiores avanços das pesquisas [15].
7.2.2 – Materiais e Métodos:
Os ensaios biológicos foram conduzidos como sugeridos pela OMS e são testes
robustos e de elevada exatidão. Os laboratórios envolvidos apresentam Condições de
Biossegurança (contenções para NB2) adequadas para execução do trabalho proposto e para
trabalho com animais experimentais.
7.2.2.1 - Animais
Foram utilizados camundongos Mus musculus das linhagens isogênicas BALB/c e
C57Bl/6, machos, com 6-8 semanas de idade, pesando 20 2 g e provenientes do biotério da
Fundação Oswaldo Cruz/FIOCRUZ, Rio de Janeiro. O protocolo de experimentação animal
(processo número 0266-05), utilizado no presente trabalho, já foi avaliado e aprovado pela
Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da FIOCRUZ com registro 0266/05.
7.2.2.2 - Obtenção de células esplênicas
Células esplênicas foram obtidas de acordo com Pereira e col. [95]
. Após sacrifício do
animal em cilindro de CO2, o baço de cada camundongo foi removido em condições
assépticas e colocado em tubo Falcon contendo meio RPMI 1640 sem SFB (meio
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Biológico Página 137
incompleto). No fluxo vertical, cada baço foi transferido para placa de Petri onde foram
macerados. As suspensões celulares obtidas foram transferidas para tubos Falcon contendo
aproximadamente 10,0 ml de meio incompleto por baço, centrifugadas a 4 C, 200 x g durante
5 minutos. Após descarte do sobrenadante, foi adicionada ao sedimento água destilada para
promover lise das hemácias. O sobrenadante, sem conter os debris celulares, será coletado e
centrifugado a 4 C, 200 x g durante 5 minutos. O sedimento (contendo as células) foi
ressuspendido em meio RPMI 1640 completo. Uma alíquota de cada suspensão celular foi
separada. Em seguida, diluída em azul de trypan e quantificada em câmara de Neubauer,
assim como verificar a viabilidade celular.
7.2.2.3 - Avaliação da atividade tóxica dos compostos em células de camundongos
isogênicos
Citotoxicidade é um termo abrangente que significa, em linhas gerais, morte celular
induzida [93]
. Está presente em todos os organismos multicelulares e unicelulares e em
mamíferos a citotoxicidade pode ser causada pela atividade lítica direta de uma célula
citotóxica (atividade fagocítica e receptores de morte, por exemplo) ou pela secreção de
moléculas líticas solúveis (defensinas, componentes do sistema complemento, TNF,
perforina/granzimas, por exemplo) [93]
.
Na infecção por T. cruzi a morte de certos tipos celulares estaria relacionada a
diferentes quadros clínicos, contribuindo para a progressão da patologia. Neste contexto, tem
sido descrito morte de cardiomiócitos na miocardiopatia, de células ganglionares do sistema
nervoso periférico caracterizando a forma neuronal e das fibras musculares lisas e neurônios
do plexo mientérico envolvidas nas “megas”-alterações do tubo digestivo. Além disso, é
observada morte de linfócitos no timo e em órgãos linfóides secundários, tais como baço e
linfonodo mesentérico. Há ainda lesões inflamatórias em outros órgãos e tecidos, como rins,
fígado e musculatura esquelética [93]
.
Para este estudo células esplênicas (6 x 105células/poço), obtidas de acordo com item
anterior, serão cultivadas em placas de 96 poços de fundo plano, contendo meio de cultura
completo. Para o ensaio de citotoxicidade, as células foram incubadas com os compostos em
sete diferentes concentrações (100, 50, 25, 10, 5 e 1 g/ml) e de timidina tritiada (1 Ci/poço)
durante 24 h em estufa de CO2 a 37 C. Para o controle foram utilizadas células tratadas com
saponina (0,05%), células tratadas com DMSO (1%), e sem tratamento, todos com timidina
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Biológico Página 138
tritiada (1 Ci/poço) associada em paralelo. Cada droga foi testada em triplicata. Após 24 h
de incubação, as células foram coletadas em papel de fibra de vidro e, posteriormente, a
captação de timidina tritiada foi determinada através do contador beta de cintilação. O
percentual de citotoxicidade foi determinado comparando-se a percentagem de incorporação
de timidina tritiada nos poços com as drogas em relação aos poços não tratados.
7.2.2.4 - Cultura de Trypanosoma cruzi.
Estima-se que existam catalogadas mais de 35 cepas do T. cruzi, as quais apresentam
diferentes perfis de resistência e susceptibilidade aos fármacos padrões 3 e 4 [15, 71]
. Para este
trabalho, foi utilizada a cepa Y do T. cruzi, por ser de fácil manuseio oferecendo parasitas
viáveis em 7-10 dias, além de ser utilizada por vários grupos de pesquisa, para o mesmo
propósito [106, 107, 108]
.
As culturas de formas epimastigotas (cepa Y) foram crescidas à 28 C em meio 3N e
expandidas em meio BHI (brain heart infusion). Para avaliar a inibição de crescimento dos
parasitas, as formas epimastigotas de Trypanosoma foram coletadas da cultura no 7° dia. A
avaliação da atividade tripanossomicida foi realizada, partindo-se de duas lavagens dos
parasitas em solução salina tampão de fosfato por centrifugação a 1000 X g a temperatura
ambiente durante 10 minutos. A contagem dos parasitas será realizada em câmara de
Neubauer.
7.2.2.5 - Avaliação da atividade dos compostos contra Trypanosoma cruzi
Para determinar o efeito antiproliferativo para T. cruzi, formas epimastigotas (106/ml)
crescidos em culturas axênicas, na fase exponencial de crescimento, foram colocadas em
placas de 96 poços no volume de 100 l, sob condições de cultura adequadas (26 C). Os
testes foram conduzidos tendo como controle o benznidazol e culturas de parasitos sem
tratamento. As substâncias serão avaliadas quanto a concentração inibidora de 50% do
crescimento dos parasitas (IC50%) onde formas epimastigotas da cepa Y de T. cruzi foram
cultivadas durante 11 dias e 24 horas, respectivamente, na presença de diferentes
concentrações dos compostos, procedendo-se em seguida a contagem de parasitas viáveis. O
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Biológico Página 139
cálculo da IC50% foi determinada por meio de uma regressão linear simples utilizando o
software Prism 4 Graphpad.
8.0 – Discussão:
Todos os produtos sintetizados apresentaram-se ativos contra a forma epimastigota do
T. cruzi em baixas concentrações. No entanto, as diferenças entre as concentrações capazes de
desencadear a IC50 epimastigota e a citotoxicidade, originadas das mudanças nas moléculas,
permitiram um estudo bioisostéricos entre as semicarbazonas, tiosemicarbazonas e
nitrofurfuril-hidrazonas derivados dos núcleos isoxazolínicos.
Um primeiro estudo de comparação entre os derivados semicarbazônicos e
tiossemicarbazônicos das séries de 5 e 6 membros VII é apresentado a seguir:
X=S e O.
n
N
O
N
O
H
H
NHN
H
R1
N
X
H
n=2, R1= F e OMe.
n=1, R1 = F, NO2 e Cl.
VII
Quando foram analizados as variações de polaridade dos substituintes da porção R1
aromática, foram constatadas interessantes peculiaridades, como: (i) a presença do
grupamento p-NO2 (80e e 80f) demonstrou alta citotoxicidade, pois as concentrações as quais
os compostos se apresentavam ativos eram, respectivamente, 5,6 e 9,9 vezes maiores que as
concentrações que desencadeavam citotoxicidade, contrariando o que afirma a literatura [22, 25]
(Tabela 09). (ii) Já a presença do p-Cl na porção arila R1 (80c e 80d), seguiu o que relata a
Dissertação de Mestrado Gleybson Correia de Almeida
Estudo Biológico Página 140
literatura, promovendo uma boa inibição contra o protozoário, em ambas os derivados e em
baixas concentrações [22, 109]
.
Também nesse aspecto, quando comparamos os compostos de seis membros (n=2),
percebeu-se que a presença de um substituinte doador de eletróns, 68a-b (p-OMe), diminui a
citotoxicidade e aumenta a sua ação inibitória sobre o protozoário, em relação à 68c-d (p-F),
ver Tabela 09. Essa peculiaridade também pode ser vista no trabalho de V.-DiVaio e col. [109]
.
A presença do Fluor na posição para-substituída em ambos os núcleos permitiu a
comparação entre os núcleos de 5 e 6 membros. Ao ser analizado a variação dos valores dos
parâmetros estudados (citotoxicidade e IC50 epimastigota), percebeu-se que a presença de um
carbono a mais no núcleo do biciclo piperidínico (n= 2) provoca uma interessante
peculiaridade, logo que a semicarbazona 68c é mais ativa e menos tóxica que à 80a núcleo
pirrolídinico (n= 1). Enquanto nas tiossemicarbazonas acontece o contráio, a 80b, núcleo de 5
membros, não demosntrou citotoxicidade na concentração 100 µg/ mL e provoca inibição do
crescimento do epimastigota numa concentração abaixo a da 68d, seis membros (tabela 09).
Tabela 09: Valores de Citotoxicidade e IC50 sobre a forma epimastigota do T. cruzi
das semicarcarbazonas e tiosemicarbazonas isoxazolínicas.
Semicarbazonas e
Tiosemicarbazonas
Citotoxicidade
(µg/ml) a
IC50 – epimastigotas –
11 dias (µg/ml)
68a n=2, R1= OMe, X= O 10 4.43
68b n=2, R1= OMe, X= S >100 11.82
68c n=2, R1= F, X= O 25 24.71
68d n=2, R1= F, X= S 5 14.36
80a n=1, R1= F, X= O 5 35.61
80b n=1, R1= F, X= S >100 10.88
80c n=1, R1= Cl, X= O 10 12.29
80d n=1, R1= Cl, X= S >100 5.80
80e n=1, R1= NO2, X= O 5 28.19
80f n=1, R1= NO2, X= S 5 49.84
3 BENZNIDAZOL 25 1,73
4 NIFURTIMOX 1 0,54
a = maior concentração atóxica em células esplênicas de camundongos BALB/c.
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Estudo Biológico Página 141
Não se pôde confirmar o porquê destas disparidades de valores da citotoxicidade e
IC50 desencadeadas por variações de polaridade (NO2, Cl, F e OMe), causadas pelas mudanças
nos substituintes R1, ou pelas presença ou ausência de um carbono dos respectivos núcleos
piperidínico ou pirrolídinico. Contudo, em um trabalho realizado por Cerecetto [22]
o qual foi
apresentado um estudo de QSAR de novas substâncias anti-tripanossomídicas, ele ratificava a
importante contribuição da porção N-óxido para a atividade antiparasitária assim como a
importante presença de grupos elétron-atratores para melhoramento da ação tripanomissídica.
Somando ao que foi comentado, é notável a contribuição do enxofre da
tiossemicarbazonas, pois foi pronuncioada em quase todos os casos em que os produtos
possuíam a melhor concentração inibitória ou a melhor citotoxicidade, ou os dois, como
mostrado na tabela 09. Com exceção do 68c, as melhores citotoxicidades foram as
conseguidas pelas tiossemicarbazonas em comparação com seus respectivos isostéricos
semicarbazônicos. Esta diminuição da citotoxicidade demonstra uma grande evolução no uso
de tiossemicarbazonas como antichagásico, logo que é conhecida uma tiossemicarbazona
bastante ativa, porém, muito tóxica que é a nitrofurazona [55]
, ao contrário das que foram
produzidas no presente trabalho, que apresentaram uma citotoxicidade bastante baixa, sendo
também bastante ativas sobre o parasita.
Logo, os melhores candidatos à droga antitripanossômica, dentre os novos derivados
semicarbazônicos e tiosemicarbazônicos sintetizados, foram as tiossemicarbazonas da
isoxazolinas pirrolidínicas 80b e 80d, e a piperidinínica 68b, que apresentaram IC50 igual a
5,8; 10,88; e 11,82 µg/mL, respectivamente. Apesar de possuírem concentrações inibitórias
acima das drogas consideradas de escolha Nfx 3 e BZD 4, estes novos compostos
isoxazolínicos possuem baixíssima citotoxicidade (>100 µg/mL).
Ainda não se pode precisar por qual mecanismo de ação as tiossemicarbazonas e
semicarbazonas 68a-d e 80a-f agem. No entanto, um grande número de pesquisas, dentre
estas alguns estudos de SAR, revela que as tiossemicarbazonas atuam inibindo a cruzaína [15]
.
Esta proteína também é conhecida como cruzipaína ou GP57/51 e constitui a mais abundante
cisteíno protease do T. cruzi, e é responsável pela maioria da atividade proteolítica de todos os
estágios de vida do parasita [15]
.
No caso das semicarbazonas, há relatos da literatura que comprovam que elas possuem
uma excelente capacidade de ligação ao DNA, e um bom potencial na liberação de oxigênio,
produzindo oxidações agudas no ciclo de geração de redução, desencadeando oxidações
agudas no parasita, o qual é bastante sensível a estes radicais livres [72]
.
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Estudo Biológico Página 142
Ao se analisar a série de isoxazolil-hidrazonas 82a-c percebe-se que o derivado 82c, o
qual possui na porção arila o substituinte p-NO2, apresentou-se como o derivado mais tóxico
dentre as substâncias sintetizadas, enquanto os outros, 82a e 82b, apresentaram citotoxicidade
melhores que o Nifurtimox e comparáveis ao benznidazol (tabela 10).
A nitrofurufuril-hidrazona que possui o substituinte p-Cl 82b demonstrou uma ação
inibitória numa concentração bem próxima a do benzinidazol (tabela 10). A hidrazona com
radical p-F 82a apresentou-se como o composto mais ativo de ambas as séries, sendo
considerado superior ao benznidazol (IC50 igual 1,73 µg/mL), pois foi necessário apenas 1,17
µg/mL para promover a morte de 50% dos parasitas na forma epimastigota, valor considerado
expressivo, pois promove uma ação inibitória semelhante ao benznidazol em uma
concentração menor.
N
N
O
O
NHO
R1
N
H
O
NO2
R1= Cl, F, NO2
IX
Tabela 10: Valores de Citotoxicidade e IC50 sobre a forma epimastigota do T. cruzi
das Nitrofurfuril-hidrazonas-isxazolínicas.
Compostos - código Citotoxicidade
(µg/ml) a
IC50 – epimastigotas – 11 dias
(µg/ml)
82a R1= F 25 1.17
82b R1= Cl 25 2.33
82c R1= NO2 <1 8.31
BZD BENZNIDAZOL 25 1,73
NFX NIFURTIMOX 1 0,54
a = maior concentração atóxica em células esplênicas de camundongos BALB/c.
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Estudo Biológico Página 143
Este resultado também pode ser considerado muito interressante se forem comparados
as citotoxicidade e o IC50 do 82a com o nifurtimox (IC50 igual 0,54 µg/mL), pois apesar de se
utilizar uma concentração maior para promover a inibição do epimastigota, a relação
citotoxicidade/IC50, para o 82a seria maior que 17, enquanto para o nifurtimox é 1,8; o que
permitiria o uso da substância com maior segurança.
Não se pode afirmar como esta nova série de híbridos hidrazonas 82 consegue inibir o
T. cruzi, pois a literatura aplica vários mecanismos de ação aos nitro-heterociclos, como por
exemplo a formação de radicais tóxicos desencadeando estresse oxidativo sobre as enzimas
do protozoário: a Cruzaína [97]
; ou a Triapanotiona redutase (através de ligação ao centro
dissufeto) [54]
, causando morte no parasita [10, 97]
.
O que se pode comentar é o sucesso destes novos compostos derivados dos aza-
biciclos isoxazolínicos, que permite agora mais uma diversidade de opções para se poder
trabalhar, tanto no aspecto químico como no biológico.
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Conclusões
Conclusões
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Conclusões Página 144
8. CONCLUSÕES
Neste estudo, foi comprovado a versatilidade química e biológica dos heterociclos
pirrolidina[3,2-d]-2-isoxazolina e pipepiridina[3,2-d]-2-isoxazolina, otimizando a síntese dos
ésteres e desenvolvendo com sucesso as sintezes das hidrazidas, dos álcoois e dos aldeídos
isoxazolínicos, e em seguida, formando híbridos ativos dos aza-biciclos.
Para se obter os novos derivados de semicarbazonas e tiossemicarbazonas, foram
sintetizados cinco derivados alcoóis com seus respectivos aldeídos isoxazolínicos, sendo três
de 5 membros e dois de 6 membros. Desta forma, foram obtidos duas novas séries de
derivados de semicarbazonas e de tiossemicarbazonas de ambos os biciclos, obtendo-se, com
bons rendimentos, 10 novos compostos bioativos, seis com núcleo pirrolidina[3,2-d]-2-
isoxazolina e quatro com o pipepiridina[3,2-d]-2-isoxazolina.
Todos os produtos, de ambas os núcleos, foram realizados os testes microbiológicos
preliminares, e mostraram que as novas nitrofurufuril-hidrazonas isoxazolínicas, na
concentração de 100,0 μg, são ativas contra as cepas bacterianas Gram-positivas e Gram-
negativas analisadas, enquanto as semicarbazonas e tiossemicarbazonas não o são. Contudo,
nenhum dos compostos foi ativo contra os fungos.
Para a avaliação preliminar da atividade antichagásica, foram utilizados dados de
citotoxicidade e da IC50 dos epimastigotas. Todos os compostos de ambas as séries
demonstraram inibir em baixas concentrações a forma epimastigota do T. cruzi, dentre os
quais, o 68b, 80b e 80d apresentaram baixíssima citotoxicidade (<100 µg/mL), e desta forma
são considerados os antitripanossômicos mais seguros dentre os compostos analisados. Além
disso, a nitrofurfuril-hidrazona 82b apresentou uma concentração inibitória de 2,33 µg/mL,
valor bem próximo ao do benzinidazol, fármaco de referência, IC50 igual a 1,73; com o
mesmo potencial citotóxico (25 µg/mL).
O resultado mais expressivo foi o da nitrofurfuril-hidrazona 82a, que despontou como
antimicrobiano e antichágasico mais potente de ambas as séries, pois além de promover os
maiores halos de inibição bacteriana, uma média de 20,0 mm, demonstrou uma
citototoxicidade de 25,0 µg/mL e uma IC50 de 1,17 µg/mL, valor superior ao benzinidazol.
Os objetivos pretendidos no projeto inicial, quanto à parte química e biológica, foram
plenamente executados, apresentando resultados bastante satisfatórios, quanto à ação
antimicrobiana e antichagásica. E, desta forma, pôde ser comprovado o grande potencial
sintético e biológico dos heterociclos isoxazolínicos.
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Perspectivas
Perspectivas
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Perspectivas Página 145
9. PERSPECTIVAS:
1- Diante dos bons resultados em testes biológicos preliminares, pretendemos dar
seguimento a testes mais específicos:
a) Avaliação dos derivados isoxazolínicos sobre as formas amastigostas e tripomastigotas
do T. cruzi;
b) Estudo de docking, e in vitro sobre a enzima cruzaína do T. cruzi;
c) Testes de Concentração Mínima Inibitória (CMI), com as hidrazonas 82.
d) Avaliação da atividade bactericida das hidrazonas 82 sobre cepas multirresistentes.
2- Aperfeiçoar o processo de purificação para melhorar os rendimentos das reações.
3- Diante da versatilidade relatada na literatura, com a formação de inúmeros complexos
de semicarbazonas [62]
, tiossemicarbazonas [28]
e hidrazonas [50]
, pretende-se, então,
desenvolver séries de complexos metálicos: rutênio[09, 50]
, cobre [25]
, platina [73]
. E
averiguar a atividade antineoplásica, antichagásica e antimicrobiana entre ligantes e
complexos.
4- Ciclizar a porção semicarbazonas e tiosemicarbazona [64]
; e conduzir a testes
biológicos.
5- Produzir novas séries de semicarbazonas e tiosemicarbazonas, com outros
substituintes a porção arila [28, 48, 63, 76]
, e uma posterior avaliação biológica.
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