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Dispersione dei raggi X
• Nello studio delle proprieta strutturali di macromolecole, le tecniche
piu potenti sono quelle basate sulla dispersione dei raggi X.
Attraverso la cristallografia dei raggi X si puo determinare la strut-
tura terziaria di proteine o di acidi nucleici con una risoluzione minore
di 3 A.
Per sistemi meno ordinati, come fibre o aggregati lipidici, la diffrazione
dei raggi X fornisce utili informazioni strutturali.
Per macromolecole biologiche in soluzione, la diffusione (scattering)
dei raggi X permettere di ottenere informazioni sulla forma e le di-
mensioni delle particelle.
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I raggi X
• Da un punto di vista classico, sono onde elettromagnetiche con
lunghezza d’onda λ compresa tra 0.1 e 100 A. Da un punto di vista
quantistico, sono fotoni con energia E = hν = hc/λ compresa tra
0.1 e 100 KeV (1 KeV = 1.6 · 10−16 J).
Normalmente vengono generati bombardando una targhetta di met-
allo (es. Cu o Mo) con elettroni di energia circa 10 KeV. Questi
elettroni riescono a strappare gli elettroni degli orbitali piu interni
(guscio K) degli atomi. La vacanza viene rapidamente riempita at-
traverso la transizione di un elettrone atomico proveniente dai gusci
piu esterni (M e L).
λKα =hc
EL − EKλKβ =
hc
EM − EK
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Numeri complessi
z = a + ib a e b numeri reali
i =√−1 unita immaginaria
a parte reale
b parte immaginaria
|z| =√
a2 + b2 modulo
z∗ = a− ib complesso coniugato
z z∗ = |z|2z = |z|(cos α + i sin α)
cos α = a|z|
sin α = b|z|
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Relazione di Eulero
eiα = cos α + i sin α Relazione di Eulero
z = |z|eiα Notazione esponenziale
eiα e nota come fase del numero complesso
• Pertanto una funzione periodica seno o coseno puo essere espressa
con un esponenziale complesso.
Combinare gli esponenziali e piu semplice che combinare le funzioni
trigonometriche
ei(x+y) = eixeiy
cos(x + y) = cos x cos y − sin x sin y
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Campo elettromagnetico
E(r, t) = E0 cos[2π
(k·rλ − νt + δ
)]Notazione reale
E(r, t) = E0e2πi(k·r/λ−νt+δ) Notazione esponenziale
t tempo
E0 ampiezza massima
k vettore unitario nella direzione di propagazione
λ lunghezza d’onda
ν frequenza
δ fase
t > 0t = 0
origine
rk
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Differenza di fase
Consideriamo due onde che differiscono solo nella fase e che si som-
mano
E1(r, t) = E0e2πi(k·r/λ−νt+δ1)
E2(r, t) = E0e2πi(k·r/λ−νt+δ2)
= E1(r, t)e2πiδ δ = δ2 − δ1, spostamento di fase
E1(r, t) + E2(r, t) = E1(r, t)(1 + e2πiδ)
• Se δ = 1/2 (mezzo ciclo) 1 + e2πiδ = 0
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Esempio
E1(1 + e2πiδ), δ = 0
E2
E1
E1(1 + e2πiδ), δ = 1
4
E2
E1
E1(1 + e2πiδ), δ = 1
2
E2
E1
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Processo elementare di scattering
2θ
rivelatore
sorgentes
s0
• Un elettrone e posto al centro del sistema di riferimento. Un fascio
collimato di raggi X lo colpisce.
• Nel caso di scattering elastico (scattering Thompson), l’elettrone e
in grado di deviare il fascio in tutte le direzioni.
s0 vettore unitario nella direzione del fascio incidente
s vettore unitario nella direzione del fascio deviato
2θ angolo di scattering
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Scattering da due elettroni
r
s
s0
s
s0
La distanza r e molto piu piccola della distanza tra gli elettroni e la
sorgente e della distanza tra il rivelatore e gli elettroni
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Differenza di fase
differenza di cammino = r · s − r · s0
r · s0
r · s
r
s
s0
• Si puo calcolare la differenza di fase tra i due fasci deviati
δ =1
λr · (s− s0)
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Vettore di scattering
Q
2θ
s
s0
Conviene definire un nuovo vettore
Q ≡ 2π
λ(s− s0) corrisponde alla quantita di moto trasferita
2πδ = Q · r
Q =4π
λsin θ modulo di Q
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Fattore di struttura di un elettrone
Ampiezza delle due onde deviate dai due elettroni
Elettrone all’origine (scattering Thomson) E(Q) ≡ −r0sin Ψ
R E0
Elettrone in r E(Q)eiQ·r
r0 raggio classico dell’elettrone, R distanza tra elettrone e rivelatore,
Ψ angolo tra r e la direzione di polarizzazione.
• Il fattore di struttura di un elettrone in r e definito dal rapporto tra
l’ampiezza dell’onda diffusa dallo stesso elettrone e quella diffusa
dall’elettrone posto all’origine. Si ha pertanto
f (Q) ≡ eiQ·r
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Fattore di struttura di un atomo
• Per un atomo il fattore di struttura sara dato dal contributo di tutti
gli elettroni
f (Q) =
∫d3rρ(r)eiQ·r
ρ(r), densita elettronica
Quest’ultima equazione e una trasformata di Fourier. Il fattore di
struttura di un’atomo e quindi la trasformata di Fourier della sua
densita elettronica.
• Trasformata di Fourier inversa
ρ(r) =1
(2π)3
∫d3Qf (Q)e−iQ·r
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Proprieta del fattore di struttura
f (0) =
∫d3rρ(r) ≡ Z Numero atomico
E’ un numero complesso, costituito pertanto da una parte reale ed
una immaginaria, oppure da un modulo e una fase.
• Il rilevatore e in grado di misurare non l’ampiezza, ma l’intensita
della radiazione diffusa. Avendo adottato la notazione complessa,
l’intensita dipende dal quadrato del numero complesso, e quindi
soltanto dal modulo di f (Q)
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Sezione d’urto differenziale
• Per un fascio di raggi X non polarizzato si definisce la sezione d’urto
differenziale dσdΩ(Q) come il rapporto tra l’energia diffusa per unita
di tempo e l’energia incidente per unita di tempo e di area,
dσ
dΩ(Q) = r2
0
(1 + cos2(2θ)
2
)f (Q) f ∗(Q)
= r20
(1 + cos2(2θ)
2
)|f (Q)|2
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Rappresentazione di Fourierdella δ(Q) di Dirac
Estensione a tre dimensioni della δ(x)
δ(Q) =
0 Q 6= 0
∞ Q = 0
• Rappresentazione di Fourier
δ(Q) =1
(2π)3
∫d3r eiQ·r
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Fattori di struttura atomici
Con buona approssimazione, la densita elettronica di un atomo ha
una simmetria sferica, ρ(r) ≡ ρ(r), dove r ≡ (r, θ, φ)
• I fattori di struttura diventano funzioni reali che dipendono soltanto
dal modulo Q
f (Q) =
∫ ∞
0
r2dr
∫ π
0
sin θdθ
∫ 2π
0
dφ ρ(r) eiQ·r
= 4π
∫ ∞
0
r2drρ(r)sin(Qr)
Qr≡ f (Q)
trasformata di Fourier isotropa
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Esempio
K
Cl
S
P
Na
O
N
C
H
Q (A−1
)
f(Q)
109876543210
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
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Fattore di struttura di una molecola
In generale, dovremo prendere in rassegna tutti gli elettroni. Si
ottiene
F (Q) =
∫d3rρ(r)eiQ·r
ρ(r), densita elettronica molecolare
• D’altra parte gli elettroni sono concentrati negli atomi. Sia N il
numero totale di atomi. L’atomo n-esimo si trovera nella posizione
rn. Il suo fattore di struttura dovra essere moltiplicato per la fase
corrispondente eiQ·rn. Si ha dunque
F (Q) =
N∑n=1
fn(Q)eiQ·rn
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Scattering di due atomi
Gli atomi sono identici, il loro fattore di struttura e f (Q). Il primo
e nell’origine, l’altro in a
F (Q) = f (Q) (1 + eiQ·a)
• Calcoliamo la sezione d’urto differenziale
dσ
dΩ(Q) = r2
0
(1 + cos2(2θ)
2
)F (Q) F ∗(Q)
= r20
(1 + cos2(2θ)
2
)f 2(Q)(1 + eiQ·a)(1 + e−iQ·a)
= r20
(1 + cos2(2θ)
2
)2f 2(Q)[1 + cos(Q · a)]
• Ci sono due termini, uno deriva dai singoli atomi, l’altro tiene conto
della loro distanza
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Scattering di un reticolomonodimensionale di atomi
a
0
Sia a il vettore traslazione e sia N il numero totale di atomi, tutti
identici. Si ha
F (Q) = f (Q)
N∑n=1
ei(n−1)Q·a
= ei(N−1)Q·a2 f (Q)sin
(N Q·a
2
)sin
(Q·a2
)
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Sezione d’urto differenziale
dσ
dΩ(Q) = r2
0
(1 + cos2(2θ)
2
)F (Q) F ∗(Q)
= r20
(1 + cos2(2θ)
2
)f 2(Q)S(Q)
S(Q) =
sin(N Q·a
2
)sin
(Q·a2
)2
funzione d’interferenza
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N = 4
S(Q)[f (Q)]2S(Q)
N 2[f (Q)]2
Q·a2π
3210-1-2-3
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
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N = 15
S(Q)[f (Q)]2S(Q)
N 2[f (Q)]2
Q·a2π
3210-1-2-3
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
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Condizione di van Laue
Si nota che se Q·a2π e un numero intero, S(Q) = N 2. Quando N e
molto grande, i picchi diventano molto alti e stretti.
• In sostanza, solo certe orientazioni tra il cristallo monodimensionale
e Q danno luogo a un segnale diverso da zero. Questa condizione e
nota come la condizione di van Laue
Q · a2π
= h h = 0,±1,±2, . . .
(s− s0) · aλ
= h h = 0,±1,±2, . . .
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Caso a e s0 paralleli
Q
s
s0
h = −5
2π
a
h = −4
2π
a
h = −3
2π
a
h = −2
2π
a
h = −1
2π
a
h = 0
a2π
λ
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Caso a e s0 perpendicolari
Qs
s0
h = 2
2π
a
h = 1
2π
a
h = 0
2π
a
h = −1
2π
a
h = −2
2π
a
a
2π
λ
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Reticolo tridimensionale
I 14 reticoli di Bravais, R = naa+nbb+ncc, con na,b,c = 0,±1,±2, . . .
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Scattering di un reticolotridimensionale di atomi
E’ un’estensione del caso monodimensionale. Siano a, b e c i tre
vettori traslazione del reticolo. Il fattore di struttura risulta
F (Q) = f (Q)∑na
∑nb
∑nc
eiQ·(naa+nbb+ncc)
• Condizioni di van Laue: F (Q) e diverso da zero solo quando
Q · a = 2πh h = 0,±1,±2, . . .
Q · b = 2πk k = 0,±1,±2, . . .
Q · c = 2πl l = 0,±1,±2, . . .
⇒ eiQ·R = 1
h, k, l sono gli indici di Miller
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Definizione di Fh,k,l
Quando le tre condizioni sono rispettate, risulta allora
F (Qh,k,l) = f (Qh,k,l)∑na
∑nb
∑nc
1
• Si scrive allora
F (Qh,k,l) ≡ Fh,k,l = Nf(Qh,k,l)
dove N e il numero totale di atomi nel reticolo. Il fattore di struttura
atomico viene “campionato” soltanto per determinati valori di Q,
quelli che obbediscono alle condizioni di von Laue.
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Cristallo
Un cristallo molecolare e un reticolo di Bravais in cui nelle posizioni
reticolari sono presenti una o piu molecole
Reticolo + Base = Cristallo
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Scattering da un cristallo molecolare
Applicando il teorema della convoluzione, si dimostra che il fattore
di struttura risulta
F (Q) = Fm(Q)∑na
∑nb
∑nc
e2πi(nah+nbk+ncl) = Fh,k,l = NFm(Qh,k,l)
dove Fm(Q) e il fattore di struttura molecolare della cella unitaria
Fm(Q) =∑
j
fj(Q)eiQ·rj
rj vettore del j-esimo atomo nella cella unitaria
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Fh,k,l di un cristallo molecolare
Possiamo esprimere il vettore rj in termini dei vettori di cella
rj = xja + yjb + zjc
• Si ha pertanto
Fm(Q) =∑
j
fj(Q)eiQ·(xja+yjb+zjc)
• Applicando le condizioni di van Laue si ottine infine
Fh,k,l =∑
j
fj(Q)e2πi(hxj+kyj+lzj)
• Rappresenta lo scattering della cella unitaria campionato nei punti
reticolari h, k, l.
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Il reticolo reciproco
Nello spazio reale, il reticolo rappresenta l’insieme delle posizioni che
si ripetono a distanze regolari. Si puo dimostrare che nello spazio
reciproco, lo spazio del vettore di scattering Q, i punti che rispettano
le tre condizioni di von Laue costituiscono, a loro volta, un reticolo,
il reticolo reciproco.
• I tre vettori del reticolo reciproco risultano
a∗ = 2πb× c
Vb∗ = 2π
c× a
Vc∗ = 2π
a× b
V
dove V = a · b × c e il volume della cella unitaria. Il simbolo ×rappresenta il prodotto vettoriale e il simbolo · il prodotto scalare.
• I valori di Q che appartegono al reticolo reciproco si calcolano dalla
relazione
Qh,k,l = ha∗ + kb∗ + lc∗
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Densita elettronica
La densita elettronica all’interno della cella unitaria si calcola at-
traverso l’antitrasformata di Fourier del fattore di struttura. Tenendo
conto delle condizioni di van Laue, si ottiene
ρ(r) =1
NV
∞∑h=−∞
∞∑k=−∞
∞∑l=−∞
Fh,k,l e−2πi(hx+ky+lz)
dove r = (x, y, z) e il vettore nello spazio diretto.
• Tuttavia dagli esperimenti si possono calcolare soltanto i moduli
|Fh,k,l| ma non le fasi eiφ. Il problema delle fasi e uno dei piu grandi
ostacoli della cristallografia.
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Centro di simmetria
Se la densita elettronica possiede un centro di simmetria,
ρ(r) = ρ(−r)
• Si dimostra che Fh,k,l e un numero reale, per cui
eiφ = ±1
ovvero c’e solo incertezza sul segno. Per n fattori di struttura, 2n
possibili scelte
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Metodo delle sostituzioniisomorfe multiple
1. Si preparano differenti cristalli della macromolecola biologica con sostituzioni isomorfe dialcuni atomi con atomi pesanti.
2. Si tenta di trovare la locazione degli atomi pesanti nel cristallo (metodo di Patterson)
3. Si calcola il fattore di struttura degli atomi pesanti
F(H)h,k,l =
∑j=atomi pesanti
fj(Q)e2πi(hxj+kyj+lzj) = |F (H)h,k,l|e
iφh,k,l
4. Si assegnano le fasi degli atomi pesanti φh,k,l alle fasi dei fattori di struttura totali con glistessi h, k, l.
5. Si calcola quindi la densita elettronica totale e da questa una nuova posizione degli atomipesanti. Si torna quindi allo step 2.
6. Dalla struttura ricavata si calcolano gli Fh,k,l di tutti cristalli isomorfi e da queste le densitaelettroniche.
7. Si torna quindi allo step 2 e si ripete la procedura per tutti i cristalli isomorfi disponibili.
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Coni di diffrazione
• Il campione e costituito da grani policristallini con orientazione ca-
suale
• I fasci diffratti si dispongono in coni
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La legge di Bragg
E’ una formulazione equivalente alle condizioni di van Laue. Si
puo dimostare che ad ogni vettore Qh,k,l del reticolo reciproco cor-
risponde una famiglia di piani nel reticolo diretto che contengono i
punti reticolari e che si trovano a distanza
dh,k,l =2π
Qh,k,l
• La legge di Bragg mette in relazione il valore di dh,k,l con l’angolo
di scattering 2θ e la lunghezza d’onda
2dh,k,l sin θ = nλ n = ±1,±2, . . . ordine di diffrazione
Questa formulazione e piu utile per descrivere la diffrazione.
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Informazioni ottenibili• Posizione dei picchi:
Distanze interplanari
Cella cristallografica
Determinazione di fase
Analisi qualitativa
• Intensita dei picchi:
Intensita di una fase
Analisi strutturale
Intensita di piu fasi
Analisi quantitativa
• Larghezza dei picchi
Dimensione dei cristalliti
Deformazione dei cristalliti
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Diffrazione di sistemi lipidi/acqua
I sistemi lipidi/acqua sono in grado di generare numerose fasi, in
funzione della concentrazione, della temperatura o della pressione.
La caratteristica fondamentale di tali sistemi e la tendenza a segre-
gare la parte polare e quella apolare delle molecole in regioni distinte
• Come diretta conseguenza, in fase acquosa si formano stutture or-
dinate a lungo raggio, in una due o tre dimensioni.
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Diffrazione di fasi lipidiche
Le fasi lipidiche sono strutturalmente analoghe a sistemi policristallini
di reticoli in una, due o tre dimensioni.
• Da uno spettro di diffrazione dei raggi X e dunque possibile risalire
alla identificazione delle fasi presente e alla determinazione della loro
struttura (parametri di cella)
La simmetria del reticolo si riflette infatti in una serie di riflessioni
di Bragg che nello spazio reciproco hanno un caratteristico rapporto
di posizioni.
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Valori di Q permessi per fasi lipidiche
Fase Q Rapporti di spaziatura
Lamellare Qh = 2πd h 1 : 2 : 3 : 4 . . .
Esagonale Qhk = 4π√3a
√h2 + k2 − hk 1 :
√3 :√
4 :√
7 :√
12 . . .
Cubica Qhkl = 2πa
√h2 + k2 − l2 Ia3d (Q230)√
6 :√
8 :√
14 :√
16 :√
20 :√
22 :√
24 . . .Pn3m (Q224)√
2 :√
3 :√
4 :√
6 :√
8 :√
9 :√
10 . . .Im3m (Q229)√
2 :√
4 :√
6 :√
8 :√
10 :√
12 :√
14 . . .Pm3n (Q223)√
2 :√
4 :√
5 :√
6 :√
8 :√
10 :√
12 . . .Fd3m (Q227)√
3 :√
8 :√
11 :√
12 :√
16 :√
19 :√
24 . . .P4332 (Q212)√
2 :√
3 :√
5 :√
6 :√
8 :√
9 :√
10 . . .
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Analisi delle intensita
Assegnata la fase, ad ogni picco di diffrazione e possibile assegnare
gli indici h, k, l (indicizzazione).
Per effetto della simmetria, alcune terne h, k, l possono portare allo
stesso Qh,k,l, percio si definisce la molteplicita della riflessione mh,k,l
• La maggior parte delle fasi lipidice sono centrosimmetriche, ovvero
ρ(r) ≡ ρ(−r). Si ha pertanto
Fh,k,l = ±
√Ih,k,l
mh,k,l
• Problema delle “fasi”
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Soluzione con metodi indiretti1. Da informazioni sulla
molecola di lipide e da con-
siderazioni di simmetria si
costruisce un modello di den-
sita elettronica
2. Dalla densita elettronica mod-
ello si calcolano i fattori di
struttura e quindi le intensita
3. Si confrontano le intensita
teoriche con quelle sperimen-
tali
4. Si modifica il modello di den-
sita elettronica e si ritorna allo
step numero 1 finche l’accordo
tra intensita teorica e speri-
mentale (step 3) e considerato
accettabile