UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARAN

PATRICIA VIOLETA ARAJO LPEZ

BIOPROSPECO DE EXTRATOS DE Croton urucurana Baill E SEUS FUNGOS ENDOFTICOS

CURITIBA 2010

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PATRICIA VIOLETA ARAJO LPEZ

BIOPROSPECO DE EXTRATOS DE Croton urucurana Baill E SEUS FUNGOS ENDOFTICOS

Dissertao apresentada ao Programa de Psgraduao em Microbiologia, Parasitologia e Patologia, rea de concentrao Microbiologia, Departamento de Patologia Bsica, Setores de Cincias Biolgicas e da Sade, Universidade Federal do Paran, como parte das exigncias para a obteno do ttulo de Mestre em Microbiologia. Orientadora: Prof Dr Vnia Aparecida Vicente. Co-orientadora: Prof Dr Chirlei Glienke.a a a a

CURITIBA 2010

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DEDICATRIA

A meus pais Davina e Juan Carlos, meu irmo Carlos David e minha av Dona Picuta (in memorian)

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AGRADECIMENTOS

A Deus pela vida, sade e bnos dadas minha pessoa e a meus seres queridos. Aos meus pais, Davina Lpez e Juan Carlos Arajo, pelo amor, compreenso e apoio incondicional em todos os momentos da minha vida. A meu irmo Carlitos, pelo apoio constante e incentivo. minha orientadora, Profa Dra Vania Aparecida Vicente, pela oportunidade, sbios conselhos e por se tornar em um exemplo de vida dedicada pesquisa. Profa Dra Chirle Glienke pela coorientao, crticas construtivas e pacincia em Corrigir a dissertao. Profa Dra Edilene Alcntara de Castro e Profa Dra Vanete Tomaz Soccol, pelo apoio e por terem possibilitado minha insero no programa de Ps-graduao em Microbiologia, Parasitologia e Patologia. Profa Dra Beatriz Helena Noronha de Sales Maia, pela colaborao no trabalho e pelo apoio, amizade e conselhos e por ser uma pessoa to generosa e sempre disposta a me ajudar. Ao Prof. Dr. Joo Lucio de Azevedo por ter participado da banca examinadora e pelas valiosas sugestes para o melhoramento do presente trabalho. Profa Dra Selma Faria Zawadzki Baggio, pelo apoio, conselhos e pela disponibilidade dos equipamentos do laboratrio. Profa Dra Rosa Degen, por me iniciar na pesquisa cientfica na graduao e pela amizade, incentivo, ensinamentos e por ter me mostrado que com fora de vontade e sacrifcio podemos alcanar nossos objetivos. Profa Dra Celma Aguilera de Fernndez pelo carinho, amizade, palavras de incentivo. Profa Dra Andria Sthingen pelo apoio e por ter participado da minha banca de qualificao. Aos professores do Programa do Mestrado em Microbiologia, Parasitologia e Patologia, pelos valiosos ensinamentos que contriburam grandemente para minha formao profissional e pessoal. Aos Prof. Dr. Jos Plans, Profa Dra Juana Ortellado de Canese e Dra Herminia Perez pelas cartas de recomendao para o ingresso no programa de Ps-graduao e por terem me ensinado tanto na rea da Microbiologia e incentivado meu interesse por esta maravilhosa cincia.

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s Dras. do Departamento de Microbiologia do Hospital das Clnicas de Asuncin Paraguai: Juana Ortellado, Marcela Laconich, Graciela Lird, Mirta Casco, Gladys Velazquez, Maria Eugenia Mayor, Myriam Rivas, Carmen Menacho e Ana Zubeldia, por terem conduzido meus primeiros passos na rea da Microbiologia. Muito obrigada pela pacincia e generosidade em me ensinar tantos aspectos importantes na Microbiologia clnica. profa Dra Marisol Domingues Muro, pela disponibilizao dos isolados clnicos de fungos filamentosos. A amiga, colega e companheira de luta Fabiana Tonial pela amizade, pacincia e apoio constante. A amiga Dicler Barbieri pela amizade, conselhos e grande ajuda nos momentos difceis. Aos colegas da Ps-graduao, Juliana Burjack, Samarina de Frana Braga, Juliana Duarte, Raquel Schier, Saloe Bispo, Paulo Dantas Marangoni, Eduardo Zardo, Angela Bozza, Mariana Porsani e Sabina Tralamazza pela ajuda e pelos agradveis momentos de convivncia. As estagirias do LabMicro Poliana M. Mazur, Ismana de Lima e Daniele Santos, pela colaborao no desenvolvimento deste trabalho. doutoranda Josiane Gomes Figueiredo, pela importante ajuda no isolamento dos microrganismos endofticos. doutoranda Nelissa Pacheco Vaz pela amizade e pacincia em me ajudar na realizao das cromatografias e pela ajuda na formatao das fotos da dissertao. A minha tia Emilia Lpez pelo apoio e por ter-me presente nas suas oraes. As amigas Yenny Gonzlez e Rocio Riveros pela amizade e ajuda. A todas as pessoas que de uma maneira o outra colaboraram com a realizao deste trabalho. Ao CNPq, pela bolsa de estudos.

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El Seor cre las plantas medicinales que brotan de la tierra: um hombre inteligente no las menosprecia. Sircida 38, 4

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RESUMO A bioprospeco de plantas medicinais e microrganismos endofticos constitui uma atividade promissora na pesquisa e deteco de novos compostos com atividades biolgicas de interesse na rea da sade e na rea agronmica. Croton urucurana Baill (Euphobiaceae) uma planta amplamente utilizada na medicina tradicional em pases como Brasil, Paraguai e Uruguai. Entre as vrias propriedades medicinais atribudas planta, destaca-se seu uso para tratar doenas de etiologia infecciosa. No presente trabalho foi avaliada a atividade antibacteriana e antifngica de diferentes extratos de C. urucurana contra as bactrias gram positivas Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis e Streptococcus mutans, bactrias gram negativas Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa e contra os fungos filamentosos Microsporum gypseum, Fonsecaea monophora e Guignardia citricarpa. Devido ao fato de que nos ltimos anos vrios trabalhos vm demonstrando a importncia dos microrganismos endofticos de plantas medicinais como fontes de compostos bioativos, neste trabalho tambm se realizou a bioprospeco de fungos endofticos isolados da planta. Avaliou-se o potencial antibacteriano e antifngico como tambm a capacidade de produo de compostos bioativos em diferentes meios de cultura desses microrganismos. Em relao atividade da planta, comparando a atividade antimicrobiana de extratos brutos da folha e casca do caule, este ltimo demonstrou maior atividade. As bactrias mais sensveis a esse extrato foram P. aeruginosa (CIM: 0,1 mg/mL) e S. aureus (CIM: 0,5 mg/mL). Nenhuma das fraes demonstrou uma atividade maior que a do extrato bruto, devido provavelmente a atividade do extrato ser produzida por um sinergismo entre vrios princpios ativos. Porm, notou-se que as fraes mais polares foram as mais ativas. Para selecionar os fungos endofticos com maior potencial antimicrobiano foi realizado o teste de antagonismo de 27 isolados endofticos contra os fungos G. citricarpa e F. monophora. Tambm foi realizada uma triagem de atividade antibacteriana contra bactrias gram positivas e gramnegativas. Seis isolados foram selecionados para a produo de metablitos em diferentes meios de cultura: meios lquidos, malte e milho, e meios slidos arroz e milho. Os extratos obtidos apresentaram diferentes graus de atividade antimicrobiana. A anlise dos extratos mais ativos da planta, atravs de cromatografia em camada delgada demonstrou a presena de metablitos da classe dos polifenis. Em relao aos extratos dos endofticos, o perfil cromatogrfico variou bastante em funo do fungo e meio de cultura utilizado. O extrato do isolado endoftico FCU 055 Epicoccum sp cultivado em meio slido milho demonstrou uma interessante atividade antimicrobiana contra G. citricarpa e P. aeruginosa. Palavras-chave: Croton urucurana, atividade antimicrobiana, endofticos, produo de compostos bioativos.

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ABSTRACT

The bioprospection of medicinal plants and endophytic microorganisms constitutes a promising activity in research and detection of new compounds with biological activities of interest in health and agricultural areas. Croton urucurana Baill (Euphobiaceae) is a plant widely used in traditional medicine of countries like Brazil, Paraguay and Uruguay. Among many of medicinal properties attributed to this plant, stands out its use to treat diseases of infectious etiology. The present study evaluated the antibacterial and antifungal activity of different extracts of C. urucurana against Gram-positives bacteria, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis and Streptococcus mutans, Gram-negatives bacteria Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa, and against filamentous fungi Microsporum gypseum, Fonsecaea monophora and Guignardia citricarpa. As in recent years several studies have shown the importance of endophytic microorganisms of medicinal plants as sources of bioactive compounds, in this study was also done the bioprospection of endophytic fungi isolated from the same plant. It were evaluated the antibacterial and antifungal potential as well as the ability of these microorganisms to produce bioactive compounds in different culture media. Regarding the activity of the plant, comparing the antimicrobial activity of crude extracts of leaf and stem bark, the latter showed greater activity. The bacteria most sensitive to this extract were P. aeruginosa (MIC: 0.1 mg / mL) and S. aureus (MIC: 0.5 mg / mL). None of the fractions showed greater activity than the crude extract, probably because the activity of the extract is produced by a synergism between various active principles. However, it was noted that the more polar fractions were most active. To select the endophytic fungi with the greatest antimicrobial potential it was performed an antagonism test in which 27 fungi were faced against G. citricarpa and F. monophora, it was also done a screening of antibacterial activity against Gram-positive and Gram-negative bacteria. Six isolates were chosen for the production of metabolites in different culture media: the liquid media, malt and corn, and the solid media, rice and corn. The extracts showed varying degrees of antimicrobial activity. The analysis of the most active extracts of the plant by thin layer chromatography revealed the presence of metabolites class of polyphenols. With regard to the endophytes extracts the chromatographic profile varied depending on the fungus and culture medium used. The extract from isolated endophytic FCU 055 Epicoccum sp grown on corn solid medium showed an interesting antimicrobial activity against G. citricarpa and P. aeruginosa. Key words: Croton urucurana, antimicrobial activity, endophyte, production of bioactive compounds.

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LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 FIGURA 2

Croton urucurana......................................................................................................... 31 PARTES DA PLANTA UTILIZADAS PARA A OBTENO DOS EXTRATOS: FOLHA (A) CASCA DO CAULE (B) DE Croton urucurana ........................................ 51

FIGURA 3

MTODO DE MACERAO PARA EXTRAO DE PRINCPIOS ATIVOS DE FOLHAS (A) E CASCA DO CAULE (B) DE Croton urucurana ............................. 52

FIGURA 4 ETAPAS DO ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS ENDOFTICOS A PARTIR DE FOLHAS DE Croton urucurana ............................................................... 57 FIGURA 5 CULTIVO EM MEIO SLIDO (GROS DE MILHO E ARROZ) DO ISOLADO ENDOFTICO FCU 055 ............................................................................................... 60 FIGURA 6 FIGURA 7 ESQUEMA DE PRODUO E EXTRAO DE METABLITOS SECUNDRIOS DE FUNGOS CULTIVADOS EM MEIO LQUIDO ........................... 61 AVALIAO PRELIMINAR DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DOS EXTRATOS BRUTOS DE FOLHAS E CASCA DO CAULE DE Croton urucurana .................................................................................................................... 65 FRACIONAMENTO DO EXTRATO BRUTO: A) COLUNA

FIGURA 8

CROMATOGRFICA. B) ESQUEMA DE SOLVENTES UTILIZADOS ...................... 66 FIGURA 9 CRESCIMENTO MICELIAL DAS COLNIAS DE M. gypseum NA

PRESENA DO EXTRATO BRUTO METANLICO DE CASCA DO CAULE de C. urucurana. .......................................................................................................... 74 FIGURA 10 MACRO E MICROMORFOLOGIA ISOLADO ENDOFTICO Epicoccum sp FCU 055 ...................................................................................................................... 76 FIGURA 11 MACRO E MICROMORFOLOGIA DO ISOLADO ENDOFTICO FCU 028 ................ 76 FIGURA 12 MACRO E MICROMORFOLOGIA ISOLADO ENDOFTICO FCU 054 ...................... 76 FIGURA 13 MACRO E MICROMORFOLOGIA ISOLADO ENDOFTICO FCU 060. ..................... 77 FIGURA 14 TESTE DE ANTAGONISMO DE PAREAMENTO DE MICRORGANISMOS ENDOFTICOS CONTRA O FUNGO Guignardia citricarpa ....................................... 82 FIGURA 15 ATIVIDADE DOS EXTRATOS DE ENDOFTICOS CONTRA O

CRESCIMENTO DE Guignardia citricarpa.................................................................. 85 FIGURA 16 CROMATOGRAFIAS EM CAMADA DELGADA DE EXTRATOS E FRAES DE Croton urucurana................................................................................................... 90 FIGURA 17 EXTRATOS DO FUNGO ENDOFTICO FCU 055 CULTIVADOS EM DIFERENTES MEIOS DE CULTURA E ANALISADOS POR CCD ............................ 93

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LISTA DE QUADROS

QUADRO 1

AVALIAO PRELIMINAR DOS EXTRATOS BRUTOS METABLICOS DE FOLHAS E CASCA DO CAULE DE Croton urucurana BASEADA NO HALO DE INIBIO DE CRESCIMENTO EXPRESSO EM mm......................................... 64

QUADRO 2

CONCENTRAO INIBITRIA MNIMA (CIM) DOS EXTRATOS BRUTOS METABLICOS DE CASCA DE CAULE E FOLHAS DE Croton urucurana ........... 67

QUADRO 3

CONCENTRAO INIBITRIA DAS FRAES DO EXTRATO BRUTO DE CASCA DE CAULE DE Croton urucurana CONTRA BACTRIAS DE IMPORTNCIA CLNICA .......................................................................................... 68

QUADRO 4

DIMETRO DAS COLNIAS E PORCENTAGEM DE INIBIO DE CRESCIMENTO MICELIAL DE M. gypseum NA PRESENA DO EXTRATO BRUTO METANLICO DE CASCA DE CAULE DE Croton urucurana .................. 72

QUADRO 5

DIMETRO DAS COLNIAS E PORCENTAGEM DE INIBIO DE CRESCIMENTO MICELIAL DE Fonsecaea monophora NA PRESENA DO EXTRATO BRUTO METANLICO DE CASCA DE CAULE DE Croton urucurana ................................................................................................................. 73

QUADRO 6

NMERO E PORCENTAGEM DE FUNGOS E BACTRIAS ISOLADOS DE FOLHAS E CASCA DE CAULE DE Croton urucurana ............................................ 75

QUADRO 7

ATIVIDADE DOS EXTRATOS DE ENDOFTICOS FRENTE A BACTRIAS E LEVEDURAS DE IMPORTNCIA CLNICA .......................................................... 86

QUADRO 8

PERCENTAGEM DE INIBIO DE CRESCIMENTO MICELIAL DO FUNGO Guignardia citricarpa NA PRESENA DE DIFERENTES EXTRATOS DO FUNGO ENDOFTICO FCU 055 .............................................................................. 88

QUADRO 9

PERCENTAGEM DE INIBIO DE CRESCIMENTO MICELIAL DO FUNGO Guignardia citricarpa NA PRESENA DE DIFERENTES EXTRATOS DO FUNGO ENDOFTICO FCU 028 .............................................................................. 88

QUADRO 10 DETECO

DE

CLASSES

DE

METABLITOS

SECUNDRIOS

PRESENTES EM EXTRATOS DE Croton urucurana ............................................... 89 QUADRO 11 DETECO DE METABLITOS SECUNDRIOS EM EXTRATOS DE FUNGOS ENDOFTICOS DE Croton urucurana ...................................................... 92

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LISTA DE TABELAS

TABELA 1 PORCENTAGEM DE INIBIO DO CRESCIMENTO MICELIAL DO FUNGO Guignardia citricarpa NO TESTE DE ANTAGONISMO CONTRA FUNGOS ENDOFTICOS DE Croton urucurana ........................................................................... 80 TABELA 2 PORCENTAGEM DE INIBIO DO CRESCIMENTO MICELIAL DO FUNGO Fonsecaea monophora NO TESTE DE ANTAGONISMO CONTRA FUNGOS ENDOFTICOS DE Croton urucurana ........................................................................... 81

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LISTA DE SIGLAS ATCC: American Type Culture Collection BDA: Batata Dextrose Agar BHI: Brain Hearth Infusion CBS: Centraal Bureau Vorr Schimmelcultures CCD: Cromatografa em camada delgada CIM: Concentrao inibitria mnima CV%: Coeficiente de variao em porcentagem DMS: Diferencia mnima significativa F.V.: Fonte de variao F: Estatstica do teste F G.L: Graus de liberdade MH: Mueller Hinton NCCLS: National Comittee of Clinical Laboratory Standards nr: nmero de repeties OMS: Organizao Mundial da Sade Q.M.: Quadrado mdio S.Q.: Soma de quadrado UFPR: Universidade Federal do Paran

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SUMRIO 1 INTRODUO .................................................................................................... 17 2 OBJETIVOS ......................................................................................................... 18 3 REVISO BIBLIOGRFICA ............................................................................... 19 3.1 USO DE PLANTAS COM FINS MEDICINAIS .................................................... 19 3.2 COMPOSTOS BIOATIVOS PRODUZIDOS POR PLANTAS ............................. 20 3.3 METABLITOS SECUNDRIOS DE PLANTAS MEDICINAIS.COM

ATIVIDADE ANTIMICROBIANA ......................................................................... 21 3.3.1 Quinonas ....................................................................................................... 22 3.3.2 Flavonoides.................................................................................................... 23 3.3.3 Taninos .......................................................................................................... 23 3.3.4 Terpenoides e leos Essenciais .................................................................. 24 3.3.5 Alcaloides ...................................................................................................... 26 3.3.6 Saponinas . .................................................................................................... 27 3.4 SINERGISMO ENTRE PRINCPIOS ATIVOS .................................................... 28 3.5 Croton urucurana ................................................................................................ 30 3.5.1 Descrio Botnica ....................................................................................... 30 3.5.2 Uso Popular ................................................................................................... 32 3.5.3 Atividades Biolgicas de Croton urucurana .............................................. 32 3.6 MICRORGANISMOS ENDOFTICOS................................................................. 33 3.6.1 Definio Generalidades ............................................................................ 33 3.6.2 Interao Planta Endoftico. ...................................................................... 35 3.6.3 Microrganismos como Fontes de Compostos de Interesse Mdico ......... 39 3.6.4 Endfitos Produtores de Substncias Antimicrobianas ............................ 41 3.6.5 Cultivo de Microrganismos Endofticos Visando Produo de Substncias Bioativas Fatores que Afetam a Produo ......................... 43 4 MATERIAL E MTODOS .................................................................................... 46 4.1 MEIOS DE CULTURA ......................................................................................... 46 4.1.1 Agar Batata Dextrose BDA ....................................................................... 46

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4.1.2 Meio BHI (Brain Hearth Infusion) ................................................................. 46 4.1.3 Agar Fub ...................................................................................................... 46 4.1.4 Agar Arroz. ..................................................................................................... 47 4.1.5 Agar Mueller Hinton ...................................................................................... 47 4.1.6 Caldo Extrato de Malte .................................................................................. 47 4.1.7 Caldo Milho (fub) ......................................................................................... 48 4.1.8 Meio Arroz Slido ......................................................................................... 48 4.1.9 Meio Milho Slido .......................................................................................... 48 4.1.10 Agar Nutriente .............................................................................................. 48 4.2 SOLUES E REAGENTES ............................................................................. 49 4.2.1 Soluo de Anisaldeido ................................................................................. 49 4.2.2 Soluo de Cloreto Frrico............................................................................ 49 4.2.3 Soluo de Dragendorff ................................................................................. 49 4.2.4 Soluo de Hidrxido de Potssio Metanlica ............................................ 50 4.2.5 Soluo de Ninhidrina.................................................................................... 50 4.2.6 Soluo de Vanillina Acido Sulfrico ........................................................ 50 4.2.7 Soluo Fisiolgica ........................................................................................ 50 4.3 MATERIAL VEGETAL ........................................................................................ 50 4.3.1 Coleta ............................................................................................................. 50 4.3.2 Identificao Botnica .................................................................................. 51 4.3.3 Elaborao de Extratos Brutos Vegetais .................................................... 51 4.3.4 Fracionamento de Extrato Bruto Metanlico de Casca do Caule de Croton urucurana por Cromatografia em Coluna a Vcuo ........................ 52 4.4 TESTES DE ATIVIDADE ANTIMICROBIANA .................................................... 53 4.4.1 Microrganismos Utilizados ........................................................................... 53 4.4.2 Avaliao Preliminar da Atividade Antimicrobiana dos Extratos Brutos Vegetais Mtodo de Difuso em Poos de Agar ......................... 53 4.4.3 Determinao da Concentrao Inibitria Mnima Mtodo da Macrodiluio ............................................................................................... 54

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4.4.4 Avaliao da Ao do Extrato Bruto de Casca do Caule Sobre o Crescimento de Fungos Filamentosos Diluio em Meio Slido ........... 55 4.5 MICRORGANISMOS ENDOFTICOS................................................................. 56 4.5.1 Isolamento de Microrganismos Endofticos ............................................... 56 4.5.2 Conservao de Microrganismos Endofticos ............................................ 57 4.5.3 Identificao Microscpica de Microrganismos Endofticos..................... 57 4.5.4 Seleo de Microganismos com Maior Potencial Antimicrobiano ............ 58 4.5.4.1 Antagonismo contra fungos patognicos cultura pareada .................. 58 4.5.4.2 Antagonismo dos microrganismos endofticos contra bactrias e leveduras patognicas humanas................................................................ 59 4.5.5 Cultivo Visando a Produo de Metablitos Bioativos .............................. 59 4.5.5.1 Cultivo em meio liquido .............................................................................. 59 4.5.5.2 Cultivo em meio slido ............................................................................... 60 4.5.6 Extrao de Metablitos de Cultivos Fngicos .......................................... 60 4.5.6.1 Extrao de metablitos secundrios de fungos cultivados em meio liquido .................................................................................................. 61 4.5.6.2 Extrao de metablitos secundrios de fungos cultivados em meio slido ................................................................................................... 62 4.5.7 Avaliao da Atividade Antimicrobiana dos Extratos de Endofticos ....... 62 4.5.7.1 Mtodo de difuso em poos de agar ....................................................... 62 4.5.7.2 Mtodo de disco difuso: disco de extrato vs disco de miclio ............. 62 4.6 DETECO PRELIMINAR DE METABLITOS SECUNDRIOS

PRESENTES EM EXTRATOS ATIVOS ............................................................ 63 4.6.1 Cromatografia em camada delgada ............................................................. 63 5 RESULTADOS E DISCUSSO .......................................................................... 64 5.1 MATERIAL VEGETAL ........................................................................................ 64 5.1.1 Extratos Brutos Metanlicos ......................................................................... 64 5.1.2 Avaliao Preliminar da Atividade Antimicrobiana dos Extratos Brutos de Casca do Caule e Folhas de Croton urucurana ........................ 64 5.1.3 Fracionamento em Coluna a Vcuo ............................................................. 66

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5.1.4 Concentrao Inibitria Mnima dos Extratos Vegetais ............................. 66 5.1.4.1 Extratos brutos de casca do caule e folha ................................................ 66 5.1.4.2 Fraes do extrato bruto metanlico de Croton urucurana .................... 67 5.1.5 Ao do Extrato Bruto Metanlico Sobre o Crescimento de Fungos Filamentosos Diluio em Agar ................................................................ 72 5.2 MICRORGANISMOS ENDOFTICOS ................................................................. 75 5.2.1 Identificao Macroscpica e Microscpica ................................................ 76 5.2.2 Seleo de microrganismos com maior potencial antimicrobiano ........... 78 5.2.2.1 Antagonismo contra fungos patognicos cultura pareada .................. 78 5.2.2.2 Antagonismo contra bactrias e leveduras patognicas ........................ 82 5.2.3 Produo de Metablitos a Partir de Fungos Endofticos Cultivados em Meios Lquidos e Slidos .................................................... 82 5.2.4 Atividade Antimicrobiana dos Extratos de Endofticos .............................. 83 5.2.4.1 Atividade dos extratos diante de Guignardia citricarpa e Fonsecaea monophora ................................................................................ 84 5.2.4.2 Atividade dos extratos frente a bactrias e levedura. .............................. 86 5.2.5 Variao da Produo de Compostos Antimicrobianos nos Diferentes Meios de Cultura ......................................................................... 87 5.3 CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD) ......................................... 89 5.3.1 Cromatografia em Camada Delgada de Extratos Vegetais ......................... 88 5.3.2 Cromatografia em Camada Delgada de Extratos de Endofticos ............... 90 6 CONCLUSES .................................................................................................. 95

REFERNCIAS ........................................................................................................ 96 ANEXOS ................................................................................................................. 119

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INTRODUO

A bioprospeco consiste na explorao e investigao de plantas, animais e microrganismos a fim de identificar princpios ativos e ou enzimas teis em diferentes reas como na indstria farmacutica e alimentcia, na agronomia entre outras. A bioprospeco tambm pode ser definida como o estudo da diversidade biolgica com fins econmicos e sociais (STROBEL e DAISY, 2003; TRIGUEIRO, 2002). O crescente nmero de pacientes imunocomprometidos, o ressurgimento de vrias infeces que pareciam ter sido controladas e o preocupante aumento da resistncia bacteriana criaram a necessidade de estudos no sentido de desenvolver novos agentes antimicrobianos. As plantas utilizadas na medicina popular e os seus microrganismos endofticos constituem uma fonte promissora na obteno de princpios ativos com atividades biolgicas de interesse, entre elas a atividade antimicrobiana. Estudos demonstraram que em determinadas plantas os microrganismos endofticos produzem metablitos secundrios que possuem uma atividade biolgica similar atribuda planta que coloniza (KUSARI et al., 2008; EYBERGER, DONDAPATI e PORTER, 2006; PURI et al., 2005). Croton urucurana uma rvore usada amplamente na medicina tradicional, com diversos fins medicinais, entre eles o tratamento de infeces. muito citada em estudos etnobotnicos por sua capacidade de curar feridas infectadas na pele e micoses superficiais. Este fato faz que seja uma planta muito interessante para o aprofundamento do estudo de sua atividade antimicrobiana, assim como tambm o estudo dos seus microrganismos endofticos que potencialmente podem estar exercendo uma importante influncia na produo de metablitos secundrios da planta, responsveis pela atividade medicinal atribuda ao vegetal. Sendo assim, o presente estudo prope avaliar a atividade antibacteriana e antifngica de extratos da planta C. urucurana, coletada da regio oriental do Paraguai, assim como isolar e avaliar o potencial antimicrobiano e a capacidade de produo de metablitos bioativos em diferentes meios de cultura de fungos

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endofticos da planta, como tambm realizar uma caracterizao qumica preliminar dos compostos presentes nos extratos mais ativos.

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OBJETIVOS

Objetivo geral:

Avaliar a atividade antimicrobiana de extratos de Croton urucurana Baill e de seus microrganismos endofticos.

Objetivos especficos:

Obter, fracionar e avaliar a atividade antimicrobiana de extratos de folhas e casca do caule de C. urucurana diante de microrganismos de importncia clnica e agronmica. Isolar fungos endofticos de folhas e casca do caule de C. urucurana. Realizar uma triagem para detectar fungos com potencial antimicrobiano. Obter e avaliar a atividade antimicrobiana de extratos de fungos endofticos. Determinar os grupos de metablitos secundrios presentes nos extratos mais ativos.

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REVISO BIBLIOGRFICA

3.1 USO DE PLANTAS COM FINS MEDICINAIS

Atravs da histria, a medicina tradicional e sua prtica permitiram conhecer o uso de plantas para o tratamento de diversas doenas. Entre os povos de Amrica Latina existe uma antiga tradio no uso de plantas com fins curativos, porm a maioria dessas plantas no conta com suficientes estudos que proporcionem um aval cientfico a suas propriedades. O uso das plantas medicinais remonta praticamente ao princpio da evoluo do homem na terra. O homem pr-histrico observava o comportamento instintivo dos animais na hora de restaurar suas feridas ou paliar suas doenas. Em seu contnuo deambular, observou que certas espcies eram aptas para o consumo alimentcio e outras eram txicas. As referidas observaes deram origem ao processo intuitivo que caracterizou o homem primitivo e lhe permitiu e ele testar com diversas plantas com a finalidade de discernir quais possuam atividades medicinais e quais no (ALONSO, 2007). Vrios achados arqueolgicos demonstraram que as antigas civilizaes do Egito, Grcia, China, ndia e rabe faziam um amplo uso de plantas com fins medicinais. Na Amrica Latina, o desenvolvimento da Fitoterapia est muito relacionado com os costumes de seus povos indgenas que possuem um conhecimento muito amplo sobre as propriedades medicinais das plantas de nossa regio. A Organizao Mundial da Sade (OMS) constatou que 80 % da populao mundial utilizam a medicina tradicional para atender suas necessidades primrias de assistncia mdica. Devido a isso, estabeleceu que os pases necessitam de informao atualizada e autorizada sobre as propriedades benficas e possveis efeitos dos fitoterpicos (ALONSO, 2007). As plantas, alm de seu uso na medicina popular com finalidades teraputicas tm contribudo ao longo dos anos para a obteno de inmeros frmacos, at hoje amplamente usados na clnica. Como exemplo, podemos citar a

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morfina, a emetina, a vincristina, a colchicina, a rutina, etc (CECHINEL FILHO e YUNES, 1997). O uso de plantas medicinais, especialmente na Amrica Latina, contribui significativamente para os cuidados bsicos com a sade. Para o tratamento de infeces comuns, muitas plantas so utilizadas na forma de extratos brutos, infuses ou emplastos sem nenhuma evidncia cientfica de sua eficcia (PESSINI et al., 2003).

3.2 COMPOSTOS BIOATIVOS PRODUZIDOS POR PLANTAS

Vegetais, microrganismos e, em menor escala, animais apresentam um arsenal metablico capaz de produzir, transformar e acumular inmeras substncias no relacionadas de forma direta manuteno da vida do organismo produtor. Nesse grupo encontram-se substncias cuja produo e acmulo esto restritas a um nmero limitado de organismos, com bioqumica e metabolismo especficos e nicos, caracterizando-se como elementos de diferenciao e especializao (WINK, 1990). A todo esse conjunto metablico costuma-se definir como metabolismo secundrio, cujos produtos, embora no necessariamente essenciais para o organismo produtor, garantem vantagens para sua sobrevivncia e para a perpetuao de sua espcie, em seu ecossistema (SIMES et al., 2007). Quando se fala das propriedades teraputicas das plantas medicinais, lgico que nos referimos aos princpios ativos que elas contm para a sua utilizao em diferentes patologias. Esses princpios ativos so os metablitos secundrios. Hoje em dia se aceita a idia de que muitos dos metablitos secundrios produzidos pelas plantas esto diretamente envolvidos nos mecanismos que permitem a adequao da planta ao seu meio. De fato, j foram reconhecidas as funes ecolgicas e fisiolgicas de vrias dessas substncias, por exemplo, na defesa contra herbvoros e microrganismos, a proteo contra os raios UV, a atrao de polinizadores ou animais dispersores de ambientes, como compostos de reserva de nitrognio, na mediao de interaes entre bactrias simbinticas e sua planta hospedeira (WINK, 2008b; SIMES et al., 2007; BRUNETON, 2001; HARBORNE, 1993; ROSENTHAL e BERENBAUM, 1991, 1992).

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O padro de metablitos secundrios de uma determinada planta complexo, muda de acordo com o tecido e rgo de uma maneira especfica. Regularmente, diferenas podem ser vistas entre diferentes estgios de

desenvolvimento, entre indivduos e entre populaes. Os metablitos secundrios podem estar presentes na planta em um estado ativo ou como pr-drogas que sero ativadas depois de um ferimento ou infeco ou no corpo de um herbvoro. A biossntese de alguns metablitos secundrios induzida depois de um ferimento ou infeco e os metablitos secundrios so feitos de novo (fitoalexinas) (WINK, 2003; TAPIERO, 2001). So consideradas como fitoalexinas compostos antimicrobianos de baixo peso molecular os quais so sintetizados de novo aps a infeco, a partir de precursores remotos com gasto energtico por parte da planta (TAPIERO, 2001; VANETTEN et al., 1994). Alm da atividade antimicrobiana desses compostos, tambm se atribui uma atividade antiproliferativa e preventiva de cncer das fitoalexinas extradas de plantas e testadas em modelos animais (MEZENCEV et al., 2003). Inmeras evidncias experimentais sustentam o fato de que muitos metablitos secundrios como os alcaloides, glicosdeos cianognicos, terpenos, saponinas, taninos, antraquinonas so aleloqumicos que representam caracteres adaptativos e que tm se diversificado durante a evoluo pela seleo natural a fim de proteger as plantas contra vrus, bactrias, fungos, plantas concorrentes e contra os herbvoros (WINK, 2003).

3.3 METABLITOS ANTIMICROBIANA

DE

PLANTAS

MEDICINAIS

COM

ATIVIDADE

As plantas so conhecidas como produtoras de constituintes qumicos que so de natureza txica para bactrias e fungos. Vrios estudos demonstraram que uma ampla gama de plantas possui atividade antimicrobiana in vitro. O estmulo para a sntese de metablitos com atividade antimicrobiana nas plantas pode produzir-se na presena de fraes de polissacardeos (elicitores) presentes na parede celular de patgenos (TAPIERO, 2001; DEMAIN, 1998). Vrios tipos de metablitos secundrios de plantas foram relacionados com a atividade antimicrobiana:

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compostos fenlicos (quinonas, flavonoides e taninos), terpenoides e leos essenciais, alcaloides, saponinas e carotenoides. A seguir sero descritas as caractersticas dos citados metablitos secundrios e trabalhos que demonstraram o seu potencial antimicrobiano. 3.3.1 Quinonas Quinonas so anis aromticos com duas cetonas. So ubquas na natureza e so caracteristicamente de alta reatividade. As quinonas podem ser consideradas como produtos de oxidao de fenis; da mesma forma, a reduo de quinonas pode originar os correspondentes fenis. Sua principal caracterstica a presena de dois grupos carbonlicos que formam um sistema conjugado, com pelo menos duas ligaes duplas C-C (COWAN, 1999; SIMES et al., 2007). conhecido que as quinonas formam complexos irreversveis com aminocidos nucleoflicos em protenas, muitas vezes levando inativao da protena e perda de funo. Por esse motivo, o potencial de efeitos antimicrobianos de quinonas grande. Provveis alvos na clula microbiana so as adhesinas expostas na superfcie, polipeptdeos da parede celular e enzimas unidas membrana (COWAN, 1999). Em geral, aceita-se a teoria de que certas quinonas tenham um papel na defesa da planta contra insetos e outros patgenos. Na quina (Cinchona ledgeriana, Rubiaceae) s foram encontradas antraquinonas em partes da planta infectadas com fungos patognicos para a espcie (WIJNSMA et al., 1986). Brandell et al. (2004) evidenciaram que a complexao de metais um dos mecanismos envolvidos na atividade antimicrobiana de naftoquinonas. As

naftoquinonas so responsveis pelas atividades antibacteriana, antifngica e antitumoral de extratos de Kigelia pinnata, Bignoniaceae (HOUGHTON et al., 1994; BINUTO et al., 1996). Decosterd et al. (1993) demonstraram atividade inibitria da replicao do vrus HIV pela naftoquinona trimrica, conocurvona isolada de Conospermum incurvum Lindl. Proteaceae. Em outro estudo, Agarwal et al. (2000) comprovaram a atividade antifngica das quinonas reina, fisciona, aloe-emodina e crisofanol isoladas de Rheum emodi, Polygonaceae.

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3.3.2 Flavonoides

Flavonides so tambm substncias fenlicas hidroxiladas que ocorrem como unidades C6-C3-C6. Uma vez que foi conhecido que esses compostos so sintetizados pelas plantas em resposta a infeces microbianas (DIXON, 1983), no surpresa que tais compostos demonstrem atividade antimicrobiana in vitro contra um amplo espectro de microrganismos. Essa atividade deve-se provavelmente habilidade de formar complexos com protenas solveis extracelulares e com a parede bacteriana. Os flavonoides mais lipoflicos podem tambm romper as membranas microbianas (TSUCHIYA et al., 1996). As catequinas, que so a forma mais reduzida de unidades C 3 em compostos flavonoides, tem sido amplamente pesquisadas devido a sua ocorrncia no ch verde (Camellia sinensis). Esses compostos demonstraram sua capacidade de inibir a enzima glicosiltransferase de Streptococcus mutans (NAKAJARA, 1993). As flavonas diosmina e hesperidina inibem a replicao do rotavrus, agente etiolgico de diarreias (BAE et al., 2000). Em outro estudo, Marasciulo et al. (2006) isolaram um flavonoide glicosilado com atividade antimicrobiana das partes areas de Pavonia distinguenda.

3.3.3 Taninos

Tanino um nome comum para nomear um grupo de substncias polimricas fenlicas que so capazes de curtir o couro e precipitar gelatina, propriedade conhecida como adstringncia. O peso molecular desses compostos varia entre 500 a 3000, e so encontrados em quase todo tipo de parte de plantas: casca, madeira, folhas, frutos e razes (SCALBERT, 1991). O papel biolgico dos taninos nas plantas tem sido investigado e acreditase que eles estejam envolvidos na defesa qumica das plantas contra o ataque de herbvoros vertebrados ou invertebrados e contra microrganismos patognicos (SIMES et al., 2007). Esse grupo de compostos recebe grande ateno de pesquisadores devido a que se acredita que o consumo de bebidas que contm taninos, como chs e vinhos, podem prevenir e curar uma grande variedade de

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doenas (COWAN, 1999). Min et al. (2008) avaliaram a atividade antimicrobiana de extratos ricos em taninos de diferentes plantas lenhosas, e os resultados indicaram que a fonte e concentrao so importantes fatores que influenciam a atividade antimicrobiana. Vrios autores relacionaram a atividade antimicrobiana de extratos vegetais com a presena de taninos nesses extratos: Souza et al. (2007) com extratos de casca de Stryphnodendron adstringens, Djipa, Delme e Leclerq (2000), com extratos de caule de Syzygium jambos. Eles demonstraram que a eliminao de taninos dos extratos suprimia a atividade antimicrobiana. Tambm Gruji-Vasi et al. (2006) observaram a atividade antimicrobiana de fraes ricas em taninos da planta Potentilla alba. Existem trs hipteses para o mecanismo de ao antimicrobiana dos taninos: a primeira hiptese pressupe a inibio de enzimas de bactrias e fungos e/ou complexao dos substratos dessas enzimas; a segunda seria a ao dos taninos sobre membranas celulares de microrganismos, modificando o seu metabolismo. Finalmente a terceira hiptese menciona a complexao dos taninos com ons metlicos, diminuindo assim a disponibilidade destes elementos essenciais para o metabolismo dos microrganismos (SIMES et al., 2007; HASLAM, 1996). Os taninos e outros compostos fenlicos possuem um grande nmero de grupos hidroxila que podem formar vrias ligaes de hidrognio e inicas com todo tipo de protenas. As protenas mudam a sua conformao quando o complexo tanino- protena formado e, portanto, perdem sua atividade e funo (WINK, 2003).

3.3.4 Terpenoides e leos Essenciais

Os leos essenciais so responsveis pela fragrncia das plantas. Esses leos so metablitos secundrios que esto altamente enriquecidos com compostos com estrutura base do isopreno. Estes compostos so chamados monoterpenos, a estrutura qumica geral C10H18 e eles tambm podem existir como diterpenos, triterpenos e tetraterpenos (C20, C30, C40 respectivamente), assim tambm como hemiterpenos e sesquiterpenos, e tambm como hemiterpenos (C5) e sesquiterpenos

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(C15). Quando os compostos contm elementos adicionais, usualmente oxignio, so chamados de terpenoides (SIMES et al., 2007; COWAN, 1999). O mecanismo de ao antimicrobiana dos terpenos no foi ainda completamente elucidado, porm supe-se que envolve uma disrupo da membrana por meio dos compostos lipoflicos. De acordo com Mendoza et al. (1997), aumentando a hidrofilicidade de caureno diterpenoides, diminui

drsticamente a atividade antimicrobiana. Terpenos lipoflicos so solveis em biomembranas. Em altas concentraes, eles podem interagir com canais inicos, transportadores e receptores presentes nas membranas e assim mudar a conformao e bioatividade. Hernandez et al. (2005) demonstraram a atividade antimicrobiana do leo essencial de Cordia curassavica contra bactrias grampositivas e gramnegativas e contra os fungos Rhizoctonia solani e Trychophyton mentagrophytes. Em 2008, Costa et al. avaliaram a atividade antimicrobiana de leos essenciais de espcies de Guateriopsis blepharophylla, G. friessiana e G. hspida contra 11 especies de microrganismos. O leo de G. fressiana exibiu significante atividade antimicrobiana contra todos os microrganismos testados, enquanto que G. hspida e G. blepharophyla tiveram potente atividade contra Rhodococcus equi com concentrao inibitria mnima (CIM) de 50 g/mL. A composio qumica e atividade antimicrobiana de leos essenciais de Lippia alba (Verbenaceae) obtidas de duas diferentes regies do Brasil (Paran e Rondnia) foram pesquisadas por Nogueira et al. (2007); houve diferena quanto composio qumica e atividade dos leos obtidos. O sesquiterpeno cinamoyloxy-1-hydroxieudesm-4-em 3-ona, proveniente de razes de Vernonathura tweedieana, isolado e identificado por Portillo et al. (2005) demonstrou-se particularmente efetivo contra o fungo Trichophyton mentagrophytes (CIM: 4 g/mL). A eficcia do leo essencial de Cymbopogon citratus (campim-limo) em inibir o crescimento de bactrias grampositivas e negativas e fungos causadores de micoses superficiais e sistmicas foi demonstrada por Guerra Ordonez et al. (2004).

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Hammer et al. (2003) estudaram a atividade antifngica dos componentes do leo essencial de melaleuca (Melaleuca alternifolia), que amplamente utilizado em formulaes fitoterpicas e cosmticas. Os compostos terpinen-4-ol, terpineol, linalool, -pineno e -pineno e 1,8-cineol foram os mais ativos (com CIMs < 0,25%) contra linhagens ATCC e isolados clnicos de leveduras e fungos filamentosos.

3.3.5 Alcaloides

Alcaloides so compostos nitrogenados farmacologicamente ativos e so encontrados predominantemente nas angiospermas. Na sua grande maioria, possui carter alcalino, com excees tais como colchicina, piperina, oximas e alguns sais quaternrios, como cloridrato de laurifolina (KUTCHAN, 1995; EVANS, 1996). Assim como outros metablitos secundrios, os alcaloides tambm possuem um comprovado papel na defesa contra a invaso de microrganismos e vrus (WINK, 1993). Essa funo pode ser exemplificada pelo aumento da concentrao de solanina em batatas quando estas esto sendo atacadas por microrganismos. Tambm como exemplo dessa funo pode-se citar a produo de sanguinarina, um alcalide com elevada atividade antimicrobiana, em culturas celulares de Eschscholzia californica, aps o tratamento com filtrados derivados de fungos. (SCHUMACHER et al., 1987). Mais recentemente, Singh et al. (2009) isolaram os alcaloides isoquinolnicos hunnemanine e norsanguinarine desta mesma planta e observaram a atividade antifngica contra os fitopatgenos Alternaria brassicae, Helminthosporium pennisetti Fusarium lini e Curvularia maculans. Souza, Stinghen e Santos (2004) demonstraram a atividade antimicrobiana da frao alcalodica de um extrato de caule de Himatanthus lancifolius, os alcaloides do tipo indlico so os principais compostos qumicos presentes no gnero Himatanthus. Tanaka et al. (2006) tambm demonstraram a atividade antibacteriana de alcaloides de Aspidosperma rmiflorum. A partir de um extrato metanlico foi realizado o fracionamento bioguiado at a obteno dos alcaloides indlicos ramiflorine A e B. Ambos apresentaram significativa atividade contra S. aureus (CIM: 25 g/mL) e E. faecalis (CIM 50 g/mL).

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Alcaloides diterpnicos, comumente isolados de plantas da famlia Ranunculaceae, frequentemente apresentam atividade antimicrobiana (ATTA-UR e CHOUDLHARY, 1995; OMULOKOLI, KHAN e CHHABRA, 1997). Karou et al. (2006) estudaram a atividade antibacteriana de um arbusto, Sida acuta (Malvaceae). Os alcaloides indoloquinolnicos demonstraram boa atividade antimicrobiana contra bactrias grampositivas. Em 1999, Navarro e Delgado isolaram dois alcalides, dihidrocheleritrina e dihidrosanguinarina a partir das partes areas de Bocconia arbrea. Os dois compostos demonstraram uma importante atividade antimicrobiana contra bactrias grampositivas e negativas e contra a levedura Candida albicans.

3.3.6 Saponinas

Saponinas so glicosdeos de esteroides ou de terpenos policclicos. Este tipo de estrutura, que possui uma parte com caracterstica lipoflica (triterpeno ou esteroide) e outra hidroflica (acares), determina a propriedade de reduo da tenso superficial da gua e sua ao detergente e emulsificante. O comportamento anfiflico das saponinas e a capacidade de formar complexos com esteroides, protenas e fosfolipdios de membranas determinam um nmero variado de propriedades biolgicas para essas substncias, destacando-se a sua ao sobre membranas celulares, formando poros, produzindo vazamento das clulas e alterando a sua permeabilidade; um amplo efeito citotxico ou antimicrobiano geralmente consequncia desta interao (SIMES et al. 2007; WINK, 2003). Diversos autores (AMOROS et al., 1988; HUDSON, 1990; DETOMMASI et al., 1991; KASHIWADA et al. 1998; SIMES et al., 1999; KRISHNAN, GOPIESH e HAMEED, 2010) demonstraram a atividade antiviral de saponinas isoladas das plantas medicinais Glycyrrihiza glabra L., Gymnema sylvestre (Retz.), Anagallis arvensis L.; Calendula arvensis L., Bupleurum falcatum L.; Guettarda platypoda e Eclipta prostrata. Com relao atividade contra bactrias, Mandal, Babu e Mandal (2005) observaram a atividade antibacteriana contra B. megaterium, S. typhimurium e P. aeruginosa de saponinas extradas de Acacia auriculiformis. Avato et al. (2006)

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avaliaram extratos de saponinas e sapogeninas obtidas das plantas Medicago sativa, M. arbrea e M. arbica e observaram uma grande atividade especialmente contra bactrias grampositivas. Este resultado est em conformidade ao observado por Soetam et al. (2006), que detectaram atividade antibacteriana de saponinas extradas de Sorghum bicolor contra S. aureus, porm Escherichia coli mostrou resistncia. Tambm a atividade antifngica de saponinas contra fungos filamentosos e leveduras foi demonstrada por Mandal, Babu e Mandal (2005) e Miyakoshi et al. (2000). Leveduras deteriorantes de alimentos, leveduras formadoras de biofilme e fungos dermatoflicos demonstraram sensibilidade a saponinas monodesmosdicas isoladas de Y. schidigera. O mecanismo sugerido para a atividade antifngica das saponinas sua interao com os esteris da membrana fngica (FRANCIS et al., 2002).

3.4 SINERGISMO ENTRE PRINCPIOS ATIVOS

Os metablitos secundrios frequentemente contm mais de um grupo funcional, por conseguinte, com frequncia exibem mltiplas funcionalidades e bioatividades. Alm disso, os metablitos secundrios esto presentes em complexas misturas constitudas por vrios tipos estruturais. Esta estratgia garantir uma interferncia com mais de um alvo molecular em herbvoros e micrbios, e pode assim proteger a planta contra uma ampla variedade de inimigos (WINK, 2003). Mesmo que a interao individual de um metablito secundrio particular possa ser inespecfica e fraca, a soma de todas as interaes leva a um efeito substancial (WINK, 2003). Muroi e Kubo (1993) analisaram a atividade

antibacteriana do ch verde (Camellia sinensis). Eles demonstraram um sinergismo na combinao de hidrocarbonetos de sesquiterpenos (-candineno e -cariofileno) com o indol, combinao que faz com que a atividade antimicrobiana se incremente entre 128 a 256 vezes. A ao das plantas medicinais pode nunca ser completamente

compreendida, analisando os seus componentes separadamente. Os defensores dessa teoria argumentam que as propriedades so devidas s interaes entre os

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mltiplos constituintes (KLIGER et al., 2004; THOISON et al., 2004 e WINK, 2008b). Estas interaes so conhecidas como sinergia qumica. Este efeito existe, no caso de plantas medicinais, quando a ao dos compostos juntos maior que a soma aritmtica da ao individual dos componentes (CSEKE et al., 2006). Wu et al. (2002) salientaram que os efeitos alelopticos usualmente resultam de um grupo de constituintes, que frequentemente demonstram sinergismo, em vez de a ao ser devida a um s composto. Essa estratgia protege contra vrias pestes e desestimula o desenvolvimento de resistncias, como comumente ocorre quando um nico composto qumico usado como inseticida (CSEKE et al., 2006). Outro exemplo de sinergismo pode ser observado na ao das saponinas presentes em muitas plantas medicinais, estas aumentam a absoro e atividade de outras substncias. As saponinas do jaboncillo japons (Sapindus mukorossi) aumentam a absoro intestinal de certos antibiticos naturais. De igual maneira, as saponinas do ginseng (Panax ginseng) ajudam a solubilizar os componentes insolveis da raiz da planta (ALONSO, 2007). Tambm, Delucca et al. (2006) comprovaram que uma saponina, CAY-1, isolada de Capsicum anuum melhorou significativamente a atividade dos antifngicos convencionais anfotericina B e itraconazol contra trs espcies de Aspergillus e Candida albicans. O ltex obtido de Croton lechleri, mediante ensaios hemolticos in vitro, mostrou uma potente atividade inibitria das vias clssicas e alternativa do sistema do complemento. O efeito do ltex maior do que o apresentado pela taspina (um alcaloide isolado do ltex) que produz inibio sobre a via clssica e no mostra efeito sobre a via alternativa (VANACLOCHA e CANIGUERAL, 2004). Esta lio da natureza, o uso de mltiplas substncias como medida defensiva, a mesma estratgia que est ganhando reconhecimento na medicina (CSEKE et al., 2006). O uso de coquetis de vrios frmacos em doses menores frequentemente demonstra-se mais efetivo que um s frmaco em alta dosagem. Na infeco por HIV (Human Immunodefiency vrus), os coquetis de frmacos tm afetado grandemente o tratamento dos pacientes. As combinaes de drogas contra o HIV atuam sinergicamente e demonstraram uma parcial restaurao do sistema imune e reduo da doena e morte (BULGHERONI et al., 2004; LEDERMAN et al., 1998). A combinao de topotecan com vincristina (ambos compostos derivados de

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plantas) em vrios cnceres infantis demonstrou ao sinrgica em muitos modelos de tumores peditricos slidos (THOMPSON et al., 1999). Infeces bacterianas so tambm tratadas com combinaes sinergsticas. A infeco por Enterococcus faecium vancomicina resistente, tratada com ampicilina e doxiciclina demonstrou uma atividade benfica, usualmente exibindo sinergismo ou, ao menos, efeitos aditivos (BROWN e FREEDMAN, 2004). Ezra et al. (2004) analisaram a atividade antimicrobiana de compostos individuais e misturas produzidas por isolados do fungo endoftico Muscodor albus. A mistura mais ativa foi a composta por naftaleno, cido propanoico e butanol, na proporo 9:45,5:45,5. O fungo patognico Pythium ultimum respondeu com 100% de inibio citada mistura, depois de 6 dias de exposio, com uma concentrao inibitria mnima (CIM100) de 15 L no vial de teste. Os compostos isolados puros: naftaleno, cido propanico e butanol tiveram CIM100 de 100 L ou maiores.

3.5 Croton urucurana Baill

3.5.1 Descrio Botnica

Reino: Plantae Phylum: Magnoliophyta Classe: Magnoliopsida Ordem: Malphigiales Famlia: Euphorbiaceae Sub famlia: Crotonoiedae Gnero: Croton Espcie: Croton urucurana Baill Croton urucurana Baill uma rvore de 4 a 15 metros de altura, copa aberta e caule claro, com at 20 cm de dimetro (FIGURA 1). Os ramos jovens so tomentosos, os adultos pubrulos, indumento alvacento e ferrugneo, tricomas estrelados, resina avermelhada, cor sangue. As folhas medem 7,5-13,5 cm x 5-10,5 cm, palmatinervas, cordadas a oval-lanceoladas, membranceas, face adaxial ferrugneo-tomentosa, nas folhas jovens, pubrula nas adultas, face abaxial

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tomentosa, tricomas estrelados, alvacenta, ferrugnea nas nervaduras, margem inteira, base cordada ou auriculada. pice acuminado, pecolo de 6-9 cm de comprimento, tomentosos, com 2 a 4 glndulas pateliformes no pice, estpulas com 1,0-1,5 cm de comprimento, foliceas. As inflorescncias medem de 10 a 25 cm de comprimento, em forma de racimos. As flores so esbranquiadas, estaminadas e pistiladas, reunidas em fascculos ou estaminadas em cima das pistiladas. O fruto mede de 5-6,5 mm de dimetro, globoso, pubescente, muricado, mericarpos pouco acentuados, clices persistente durante o amadurecimento. As sementes medem 3,54 mm de comprimento, so de cor castanha, estriada na face dorsal (CAVALCANTE, 2006; PAOLI, 1995). Exclusiva ou predominante de matas ciliares ou de vrzeas, ocorrendo em solos permanentemente muito midos, encharcados ou brejosos, sujeitos a inundaes peridicas, sendo pouco frequentes nas matas de terra firme, e, portanto, indicada para plantios mistos em reas ciliares degradadas (SALVADOR, 1987; CATHARINO, 1989; LUCHI; 2004). uma rvore comumente encontrada no Paraguai, norte da Argentina, sul do Brasil e no Uruguai. conhecida popularmente com os seguintes nomes: Sangue da gua, sangue de drago, sangue de grado, capixingui, urucuana, lucurana, tapexingui, tapixingui.

FIGURA 1 Croton urucurana Baill

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Entre as espcies do gnero Croton, alm de C. urucurana, existem outras que tambm so popularmente conhecidas como sangue de drago: C. lechleri, C. salutaris, C. palanostigma, C. draconoides, C. eryhtrochilus entre outras (DI STASI, 2003; VANACLOCHA e CANIGUERAL 2003; GUPTA, BLEALEY e GUPTA, 2008). Ainda o nome de sangue de drago utilizado para designar resinas e exudatos de cor avermelhada, obtidos de plantas de diferentes gneros: Croton (Euphorbiaceae), Dracaena (Dracaneaceae), Daemonorops (Palmaceae) e Pterocarpus (Fabaceae) (GUPTA, BLEALEY e GUPTA, 2008).

3.5.2 Uso Popular

A medicina popular atribui inmeras propriedades medicinais planta: utilizada para tratar cncer, hemorragias internas, no tratamento de aftas bucais, cicatrizante de lceras, feridas externas e micoses superficiais. Tambm no tratamento de bronquites, asma, anemia, transtornos renais, disenterias, reumatismo, infeces vaginais, no tratamento de dor de dente entre outros usos (GONZALEZ TORRES, 1997; LORENZI e ABREU DE MATTOS, 2002; GURGEL et al., 2002). As partes da planta utilizadas com fins medicinais so: folhas, casca do caule e ltex ou resina da casca do caule.

3.5.3 Atividades Biolgicas de Croton urucurana

O primeiro estudo descrito na literatura em relao atividade antimicrobiana de Croton urucurana foi o trabalho realizado por Peres et al. (1997). Os autores avaliaram a atividade antibacteriana contra Staphylococcus aureus e Salmonella typhimurium do extrato etanlico aquoso, algumas fraes e as substncias puras, catequina e cido acetil aleurtico isolados da casca do caule dessa espcie. Gurgel et al. (2005) demostraram a atividade antifngica do ltex de Croton urucurana contra fungos causadores de micoses de peles, os dermatfitos Trichophyton rubrum, T. mentagrophytes, T. tonsurans, Microsporum canis e Epidermophyton floccossum.

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A atividade antimicrobiana e antioxidante do leo essencial da casca do caule de Croton urucurana foi avaliada por Simionatto et al. (2007). Os microrganismos mais sensveis ao leo foram S. epidermidis e E. coli (CIM= 1,25 mg/mL) enquanto que os mais resistentes foram B. subtillis e C. albicans (CIM= 10 mg/mL). Foi detectada atividade antioxidante e anlises por Cromatografia gasosa (CG) e Cromatografia gasosa Espectrometria de massas (CG-EM) revelaram os principais compostos da frao com melhor atividade antioxidante: -bisabolol (38,3%), -eudesmol (9,3%) e guaiol (8,2%). Gurgel et al. (2002a) avaliaram a atividade antidiarreica do ltex de Croton urucurana. Foi detectado um potente efeito inibitrio da diarreia induzida por leo de rcino. Tambm foi avaliado o modelo de secreo intestinal em ratas, induzido pela toxina colrica. O ltex de C. urucurana (600 mg/kg) produziu uma significativa inibio da secreo intestinal. Esmeraldino et al. (2005) avaliaram a atividade antihemorrgica da casca do caule de C. urucurana por duas metodologias: anlise grfica computadorizada do halo de hemorragia e quantificao da hemoglobina no halo hemorrgico. Foi demonstrado que o extrato aquoso da casca do caule de C. urucurana antagoniza a atividade hemorrgica do veneno de Bothrops jararaca, e que as proantocianidinas esto envolvidas nessa atividade. Vrios compostos com atividade analgsica foram identificados na casca do caule de C. urucurana: campesterol, -sitosterol, stigmasterol, cido acetil aleurtico, catequina, gallocatequina e glicosdeo de sitosterol (PERES et al., 1998). A comparao entre a potncia analgsica dos extratos e dos compostos puros sugere que existem outros compostos com maior potncia e que provavelmente se encontram em uma proporo muito pequena, ou que exista um sinergismo entre os princpios ativos. 3.6 MICRORGANISMOS ENDOFTICOS 3.6.1 Definio Generalidades Os microrganismos endofticos so todos aqueles que podem ou no crescer em meios de cultura e que habitam o interior de tecidos e rgos vegetais sem cauzar prejuzos a seu hospedeiro (AZEVEDO E ARAJO, 2007).

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O

estudo

dos

microrganismos

endofticos

tem

aumentado

substancialmente nos ltimos 20 anos, pois foi observado que essa comunidade apresenta um importante papel no desenvolvimento da planta hospedeira. Algumas espcies de microrganismos endofticos so produtoras de frmacos, por exemplo ,antitumorais e antibiticos, e outras produzem fatores de crescimento do vegetal, toxinas e enzimas (FAVARO, 2009; GU, 2009; KJER et al., 2009; BORGES, 2008; KUSARI et al., 2008; RALPHS et al., 2008; CHANDRA PAUL et al. , 2007;

EYBERGER, DONDAPATI e PORTER, 2006; REDKO et al., 2006; FIGUEIREDO, 2006; BERDY, 2005; CAFFEU, 2005; PURI, et al., 2005; EZRA e STROBEL, 2004; CASSADY et al. 2004; STROBEL e DAISY, 2003; DOS SANTOS, 2003; ARAUJO et al.., 2002; HELLWING et al., 2002; STROBEL, 2002; SCHULZ et al., 2002; LU et al., 2002; STIERLE, STROBEL e STIERLE,1993). A espcie hospedeira, as interaes entre os endofticos e o hospedeiro, interaes inter e intraespecficas dos endofticos, tipo e idade do tecido, distribuio geogrfica, tipo de colonizao fngica, condies de cultura, esterilizao superficial e seletividade do meio de cultura podem influenciar na eficincia da estratgia de amostragem para a deteco de microrganismos endofticos (STONE, POLISHOOK e WHITE, 2004; BACON e WHITE, 1994; PETRINI, 1986). Investigaes detalhadas da microbiota interna de plantas frequentemente levam descoberta de novos taxons e tambm revelam novas distribuies de espcies conhecidas (STONE, POLISHOOK e WHITE, 2004). At agora os endofticos ainda no tm sido amplamente explorados em relao a suas propriedades teraputicas. Um nico endfito pode ser capaz de produzir no s um, mas vrios metablitos bioativos (RAMASAMY et al., 2009). Os microrganismos endofticos so uma fonte rica e confivel de novos compostos bioativos farmacologicamente ativos e com grande potencial na medicina e agricultura (STROBEL, 2002; TAN e ZOU, 2001). Devido ao fato de que s uma pequena parte de plantas potencialmente hospedeiras de endofticos tem sido estudada, os fungos endofticos podem representar um nmero consideravelmente alto de fungos ainda no descobertos (ARNOLD, MAYNARD e GILBERT, 2000; STONE et al., 1996).

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3.6.2 Interao Planta Endoftico

Os fungos endofticos gastam uma parte ou a totalidade de seu ciclo de vida dentro dos tecidos da planta hospedeira e estabelecendo uma relao com o hospedeiro que pode variar de uma simbiose a uma ligeira patogenicidade (KJER et al., 2009). A natureza e o papel biolgico dos fungos endofticos na planta hospedeira so variveis. conhecido que fungos endofticos tm uma relao mutualista com seus hospedeiros, frequentemente protegem a planta contra o ataque de hervboros, ataque de insetos e a invaso dos tecidos por patognicos ( SCHULZ et al., 2002; CANNON e SIMMONS, 2002; AZEVEDO et al. 2000, SIEGEL, LATCH e JOHNSON, 1985; YANG et al., 1994). Tambm podem melhorar o crescimento da planta hospedeira. Em algumas instncias, um endoftico pode sobreviver como um

patgeno latente causando infeces quiescentes por longos perodos e produz sintomas s quando condies fisiolgicas ou ecolgicas favorecem a virulncia (BETTUCCI e SARAVAY, 1993; CARROLL, 1986). Alguns fungos endofticos aparentemente so capazes de produzir metablitos secundrios e contribuir com as defesas qumicas da sua planta hospedeira (WINK, 2008b). As interaes metablicas entre os endofticos e seus hospedeiros podem favorecer a sntese de metablitos secundrios biologicamente ativos (SCHULZ et al., 2002). Alguns trabalhos demonstraram que na relao micrbio-planta, endofticos contribuem com substncias que possuem vrios tipos de bioatividade, tais como atividade antibacteriana e antifngica (RADU e YOKE, 2002). Os endfitos colonizam tecidos vegetais internos e obtm nutrio e proteo da planta hospedeira. Em troca, eles produzem metablitos funcionais que melhoram o estado da planta (TAN e ZOU, 2001). Em todas as interaes endofticas, o carter assintomtico de colonizao d-se atravs de um equilbrio de antagonismos, entre a virulncia do microrganismo e a defesa da planta, na qual h produo de metablitos de interesses opostos por parte de ambos, pois os microrganismos secretam enzimas e outros metablitos, necessrios ao processo de infeco, e a planta, por sua vez produz metablitos

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responsveis pela conteno da infeco (SCHULZ e BOYLE, 2005). Porm nessa interao, ocorrem benefcios tanto para a planta como para os microrganismos endofticos: os metablitos produzidos pelos endofticos podem melhorar o crescimento e competitividade do hospedeiro, incrementando a resistncia a herbvoros, patgenos e outros estresses abiticos. Em troca os endofticos so supridos com nutrientes e proteo pela planta (KJER et al., 2009; RALPHS, CREAMER e BAUCOM, 2008; SAIKKONEN et al., 1998). Os patgenos superam o sistema defensivo das plantas, por exemplo, reduzindo as concentraes de metablitos fenlicos de defensa (AGRIOS, 1997 apud SCHULZ et al., 2002). Em contraste quando as razes so colonizadas por endofticos, a concentraes desses metablitos so as mesmas do controle ou ainda maiores (SCHULZ et al., 1999). Por exemplo, quando as razes do lario so inoculadas com Cryptosporidiopsis sp., as concentraes de proantocianidinas solveis incrementam-se em comparao com o controle; quando est infectada com o patgeno Heterobasidium annosum, a concentrao decresce (SCHULZ et al., 2002). Os endofticos permanecem quiescentes ao longo do perodo de vida do hospedeiro, logo podem interceptar e utilizar os metablitos mobilizados durante o perodo de senescncia precoce (CHAPELA e BODDY 1988; GRIFFITH e BODDY, 1988; BODDY e GRIFFITH, 1989). As interaes competitivas entre os endofticos com a posterior invaso de fungos saprobios podem ser responsveis pela grande produo de metablitos antagnicos pelos fungos endofticos (STONE,

POLISHOOK e WHITE, 2004). Os microrganismos endofticos no somente sintetizam metablitos para competir com os epifticos e com os patgenos a fim de colonizar o hospedeiro, mas presumivelmente tambm para regular o metabolismo do hospedeiro em sua associao delicadamente equilibrada (SCHULZ et al., 2002). A estreita relao entre microrganismos endofticos e seus hospedeiros envolve processos de coevoluo, que podem influenciar os mecanismos fisiolgicos da planta (REDKO et al., 2006; MISAGHI e DONNDELINGER, 1990).

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Apesar de as plantas superiores desenvolverem uma variedade de mecanismos de resistncia para prevenir a infeco pela maioria dos fungos oportunistas, os fungos simbiticos, incluindo os endofticos, evoluram com suas plantas hospedeiras e se adaptaram a elas. Estas adaptaes incluem reconhecimento do hospedeiro, meios para superar e complementar as defesas do hospedeiro, mecanismos de fixao ao hospedeiro, induo da germinao dos esporos pelo hospedeiro e diversificao das estruturas de infeco (STONE et al., 1994). A produo de dois alcaloides macrocclicos com atividade antibitica, produzidos pelo fungo endoftico Acremonium zeae tem sido implicada na proteo da sua planta hospedeira, o milho, contra fungos fitopatognicos e produtores de micotoxinas Aspergillus flavus e Fusarium verticillioides (WICKLOW et al., 2005). Os extratos de plantas utilizados na medicina tradicional podem ter suas atividades influenciadas de grande maneira pelos microrganismos endofticos presentes nelas. A questo se a atividade da planta produzida pela prpria planta ou consequncia de uma relao mutualista entre microrganismos benficos em seus tecidos (RADU e YOKE, 2002). Vrios autores demonstraram que as atividades biolgicas dos

microrganismos e, por conseguinte, os metablitos secundrios produzidos pelos mesmos so semelhantes aos produzidos pela planta hospedeira. Exemplos deste fato so os estudos realizados por Stierle, Strobel e Stierle (1993) que isolaram um endoftico, Taxomyces andreana, produtor de taxol da planta Taxus brevifolia. Puri et al. (2005) descobriram que um fungo endoftico isolado de Nothapodytes foetida tem a capacidade de produzir camptotencina um alcaloide que apresenta uma considervel atividade antitumoral, cujo mecanismo de ao envolve a inibio da topoisomerase I, enzima presente em altas concentraes nos tumores. Eyberg, Dondapati e Porter (2006) demonstraram a capacidade de um fungo endoftico da espcie Phialocephala fortinni, isolado de rizomas da planta Podophyllum peltatum, em produzir podofilotoxina, uma valiosa lignana utilizada para o tratamento de infeces por vrus do papiloma humano, e como precursora de drogas antitumorais etopsido, tenipsido e fosfato de etopsido.

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Mais recentemente, Kusari et al. (2008) revelaram a capacidade de um fungo endoftico isolado do caule de Hypericum perfolatum em produzir hipericina, uma antraquinona bastante utilizada em preparaes fitoterpicas para o tratamento da depresso. A planta conhecida popularmente como erva de So Joo. Redko et al. (2006) avaliaram a atividade antimicrobiana de Erythrina crista galli, (planta medicinal utilizada popularmente para tratamento de infeces), e os extratos de um fungo endoftico isolado da planta, Phomopsis sp. O extrato de acetona de ramos jovens de Erytrina crista-galli inibiu o crescimento de Bacillus brevis ATCC 9999 e Bacillus subtillis ATCC 6633. O extrato de Phomopsis sp. foi tambm ativo contra esses microrganismos e tambm contra Micrococcus luteus ATCC 381, Enterobacter dissolvens LMG 2683, Nematospora coryli ATCC 10647, Penicillium notatum coleo IBWF e Paecilomyces variotti ETH 114646. Foram comparados os perfis de HPLC do extrato de galhos velhos da planta e do extrato de miclio do fungo e foram encontrados dois compostos comuns. No Brasil e na maioria dos pases da Amrica Latina, a maioria das investigaes de fontes de novos frmacos concentra-se em plantas (RAMOS, 2008). Porm, os citados estudos de Stierle, Strobel e Stierle (1993); Eyberg, Dondapati e Porter (2006); Redko et al. (2006); Kusari et al. (2008) confirmam a importncia de uma nova abordagem na pesquisa de atividade das plantas medicinais, as quais deveriam no s ser focalizadas nos extratos vegetais como tambm nos microrganismos endofticos presentes no vegetal. Schulz et al. (2002) concluram que a pesquisa das atividades biolgicas produzidas por microrganismos endofticos no aleatria, j que as atividades biolgicas e os metablitos produzidos esto associados como o respectivo bitopo e ou hospedeiro. Wink (2008b) sugere que a produo de metablitos secundrios comuns entre a planta hospedeira e seus microrganismos endofticos pode ser devida a uma transferncia lateral de genes que ocorreu durante o processo de evoluo. Isso explicaria o motivo pelo qual tanto a planta como os microrganismos endofticos sejam capazes de produzir metablitos bioativos comuns.

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Tem sido recentemente demonstrado que a formao de alcaloides de ergot devida a fungos endofticos clavicipitceos que vivem com certas espcies de plantas da famlia Convolvulaceae (AHIMSA-MULLER et al., 2007). Aly et al. (2008) estudaram a composio qumica de extratos obtidos da planta Polygonum senegalense e de um isolado endoftico pertencente ao gnero Alternaria sp., cultivado em meio slido e lquido. Tanto no extrato da planta como nos extratos dos cultivos do fungo foi detectada a presena dos compostos Alternariol 5-O-metil-eter, Altenusin e Alternariol. Este resultado sugere que a produo, embora em quantidades menores de metablitos do tipo alternariol por fungos endofiticos sob condies in situ dentro de tecidos sadios da planta hospedeira, implica a possvel contribuio da interao mutualista entre endofticos e seu hospedeiro e provando a contribuio do fungo endoftico na composio qumica da planta hospedeira. Existem outros poucos estudos que reportam o isolamento de tpicos metablitos fngicos a partir de uma origem vegetal, por exemplo, alternariol, 5-O-metil ter de Anthocleista djalonensis (ONOCHA et al., 1995 apud ALY et al. 2008), 2,5-dimetil-7-hidroxicromona de Polygonum cuspidatum (KIMURA et al., 1983 apud ALY ET AL. 2008)) e Hypericum perfolatum (YIN et al., 2004), como tambm aurenitol, um metablito comum de espcies do fungo Chaetomium de um extrato da planta Helichrysum aureo-nitens.

3.6.3 Microrganismos como Fonte de Metablitos de Interesse Mdico

Os metablitos secundrios microbianos continuam sendo uma diversa fonte de substncias qumicas para o descobrimento de desenvolvimento de agentes farmacuticos (IGARASHI et al., 2002). A explorao de microrganismos como fontes de compostos

terapeuticamente teis tem uma histria mais curta e menos conhecida que a do uso de plantas e extratos de plantas na medicina humana (VICENTE et al., 2002). Porm, uma das primeiras evidncias da antibiotiocoterapia relatada pelo costume dos egpcios de tratar infeces urinrias e feridas supuradas com po mofado. Esse povo tambm era um grande conhecedor das virtudes medicinais das plantas (ALONSO, 2007).

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O amplo nmero e variedade de agentes quimioterpicos isolados de fontes naturais microbianas e usados no tratamento de infeces bacterianas tiveram uma grande contribuio para o melhoramento da sade humana durante o sculo passado (VICENTE et al., 2002). Metablitos secundrios de fungos so extremamente importantes para nossa sade e nutrio e possuem um grande impacto econmico (ADRIO e DEMAIN, 2003). Microrganismos, em particular fungos, so importante fonte de novos metablitos com pronunciada atividade antibacteriana, antifngica e antiviral (RODRIGUES, HESSE e WERNER, 2000). Alm disso, os fungos so

extremadamente teis na realizao de processos de biotransformao (ADRIO e DEMAIN, 2003). Apesar de que quase 20.000 metablitos microbianos e cerca de 100.000 produtos vegetais foram descritos at agora, metablitos secundrios de fontes naturais ainda parece ser uma fonte inesgotvel de novas molculas com atividade antimicrobiana, antiviral, antitumoral e outras de interesse na farmacologia e agricultura (VICENTE, 2002). Os microrganismos constituem uma valiosa fonte de substncias de aplicao em diversas reas. So utilizados na produo de antibiticos, antitumorais, imunossupressores, antiparasitrios, vitaminas, pigmentos e enzimas. (GUNATILAKA, 2006; ADRIO 2003; DEMAIN, 1999). Os mais importantes compostos antitumorais usados na quimioterapia atual so antibiticos produzidos microbiologicamente: actinomicina D, mitomicina, bleomicina e as antraciclinas, daunorrubicina, e doxorrubicina (DEMAIN, 1999). O taxol (paclitaxel), que foi originalmente descoberto em plantas, tambm foi descrito como um metablito produzido por um fungo endoftico (STIERLE, STROBEL e STIERLE; 1993). Devido a que somente uma mnima porcentagem de microrganismos que vivem na biosfera tm sido descritos e estudados at hoje, h uma enorme fonte (reservatrio) inexplorada de compostos naturais de grande diversidade estrutural que poderia ser usada para o desenvolvimento de novos antifngicos (VICENTE et al., 2002).

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Considerando-se que 6 dos 20 medicamentos mais comumente prescritos so de origem fngica (GLOER, 1997), e que aproximadamente s 5% dos fungos foram descritos at o momento, estes organismos oferecem um enorme potencial para a obteno de novos frmacos. Hawksworth e Rossman (1997) acreditam que entre as espcies ainda no descritas de fungos, muitas delas devem ser fungos da floresta tropical, em particular, endofticos. Estes microrganismos so particularmente uma das fontes mais promissoras para a descoberta de novos princpios bioativos. A proporo de compostos qumicos inditos isolados a partir de endofticos (51%)

consideravelmente mais alta que a produzida por microrganismos isolados do solo (38 %) (SCHULZ et al., 2002). Um fato interessante que a maioria dos metablitos secundrios teis de origem fngica foi descoberta por estudos de triagem rotineiros, ou seja, testando a atividade de extratos de caldos de cultura de um grande nmero de fungos isolados em determinados ensaios biolgicos ou bioqumicos, que vo desde o uso de organismos inteiros utilizao de enzimas isoladas. Extratos que mostraram atividade em um tipo de triagem so comumente testados em outros tipos de triagem e, muitas vezes com resultados inesperados. Por exemplo, a ciclosporina foi originalmente descoberta em uma triagem de atividade antifngica, porm demonstrou uma atividade insuficiente para o desenvolvimento como droga antifngica, no entanto demonstrou grande potncia em uma triagem para deteco de agentes imunosupressivos (CARLILE, WATKINSON e GOODAY, 2001).

3.6.4 Endfitos Produtores de Substncias Antimicrobianas

Vrios autores descreveram a produo de metablitos secundrios com atividade antimicrobiana obtidos a partir de culturas de fungos endofticos. Gu (2009) isolou 48 microrganismos a partir de folhas de Malus halliana e submeteu triagem de atividade antimicrobiana os extratos de acetato de etila das culturas desses microrganismos. Como resultado, 22 isolados exibiram atividade antimicrobiana contra ao menos um dos microrganismos testados. Entre os extratos brutos dos endofticos, Alternaria brassicicola ML-P08 demonstrou a mais potente atividade

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antimicrobiana (0,31-2,5 mg/mL). O fracionamento bioguiado deste extrato levou ao isolamento de 7 compostos: altenariol(1), alteraniol 9-metil ter (2), altercromona A (3), herbarin A (4), cerevisterol(5), 3-hidroxi (22EM 24R)-ergosta-7,22-dien-6-one (6) e 3,hidroxi (22R,24R)-ergosta-5,8,22-trien-7-one(7). Entre estes compostos isolados, a altercromona A demonstrou a melhor atividade antimicrobiana in vitro contra Bacillus subtillis, Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens e Candida albicans com CIMs de 3,9 ug/mL, 3,9 g/mL, 1,8 g/mL e 3,9 g/mL, respectivamente. O composto herbarin A demonstrou pronunciada atividade antifngica contra Trichophyton rubrum e C. albicans, com CIMs para ambos de 15,6 g/mL. Alm disso, o composto alternariol produziu uma forte atividade inibitria da enzima xantina oxidase (IC50 15,5 M). Kjer et al. (2009) isolaram a partir de planta Sonneratia alba, uma linhagem de Alternaria sp. Este microrganismo foi cultivado em meio arroz slido, extratos obtidos a partir deste meio levaram ao isolamento dos compostos novos: cido xanaltrico I e II (exibiram fraca atividade antimicrobiana contra uma linhagem de Staphylococcus aureus multirresistente), junto aos j conhecidos metablitos fngicos cido alternariennico, altenusina,(demonstrou amplo espectro de ao contra varias bactrias e fungos multirresistentes) altenuene, 4-epialtenueno, alternariol, altertoxin I, 2,5-dimetil-7-hydroxychromone e cido alternarinico. Um novo composto antibacteriano, altersetin foi isolado a partir de culturas lquidas de dois endofticos do gnero Alternaria. Este composto demonstrou uma potente CIM contra vrias bactrias gram positivas patognicas, enquanto que bactrias gram negativas e leveduras no se mostraram muito suscetveis ao composto (HELLWING et al., 2002). LU et al. (2000) isolaram a partir de culturas de Colletotrichum sp. endfitos da planta Artermisia annua novos compostos bioativos: 6-isoprenilindona-3carboxylic acid, 3,5dihydroxy-6-acetoxy-ergosta-7,22-diene e 3,5-dihydroxy6-phenylacety-loxy-ergosta-7,22 diene. Esses compostos inibiram o crescimento de todas as bactrias testadas: Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Sarcina ltea, e Pseudomonas sp. com CIMs no rango de 25 a 75 g/mL. Em uma ampla reviso de compostos bioativos produzidos por endofticos, Gunatilaka (2005) observou que a maioria dos compostos produzidos por

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microrganismos endofticos demonstrou ter atividade antimicrobiana, e, em muitos casos, estes compostos tm sido implicados na defesa da planta hospedeira contra microrganismos fitopatognicos.

3.6.5 Cultivo

de

Microrganismos

Endofticos

Visando

a

Produo

de

Substancias Bioativas- Fatores que Afetan a Produo

bem conhecido que a composio do meio de cultura tem um grande impacto no crescimento e produo de metablitos secundrios (NIELSEN et al., 2004; BERDY, 2005; BODE, 2002; MONAGHAN, 1995). As condies timas para o crescimento e produo de metablitos variam muito de uma espcie outra. Alm de fatores gerais como fonte de carbono, nitrognio, metais traa, temperatura, areao, tempo de cultivo, alguns

microrganismos requerem estimulao por molculas sinais provenientes de outros microrganismos (LARSEN et al., 2005). As caractersticas do meio de cultivo so fundamentais para a produo de metablitos secundrios j que podem privilegiar ou no a produo de substncias de interesse. O uso de elicitores (tambm chamados eliciadores) pode direcionar a produo de certas substncias de interesse (FURTADO et al., 2002). muito vantajoso conhecer o gnero do microrganismo para assim escolher o meio de cultura timo para a produo de metablitos (MONAGHAN et al. 1995). Por exemplo, YES (Yeast Extract Sucrose) e CYA (Czapeck yeast agar) so, em geral, excelentes meios para a produo de metablitos a partir de Penicillium e Aspergillus, enquanto que resultam pouco efetivos para Rhizophus (JENNESSEN et al., 2005). Meios de cultura como arroz e milho frequentemente produzem boa esporulao e produo metablica (WILD, TOTH e HUMPF, 2002). Gloer (1995) e Nielsen et al. (2004) argumentam fortemente a favor do uso de substratos slidos em estudos de metablitos de fungos, devido que os fungos ao contrario de outros microrganismos, geralmente crescem na natureza sob substratos como madeira, razes e folhas de plantas.

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A sntese de metablitos secundrios na natureza por microrganismos endofticos influenciada por vrios fatores. O bioma no qual se encontram inseridos, pode influenciar as vias biogenticas da produo de metablitos secundrios (SCHULZ et al., 2002). Overy e Blunt (2004) e Overy et al. (2005) demonstraram que a presena de tecido vegetal macerado no meio de cultura estimulou a produo de alguns novos compostos fenlicos por parte de endofticos e patognicos de plantas. Outro fator que influencia a produo de metablitos a diferenciao da cultura fngica durante a fase de crescimento, especialmente a conidiao. Alguns metablitos secundrios s so produzidos durante a esporulao (FRISVALD et al., 2008). A produo de metablitos secundrios por fungos um processo complexo, estes produtos secundrios pertencem a diversos grupos estruturais, como esteroides, xantonas, compostos fenlicos, isocumarinas, quinonas, terpenos, citocalasanas, alcaloides e diversos outros grupos estructurais (RAMOS, 2008). Alguns produtos naturais so produzidos somente sob certas condies ambientais, e se todas as condies esto presentes como traos de metais, e outros elementos como o fosfato em determinado intervalo de concentraes, portanto se faz necessrio experimentar vrios meios de cultura para otimizar a produo de metablitos bioativos. As linhagens de microrganismos devem estar em boas condies e no deterioradas por causa de repetidos repique. A acumulao de dixido de carbono pode inibir a produo de metablitos e o solvente utilizado na extrao pode influenciar na deteco de metablitos ativos (LARSEN, et al.. 2005). Ramos (2008) testou vrias condies para a otimizao na produo de metablitos secundrios pelo fungo endofitico Arthrinium state of Apiospora montagnei. A sacarose como fonte de carbono e o nitrato de sdio como fonte de carbono foram as melhores substratos para a produo de metablitos com atividade contra Escherichia coli e Aspegillus fumigatus. Fatores genticos desempenham uma importante funo na produo de metablitos secundrios. Frequentemente uma simples mutao pontual em um gene regulatrio suficiente para converter um isolado em no-produtor de um

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metablito dado. Em outros casos, genes podem ser silenciados por outras razes, o que faz que os metablitos no sejam expressos (LARSEN et al., 2005). A produo de certos metablitos est associada formao de esporo ou esclercio, que so produzidos em condies de cultura slida, enquanto que a produo de outros metablitos melhorada em condies lquidas. Isso foi demonstrado para Penicillium solitum, os alcaloides viridicatol e anlogos de ciclopenol so produzidos em quantidades relativamente altas em meio semislido, entanto que policetdeos so os compostos dominantes produzidos sob condies de cultura lquida (NIELSEN et al., 2004). Aly et al. (2008) investigaram a atividade biolgica e composio qumica de extratos produzidos por um isolado de Alternaria sp. endofitico da planta medicinal Polygonum senegalense. A triagem qumica indicou diferenas entre os extratos obtidos do meio de cultura lquido Wickerham e o meio de cultura slido arroz. Essas diferenas foram refletidas tambm na citotoxicidade dos extratos contra a linhagem L5178Y, linfoma de ratos. O extrato de acetato de etila, obtido da cultura em meio arroz slido, foi mais efetiva que o extrato obtido em cultura lquida.

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4

MATERIAL E MTODOS

4.1 MEIOS DE CULTURA

4.1.1 Agar Batata Dextrose BDA

Dextrose Agar Batatas gua destilada

20 g 15 g 200g 1000 mL

As batatas foram cozidas em 500 mL de gua destilada durante 4 minutos em forno de micro-ondas. Em seguida, foram filtradas com algodo, adicionou-se a dextrose e o agar ao caldo e completou-se com gua destilada para 1000 mL

4.1.2 Meio BHI (Brain Hearth Infusion)

BHI p Agar gua Destilada

37g 17 g 1000ml

Os ingredientes foram misturados e autoclavados durante 20 minutos a 1 atm de presso.

4.1.3 Agar Fub

Tween 80 Fub Agar gua destilada

10 mL 40 g 15 g 1000 mL

O fub foi fervido em banho-maria por 1 hora a 60C, com metade do volume da gua. A suspenso foi filtrada com algodo. Seguidamente acrescentou-

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se o tween 80, o agar e o restante da gua destilada at alcanar 1000 mL. Autoclavou-se por 20 minutos a 120C e 1 atm.

4.1.4 Agar Arroz

Arroz integral em gros Tween 80 Agar gua destilada

10 g 10 mL 15 g 1000 mL

O arroz foi fervido por 1 hora a 60C. Seguidamente acrescentou-se o tween 80, o agar e o restante da gua destilada at alcanar 1000 mL. Autoclavouse por 20 minutos a 120C e 1 atm.

4.1.5 Agar Mueller Hinton

Infuso de carne bovina Peptona de casena cida Amido Agar gua destilada

30 g 17,5 g 1,5 g 17 g 1000 mL

Para a preparao de caldo Mueller Hinton so os mesmos ingredientes sem a adio do agar.

4.1.6 Caldo Extrato de Malte

Extrato de malte Peptona Glicose gua destilada pH

20 g 1,0 g 20 g 1000 mL 6,8

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Todos os ingredientes foram misturados em gua destilada. O volume foi completado com gua destilada para 1000 mL

4.1.7 Caldo Milho (fub)

Farinha de milho (fub) Sacarose K2HPO4 MgSO4 gua destilada

40 g 3% 0,1% 0,05% 1000 mL

Dissolveu-se a farinha de milho em gua destilada, logo levou-se a banhomaria a 52C por uma hora, filtrar. Adicionou-se ao lquido filtrado a sacarose e os sais e autoclavou-se por 20 minutos. Adaptado de Baute et al. (1978).

4.1.8 Meio Arroz Slido

Arroz integral em gros gua destilada

100 g 100 mL

Ao arroz em gros foi adicionada a gua destilada e seguidamente autoclavou-se duas vezes por 40 minutos.

4.1.9 Meio Milho Slido

Milho em gros gua destilada

100 g 100 mL

Ao milho em gros foi adicionada a gua destilada e seguidamente autoclavou-se duas vezes por 40 minutos.

4.1.10 Agar Nutriente

Peptona de carne

5g

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Extrato de carne bovina Agar gua destilada

3g 15 g 1000 mL

Os ingredientes foram misturados e autoclavados durante 20 minutos a 1 atm de presso.

4.2 SOLUES E REAGENTES

4.2.1 Soluo de Anisaldeido

Anisaldeido cido actico glacial

0,5 mL 50 mL

4.2.2 Soluo de Cloreto Frrico

Cloreto frrico cido clordrico 0,5%

1,5 g 100 mL

4.2.3 Soluo de Dragendorff

Soluo A Nitrato de bismuto cido actico glacial gua 0,85 g 10 mL 40 mL Dissolveu-se o sal no cido actico glacial e acrescentou-se 40 mL de gua fervente. Soluo B Iodeto de potssio gua 8g 30 mL A soluo estoquefoi preparada misturando a soluo A e B.

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4.2.4 Soluo de Hidrxido de Potssio Metanlica

KOH Metanol

5g 100 mL

4.2.5 Soluo de Ninhidrina

Ninhidrina Butanol cido actico glacial

0,3 g 100 mL 3mL

4.2.6 Soluo de Vanillina cido Sulfrico

Vanillina Acido sulfrico

1g 100 mL

4.2.7 Soluo Fisiolgica NaCl gua destilada 0,9 g 100 mL

A soluo foi autoclavada e estocada sob refrigerao a 4 C 4.3 MATERIAL VEGETAL

4.3.1 Coleta

O material vegetal foi coletado na Fazenda Violeta, distante a 25 km da cidade de Pedro Juan Caballero, Paraguai, elevao de 960 metros, coordenadas geogrficas 606628.67m E, 749192925 m S. Duas coletas foram realizadas: em janeiro de 2008 e fevereiro de 2009. Na primeira foram coletadas folhas C. urucurana, na segunda foi coletada casca do caule de C. urucurana, ambas com o objetivo da produo de extratos vegetais.

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4.3.2 Identificao Botnica

O material vegetal foi submetido a estudos botnicos para a identificao da espcie no departamento de Botnica da Faculdade de Cincias Qumicas Universidade Nacional de Asuncin Paraguai. No Herbrio desta Instituio foi depositada uma exsicata da planta, registrada com o cdigo Gonzalez, Y. 78 (FCQ).

4.3.3 Elaborao de Extratos Brutos Vegetais

O material coletado, folhas e casca do caule de C. urucurana (FIGURA 2) foi submetido secagem em estufa, a temperatura utilizada para as folhas foi de 30C, e para a casca do caule, 40C. Uma vez seco o material, realizou-se uma triturao com o objetivo de facilitar a liberao dos princpios ativos presentes no tecido vegetal. Para a triturao das cascas de caule foi utilizado moinho de martelos. As folhas foram trituradas manualmente.

A

B

FIGURA 2 PARTES DA PLANTA UTILIZADAS PARA A OBTENO DOS EXTRATOS: FOLHA (A) E CASCA DO CAULE (B) DE Croton urucurana

O mtodo utilizado para a extrao de princpios ativos foi o mtodo da mace